Apoyo Terico a protocolo No. 3.

La Transformacin Bacteriana y su Relevancia en la Biologa Molecular General y

Biotecnologa
.

La transformacin biolgica tiene una historia interesante. En 1928, Frederick Griffith, un mdico de
Londres que trabajaba en un laboratorio de patologa, llev a cabo un experimento que l nunca fue
capaz de interpretar por completo durante su vida. Griffith modific permanentemente (transform)
una cepa no patgena de Diplococcus pneumona en una cepa bacteriana de neumococo
mortalmente patgena. Griffith realiz esta sorprendente modificacin de la patogenicidad de las
bacterias mediante el tratamiento de las bacterias no patgenas con bacterias que haban sido
muertas por accin del calor. En este experimento, las cepas de bacterias (no patgenas) que
haban sido puestas en contacto con los restos no vivos de la cepa virulenta, fueron capaces de
matar a ratones inyectados con ellas. Griffith repiti el experimento muchas veces, siempre con los
mismos resultados. l y muchos de sus colegas estaban muy perplejos. Qu estaba sucediendo
que transformaba bacterias no patgenas en asesinos mortales?

Muchos aos despus, ste vendra a ser conocido como el primer caso registrado de
transformacin biolgica llevada a cabo en un laboratorio. Griffith no saba de nada del DNA y
su funcin, pero se dio cuenta que la transformacin se poda heredar. Los experimentos de
Griffith pueden hoy da ser visto como el nacimiento de la manipulacin gentica que
condujeron al desarrollo de la tecnologa del DNA recombinante y biotecnologa, con las
perspectivas de poder manipular genes humanos.

Diecisis aos despus del experimento de Griffith, en 1944, un grupo de investigacin del
Rockefeller Institute, dirigido por Oswald T. Avery, public un artculo que se derivaba directamente
de la obra de Griffith. El trabajo de Avery pretenda dilucidar cul era la sustancia responsable de la
modificacin fenotpica de las bacterias de neumona. Avery y sus colaboradores demostraron que la
sustancia es el DNA, y que la transformacin biolgica es producida cuando las clulas incorporan y
expresan el DNA extrao. A pesar de que pasaron muchos aos antes de que el crdito de este
descubrimiento se le atribuyese a Avery, hoy l es universalmente reconocido como el autor
indiscutido del desarrollo de este conocimiento biolgico. A partir del trabajo de Avery y otros,
Douglas Hanahan desarroll la tcnica de transformacin utilizada hoy en da en todos los
laboratorios del mundo.

Cmo se produce la regulacin de la expresin de la arabinosa?
Los organismos regulan la expresin de sus genes y, finalmente, las cantidades y tipos de protenas
presentes en sus clulas debido a varias razones, entre ellas la adaptacin al medio. La regulacin
de los genes no slo permite la adaptacin de los seres vivos a las diferentes condiciones
ambientales, sino que tambin evita la sobre expresin de protenas en condiciones no deseadas y
un derroche energtico innecesario que pondra al organismo en una desventaja competitiva.
Los genes implicados en el transporte y degradacin (catabolismo) de los alimentos son buenos
ejemplos de genes altamente regulados. Por ejemplo, el azcar arabinosa es una fuente de energa
y una fuente de carbono para la bacteria E. coli. Esta bacteria producen tres enzimas (protenas)
necesarias para degradar la arabinosa como fuente de alimento. Los genes que codifican estas
enzimas no se expresan cuando la arabinosa est ausente en el medio, pero se expresan cuando la
arabinosa est presente en su entorno.


La regulacin de la expresin de las protenas ocurre a menudo a nivel de la transcripcin del DNA
en ARN. Esta regulacin se lleva a cabo en una secuencia muy especfica en el DNA, llamada
promotor, donde la ARN polimerasa se une al DNA y comienza la transcripcin del gen. El segmento
promotor se encuentra generalmente justo antes de los segmentos de DNA que codifican los genes.
En el esquema a continuacin, el promotor se indica con la letra P (P
BAD
en el caso en la figura). En
bacterias, es frecuente observar que grupos de genes, relacionados metablicamente, se agrupan y
se transcribe en un slo ARN mensajero a partir de un promotor. Estos grupos de genes controlados
por un nico promotor son llamados operones. Los tres genes (araB, araA y araD) que codifican
para las tres enzimas que participan en la degradacin de la arabinosa se encuentran
agrupados en lo que se conoce como el opern arabinosa y donde la RNA polimerasa
transcribe los genes de este opern (ver Figura Regulacin del Operon Arabinosa).




Regulacin del Opern Arabinosa

La expresin de estos tres genes depende de la iniciacin de la transcripcin en un nico promotor,
llamado P
BAD
. La transcripcin de estos tres genes requieren de la presencia simultnea de:

El DNA templado que contiene el promotor PBAD ,del opern arabinosa (que lleva las
secuencias que codifican a los ARN mensajeros para las protenas araB, AraA y araD)
la ARN polimerasa,
la protena araC que une al promotor PBAD,
la azcar arabinosa.

Cuando la arabinosa est presente en el medio ambiente, las bacterias la ocupan como nutriente.
Una vez dentro de la bacteria, la arabinosa interacta directamente con araC, la protena que se une
al DNA en la secuencia promotora. Esta interaccin hace que araC cambie su conformacin.

Este cambio conformacional de araC promueve la unin de la ARN polimerasa en la secuencia
promotora del opern arabinosa y permite la transcripcin del nico ARN que codifica para los tres
genes, araB, AraA y araD.

Cuando las tres enzimas se sintetizan, se degrada la arabinosa. En ausencia de arabinosa, araC
vuelve a su conformacin original y la transcripcin del opern arabinosa se inhibe.

El plsmido pGLO es construido en el laboratorio e incorpora parte de la estructura del opern
arabinosa.

Tanto el promotor PBAD como el gen araC estn presentes. Sin embargo, los genes que codifican
para el catabolismo de arabinosa, araB, araA y araD, han sido sustituidos por el gen que codifica
para la protena fluorescente verde (GFP) (ver Figura Expresin de la protena fluorescente verde en
el plsmido).

Por lo tanto, en la presencia de arabinosa, la protena araC promueve la unin de la ARN
polimerasa al promotor y la transcripcin del ARN que codifica para la protena fluorescente
verde GFP.

Las clulas que expresan esta protena en su citoplasma fluorescente de un color verde brillante, en
la medida que produzcan ms y ms GFP fluorescente. En ausencia de arabinosa, araC no facilita la
unin de la ARN polimerasa y el gen GFP no se transcribe. Cuando la protena GFP no se sintetiza,
las colonias de bacterias presentan el fenotipo silvestre, es decir, colonias de color blanco, sin
fluorescencia.

















Este es un excelente ejemplo del dogma central de la biologa molecular en accin: DNA
ARNPROTEINA FENOTIPO, CARCTER O RASGO GENTICO.




























Electroforesis Denaturante de protenas.
Esta tcnica permite separar las molculas de una mezcla mediante la aplicacin de un campo
elctrico. Las protenas presentan propiedades cido-base que estn determinadas por el nmero y
tipo de sus radicales ionizables, junto con los grupos amino y carboxilo terminal. Las protenas que
han sido modificadas post-traduccionalmente, ya sea mediante glicosilacin, fosforilacin,
sulfonacin, acetilacin etc., poseen cargas adicionales. A un pH diferente al de su punto
isoelctrico, las protenas presentan carga y al ser sometidas a un campo elctrico migran a diferente
velocidad segn esta carga.

Cuando una molcula cualquiera es sometida a un campo elctrico, la velocidad con que migra
depende de dos fuerzas opuestas, una impulsora y otra de resistencia. La primera depende
fundamentalmente de la magnitud del campo elctrico aplicado y de la carga neta de la molcula. En
la segunda influyen, entre otros factores, el tamao y la forma de la molcula y la viscosidad del
medio a travs del cual se mueve.

Al respecto, la velocidad de migracin resulta ser directamente proporcional a la carga neta de la
molcula y al potencial aplicado e inversamente proporcional al tamao de la molcula y a la
viscosidad del medio. En relacin a este ltimo punto, un factor importante en una electroforesis es
el soporte o matriz en el cual est migrando la mezcla de protenas en solucin. La matriz ptima
para electroforesis es aquella que es estable, que disminuye o elimina la conveccin y que no
reacciona qumicamente con la muestra. Se ha utilizado una variedad de matrices o soportes para la
separacin de molculas mediante electroforesis, entre las cuales se encuentran la agarosa y la
poliacrilamida.

EXPRESIN DE LA PROTENA
FLUORESCENTE VERDE EN
EL PLSMIDO pGLO
Poliacrilamida: es un polmero que proviene de la polimerizacin de la acrilamida en conjunto con la
N,N, metilen-bis-acrilamida, que acta como reactivo entrecruzador. Mediante variaciones en las
concentraciones de ambos reactivos se puede lograr distintos tamaos de poros en los geles. Para
iniciar la polimerizacin se adiciona un catalizador que generalmente es una amina cuaternaria,
N,N,N',N'-tetrametil etilen-diamina (TEMED), y el iniciador, persulfato de amonio, que genera
radicales libres de oxgeno.

Los poros del gel son de tamao pequeo, lo cual retarda la migracin de las protenas de gran
tamao, permitiendo separar con gran resolucin aquellas que tengan densidad de carga (razn
entre la carga y la masa de la protena) similares. Como resultado de la electroforesis se obtienen
bandas de las protenas separadas, las cuales se pueden visualizar por tincin u otros medios.

Existen varios sistemas para efectuar electroforesis en geles de poliacrilamida, entre ellos se
pueden mencionar:

i. Electroforesis en condiciones nativas: en estas condiciones las protenas se separan
principalmente de acuerdo a la carga neta que presentan a un pH determinado, a la forma y al
tamao de ellas.

ii. Electroforesis en condiciones denaturantes en geles de poliacrilamida en presencia de
dodecil sulfato de sodio (SDS): en este sistema las protenas se separan segn su tamao.
Para realizar una electroforesis en estas condiciones, las protenas se incuban previamente
en presencia de SDS, que es un detergente aninico que rodea a la protena en solucin,
evitando la formacin de agrupaciones de la protena. El tratamiento de las protenas con
este detergente y con agentes reductores de grupos sulfhidrilos (generalmente -
mercaptoetanol), cambia su forma tridimensional compacta a una de tipo filamentoso. El
SDS se une a las regiones hidrofbicas de las protenas confirindoles una importante carga
negativa, haciendo que la carga intrnseca de la protena no sea significativa. As, se eliminan
las diferencias en cuanto a forma y a carga elctrica y las velocidades de migracin de las
protenas de la mezcla se correlacionan en forma muy precisa con el peso molecular.

Por esto, este mtodo se usa frecuentemente para determinar el peso molecular de las
protenas, por comparacin con la movilidad electrofortica de protenas patrones de peso
molecular conocido.
El tratamiento con SDS permite adems la disociacin de las subunidades de las protenas
oligomricas.

Uso de antibiticos como marcador de seleccin de bacterias que contienen el gen de inters
El plsmido pGLO utilizado en el trabajo prctico contiene el gen de la -lactamasa que le
proporciona a la bacteria que lo posee resistencia al antibitico ampicilina. La protena -lactamasa
es producida y secretada por bacteria que han sido transformadas con el plsmido que contiene el
gen para la -lactamasa. La -lactamasa secretada inactiva a la ampicilina presente en el LB/ agar,
lo que permite el crecimiento bacteriano. Slo las bacterias que contienen el plsmido pGLO pueden
crecer y formar colonias en las placas que contienen ampicilina. Las clulas no transformadas
(aquellas bacterias que no contienen el plsmido) no puede crecer en las placas de seleccin con
ampicilina.





Glosario de algunos trminos usados en este Trabajo Prctico.

Agar
Proporciona una matriz slida para permitir el crecimiento de bacterias. Contiene adems mezclas
de nutrientes con carbohidratos, aminocidos, nucletidos, sales y vitaminas.

Arabinosa
Un hidrato de carbono aislado de plantas, que es normalmente utilizado como nutriente para
bacterias

-lactamasa
La -lactamasa es una protena con actividad enzimtica que proporciona resistencia al antibitico
ampicilina. La protena -lactamasa es producida y secretada por bacterias que han sido
transformadas con un plsmido que contiene el gen de la -lactamasa (por ejemplo el pGLO). La
protena -lactamasa secretada por la bacteria inactiva a la ampicilina presente en el LB/agar, lo que
permite a la bacteria dividirse, crecer y expresar los genes contenidos en el plsmido recientemente
adquirido en la transformacin (en nuestro caso la protena GFP ).

Biotecnologa
Es la manipulacin de los organismos vivos a nivel gentico, para producir productos potencialmente
beneficiosos.

Clonacin o clonamiento
Es el proceso de generar copias idnticas de un individuo. Por ejemplo, cuando a partir de la divisin
de una clula nica se origina una poblacin de clulas, todas las clulas de la poblacin sern
genticamente iguales. Esta poblacin se llama clon o poblacin clonal. El proceso de generacin de
una poblacin clonal se llama "clonacin". Luego de la transformacin de una bacteria con un DNA
plasmidial (pGLO), cada vez que la bacteria se divida, va a producir copias idnticas del plsmido
que son heredadas por las clulas hijas. Se generan por tanto copias idnticas de esta secuencia
especfica de DNA que constituyen una poblacin clonal o clon de molculas de DNA.

Ingeniera Gentica
Consiste en la manipulacin del material gentico de un organismo (DNA) mediante la introduccin o
eliminacin de genes especficos.

Regulacin de la expresin Gnica
La expresin gnica es cuidadosamente regulada en todos los organismos que se conocen para
permitir su adaptacin a las diferentes condiciones ambientales y evitar la sobreproduccin de
protenas no utilizadas en determinadas condiciones fisiolgicas. Los genes implicados en la
degradacin de diferentes fuentes de alimentos son buenos ejemplos de genes altamente regulados.
Por ejemplo, la arabinosa es una azcar simple, que es a la vez una fuente de energa y una fuente
de carbono para las bacterias. Los genes de bacterias que codifican para las enzimas necesarias
para la degradacin de la arabinosa no se expresan cuando la arabinosa no est presente en el
medio ambiente. Sin embargo, cuando la arabinosa se encuentra presente en el medio, estos genes
se activan. Cuando la arabinosa se agota en el medio, los genes se desactivan nuevamente.

Protena fluorescente verde
El gen que codifica para la protena fluorescente verde (GFP) fue aislado originalmente a partir de la
medusa bioluminiscente Aequorea victoria. El gen de la GFP ha sido recientemente clonado. La
conformacin tridimensional nica de la protena GFP permite que emita energa en forma de luz
verde cuando se expone a la luz ultravioleta.

Plsmido o plasmidio
Es una molcula de DNA circular, capaz de replicarse de manera autnoma, que porta adems uno
o varios genes de resistencia a antibiticos y permite expresar secuencias de DNA codificantes para
genes forneos (como el GFP).

pGLO
Plsmido que contiene la secuencia codificante para la protena GFP. Adems contiene el gen de
resistencia a ampicilina, -lactamasa.

Tecnologa del DNA recombinante
Consiste en el proceso de cortar y recombinar fragmentos de DNA con la finalidad de aislar genes o
alterar su estructura y funcin.

Deteccin o bsqueda de genes (screening)
Conjunto de tcnicas diseadas para identificacin y aislamiento de genes a partir de una genoteca.

Vector
Molcula de DNA con capacidad de replicarse de manera autnoma, en la que fragmentos de DNA
forneos se insertan y son propagados en una clula hospedante (por ejemplo un plsmido).