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NEFELOMETRA
La nefelometra es un procedimiento analtico que se basa en la dispersin de la radiacin que
atraviesan las partculas de materia. Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que
existe una suspensin de partculas slidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia
se observa turbia. La dispersin no supone la prdida neta de potencia radiante, solo es afectada
la direccin de la propagacin, porque la intensidad de la radiacin es la misma en
cualquier ngulo. La intensidad depende de: el nmero de partculas suspendidas, su tamao, su
forma, los ndices refractivos de la partcula y del medio dispersante, y la longitud de onda de la
radiacin dispersada. La relacin entre variables y es ms factible un tratamiento terico, pero
debido a su complejidad raras veces se aplica a problemas analticos especficos. El procedimiento
generalmente es emprico y slo se consideran 3 factores:
1. La concentracin: Mayor sea el nmero de partculas, mayor es la dispersin.
2. Tamao de la partcula: Factores como el pH, la velocidad y orden de la mezcla, concentracin
de los reactivos, duracin del estado de reposo y la fuerza inica.
3. Longitud de onda: Generalmente las muestras se iluminan con luz blanca, pero si estn
coloreadas, se debe escoger una porcin del espectro electromagntico en la que la absorcin del
medio se reduzca al mnimo.
En las muestras se agregan agentes tensoactivos (como gelatina), para prevenir la coagulacin del
coloide. Slo se obtienen datos confiables si se controlan escrupulosamente las variables que
afectan el tamao de partculas. Se suele utilizar para concentraciones ms diluidas.

La nefelometra: mide la luz dispersada en direccin distinta a la luz emitida (generalmente con
ngulos que oscilan entre 15 y 90). Utiliza como instrumento el nefelmetro (en el que el
detector se ubica con un ngulo que oscila entre 15 y 90 ej. a 90).

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Aspectos prcticos:
Tanto en los reactivos como en el suero pueden existir partculas que produzcan una dispersin
de luz no deseada ej. lipoprotenas, quilomicrones Tambin puede interferir la suciedad.
La intensidad de la luz dispersada aumenta al disminuir la ?. Las protenas suelen tener un pico de
absorcin en el ultravioleta (? < 300nm) y los cromgenos del suero entre 400-425nm; por todo
ello se suele trabajar a ? que oscilen entre 320-380nm y 500-600nm.
Muy frecuentemente, para cuantificar protenas concretas, se utilizan anticuerpos que reaccionan
con dichas protenas de la muestra, en este caso se habla de inmunoturbidimetra e
inmunonefelometra. Para entender estas tcnicas necesitamos tener claro unos conceptos
previos:
- Antgenos (Ag): sustancias, generalmente de gran tamao, capaces de estimular el
sistema inmunolgico de un animal y originar una respuesta dirigida especficamente
contra l.
- Eptopo o determinante antignico: lugar del antgeno que reconoce y se une al
anticuerpo.
- Anticuerpo (Ac): grupo de protenas llamadas inmunoglobulinas, producidas por linfocitos
B y su progenie (clulas plasmticas) que se combinan especficamente con los antgenos.
Cuando se ponen en contacto un Ag y un Ac especfico contra ese antgeno ambos reaccionan y
forman un complejo Ag-Ac. Inicialmente los complejos se forman rpidamente pero, existe una
segunda fase de crecimiento de complejos ms lenta y, es precisamente en sta fase en la que
aparece la dispersin de la luz. As, en la inmunoturbidimetra e inmunonefelometra se mide la
dispersin de la luz provocada por los compeljos Ag-Ac. En ocasiones los Ac se unen a bolitas de
ltex para aumentar el tamao de los complejos (inmunoanlisis potenciados).
FLUOROMETRA
La espectrometra de fluorescencia (tambin llamada fluorometra o espectrofluorimetra) es un
tipo de espectroscopia electromagntica que analiza la fluorescencia de una muestra. Se trata de
utilizar un haz de luz, por lo general luz ultravioleta, que excita los electrones de las molculas de
ciertos compuestos y provoca que emitan luz de una menor energa, generalmente luz visible
(aunque no necesariamente). Una tcnica complementaria es la espectrometra de absorcin.
Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluormetros o fluormetros.

TEORA DE LA FLUORESCENCIA
Las molculas tienen diferentes estados llamados niveles de energa. La espectrometra de
fluorescencia se refiere principalmente a estados vibracionales y electrnicos. En general, las
especies objeto de examen tendrn un estado electrnico basal (un estado de baja energa) de
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inters, y un estado electrnico excitado de mayor energa. Dentro de cada uno de estos estados
electrnicos hay diferentes estados vibracionales.
En la espectroscopia de fluorescencia, primero se excita la muestra mediante la absorcin de un
fotn de luz, desde su estado electrnico basal a uno de los distintos estados vibracionales del
estado electrnico excitado. Las colisiones con otras molculas causan que la molcula excitada
pierda energa vibracional hasta que alcanza el estado vibracional ms bajo del estado electrnico
excitado.

La molcula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibracin del estado electrnico
basal, emitiendo un fotn en el proceso. Como las molculas pueden caer a cualquiera de los
diferentes niveles de vibracin en el estado basal, los fotones emitidos tendrn diferentes energas
y, por lo tanto, frecuencias. As pues, mediante el anlisis de las diferentes frecuencias de luz
emitida por espectrometra de fluorescencia, junto con sus intensidades relativas, se puede
determinar la estructura de los diferentes niveles de vibracin.

En un experimento tpico, se miden las diferentes frecuencias de luz fluorescente emitida por una
muestra, manteniendo la luz de excitacin a una longitud de onda constante. A esto se le llama
espectro de emisin. Un espectro de excitacin se mide mediante el registro de una serie de
espectros de emisin utilizando luz de diferentes longitudes de onda.







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INSTRUMENTOS
En la espectrometra de fluorescencia se utilizan dos tipos generales de instrumentos:

* Fluormetros de filtro. Utilizan filtros para aislar la luz incidente y la luz fluorescente.
* Espectrofluormetros. Usan monocromadores de retculo de difraccin para aislar la luz
incidente y la luz fluorescente.
Ambos tipos de instrumentos utilizan el siguiente esquema. La luz de una fuente de excitacin
pasa a travs de un filtro o monocromador, e incide sobre la muestra. Una parte de la luz incidente
es absorbida por la muestra, y algunas de las molculas de la muestra producen una fluorescencia.
La luz fluorescente es emitida en todas las direcciones. Parte de esta luz fluorescente pasa a travs
de un segundo filtro o monocromador y llega a un detector, el cual muy a menudo se encuentra a
90 con respecto al haz de luz incidente para minimizar el riesgo de que la luz incidente reflejada o
transmitida llegue al detector.
Diversas fuentes de luz pueden ser utilizadas como fuentes de excitacin, incluyendo el lser,
fotodiodos y lmparas; arcos de xenn y lmparas de vapor de mercurio. Un lser slo emite luz
de alta irradiancia en un intervalo muy estrecho de longitudes de onda, por lo general a 0,01 nm,
lo que hace innecesario el monocromador de excitacin o el filtro. La desventaja de este mtodo
es que la longitud de onda de un lser no se puede cambiar mucho. Una lmpara de vapor de
mercurio es una lmpara lineal, lo que significa que emite luz cerca del pico de longitudes de onda.
Por el contrario, un arco de xenn tiene un espectro de emisin continuo con intensidad casi
constante en el rango de 300-800 nm, y una irradiancia suficiente para las mediciones hasta justo
por encima de 200 nm.
En los fluormetros pueden usarse filtros y/o monocromadores. Un monocromador transmite luz
de una longitud de onda y tolerancia ajustables. El tipo ms comn de monocromador utiliza un
retculo de difraccin; es decir, la luz colimada entra en una rejilla y sale con un ngulo diferente
dependiendo de la longitud de onda. El monocromador puede entonces seleccionar qu
longitudes de onda transmite. Para permitir mediciones de anisotropa se aaden dos filtros de
polarizacin: uno despus del monocromador de excitacin o filtro, y otro antes del
monocromador de emisin o filtro.
Como se mencion antes, la fluorescencia se mide ms a menudo en un ngulo de 90 en relacin
a la luz de excitacin. Esta geometra se utiliza en lugar de colocar el sensor en la lnea de la luz de
excitacin en un ngulo de 180 a fin de evitar la interferencia de la luz de excitacin transmitida.
El monocromador no es perfecto y transmitir la luz con otras longitudes de onda diferentes a las
establecidas. Un monocromador ideal slo transmite luz en el rango especificado y tiene una
transmisin independiente de la longitud de onda. Al medir en un ngulo de 90, slo la luz
dispersa por la muestra provoca luz. Esto se traduce en una mejor relacin seal-ruido, y reduce el
lmite de deteccin a un factor de aproximadamente 10000, si se compara con la geometra de
180. Por otra parte, la fluorescencia tambin puede ser medida desde la parte delantera,
procedimiento que se utiliza a menudo para las muestras turbias.
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El detector puede ser de un solo canal o de mltiples canales. El detector de un nico canal slo
puede detectar la intensidad de una longitud de onda en cada momento, mientras que el de
mltiples canales detecta la intensidad en todas las longitudes de onda simultneamente, con lo
que el monocromador de emisin o filtro es innecesario. Los diferentes tipos de detectores tienen
sus ventajas y desventajas.
El fluormetro ms verstil, con monocromadores dobles y una fuente de luz de excitacin
continua, puede registrar tanto un espectro de excitacin como un espectro de fluorescencia. Al
medir los espectros de fluorescencia, la longitud de onda de la luz de excitacin se mantiene
constante, de preferencia en una longitud de onda de alta absorcin, y el monocromador de
emisin escanea el espectro. Para medir los espectros de excitacin, la longitud de onda que pasa
a travs del filtro o monocromador de emisin se mantiene constante y el monocromador de
excitacin va escaneando. El espectro de excitacin generalmente es idntico al espectro de
absorcin, ya que la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la absorcin.
ANLISIS DE LOS DATOS

A bajas concentraciones, la intensidad de fluorescencia es, por lo general, proporcional a la
concentracin del fluorforo.
A diferencia de la espectrometra visible o ultravioleta 'estndar', los espectros independientes del
dispositivo no son fciles de alcanzar. Son varios los factores que influyen y distorsionan los
espectros, y son necesarias correcciones para lograr el espectro 'verdadero', es decir,
independiente de la mquina.
Los distintos tipos de distorsiones se pueden clasificar en relacin al instrumento o a la muestra.
En primer lugar, veamos las distorsiones derivadas del instrumento. Como punto de partida, la
intensidad de las fuentes de luz y las caractersticas de la longitud de onda varan con el tiempo
durante cada experimento. Por otra parte, ninguna lmpara tiene una intensidad constante en
todas las frecuencias. Para corregir esto, se puede aplicar un haz separador despus del filtro o
monocromador de excitacin, para dirigir una porcin de luz a un detector de referencia.

Adems, debe tenerse en cuenta el rendimiento de transmisin de los monocromadores y los
filtros, ya que tambin puede cambiar con el tiempo. La eficacia de la transmisin del
monocromador vara dependiendo de la longitud de onda. Esta es la razn por la que debe
colocarse un detector de referencia despus del filtro o monocromador de excitacin. El
porcentaje de fluorescencia recogido por el detector tambin depende del sistema. Por otra parte,
la eficiencia cuntica del detector, es decir, el porcentaje de fotones detectados, vara entre los
diferentes detectores, segn la longitud de onda y el tiempo.

La correccin de todos estos factores instrumentales para conseguir un "estndar" del espectro es
un proceso tedioso, que slo se aplica en la prctica cuando es estrictamente necesario. Es el caso
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de las mediciones de rendimiento cuntico o cuando se encuentra la longitud de onda con la
mayor intensidad de emisin, por ejemplo.
Como se mencion anteriormente, tambin surgen distorsiones de la muestra. Por lo tanto,
algunos aspectos de la muestra deben tenerse en cuenta tambin. En primer lugar, la
fotodescomposicin puede disminuir la intensidad de fluorescencia con el tiempo. La dispersin
de la luz tambin debe tenerse en cuenta. Los tipos ms importantes de dispersin en este
contexto son la dispersin de Rayleigh y la de Raman. La luz dispersa por dispersin de Rayleigh
tiene la misma longitud de onda que la luz incidente, mientras que en la dispersin Raman la luz
cambia a longitudes de onda ms largas. La dispersin de Raman es el resultado de un estado
electrnico virtual inducido por la luz de excitacin. A partir de este estado virtual, las molculas
pueden volver a un nivel vibracional distinto del estado basal. En los espectros de fluorescencia
siempre se observa una diferencia de nmero de onda constante en relacin con la excitacin; por
ejemplo, en el agua el pico aparece a un nmero de onda 3600 cm-1 inferior a la luz de excitacin.

Otros aspectos a considerar son los efectos del filtro interior. Estos incluyen la reabsorcin, que
ocurre porque otra molcula o parte de una macromolcula absorbe las longitudes de onda en la
que el fluorforo emite radiacin. Si este es el caso, una parte o la totalidad de los fotones
emitidos por el fluorforo pueden ser absorbidos de nuevo. Otro efecto del filtro interno se
produce a causa de las altas concentraciones de absorcin de las molculas, incluyendo el
fluorforo. El resultado es que la intensidad de excitacin de la luz no es constante a lo largo de la
solucin. Como resultado, slo un pequeo porcentaje de la luz de excitacin llega a los
fluorforos que son visibles para el sistema de deteccin. Los efectos del filtro interior cambian el
espectro y la intensidad de la luz emitida y, por tanto, deben ser considerados al analizar el
espectro de emisin de luz fluorescente.
APLICACIONES
La espectrometra de fluorescencia se utiliza en anlisis bioqumicos, mdicos, qumicos y de
investigacin de compuestos orgnicos. Tambin se ha utilizado para diferenciar los tumores
malignos de piel de los benignos.
La fluorescencia tambin puede utilizarse para reorientar los fotones.

Fluorescencia del triptfano
Este tipo de fluorescencia es una prueba importante que puede ser usada para estimar la
naturaleza del microambiente del triptfano (un aminocido). Cuando se realizan experimentos
con desnaturalizantes, surfactantes u otras molculas anfiflicas, el microambiente del triptfano
puede cambiar. Por ejemplo, si una protena que contiene un nico triptfano en su ncleo
"hidrofbico" se desnaturaliza con el aumento de temperatura, aparece un cambio de color en el
espectro de emisin del rojo. Esto se debe a la exposicin del triptfano a un medio ambiente
acuoso en contraposicin a una protena hidrofbica interior. En contraste, la adicin de un
tensioactivo a una protena que contiene triptfano, que se encuentra expuesto al solvente
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acuoso, causar un cambio al espectro azul de emisin si el triptfano est incrustado en la
vescula o micela de surfactante. Las protenas que carecen de triptfano puede ser enlazadas a un
fluorforo.

A 295 nm, el espectro de emisin del triptfano es dominante sobre la fluorescencia ms dbil de
la tirosina y fenilalanina.

BIBLIOGRAFA
Streitwieser A, Heathcock CH. Qumica Orgnica 3 ed. Ed. Panamericana; 1986.
Harlow E, Land D, eds. Antibodies: A Laboratory Manual. New York:Cold Spring Harbor
Laboratory; 1988.
Moore WT, Eastman RC, eds. Diagnostic Endocrinology. Toronto: BC Decker; 1990.