UNIVERSIDAD DE SANTANDER - UDES

PROGRAMA MEDICINA VETERINARIA

INMUNOLOGIA Y VIROLOGIA VETERINARIA
DOCENTE: JOHN JAIRO URIBE GONZALEZ-BACTERIOLOGO.
PRACTICA N 2

TECNICAS DE IMUNODIAGNOSTICO

OBJETIVO:
Conocer las diferentes tcnicas de inmunodiagnstico de utilidad clnica en medicina
veterinaria.
Describir cada una de las tcnicas de inmunodiagnstico y sus caractersticas en cuanto a
sensibilidad y especificidad.
MARCO TEORICO:
La respuesta inmune puede emplearse de dos maneras para diagnosticar una enfermedad. Los
anticuerpos especficos pueden utilizarse para detectar e identificar un antgeno de inters. Estos
antgenos pueden estar asociados con un agente infeccioso o simplemente ser molculas que es
necesario localizar o cuantificar. Segunda, es posible determinar si un animal ha estado expuesto
previamente a un agente infeccioso mediante la deteccin de anticuerpos especficos en su suero.
Esto establecera un diagnostico o determinara el grado de exposicin de una poblacin a ese
agente. La medicin de las interacciones antgeno-anticuerpo con fines diagnsticos se denomina
serologa.
Las tcnicas serolgicas se clasifican en tres amplias categoras, la primera integrada por las
pruebas de unin primaria que mide directamente la unin antgeno anticuerpo, algunas de estas
pruebas son el enzimoinmunoanalisis (ELISA) y el radioinmunoanlisis (RIA).
Las pruebas de unin secundaria miden el resultado de la interaccin antgeno anticuerpo in vitro,
estas pruebas son normalmente menos sensibles que las pruebas de unin primaria, pero son
fciles de realizar o requieren tecnologa ms sencilla. Las pruebas in vivo, la tercera categora mide
el efecto protector real de los anticuerpos en un animal.
REACTIVOS PARA PRUEBAS SEROLOGICAS.
SUERO: la fuente ms comn de anticuerpos es el suero obtenido de la sangre coagulada, el suero
puede almacenarse congelado y analizarse cuando sea conveniente. Si es necesario puede
suprimirse la actividad del complemento calentndolo a 56C por 30 min.
ANTIGLOBULINAS: Son protenas complejas con gran capacidad antignica, se obtienen de la
inoculacin de inmunoglobulinas en conejos; este, responder produciendo anticuerpos especficos
contra la inmunoglobulina inoculada, dependiendo de la inmunoglobulina inoculada es posible
producir anti globulinas especficas frente a toda clase de inmunoglobulinas.
ANTICUERPOS MONOCLONALES: Un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo homogneo
producido por una clula hbrida producto de la fusin de un clon de linfocitos B descendiente de
una sola y nica clula madre y una clula plasmtica tumoral. Son anticuerpos idnticos porque
son producidos por un solo tipo de clula del sistema inmune, es decir, todos los clones proceden
de una sola clula madre. Es posible producir anticuerpos monoclonales que se unan
especficamente con cualquier molcula con carcter antignico.
PRUEBAS DE UNION PRIMARIA
Las pruebas de unin primaria se realizan permitiendo que el antgeno y el anticuerpo se combinen
y midiendo despus los inmunocomplejos formados. Para ello uno de los reactivos debe marcarse
qumicamente. Se han empleado como marcadores en estas pruebas los radioistopos, colorantes
fluorescentes o fluorocromos, materiales coloidales o enzimas.
RADIOINMUNOANALISIS (RIA): Los ensayos que utilizan radioistopos como marcadores tienen
la ventaja de ser extremadamente sensibles. Por otra parte, los sistemas de detecion de isotopos
son costosos, combinados con el riesgo de la radioactividad y la necesidad de eliminar material
radioactivo con la mxima seguridad, hace que estas tcnicas sean utilizadas en ensayos altamente
sensibles.
RIA PARA DETECCION DE ANTICUERPOS: los discos de celulosa impregnados de antgeno se
sumergen en el suero a analizar, de manera que cualquier anticuerpo especfico se une al antgeno.
Despus de lavar para eliminar los anticuerpos sin unir, el disco se sumerge en una solucin que
contiene anti globulina marcada con un isotopo radioactivo. La cantidad de radiactividad que emite
el disco es una medida del nivel de actividad del anticuerpo especfico del suero.

INMUNOFLUORESCENCIA
Los colorantes fluorescentes o fluorocromos se emplean con frecuencia como marcadores en las
pruebas de unin primaria, la ms importante de estas pruebas es la isotiocianato de fluorescena
(FITC) un compuesto amarillo que puede unirse qumicamente a los anticuerpos sin afectar su
reactividad, cuando se aplica una luz ultravioleta invisible o una luz azul a 290 y 145 nm, el FITC
reemite una luz visible de color verde brillante, que puede verse con un microscopio de
fluorescencia fcilmente. Los anticuerpos marcados con FITC se usan en pruebas directas e
indirectas. Las pruebas directas se emplean para identificar la presencia de un antgeno en una
muestra de tejido, el anticuerpo especifico contra el antgeno se marca primero con FITC, un corte
de un tejido que contenga el microorganismo se fija en un portaobjeto de vidrio, se incuba con el
antisuero marcado y se lava para eliminar cualquier anticuerpo no unido, cuando se examina la
iluminacin de campo oscuro en un microscopio con luz ultravioleta, el microorganismo al que se
une el anticuerpo marcado, presentara un brillo fluorescente.

La inmunofluorescencia indirecta se utiliza para detectar anticuerpos en el suero o para identificar
antgenos especficos en los tejidos o cultivos tisulares. Para medir los niveles de anticuerpos se
emplea el antgeno presente en un frotis, colocado sobre un portaobjeto, este se incuba con el
suero sospechoso de contener anticuerpos frente a este antgeno. Despus se lava el suero
quedando solo los anticuerpos especficos unidos al antgeno, estos anticuerpo se observan,
incubando el frotis con una anti globulina marcada con FITC, cuando se elimina la anti globulina
marcada sin unir mediante lavados y se examina el portaobjeto, la presencia de fluorescencia indica
que hay anticuerpos en el suero analizado.



INMUNOCROMATOGRAFIA
Tcnica que permite que una solucin antignica fluya a travs de una banda porosa. Mientras fluye
la solucin, primero pasa a travs de una zona donde se encuentra con el anticuerpo marcado
desecado, al que solubiliza y con el que forma inmunocomplejos. Este anticuerpo esta marcado con
oro o selenio coloidal (banda rosa o azul). El lquido fluye a travs de una zona de deteccin que
contiene el anticuerpo frente al antgeno, inmovilizado en la tira porosa, que captura a los
inmunocomplejos. En un resultado positivo se desarrolla una zona rosa o azul en la zona de
deteccin.



PRUEBAS DE UNION SECUNDARIA

Las reacciones entre antgeno y anticuerpo normalmente se sigue de una reaccin secundaria. As,
si los anticuerpos se combinan con antgenos solubles en solucin, los inmunocomplejos
resultantes pueden precipitar. Los anticuerpos unidos a antgenos particulados pueden hacer que
formen grumos o aglutinen. Si un anticuerpo puede activar la va clsica del complemento, y el
antgeno esta sobre la superficie celular, puede provocar lisis celular.
PRUEBAS DE PRECIPITACION
Al mezclar cantidades suficientes de Ag soluble con Acs especficos, la interaccin Ag-Ac puede dar
lugar a una red capaz de ser visualizada como un precipitado. Esa red de la que hablamos, no es
otra cosa que grandes complejos inmunes (CI) formados por la interaccin Ag-Ac. Tal como se
observa en la figura, cuando se agregan concentraciones crecientes de Ag soluble a una cantidad
fija de suero conteniendo Acs especficos, a medida que la cantidad de Ag agregado aumenta, la
cantidad de precipitado se incrementa hasta alcanzar un mximo, luego del cual declina. En un
extremo de la curva de precipitacin, cuando se agregan pequeas cantidades de Ag, los CI se
forman en exceso de Ac. En el otro extremo, al agregar grandes cantidades de Ag, los CI se forman
en exceso de Ag siendo pequeos y probablemente constituidos por una molcula de Ac y dos de
Ag. Entre estas dos situaciones extremas se encuentra la zona de equivalencia, en donde la relacin
Ag-Ac permite la formacin de grandes redes de CI que precipitan.



INMUNODIFUSION
Esta tcnica permite cuantificar de manera sencilla y econmica inmunoglobulinas de isotipo G, M y
A o antgenos solubles (C3, C4, transferrina, etc) presentes en muestras biolgicas. La tcnica se
basa en la difusin de la muestra conteniendo el antgeno a medir (inmunoglobulinas o antgenos
solubles) en una matriz semislida de agar en la que se encuentra disuelto el Ac especfico. La
muestra biolgica se introduce en los orificios cilndricos excavados en el agar y a medida que el
antgeno difunde en forma radial, se alcanza la relacin Ag-Ac que permite la formacin
precipitados visibles. Una vez finalizada la difusin se mide el radio (R) de los precipitados que es
proporcional a la concentracin de antgeno (C). La concentracin de protena en la muestra
biolgica (Cx) se calcula realizando una curva de calibracin utilizando muestras patrones de
concentracin conocida.

AGLUTINACION
Las reacciones de aglutinacin, tal como vimos para las reacciones de precipitacin, involucran una
interaccin secundaria entre Ag-Ac que llevar a la aparicin de un aglutinado que se visualiza
como grumos. Los principios fisicoqumicos que gobiernan la formacin de estos aglutinados son
los mismos que gobiernan la formacin de un precipitado. La gran diferencia entre las reacciones
de precipitacin y las reacciones de aglutinacin son las caractersticas del antgeno: mientras que
en las reacciones de precipitacin se emplean antgenos solubles, en las reacciones de aglutinacin
el Ag es particulado. Con un Ag soluble, tambin es posible disear una reaccin de aglutinacin
gracias a que es posible utilizar distintas partculas (partculas inertes o glbulos rojos) y realizar un
pegado qumico o fisicoqumico del Ag soluble a dichas partculas, generando de esa manera un
Ag particulado til para fines diagnsticos. Considerando que es posible inmovilizar muchos tipos
diferentes de protenas a distintos tipos de partculas inertes, es posible clasificar las reacciones de
aglutinacin pasiva en:
Reacciones de aglutinacin pasiva directa; o Reacciones de aglutinacin pasiva reversa.
Las reacciones de aglutinacin directa se basan en la sensibilizacin de la partcula inerte con el Ag,
por lo que resultan tiles para la deteccin y titulacin de Ac en distintos fluidos biolgicos. Las
reacciones de aglutinacin reversa se basan en la inmovilizacin del Ac (en general, se inmoviliza un
anticuerpo monoclonal AcMo-) en la superficie de la partcula inerte, siendo este tipo de
reacciones particularmente tiles para la deteccin de Ag en distintas muestras biolgicas.
TITULACION
Aunque la deteccin de anticuerpos o antgenos es suficiente, normalmente es deseable cuantificar
la reaccin. Una manera de medir los niveles de anticuerpos especficos es mediante una titulacin.
El suero que se analiza se diluye en una serie de concentraciones decrecientes y cada una de ellas
se analiza en busca de actividad. El reciproco de la dilucin mas alta que da una respuesta positiva
se denomina titulo y proporciona una estimacin de los anticuerpos de ese suero. En determinadas
muestras en las que existe una gran cantidad de Ac es posible que a diluciones bajas (es decir, a
altas concentraciones de suero) no se observe aglutinacin. Este fenmeno se denomina efecto
prozona y se debe a que en exceso de Ac se forman preferentemente complejos Ag-Ac solubles
(como los formados en la zona de exceso de Ac en la curva de precipitacin). En este caso, el ttulo
de Ac sigue siendo la mxima dilucin de suero que produce aglutinacin visible.



PREINFORME
1. Investigar diferentes pruebas de unin primaria y secundaria como ELISA, western blot, inmunofiltracion y
citometria de flujo.
2. Describa las diferentes aplicaciones diagnosticas y clnicas que tienen las pruebas de unin consultadas.

MATERIALES:
Pruebas de inmunocromatografia (prueba de gravidez y hemoglobina glicosilada)
Puntas amarillas y azules para micro pipetas.
Micro pipetas de 5 50 y 10 100 micro litros.
Tubos de ensayo
Muestras de sangre con EDTA
Muestras de suero
palillos
solucin salina
Cmara hmeda
Alcohol, torundas de algodn, tubos tapa roja y agujas sistema al vacio.
Prueba de antiestreptolisina O, VDRL, Rosa de bengala.

PROCEDIMIENTO:
Realizar ven puncin: Obtener muestra de suero de paciente problema.
Tecnica de inmunocromatografia: Colocar una gota 50 micro litros de suero problema en el porta
muestra con el que cuenta la columna de inmunocromatografia, dejar correr el suero por la superficie
porosa, realizar lectura 5 minutos despus de la adicin de la muestra.
Tcnica de precipitacin: Colocar una gota 50 micro litros de suero problema en un portaobjetos
previamente identificado, adicionar una gota de reactivo VDRL, con el dispensador con el que cuenta el kit
de reactivo, mezclar en un agitador de mazzini por 4 minutos a una velocidad de 180 rpm y observar
resultados.
Tcnica de precipitacin por inmunodifusion radial: Marque en el disco de inmunodifusion el pozo a
utilizar por su grupo de trabajo, tomar 10 micro litros de muestra de suero y dispensarla en el pozo
seleccionado. Colocar el disco en una cmara hmeda durante 24 horas, observar la presencia o ausencia
de lneas de precipitacin por el complejo antgeno anticuerpo visible.
Tcnica de aglutinacin: En muestras bovinas sospechosas, realizar la separacin del suero mediante
centrifugacin. Marcar tres sitios de muestras distribuidos para control negativo, positivo y muestra de
suero problema. Colocar una gota del reactivo de rosa de bengala sobre cada uno de los controles y
suero, con un aplicador de madera realizar una mezcla de ambos reactantes (suero y antgeno)
extendiendo la muestra en un amplio crculo sobre la cuadricula, sin exceder los limites delineados. Mover
manualmente la placa en forma giratoria. Dejar reposar la placa sobre el mesn por 1 minuto y realizar la
lectura.
Tcnica de aglutinacin para ASTOS: Obtenga suero de un paciente, Marcar tres sitios de muestras
distribuidos para control negativo, positivo y muestra de suero problema. Colocar una gota del reactivo de
ASTOS sobre cada uno de los controles y suero, con un aplicador de madera realizar una mezcla de ambos
reactantes (suero y antgeno) extendiendo la muestra en un amplio crculo sobre la cuadricula, sin exceder
los limites delineados. Mover manualmente la placa en forma giratoria o siga las instrucciones de
agitacin mecnica indicadas en el inserto de la prueba. Realizar lectura.
Tecina de dilucin: Tomar y marcar 8 tubos de ensayo o una tarjeta con las diluciones a realizar. Colocar
una gota de suero problema de 50 micro litros y adicionar 50 micro litros de solucin salina dilucin 1:2,
colocar en el pocillo siguiente una gota de la dilucin 1:2 y adicionar una gota de 50 micro litros de
solucin salina dilucin 1:4, realizar el mismo procedimiento hasta una dilucin 1:128, agregar reactivo de
VDRL en cada una de las diluciones realizadas, mezclar con un palillo. Mover manualmente la placa en
forma giratoria o siga las instrucciones de agitacin mecnica indicadas en el inserto de la prueba. Realizar
lectura, anotar la dilucin hasta donde se observa la prueba positiva.


ANALISIS DE RESULTADOS.
CAUSAS DE ERROR.
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFIA.