Efectos de la radiacin UV B en Brassica oleracea

AUTORES

RESUMEN

INTRODUCCION
La radiacin solar es uno de los principales factores ambientales que afectan la vida en
nuestro planeta (Carrasco, 2009). Esta radiacin controla el funcionamiento de los
ecosistemas terrestres y acuticos tanto a travs del control de procesos fotobiolgicos
(fotosntesis, fotoperodo, fototropismos, etc.) como por medio de su accin sobre otros
factores ambientales (temperatura, humedad, etc.) y ciclos naturales (ciclos diarios,
anuales, hdricos, etc.) que finalmente inciden en la distribucin de los organismos
(Carrasco, 2009).
El contenido energtico de radiacin solar que alcanza la superficie terrestre, depende de
su longitud de onda, y comprende: radiaciones de onda corta (280 400 nm)
denominadas radiacin ultravioleta (UV), radiacin fotosintticamente activa o PAR (sigla
derivada del ingls: photosynthetic active radiation) que es sensible al ojo humano (400
780 nm) y que abarca los colores violeta, azul, verde, amarillo, naranja y rojo (Carrasco,
2009); la radiacin infrarroja (750 a 4000 nm), la cual afecta el balance trmico y los
procesos morfognicos de las plantas (Aichele, 2006).
Esta misma radiacin solar, la cual ha hecho posible la vida sobre nuestro planeta, puede
ser perjudicial en altas intensidades o cuando la proporcin de ondas cortas aumenta por
sobre determinados lmites (Carrasco, 2009). Altas intensidades de radiacin y cambios
en la composicin espectral pueden afectar importantes procesos en los organismos, en
particular en los vegetales que por no poder moverse slo les queda adaptarse a tales
cambios (Carrasco, 2009).
La radiacin ultravioleta se divide en tres tipos: radiaciones UV-A (380-320 nm) la cual es
dbilmente absorbida por el ozono estratosfrico, llegando a la superficie de la tierra, y
produce en las plantas diferentes reacciones fotoqumicas (Aichele, 2006). El nivel de
radiacin de sta se mantiene relativamente constante; radiaciones UV-B (320-280 nm) la
cual es filtrada por el ozono estratosfrico tambin llamada UV biolgicamente activa,
representa el 5% del espectro de radiacin UV y el 0.25% de toda la radiacin solar que
llega a la Tierra; y radiaciones UV-C con longitudes de onda menores que 280 nm y que
son absorbidas por la atmsfera no llegando a alcanzar la superficie terrestre (Aichele,
2006). Debido a que la energa es inversamente proporcional a la longitud de onda, la
radiacin UV-C, es la radiacin mayormente energtica la cual es incompatible con todas
las formas de vida (Aichele, 2006).
Uno de los principales cambios que ha sucedido este ltimo tiempo ha sido el aumento
de la radiacin UV-B (Carrasco, 2009). Esto, producto de la destruccin de la capa de
ozono por compuestos contaminantes como los clorofluorocarbonos (CFC), xidos de
nitrgeno, cloro, bromo, etc. (Carrasco, 2009). Estos compuestos tienden a formar
compuestos estables con el ozono (O3) con una vida media de 50 a 150 aos (Carrasco,
2009).
Si bien la radiacin ultravioleta-B comprende una pequea regin del espectro
electromagntico, su accin sobre plantas y animales es considerable (Carrasco, 2009).
Esto principalmente debido a que importantes biomolculas como protenas y cidos
nucleicos, por presentar electrones la absorben fuertemente (Carrasco, 2009).
Numerosos son los efectos atribuibles a esta radiacin, la cual ha estado desde siempre
presente en el ambiente (Carrasco, 2009). As, las plantas desde temprano en su
evolucin han debido adaptarse a su presencia y desarrollar mecanismos capaces de
disminuir sus efectos adversos (Carrasco, 2009). Por tal motivo, desde el descubrimiento
del denominado agujero de ozono en la Antrtica, el inters por estudiar los principales
efectos de la radiacin ultravioleta-B sobre los vegetales ha aumentado
considerablemente (Carrasco, 2009). Estos efectos se pueden clasificar en efectos
anatomomorfolgicos, metablicos y moleculares (Carrasco, 2009).
En el presente trabajo se analizo el efecto de la radiacin UV-B en las plantas con especial
nfasis en aquellos efectos sobre los pigmentos fotosintticos y protectores.

OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Analizar el efecto de la radiacin UV artificial en las respuestas fisiolgicas de plntulas
de Brassica oleracea.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Determinar el efecto de la radiacin UV - B en la concentracin de pigmentos
fotosintetizadores (clorofilas a, b y carotenos) en plntulas de Brassica oleracea.
Determinar el efecto de la radiacin UV- B en la concentracin de pigmentos
protectores (flavonoides) en plntulas de Brassica oleracea.
Determinar y comparar el ndice estomtico de plntulas del Grupo Control y plntulas
de tratamiento sometidas a radiacin UV.
HIPOTESIS
MATERIALES Y METODOS
El trabajo se realizo en el laboratorio de Fisiologa vegetal y en las instalaciones de
cubierta del laboratorio de la Escuela Profesional y Acadmica de Biologa de la
Universidad Nacional De San Agustn (16 24`51.19`` S 71 32`02.43`` O, a una
elevacin de 2327 msnm), durante los meses de octubre y diciembre del 2012.

a. Unidad Experimental:

El efecto de la radiacin UV-B en los pigmentos fotosintticos se estudiaron en
unidades experimentales compuestas por: Plntulas de repollo (Brassica oleracea)
las cuales fueron sembradas en un sustrato formado por arena, musgo y tierra de
chacra en proporciones de 3:1:1 respectivamente. Ya con 5 semanas de edad, y
habiendo desarrollado de 5 a 6 hojas verdaderas, se las someti a tratamiento (T1)
de radiacin UV-B en una cmara oscura y Grupo control se mantuvieron en
temperaturas y condiciones ambiente; cada grupo con 9 repeticiones.



Fig. 1: Plntulas de Brassica oleracea subsp. capitata (L.) Metzg con 5
semanas de edad, antes ser sometidas a radiacin UV-B

b. Periodo de Irradiacin:

La radiacin UVB se aplic mediante una lmpara halgena al tratamiento,
durante 4 horas al da entre 11.00-15.00 horas, en el tiempo de 2 semanas.


Fig. 2: Lmpara halgena (A) y cmara oscura (B) donde se trataron a las
plntulas (T1) con radiacin durante 4 horas al da por 2 semanas.

c. Determinacin de parmetros fisiolgicos

Al trmino del perodo de tratamiento UV-B, se realiz la cosecha de las plntulas
de B. oleracea haciendo un registro de altura vstago (hojas ms tallo) y raz, peso
fresco de vstago y raz. De las hojas frescas se midi el rea foliar, apertura
estomtica y adems se eligi al azar hojas de las cuales se tomaron 40 mg para su
anlisis qumico, tanto del grupo control y tratamiento.
El resto del material fresco se sec en estufa a 70C hasta obtencin de peso
constante (Peso Seco). Del peso total (fresco y seco) se obtuvo matemticamente
biomasa y contenido hdrico. De las hojas secas se tomaron 10 mg para la
extraccin de flavonoides.

d. Determinacin de la Apertura Estomtica

De una hoja fresca de la muestra control y tratamiento, se extrajo un pedazo del
tejido epidrmico del envs, el cual fue colocado en una luna de reloj y coloreado
con azul de metileno, posteriormente se la fijo a la una lamina y fue observado al
microscopio con el objetivo de X40 (400 micras). Para calcular la apertura
estomtica se midi el ancho y alto del ostiolo por cm
2
de la hoja.

e. Determinacin del Contenido Hdrico total

El contenido hdrico de las plantas vara de acuerdo con la especie y rgano
considerado, dependiendo de las condiciones ambientales. Para calcular el
contenido hdrico se empleo la siguiente frmula:

Donde:
PF: peso fresco
PS: peso seco

La diferencia entre este porcentaje y el 100%, corresponde al porcentaje de Peso
Seco (biomasa).

f. Determinacin de Pigmentos Fotosintticos por Espectrofotometra:

Se pesaron 40 mg de la muestra control y se moli en un mortero, agregando 2.5
ml de acetona al 85%. Luego se filtro el contenido en un embudo que contuvo
papel filtro Whatman N1, enjuagando el macerado con otros 2.5 ml de acetona al
80% v/v y todo fue recepcionado todo en un tubo de ensayo. Luego se midi la
extincin de la solucin haciendo uso de un espectofotmetro a 662, 644 y 440
nm contra un blanco de solvente.

Para carotenos se hizo una dilucin X6, tomando 0.5 ml extracto inicial y enrazado
a 3 ml con acetona al 85%.

La extincin medida se realiz para cada pigmento segn las formulas descritas a
continuacin (el procedimiento se repiti para las muestras irradiadas):
Clorofila A (mg/l): 9.784*E662 - 0.99*E644
Clorofila B (mg/l): 21.426*E644 - 4.65*E662
Carotenos (mg/l): 4.695*E440- 0.268*(Clorofila A+B)
mg/g = mg/l /(peso de la muestra*1000)

g. Determinacin de Flavonoides:
Para su determinacin ser de acuerdo a la metodologa de Caldwell, (1968). Con
las siguientes modificaciones; Se pesaron 10 mg de la muestra foliar seca
pulverizada en un mortero y se extrajeron con 5 ml de metanol puro caliente
agitando moderadamente por 1 o 2 minutos, luego la muestra fue homogenizada
en un mortero aadiendo 5 ml de una solucin metanolica acidificada (HCl-agua-
Metanol) (1:20:79) v/v/v. se centrifug la muestra a 3000 rpm durante 15
minutos, por ltimo se lee la absorvancia del sobrenadante a 300nm (UV) en un
espectrofotmetro.
Se diluyo la muestra X20, tomando 0.2 ml del extracto inicial y enrazado a 4ml con
metanol puro. La concentracin de sustancia flavonoide se expres en trminos de
A/peso de la muestra foliar seca.














RESULTADOS
Clorofila A
Pruebas de Hiptesis
Medias muestrales = 0.368 y 0.4
Desviaciones estndar muestrales = 0.111 y 0.111
Tamaos de muestra = 9 y 9
Intervalos de confianza del 95.0% para la diferencia entre medias: -0.032 +/- 0.102557 [-
0.134557,0.0705571]
Hiptesis Nula: diferencia entre medias = 0.0
Alternativa: no igual
Estadstico Z calculado = -0.611552
Valor-P = 0.540832
No rechazar la hiptesis nula para alfa = 0.05.

Clorofila B
Pruebas de Hiptesis
Medias muestrales = 0.101 y 0.112
Desviaciones estndar muestrales = 0.025 y 0.019
Tamaos de muestra = 9 y 9
Intervalo aproximado del Intervalos de confianza del 95.0% para la diferencia entre
medias: -0.011 +/- 0.0205147 [-0.0315147,0.00951475]
Hiptesis Nula: diferencia entre medias = 0.0
Alternativa: no igual
Estadstico Z calculado = -1.05093
Valor-P = 0.293288
No rechazar la hiptesis nula para alfa = 0.

Carotenos
Pruebas de Hiptesis
Medias muestrales = 0.322 y 0.379
Desviaciones estndar muestrales = 0.084 y 0.074
Tamaos de muestra = 9 y 9

Intervalo aproximado del Intervalos de confianza del 95.0% para la diferencia entre
medias: -0.057 +/- 0.0731371 [-0.130137,0.0161371]
Hiptesis Nula: diferencia entre medias = 0.0
Alternativa: no igual
Estadstico Z calculado = -1.52752
Valor-P = 0.126632
No rechazar la hiptesis nula para alfa = 0.05.

Flavonoides
Pruebas de Hiptesis
Medias muestrales = 0.173 y 0.217
Desviaciones estndar muestrales = 0.042 y 0.052
Tamaos de muestra = 9 y 9
Intervalo aproximado del Intervalos de confianza del 95.0% para la diferencia entre
medias: -0.044 +/- 0.0436701 [-0.0876701,-0.000329894]
Hiptesis Nula: diferencia entre medias = 0.0
Alternativa: no igual
Estadstico Z calculado = -1.97477
Valor-P = 0.0482935
Rechazar la hiptesis nula para alfa = 0.05.










AREA
FOLIAR
TRATAMIENTO (cm^2)
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9
68.87 44.95 37.06 16.04 57.81 52.55 24.76 65.69 56.01

AREA
FOLIAR
CONTROL (cm^2)
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9
83.67 154.20 107.87 66.38 53.94 154.89 63.62 143.83 106.21



INTERPRETACION:
El rea foliar de los tratamiento ha disminuido en comparacin de el rea foliar de las
plantas en control, esto puede deberse a la inhibicin que causa la radiacin UV-B en el
epitelio de la cara adaxial que la que usualmente recibe mayor radiacin que la cara
abaxial.


INDICE DE
TOLERANCIA

0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
140.00
160.00
180.00
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A
R
E
A

(
c
m
^
2
)

numero de tratamiento
AREA FOLIAR
TRATAMIENTO
CONTROL
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9
33.49 36.36 28.86 56.89 42.80 46.15 47.51 40.09 57.69



INTERPRETACION


CONTENIDO HIDRICO
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9
VASTAGO 96.60 96.50 97.69 98.60 99.35 97.18 99.27 97.84 98.75
RAIZ 83 79.4 77.5 82 98 72.5 77 36.5 86.5
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9
VASTAGO 89.50 88.50 91.44 91.65 91.31 91.46 88.67 91.12 86.24
RAIZ 86 88 91.5 91.5 91.33 91.25 88.67 91 85.8


0
10
20
30
40
50
60
70
1 2 3 4 5 6 7 8 9
%

d
e

t
o
l
e
r
a
n
c
i
a

numero de tratamiento
INDICE DE TOLERANCIA
INDICE DE TOLERANCIA


INTERPRETACION

0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
1 2 3 4 5 6 7 8 9
%

D
E

C
O
N
T
E
N
I
D
O

NUMERO DE TRATAMIENTO
CONTENIDO HIDRICO
VASTAGO C
RAIZ C
VASTAGO T
RAIZ T
CLOROFILA A
CONTROL TRATAMIENTO
C1 0.25 T1 0.48
C2 0.32 T2 0.44
C3 0.26 T3 0.28
C4 0.42 T4 0.44
C5 0.60 T5 0.60
C6 0.26 T6 0.35
C7 0.39 T7 0.22
C8 0.41 T8 0.40
C9 0.40 T9 0.39


INTERPRETACION: L a clorofila a en la mayora de repeticiones es mayor en las plantas de
control que en las de tratamiento, esto se debe a que la radiacin UV-B afecta al sistema
PSII lo cual influye directamente en la protena D1 y la degradacin de dicha protena
provoca la desorganizacin de los centro de raccion y la liberacin de los complejos CP43
Y CP47, adems tambin influye un cloroplastos con menor cantidad de granas lo que
provoca la perdida de clorofila a.El hecho de que algunas no presenten menor cantidad
de clorofila que es debido a la recuperacin de las repeticiones al ser cometidas a un
periodo de iluminacin normal durante un dia despus de haber estado sometidas a
radiacin UV-B durante 10 dias.

CLOROFILA B
CONTROL TRATAMIENTO
C1 0.08 T1 0.13
C2 0.14 T2 0.11
C3 0.08 T3 0.09
C4 0.08 T4 0.12
C5 0.14 T5 0.15
C6 0.08 T6 0.11
C7 0.10 T7 0.09
C8 0.11 T8 0.10
C9 0.10 T9 0.11

0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1 2 3 4 5 6 7 8 9
m
g

C
l

A
/
g
.
p
.
f

numero de tratamiento
CLOROFILA A
CONTROL
TRATAMIENTO

INTERPRETACION:

CAROTENO
CONTROL TRATAMIENTO
C1 0.19 T1 0.39
C2 0.40 T2 0.43
C3 0.30 T3 0.28
C4 0.43 T4 0.41
C5 0.44 T5 0.48
C6 0.27 T6 0.32
C7 0.31 T7 0.32
C8 0.26 T8 0.47
C9 0.30 T9 0.31



0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
1 2 3 4 5 6 7 8 9
m
g

C
l

B
/
g
.
p
.
f

numero de tratamiento
CLOROFILA B
CONTROL
TRATAMIENTO
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
1 2 3 4 5 6 7 8 9
m
g

c
a
r
o
t
e
n
o
s
/
g
.
p
.
f

numero de tratamiento
CAROTENOS
CONTROL
TRATAMIENTO
INTERPRETACION: Los carotenos con mnimas cantidades de radiacin no demuestran
una variacin importante, tericamente el cambio se da largas exposiciones y a grandes
cantidades de radiacin.

FLAVONOIDES
CONTROL TRATAMIENTO
C1 0.31 T1 0.08
C2 0.27 T2 0.20
C3 0.21 T3 0.22
C4 0.18 T4 0.21
C5 0.21 T5 0.18
C6 0.25 T6 0.18
C7 0.14 T7 0.14
C8 0.19 T8 0.18
C9 0.19 T9 0.17


INTERPRETACION: Los flavonoides son sustancias que se acumulan en las clulas de las
plantas y absorben la radiacin por lo que su cantidad aumenta considerablemente
inclusive en exposiciones muy cortas a radiacin UV-B, este aumento tambin est
relacionado a su potencial antioxidante ante radicales libres.


0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A
3
0
0
g
-
1
p
.
s
.

numero de tratamiento
FLAVONOIDES
TRATAMIENTO
CONTROL
RELACION A/B
CONTROL TRATAMIENTO
C1 3.11 T1 3.77
C2 2.30 T2 4.08
C3 3.32 T3 3.11
C4 5.06 T4 3.74
C5 4.15 T5 4.00
C6 3.13 T6 3.23
C7 3.79 T7 2.63
C8 3.86 T8 4.15
C9 4.15 T9 3.66


INTERPRETACION: Representa la relacin entre la Cantidad de clorofila A y clorofila B,
esta grafica comprueba la disminucin de pigmentos fotosintticos explicados
anteriormente.

CONTROL TRATAMIENTO
C1 1.74 T1 1.55
C2 1.13 T2 1.27
C3 1.16 T3 1.35
C4 1.19 T4 1.34
C5 1.69 T5 1.58
C6 1.25 T6 1.47
C7 1.61 T7 0.95
C8 2.04 T8 1.05
C9 1.64 T9 1.60
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
1 2 3 4 5 6 7 8 9
m
g

C
l

A

/

m
g

C
l

B

numero de tratamientos
RELACION A/B
CONTROL
TRATAMIENTO


INTERPRETACION: Al igual que la relacin anterior la cantidad de pigmentos es mayor en
las plantas de control ya que afectadas por la radiacin , estos pigmentos disminuyen en
las plantas de tratamiento, y los carotenos que no tienen una variacin importante no
afectan a esta relacin de pigmentos.
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
1 2 3 4 5 6 7 8 9
m
g

C
l

A
.
m
g

C
l
B
/
m
g

c
a
r
o
t
e
n
o
s

numero de tratamientos
RELACION A+B/C
CONTROL
TRATAMIENTO