Separacin de Organelos.

En los aos 1950 y 1960, cientficos usaron dos tcnicas para estudiar los organelos de las clulas:
microscopia y fraccionamiento.
Christian de Duve fue el pionero en el fraccionamiento celular. A principios de 1950, el us la
centrifugacin para distinguir un nuevo organelo, el lisosoma, a partir de fracciones previamente
caracterizadas: el ncleo, fraccin rica en mitocondrias, y los microsomas. Poco despus, el us la
centrifugacin por equilibrio de densidad, para descubrir un nuevo organelo.

Antecedentes:
Las clulas eucarioticas son altamente organizadas y se componen de estructuras celulares
conocidas como organelos que realizan funciones especificas. Mientras la microscopia ha
permitido a los bilogos descubrir la localizacin y apariencia de varios organelos, es limitado en el
descubrimiento de la funcin de los organelos. Para hacer esto, los bilogos celulares se han
basado en una tcnica conocida como fraccionamiento celular. Aqu, las clulas son rotas, y los
componentes celulares son separados en base al tamao, masa, y densidad usando una variedad
de tcnicas de centrifugacin. Cientficos pueden aislar y analizar los componentes celulares de
diferentes densidades, llamadas fracciones. Usando este mtodo, los bilogos han dividido la
clula en 4 fracciones: ncleo, fraccin rica en mitocondrias, microsomas y CELL SAP.
de Duve fue un bioqumico interesado en la localizacin subcelular de enzimas metablicas. El ya
haba completado un gran nmero de trabajos en el fraccionamiento de clulas hepticas, en el
cual tuvo que determinar la localizacin subcelular de numerosas enzimas. Por la localizacin de
estas enzimas en fracciones celulares especificas, el pudo comenzar a dilucidar la funcin de los
organelos. Ha sealado que su trabajo se baso en 2 hiptesis: " el postulado de la homogeneidad
bioqumica" y " el postulado de la ubicacin". En resumen, estas hiptesis proponen que toda la
composicin de una poblacin subcelular contendr las mismas enzimas, y que cada enzima se
encuentra en un sitio discreto dentro de la clula. Armado con estas hiptesis y la poderosa
herramienta de la centrifugacin , de Duve subdivide la fraccin rica mitocondrial.
Primero identifico la fraccin mitocondrial liviana, que se compone de enzimas hidroliticas que
ahora se sabe que componen el lisosoma. Luego, en una serie de experimentos, el identifico otra
fraccin celular discreta, que llamo peroxisoma , dentro de la fraccin rica en mitocondrias.



Experimento:
de Duve estudi la distribucin de las enzimas en clulas de hgado de ratas. Gran actividad en el
metabolismo de la energa , el hgado contiene un numero de enzimas tiles para estudiar. Para
buscar la presencia de varias enzimas durante el fraccionamiento, se baso en pruebas conocidas,
llamados ensayos enzimticos, para la actividad enzimtica. Para retener la actividad mxima de la
enzima, tuvo que tomar precauciones, las cuales incluyo realizar todas las etapas del
fraccionamiento a 0C porque el calor desnaturaliza las protenas que pueden comprometer la
actividad enzimtica.
de Duve usa la tasa de centrifugacin zonal para separar los componentes celulares por
centrifugacin en los pasos sucesivos. Removi el hgado de las ratas, y lo rompi aparte por
homogeneizacion. La preparacin cruda de las clulas homogeneizadas fueron sometidas a
centrifugacin de relativamente de baja velocidad. Este paso inicial separa el ncleo de la clula,
que recoge como sedimento en el fondo del tubo, a partir del extracto citoplasmtico que
permanece en el sobrenadante. A continuacin, de Duve adems subdividi el extracto
citoplasmtico en la fraccin mitocondrial pesada, la fraccin mitocondrial liviana, y fraccin
microsomal. Logr separar el citoplasma mediante sucesivas etapas de centrifugacin de aumento
de la fuerza. En cada paso, recolecto y almacen las fracciones para el posterior anlisis
enzimtico.
Una vez que el fraccionamiento se completo, de Duve realiz ensayos enzimticos para
determinar la distribucin subcelular de cada enzima. Luego represento grficamente la
distribucin de la enzima en toda la celula. Como se demostr previamente, la actividad de la
citocromo oxidasa, una importante enzima en el sistema de transferencia de electrones, se
encontr ante todo, en la fraccin mitocondrial pesada. La fraccin microsomal mostr contener
otra enzima caracterizada previamente glucosa 6 fosfatasa. La fraccin mitocondrial liviana, que se
compone del lisosoma, mostr la actividad caracterstica de la fosfatasa acida. Inesperadamente,
de Duve observo un cuarto patrn cuando se ensayo la actividad de la uricasa. En lugar de seguir
el patrn de las enzimas de referencia, la actividad de la uricasa fue bruscamente concentrada
dentro de la fraccin mitocondrial liviana. Esta fuerte concentracin, en contraste con la amplia
disrtribucin sugirieron a de Duve que la uricasa puede ser aislada en otra poblacin subcelular
separada de las enzimas lisosomales.
Para probar esta teora, de Duve uso una tcnica conocida como centrifugacin en gradiente de
densidad de equilibrio, la cual separa las macromolculas en base a la densidad. La centrifugacin
en gradiente de densidad de equilibrio se puede realizar usando un numero de diferentes
gradientes incluyendo sacarosa y glucgeno. Adems, la gradiente puede estar compuesta en
cualquier agua o agua dura que contiene al deuterio (isotopos de hidrogeno) en lugar del
hidrogeno. En su experimento, de Duve separo la fraccin rica mitocondrial preparado por la tasa
de centrifugacin zonal en cada uno de los diferentes gradientes (fig.5.1)

FIG.5.1 representacin esquemtica de la separacin de los lisosomas, mitocondrias, y
peroxisomas por centrifugacin de densidad de equilibrio. La fraccin rica mitocondrial de la tasa
de centrifugacin zonal fue separada en una gradiente de sacarosa, y los organelos fueron
separados en base a la densidad.

Si la uricasa fuera parte de un compartimiento subcelular separado, se podran separar de las
enzimas lisosomales en cada gradiente probado. De Duve realizo el fraccionamiento en esta serie
de gradientes, luego realizo ensayos enzimticos como antes. En cada caso, encontr uricasa en
una poblacin separada de la enzima fosfatasa acida lisosomal y la enzima citocromo oxidasa
mitocondrial.(fig.5.2)
FIG.5.2 representacin grafica del anlisis enzimtico de los productos de una gradiente de
sacarosa. La fraccin rica en mitocondria fue separada como se representa en la fig.5.1 , y luego se
realizo el ensayo enzimtico. La concentracin relativa de la enzima activa es trazado en el eje Y; la
altura en el tubo es trazado en el eje X. La actividad mxima del citocromo oxidasa (top) y
fosfatasa acida ( fondo)fueron observadas cerca de la parte superior del tubo. La mxima actividad
de la uricasa (mitad) migro al fondo del tubo.
Luego de reiteradas observaciones de la actividad de la uricasa en distintas fracciones de la
actividad enzimtica lisosomal y mitocondrial, de Duve concluyo que la uricasa forma parte de un
organelo separado. El experimento tambin demostr que otras 2 enzimas, catalasa y oxidasa de
D aminocido segregaron en la misma fraccin que la uricasa. Porque cada una de estas enzimas
producen o utilizan el perxido de hidrogeno, de Duve propuso que esta fraccin representa un
organelo responsable del metabolismo del perxido, apodado perioxisoma.
Discusin:
El trabajo de de Duve en el fraccionamiento celular proporciono una visin dentro de la funcin de
las estructuras celulares, mientras buscaba la ubicacin de las enzimas conocidas. Examinar el
inventario de enzimas en una fraccin de celula le dio pistas sobre su funcin.
Su cuidadoso trabajo resulto en el descubrimiento de 2 organelos: el lisosoma y el perioxisoma. Su
trabajo tambin proporciono importantes pistas de la funcin de los organelos. El lisosoma, donde
de Duve encontr mucho potencial de enzima destructiva, es ahora conocido como un importante
sitio de degradacin de biomolculas. El perioxisoma ha demostrado ser un sitio de los cidos
grasos y la oxidacin de aminocidos, reacciones que producen una gran cantidad de perxido de
hidrogeno. En 1974, de Duve recibi el premio Nobel Fisiologa y Medicina en reconocimiento a su
trabajo pionero.