METABOLISMO

Gua de Laboratorio
ENZIMOLOGIA
PARTE I

Cdigo:
MC-2013-01-
Versin:
03
Pgina:
1 de
Fecha de Emisin: Febrero - 2014 Ttulo: FACULTAD DE SALUD DPTO. DE CIENCIAS FISIOLGICAS
BIIOQUIMICA
Elaborado por:
Profesional: Martha Solrzano
Revisado por:
Dr. Adalberto Snchez
Aprobado por:
Dr. Jos Ma. Satizabal


I. INTRODUCCIN.

Con el nombre de fosfatasas se conocen un gran nmero de enzimas que catalizan la hidrlisis de esteres fosfricos
de alcoholes y fenoles.
Son enzimas abundantes en animales, vegetales y microorganismos.

Los primeros hallazgos de actividad fosfatsica en tejidos de animales y plantas se remontan a 1907 1913. La
posterior demostracin del papel del radical fosfato en el metabolismo de la glucosa y el descubrimiento en 1923, de
la llamada enzima del hueso, importante en el proceso de la calcificacin, hicieron que muchos investigadores se
dedicaran al estudio de las fosfatasas.
Se han sealado cuatro tipos de fosfatasas.


FOSFOMONOESTERASAS: que catalizan la hidrlisis de monoesteres del cido

Fosfrico.

FOSFOESTERASAS: que actan sobre diesteres del mismo cido.

PIROFOSFATASAS: que hidrolizan esteres del cido pirofosfrico y

METAFOSFATASAS: que hidrolizan esteres del cido metafosfrico y
(HPO3)n.

Las fosfomonoesterasas conocidas tambin como ortofosfrico-monoester fosfohidrolasas catalizan la reaccin.


O O


R O P = O + H
2
O Enzima R-OH + H O-P = O

O O-

P- Nitro fenil Fosfato + H
2
O Fosfatasa Alcalina P-Nitro Fenol + H
3
PO
4
Incoloro Enzima Color Amarillo Fsforo inorgnico












Hay dos enzimas isodinmicas: FOSFATASA ALCALINA con pH ptimo prximo a 9.0 y FOSFATASA CIDA con
pH prximo a 5.0. Una y otra se diferencian en el lugar de ubicacin, especificidad de sustrato, activadores,
inhibidores y estabilidad frente al pH. Los niveles de fosfatasas en plasma, habitualmente bajos, tienen valor
diagnstico: Enfermedades de destruccin sea, oclusin de conductos biliares, carcinoma de prstata, etc. La
determinacin de la fosfatasa alcalina permite determinar la contaminacin y controlar la pasteurizacin de la leche.
Todas las clulas en el duodeno exhiben actividad fosfatasa en varios grados de intensidad cuando se prueban por
el procedimiento apropiado. El procedimiento se basa en el sustrato utilizado, el pH en el cual se lleva a cabo la
incubacin y la duracin de la incubacin.

Las enzimas desforiladoras (fosfatasas) de la mucosa intestinal tienen actividad en un ms amplio rango de pH y con
una variedad de sustratos diferentes. La presencia de fosfatasas en el intestino sugiere que stas se secretan con
propsitos digestivos, ya que se necesitan para la desfosforilacin de las diferentes sustancias fosforiladas
presentes en los contenidos intestinales.

La evidencia experimental indica la existencia de enzimas fosfatasa independiente que operan en rangos cidos y
alcalinos respectivamente. De lo anterior, se desprende que las diferentes fosfatasas capaces de defosforilar
diversos sustratos y capaces de operar en varios rangos de acidez, pueden coexistir en la misma localizacin
celular.

UNIDAD INTERNACIONAL: Cantidad de enzima necesaria para transformar un micro mol de sustrato en un minuto
bajo condiciones ptimas de ensayo.


2. OBJETIVOS.
Al terminar la prctica el estudiante estar en capacidad de:
a. Conocer y adquirir experiencia en el manejo de los instrumentos necesarios para la prctica de
espectrofotometra.
b. Utilizar la Ley de Beer Lambert para establecer la concentracin de una muestra realizando una curva de
calibracin de Para- Nitrofenol.

c. Determinar el efecto sobre la actividad enzimtica de la variacin del tiempo, pH,
Temperatura, en la enzima fosfatasa utilizando el sustrato sinttico p-nitro- fenilfosfato.
(PNFP)

PRESENTAR EL DIAGRAMA DE FLUJO A MANO SOBRE LA PRCTICA QUE VA A
REALIZAR (INDIVIDUAL)





















FACULTAD DE SALUD DPTO. DE CIENCIAS FISIOLGICAS
METABOLISMO

PROCEDIMIENTO

3. Curva de calibracin de p-nitrofenol (Utilizando una longitud de onda de 405 nm determine la relacin entre
absorbancia y concentracin y entre transmitancia y concentracin:

Tome 5 tubos de ensayo mrquelos con cinta de enmascarar y agrguele a cada uno las siguientes soluciones:

SOLUCION
TUBO (ml)
Blanco 1 2 3 4 5
Buffer pH 9.6 Barbital 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 Muestra
Problema
Agua 1.5 1.47 1.44 1.41 1.35
PNFP 2.0 mM ------ 0.03 0.06 0.09 0.15
Ex. Enzima FAL 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

Absorbancia 405 nm

Transmitancia


Leer la serie de muestras en el colormetro contra el blanco, anote sus datos en la parte inferior de la tabla.

Ud. Recibir una solucin problema de PNF ( p-nitro fenol ) para que le determine la concentracin a dicha muestra.

Efecto de la temperatura

a) Prepare las siguientes soluciones (Marque los tubos con cinta de enmascar)
b) Realice una preincubacin de cada uno de los tubos por de 3 minutos a las diferentes temperaturas antes de
adicionar la enzima FAL (Fosfatasa alcalina)

SOLUCION
TUBO (ml)
Blanco 1 2 3 4 5
Buffer B . pH 9.6 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
Agua Destilada 2.7 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4
PNFP 2.0 mM ------ 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
Temperatura C

AMBIENTE
4C 30C 37 C 50C 100C
Ex. Enzima FAL 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Absorbancia 405nm


c) Cumplidos los 3 minutos de preincubacin con las diferencia temperaturas y diferencia de tiempo de 1 minuto
entre tubo y tubo agregue 0.1 ml de enzima, deje incubando nuevamente por 3 min., luego saque el tubo del bao
Mara squelo y rpidamente lea la absorbancia







2. Efecto del pH

SOLUCION
TUBO (ml)
Blanco 1 2 3 4 5 6
Buffer 0.3 ml 0.3 PH 3.4 pH 7.0 pH 9.2 pH 9.6 PH 10.4 pH 10.8
2.4
Agua 2.7 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4
PNFP 2.0 mM ------ 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
Enzima FAL 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Absorbancia


a) Prepare las siguientes soluciones (Marque los tubos con cinta de enmascarar)

b) Realice una preincubacin de cada uno de los tubos por de 3 minutos a 37 C antes de adicionar la enzima FAL
(Fosfatasa alcalina)

c) Cumplidos los 3 minutos de preincubacin a 37 C con diferencia de tiempo de 1 minuto entre tubo y tubo
agregue 0.1 ml de enzima, deje incubando nuevamente por 3 min., luego saque el tubo del bao Mara squelo y
rpidamente lea la absorbancia.

Taller

1). Grafica de Absorbancia Vs. Concentracin de p-nitro fenol (PNF)

a). Concentracin de la muestra problema de PNF =
b). Ubique en la grafica la concentracin de su solucin problema del PNF

2. Grafica de A vs Temperatura Optima de la Enzima

c).Cul es la temperatura ptima de la Enzima? ___________

d). Relacione esta temperatura con la temperatura corporal haga una breve explicacin.

3. Grfica de A Vs. pH

e) Cul es el pH ptimo de la fosfatasa alcalina? _______

f) Tiene alguna relacin este pH con el sitio donde se encuentra la enzima. Haga una breve Explicacin.















METABOLISMO

Gua de Laboratorio
ENZIMOLOGIA
PARTE II

Cdigo:
MC-2013-01-
Versin:
02
Pgina:
1 de 1
Fecha de Emisin:
Agosto - 2014
Ttulo: FACULTAD DE SALUD DPTO. DE CIENCIAS FISIOLGICAS
BIIOQUIMICA
Elaborado por:
Profesional: Martha Solrzano
Revisado por:
Dr. Adalberto Snchez
Aprobado por:
Dr. Jos Ma. Satizabal

CINETICA ENZIMATICA DE LA FOSFATASA ALCALINA
Para estudiar la cintica enzimtica se debe determinar el efecto de la concentracin inicial de sustrato sobre la
velocidad inicial de la reaccin, manteniendo la cantidad de enzima constante. La velocidad de una reaccin
enzimtica toma una forma hiperblica en funcin de la concentracin de sustrato. Bajo condiciones de saturacin la
velocidad de la reaccin es mxima (Vmax) y cuanto mayor sea la capacidad cataltica de la enzima ms rpido el
complejo enzima -sustrato se trasformaran en producto y enzima libre.
Las reacciones catalizadas por las enzimas se clasifican de acuerdo a la dependencia de la velocidad de la reaccin
con respect a la concentracin de sustrato en:
Reaccin de orden cero:, a concentraciones elevadas de sustrato, la velocidad de reaccin es prcticamente
constante, tendiendo asintticamente a un valor de velocidad mxima, es decir la velocidad de formacin del
producto es independiente de la concentracin de sustrato.
Reaccin de primer orden: a concentraciones de sustrato bajas, la velocidad de la reaccin aumenta
proporcionalmente con la concentracin de sustrato.
Reaccin de segundo orden: es aquella en la que la velocidad de formacin del producto depende de la
concentracin de dos sustratos (como en una reaccin de ondensacin) o del cuadrado de la concentracin de un
nico sustrato (reaccin de dimerizacin).
La concentracin de sustrato que produce la mitad de la V
max
es denominada Km, puede determinarse
experimentalmente al graficar la Velocidad inicial (Vi) en funcin de la concentracin de sustrato. La Km puede ser
calculada a partir de la Ecuacin de Michaelis -Menten y se expresa como una concentracin molar.
Ecuacin de Michaelis y Menten :

S Km
S V
Vi

max

Frecuentemente se emplean dos transformaciones lineales de la ecuacin para un clculo ms aproximado de los
valores de Km y V
max
. En la representacin de Linerweaver-Burk, o dobles recprocos, los datos cinticos (Vi y [S])
se llevan a una grfica de 1/v vs 1/[S], de tal forma que se obtenga una linea recta cuyo corte en el eje y
corresponde a 1/V
max
, y la interseccin con el eje x corresponde a -1/Km. Una alternativa que se puede utilizar para
hallar la V
max
y Km de una enzima es la Ecuacin de Eadie Hoftsee.





OBJETIVOS GENERAL
Comprender los conceptos bsicos de la cintica enzimtica utilizando un modelo con
fosfatasa alcalina
Objetivos Especficos:
1. Determinar la Km y la V Mx. de la Fosfatasa Alcalina utilizando la ecuacin de
Linerweaver Burk.
2. Identificar el tipo de inhibicin efectuada por el fosfato inorgnico y citrato de sodio sobre la
actividad enzimtica de la fosfatasa alcalina.
3. Evaluar el efecto del Cl
2
Mg sobre la actividad enzimtica de la Fosfatasa Alcalina.

PRESENTAR EL DIAGRAMA DE FLUJO A MANO SOBRE LA PRCTICA QUE VA A
REALIZAR (INDIVIDUAL)


PROCEDIMIENTO

1. EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO.

2. Marque el tubo blanco y los tubos del 1-5 con cinta de enmascarar.
3. Prepare los tubos tal como se indica en la tabla exceptuando la adicin de la enzima.
4. Calibre el equipo con el tubo Blanco a 405 nm.
5. Preincube los tubos a 37 C 5 minutos.
6. Agregue el extracto enzimtico y mezcle por 5 segundos.
7. Incube en bao mara los tubos a 37 C durante 3 minutos y lea inmediatamente la
absorbancia a 405nm.

SOLUCION
TUBO (ml)
Blanco 1 2 3 4 5
Buffer pH 9.6 0.3 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
Agua destilada 2.7 1.35 1.3 1.2 1.1 0.8
pNFP 1 mM ------ 0.05 0.1 0.2 0.30 0.60
Enzima FAL 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Absorbancia

Con los resultados de esta prueba realice una grfica de velocidad Vs. Concentracin de sustrato. Para
calcular la velocidad es necesario conocer la concentracin de producto formado en cada tubo. Esto se
logra extrapolando las absorbancias obtenidas en la grfica de absorbancia vs concentracin de p-
nitro fenol (pNF) dibujada en la prctica de colorimetra. La concentracin de pNF se divide por el
tiempo en minutos y se obtiene la velocidad de la reaccin para cada tubo.

V =

min 3
pNF




Para la calcular la concentracin de sustrato para cada tubo utilice la frmula: V
I
C
I
= V
F
C
F

2. EFECTO DEL FOSFATO SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

Marque el tubo blanco y los tubos del 1-5 con cinta de enmascarar.
1. Prepare los tubos l como se indica en la tabla exceptuando la adicin de la enzima.
2. Calibre el equipo con el Blanco a 405 nm.
3. Pre incube los tubos a 37 C 5 minutos.
4. Agregue el extracto enzimtico y mezcle por 5 segundos.
5. Incube los tubos a 37 C durante 3 minutos y lea inmediatamente la absorbancia a 405nm.

SOLUCION
TUBO (ml)
Blanco 1 2 3 4 5
Buffer B. pH 9.6 0.3 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Agua destilada 2.7 1.5 0.4 0.1 0.3 -
Fosfato 0.1 M ------ - 0.3 0.60 - 0.3
pNFP 1 mM ------ 0.7 0.7 0.7 2.1 2.1
Enzima F.AL 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Absorbancia

4. EFECTO DEL MAGNESIO Y EL CITRATO SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
1. Marque el tubo blanco y los tubos del 1-5 con cinta de enmascarar.
2. Prepare los tubos tal como se indica en la tabla exceptuando la adicin de la enzima.
3. Calibre el equipo con el Blanco a 405 nm.
4. Pre incube los tubos a 37 C 5 minutos.
5. Agregue el extracto enzimtico y mezcle por 5 segundos.
6. Incube los tubos a 37 C durante 3 minutos y lea inmediatamente la absorbancia a 405nm.


SOLUCION
TUBO (ml)
Blanco 1 2 3 4 5
Buffer B. pH 9.6 0.3 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Agua destilada 2.7 1 0.8 0.6 0.7 0.4
p-NFP 1 mM ------ 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9
Cl
2
Mg 0.1M ------ ------- 0.2 0.4 ------ 0.4
Citrato de Sodio
0.2M
------- ------ ----- ------- 0.3 0.2
Enzima FAL 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Absorbancia







1. Con los resultados de esta prueba realice una grfica de velocidad Vs. Concentracin de sustrato. Para
calcular la velocidad es necesario conocer la concentracin de producto formado en cada tubo. Esto se
logra extrapolando las absorbancias obtenidas en la grfica de absorbancia vs concentracin de p-
nitrofenol (pNF) dibujada en la prctica de colorimetra. La concentracin de pNF se divide por el tiempo
en minutos y se obtiene la velocidad de la reaccin para cada tubo.

V =

min 3
pNF


Para la calcular la concentracin de sustrato para cada tubo utilice la frmula: V
I
C
I
= V
F
C
F

2. Calcule la Km y la velocidad mxima para esta Enzima. Anexe sus clculos de manera clara en una
hoja de papel cuadriculado.

Km= Vmax=


3. Explique cmo es la afinidad de la enzima por el pNFP.

4. Con los resultados anteriores explique qu tipo de inhibicin se presenta con la adicin del fosfato.
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

5. Mencione cuntos tipo de Fosfatasas hay en suero y cul es su valor normal?
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________

6. Cul es la especificidad como biomarcador de la Fosfatasa Alcalina para el Diagnostico de
enfermedades:________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
__________________

7. Que efecto tiene el Magnesio sobre la actividad de la Fosfatasa Alcalina. Porque? ________
_________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

8. Que efecto tuvo el Citrato de Sodio sobre la reaccin enzimtica. Porque?_______________
________________________________________________________________________________


















Gua de Laboratorio
TRANSAMINACION
METABOLISMO
Cdigo:
MC-2012-08-21
Versin:
02
Pgina:
1 de 5
Fecha de Emisin:
Febrero - 2014
Ttulo: FACULTAD DE SALUD DPTO. DE CIENCIAS FISIOLGICAS

Elaborado por:
Profesional: Lic. Martha
Solrzano
Revisado por:
Dra. Adalberto Snchez
Aprobado por:
Dr. Jos Ma. Satizabal

1. INTRODUCCION
Las aminotransferasas (o transaminasas) son un conjunto de enzimas del grupo de las transferasas,
pues transfieren grupos amino desde un metabolito a otro, generalmente aminocidos. Estas enzimas
son inducibles, porque su actividad puede aumentarse por la accin de diversas hormonas como la
tiroxina o los glucocorticoides, su reaccin es libremente reversible y su constante de equilibrio est cerca
a la unidad.
La transaminacin es muy importante para:
La sntesis de aminocidos no esenciales.
La degradacin de la mayora de los aminocidos. La transaminacin no es posible con los
aminocidos lisina y treonina.
Intercambio de grupos amino entre molculas que no son aminocidos.
Las transaminasas necesitan de una coenzima llamada piridoxal fosfato (derivado de la piridoxina o
vitamina B6) para ejercer su funcin; acta como transportador del grupo amino entre los sustratos,
alternando su estructura entre la forma aldehdica (piridoxal) y la forma aminada (piridoxamina). El
piridoxal fosfato se une a las transaminasas a travs del amino psilon de un residuo de lisina, y durante
la reaccin es transferido al aminocido con formacin de una base de Schiff, a partir de cuyo compuesto
se producen las modificaciones qumicas que conducen a la transaminacin.
Las principales aminotransferasas son las hepticas como la AST y la ALT, que aumentan en asociacin
a diversas enfermedades. En ocasiones, el tipo especfico de aminatransferasa elevada sugiere el rgano
afectado por su relativa abundancia en l.
Nivel de Transaminasas en sangre
Los niveles de Transaminasas en sangre se utilizan como indicador para detectar posibles patologas en
las funciones del hgado. Las enfermedades hepticas -hepatitis viral, cirrosis- , el hgado graso, el
consumo excesivo de alcohol, quistes o tumores en el hgado u obstruccin graves de la va biliar pueden
provocar un aumento notable de la transaminasa en sangre.
Enfermedades hepticas -hepatitis viral, cirrosis- provocan un aumento notable de la transaminasa
glutmico-pirvico en el plasma sanguneo, mientras que si ocurriese un infarto de miocardio se
producira entonces un incremento ms marcado de la transaminasa glutmico-oxalactico.






Para el anlisis se utiliza la separacin de sustancias por medio de la cromatografa sobre papel.

2. OBJETIVOS.

Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de:

a. Diferenciar las tcnicas utilizadas en bioqumica para la extraccin de una enzima tal como la
transaminasa.
b. Comparar las actividades enzimticas en diferentes condiciones experimentales.
c. Utilizando el mtodo de la cromatografa en papel y capa fina identificar sustratos y productos de la
reaccin enzimtica.

3. REACTIVOS:

a. KH
2
PO
4
.H
2
O. A
b. Na
2
HPO
4
.12H
2
O B
c. Buffer de Fosfato M/100 pH 7.4

d. Buffer de Fosfato M/15 pH 7.4
e. FASE MOVIL: Etanol amoniaco concentrado, agua destilada. Saturar el tanque 12 horas antes
de correr la cromatografa
f. Ninhidrina: 250 mg etanol absoluto, colidina y cido actico glacial.
g. Alanina alfa-cetoglutarato: de alfa-cetoglutarato de sodio NaOH 1 N; de Alanina
h. Alanina-Acido Glutmico:
i. cido Actico


PRESENTAR EL DIAGRAMA DE FLUJO SOBRE LA PRCTICA QUE VA A REALIZAR
(INDIVIDUAL)













4. PROCEDIMIENTO.

a. Preparacin del Extracto enzimtico:

Pese (aproximadamente unos 30 g) de corazn de ternera fresco crtelos en pedacitos pequeos y
colquelos en un homogenizador agregue doble volumen de buffer de fosfato M/100. Homogencese
durante unos 10 minutos, reprtase el homogenizado en dos tubos de centrfuga de 50 ml. Luego
centrifugue por 15 min., decntese las soluciones sobrenadante y descrtese el precipitado.

b. Reaccin de Trasnominacin:

Prepare cinco tubos de ensayo con las siguientes mezclas de soluciones. Adicione siempre de ltimo
el extracto enzimtico.


SOLUCION TUBO (ml)

Temperatura
1 2
100C
3
37C
4 5
37C
Alanina- ceto-
Glutarato
- 1 ml 1 ml 1ml -
Buffer Fosfatos
pH 7.4
2ml 2ml 2ml 2ml 2ml
Agua destilada 1ml - - 1ml 1ml
Alanina-glutmico 1ml - - - -
Glutmico - - - - 1ml
Enzima (Transaminasa) - 1ml 1ml - -

Antes de aadir la enzima al tubo No. 2 pre incube a ebullicin durante 3 min. Agregue la enzima, y
aada 0.5 ml de cido actico 4%. Filtre a un tubo de ensayo y descarte el residuo.
Los tubos 3 y 5 deben ser incubados por 30 minutos en un bao de agua a 35 C. Terminada la
incubacin aada 0.5 ml de cido actico 4% y colquelos en el bao de agua hirviendo por 3 min; luego
fltrelos. El tubo 4 no necesita filtracin.

Ahora efecte la cromatografa de las soluciones de los 5 tubos, utilizando micro pipetas una por cada
tubo evite confundirlas para no contaminar la cromatografa y as obtener buenos resultados.


c. Cromatografa sobre papel de la mezcla de Transaminacin.

En este experimento se utilizar la tcnica ascendente de cromatografa sobre papel. Para ello,
colquese la hoja suministrada de papel filtro para cromatografa sobre la hoja de papel blanco limpio en
que se ha preservado. Coja el papel de filtro slo por el extremo opuesto al que lleva la marca con lpiz y
por medio de las micropipetas aplique lentamente sobre dicha lnea, a distancias de unos 2 cm de
separacin 0.01 ml de cada una de las soluciones de los cinco tubos.

No toque el papel con los dedos ya que estos poseen aminocidos que reaccionarn con la ninhidrina
dejando manchas indeseables despus del revelado.

Djese secar bien las respectivas manchas, que deben poder ser identificadas fcilmente de izquierda a
derecha por el lado del trazado con lpiz, y enrollando el papel de filtro, de modo que las manchas o el
trazado queden hacia afuera, sujtelo por los bordes superiores mediante un clip, manejando siempre el
papel por el extremo opuesto al de las manchas para no contaminarlo. Ahora coloque suavemente el
cilindro de papel en todo el centro del tanque, de modo que el extremo con las manchas quede


sumergido dentro del solvente sin que las manchas queden embebidas en l, y sin que el cilindro quede
en contacto con las paredes de aquel.


CROMATOGRAFIA

Cromatografa de Transaminacion - Fecha

Frente del Solvente___________________










1cm ______ ______ ______ _______ _______ 1cm
1 2 3 4 5


Tape con cuidado el tanque con su tapa y deje desarrollar el cromatograma por dos horas. El desarrollo
de la cromatografa se realiza en la cmara extractora ubicada en el 5-Piso, saque el papel del tanque de
cromatografa mediante las pinzas metlicas y squelo en la estufa. Teniendo en cuenta en abrir puertas
y ventanas para ventilar el laboratorio Una vez seco el papel culguelo en un soporte que lleve una varilla
de vidrio horizontal con el mismo. Solictele entonces al instructor el rociamiento del papel con el reactivo
de ninhidrina mediante el atomizador (evite respirar estos vapores), seque nuevamente en la estufa. Las
manchas color prpura que aparecen despus localizadas sobre la superficie de papel son de los
aminocidos componentes de la respectiva mezcla de reaccin, los cuales pueden ser no slo
identificados debidamente sino tambin valorados mediante procedimientos muy variados.













5. CALCULOS Y RESULTADOS.

Mediante una regla localcense los centros de las manchas en la copia o en el cromatograma original y
mida las distancias que hay del centro de las manchas al punto en que haban sido colocadas sobre la
lnea transversal del papel. Adems mida tambin la distancia que haya entre la lnea y la altura total
alcanzada por el solvente, que es localizable por la mancha que deja a todo lo ancho del borde superior
del papel. La relacin o razn de dichos valores es el Rf caracterstico para el respectivo componente de
la mezcla de Aminocidos en el solvente usado.


6. TALLER

Menciones los aminocidos encontrados con respecto al control estndar, y calcule los Rf de cada uno de
ellos

Rf1 = Rf2 = Rf3 = Rf4 =


a. Escriba las reacciones catalizadas por las transaminasas presentes en el corazn.
b. Cules son las coenzimas y activadores de las reacciones de Transaminacin?
c. Escriba 2 ejemplos de reacciones de Transaminacin no enzimtica.
e. En qu se basa la reaccin utilizada para revelar los cromatogramas?
f. Dos enfermedades que causen la deficiencia de Transaminasas
g. Mencione por lo menos 2 mtodos de identificacin de aminocidos
h. Escriba 2 aplicaciones de uso para el reactivo de Ninhidrina en la clnica.
j. Menciones 2 enfermedades por deficiencia de un aminocido en el metabolismo de aminocidos.
k. El aumento del aminocido glicina en un recin nacido le puede causar?
l. El tratamiento sugerido cual sera?
m. Entregar la prediccin de lo que usted cree que va a dar la reaccin de transaminacin en la
cromatografa