Miel

EVALUACION DEL USO DE ANTIBIOTICOS COMO MECANISMO PARA EL
CONTROL DE CONTAMINANTES BACTERIANOS

EN LA FERMENTACIN PARA LA PRODUCCIN
DE ALCOHOL ETLICO
NAYDA MILENA CALDERN PREZ
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar el ttulo de
MICROBILOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Bogot D.C.
Marzo de 2007
NOTA DE ADVERTENCIA
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral
catlica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes
bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.
Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946

DE ALCOHOL ETLICO
APROBADO
ANA LUCA GMEZ SCHOUBEN

Biloga gentica
Directora
JOAQUN QUINTERO GARCA

Ing. Produccin Biotecnolgica
Codirector
BALKYS QUEVEDO HIDALGO

Ing. Qumica
Jurado
IVONNE GUTIERREZ ROJAS

Bacteriloga
Jurado

DE ALCOHOL ETLICO
APROBADO
DRA. ANGELA UMAA MUOZ

Decana Acadmica
DR. LUIS DAVID GMEZ

Director de Carrera
El presente trabajo lo dedico a Dios por permitir que me levantara todos los das con el
mejor nimo y energa para realizar mis actividades, a mis padres y hermano que con su
cario y apoyo me han formado e inculcado los valores de disciplina y respeto, a mi ta
Rosa Mara que siempre insiste en la fortaleza frente al trabajo, a mis amigos que an en
la distancia estuvieron conmigo durante este tiempo, a todos quienes en esta ciudad (CaliValle) me acogieron amablemente y me brindaron su soporte para que esta investigacin
se llevara a cabo con xito.
Mi sincero y especial agradecimiento para SUCROMILES S.A. por permitirme utilizar sus
recursos no slo materiales sino adems los ms importantes y valiosos, sus recursos humanos, al
ingeniero Rubiel Galarza, superintendente de la planta alcoqumica quien permiti y acondicion
las instalaciones donde trabaj y llev a cabo mi investigacin, a mi Directora de proyecto Ana
Luca Gmez, Jefe de Desarrollos Microbiolgicos, quien me apoy incondicionalmente desde el
momento en que present mi propuesta y an dentro de sus mltiples ocupaciones dedic tiempo a
la direccin de mi trabajo, a mi Codirector de proyecto Joaqun Quintero Garca quien fue mi
principal soporte en las aplicaciones a nivel de planta, a Jairo Orozco, Julin Ortz, Ana Mara
Gmez y William Ortz, analistas del laboratorio de calidad alcoqumica por brindarme su amistad
y apoyo en la parte de anlisis qumico y en general a todo el capital humano de esta slida
empresa del sector biotecnolgico para la cul, la microbiologa es una de las bases fundamentales
de su desarrollo.
TABLA DE CONTENIDO
PAG
22
1. Introduccin
2. Marco Terico
24
2.1. Saccharomyces Cerevisiae
24
2.2. Bioqumica de la produccin de alcohol por Saccharomyces Cerevisiae
25
2.3. Parmetros y condiciones en la Fermentacin
30
2.3.1. pH
30
2.3.2. Temperatura
31
2.3.3. Concentracin de azcar
32
2.3.4. Tolerancia a altas concentraciones de alcohol
34
2.3.5. Requerimientos de oxigeno
35
2.4. Rendimiento de alcohol etlico
36
2.4.1. Factores que afectan el rendimiento de alcohol
37
2.4.1.1. Crecimiento celular
37
2.4.1.2. Generacin de alcoholes superiores
38
2.4.1.3. Generacin de cidos orgnicos
39
2.5. Melazas como sustrato de fermentacin
41
2.5.1. Produccin de melaza de caa
41
2.5.2. Pretratamiento a las melazas de caa
42
2.5.3. Manejo de nutrientes en la fermentacin con melaza
43
2.5.4. Ventajas del uso de melazas de caa como sustrato
44
2.6. Contaminacin bacteriana en melaza
44
2.6.1. Fuentes de contaminacin
45
2.6.2. Prdidas de sacarosa
45
2.6.3. Bacterias lcticas como contaminantes
46
2.6.3.1. Metabolismo homofermentativo y heterofermentativo
47
2.6.3.2. Requerimientos nutricionales de bacterias lcticas y subproductos
49
2.7. Tratamientos de contaminacin bacteriana
52
2.7.1. Antibiticos
53
2.7.1.1. Penicilina y virginamicina
54
2.7.1.2. Estreptograminas
55
2.7.3. Otras alternativas
57
3. Formulacin del problema, justificacin y antecedentes
60
3.1. Formulacin del problema
60
3.2. Justificacin
60
3.3. Antecedentes
61
4. Objetivos
63
4.1. Objetivo General
63
4.2. Objetivos Especficos
63
5. Materiales y Mtodos
64
5.1. Ubicacin y diseo de la investigacin
64
5.1.1. Parmetros y variables en la etapa de reproduccin
66
5.1.2. Parmetros y variables en la etapa de fermentacin
66
5.2. Mtodos
67
5.2.1. Pretratamiento del sustrato
67
5.2.2. Tratamiento con antibitico
67
5.2.2.1. Hidratacin de levadura activa seca
67
5.2.2.2. Preparacin del sustrato para la reproduccin
68
5.2.2.3. Determinacin de los niveles de contaminacin
69
5.2.2.4. Determinacin del inculo para la fermentacin
70
5.2.2.5. Preparacin del sustrato para la fermentacin
70
5.2.2.6. Determinacin de rendimiento (%), eficiencia (%) y

productividad (g/L*h) del proceso
5.2.3. Tratamiento con descenso de pH
71
72
5.2.3.1. Diseo Experimental
73
5.3. Recoleccin de la informacin
74
5.4. Anlisis de la informacin
75
10
6. Resultados
76
6.1. Caracterizacin del sustrato
76
6.2. Dilucin de sustrato en etapa de reproduccin
78
6.3. Dilucin de sustrato en etapa de fermentacin
79
6.4. Preparacin y alistamiento de la levadura
80
6.5. Tratamiento con antibiticos en la etapa de reproduccin
81
6.5.1. Reproduccin con melaza
81
6.5.2. Reproduccin con jugo de caa concentrado
83
6.5.3. Fermentacin con melaza
84
6.5.4. Fermentacin con jugo de caa concentrado
87
6.6. Tratamiento con descenso de pH
90
6.6.1. Etapa de reproduccin
90
6.6.2. Etapa de fermentacin
91
7. Anlisis de varianza
94
7.1. ANOVA doble va
94
7.1.1. ANOVA doble va para melaza como sustrato de fermentacin
95
7.1.2. ANOVA doble va para jugo de caa concentrado como sustrato

de fermentacin
97
7.2. ANOVA una va
99
7.2.1. ANOVA una va para tratamiento con pH en melaza como sustrato

de fermentacin
100
7.2.2. ANOVA una va para tratamiento con pH en jugo de caa concentrado

como sustrato de fermentacin
102
7.3. Medidas de Tendencia Central para datos de Productividad
102
8. Discusin de Resultados
103
9. Conclusiones
120
10. Recomendaciones
121
11. Referencias Bibliogrficas
123
12. Anexos
128
11
LISTA DE TABLAS
PAG
Tabla 1. Rendimiento de alcohol a partir de concentraciones de azcar
para una cepa de Saccharomyces aislada de un sustrato especfico
Tabla 2. Composicin tpica de una Miel tipo A
33
42
Tabla 3. Composicin tpica de una Miel tipo B
42
Tabla 4. Composicin tpica de una miel tipo C
42
Tabla 5. Tipos bacterianos segn su metabolismo fermentativo.
49
Tabla 6. Tratamientos con antibitico para la etapa de propagacin con melaza

y jugo de caa concentrado
69
Tabla 7. Tratamiento con descenso de pH para la etapa de propagacin con melaza

y jugo de caa concentrado
73
Tabla 8. Caractersticas fsico-qumicas y microbiolgicas de melaza y

jugo de caa concentrado
76
Tabla 9. Pruebas de identificacin de los microorganismos aislados de los

Sustratos de fermentacin
77
Tabla 10. Caractersticas iniciales de Miel de Tercera dilucin
78
Tabla 11. Caractersticas iniciales de Miel de Segunda dilucin
79
Tabla 12. Crecimiento en medio slido de la levadura hidratada y

recuento en cmara de neubauer
81
Tabla 13. Variables de respuesta etapa de reproduccin con Melaza tratada con
Penicilina (24 horas)
82
Tabla 14. Variables de respuesta etapa de reproduccin con Melaza

tratada con Virginamicina (24 horas)
82
Tabla 15. Variables de respuesta etapa de reproduccin con Jugo de caa

concentrado tratado con Penicilina (24 horas)
90

concentrado tratado con Virginamicina (24 horas)
Tabla 17. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Melaza inoculo
12
90
tratado con Penicilina (30 horas)
85

tratado con Virginamicina (30 horas)
85
Tabla 19. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Jugo de caa

concentrado inculo tratado con Penicilina (30 horas)
87

concentrado inculo tratado con Virginamicina (30 horas)
87
Tabla 21. Variables de respuesta etapa de reproduccin con Melaza bajo

ajuste de pH (24 horas)
90

concentrado bajo tratamiento de ajuste de pH (24 horas)
90

tratado con ajuste de pH (30 horas)
91

concentrado inoculo tratado con ajuste de pH (30 horas)
Tabla 25. Frmulas generales para el anlisis de varianza de dos vas.
91
94
Tabla 26. Datos de rendimiento (%) obtenidos con Melaza como sustrato de
fermentacin
95
Tabla 27. ANOVA doble va (Melaza como sustrato de fermentacin)
96
Tabla 28. Datos de rendimiento (%) obtenidos con Jugo de caa como
sustrato de fermentacin
97
Tabla 29. ANOVA doble va (Jugo de caa como sustrato de fermentacin)
98
Tabla 30. Frmulas generales para anlisis de varianza una va.
99
Tabla 31. Datos de rendimiento (%) obtenidos con Melaza como sustrato de
fermentacin
100
Tabla 32. ANOVA una va Melaza como sustrato de fermentacin
100
Tabla 33. Datos de rendimiento (%) obtenidos con Jugo de caa como
sustrato de fermentacin
101
Tabla 34. ANOVA una va (Jugo de caa como sustrato de fermentacin)
13
102
Tabla 35. Medidas de tendencia central datos de productividad
102
Tabla 36. Caractersticas iniciales de Miel de Tercera dilucin
141
Tabla 37. Caractersticas iniciales de Miel de Segunda dilucin
142
Tabla 38. Variables de respuesta etapa de reproduccin de Melaza tratado

con Penicilina (24 horas)
142
Tabla 39. Variables de respuesta etapa de reproduccin de Melaza

143
Tabla 40. Variables de respuesta etapa de reproduccin de Jugo de caa

concentrado tratado con Penicilina (24 horas)
144

concentrado tratado con Virginamicina (24 horas)
144
Tabla 42. Variables de respuesta etapa de reproduccin de Melaza con

145

concentrado con ajuste de pH (24 horas)
146

147

147

concentrado inoculo tratado con Penicilina (30 horas)
148

concentrado inoculo tratado con Virginamicina (30 horas)
149

tratado con ajuste de pH (30 horas)
149

concentrado inoculo tratado ajuste de pH (30 horas)
14
150
LISTA DE FIGURAS
PAG
Figura 1. Ruta Embden Meyerhof Parnas para la utilizacin de la glucosa.
26
Figura 2. Ciclo del cido ctrico Ciclo de Krebs
28
Figura 3. Conversin de leucina en alcohol isoamlico como ejemplo de la

produccin de alcoholes superiores
38
Figura 4. Fermentacin de glucosa por bacterias cido lcticas.
48
Figura 5. Contaminantes bacterianos tpicos en las destileras.
50
Figura 6. Productos desarrollados por contaminantes bacterianos en la

fermentacin.
51
Figura 7. Esquema de estructuras bacterianas atacadas por diversos antimicrobianos
54
Figura 8. Esquema del proceso de fermentacin por lotes
65
Figura 9a. Colonias en medio MRS a partir de jugo de caa concentrado sin calentamiento
tpicas del gnero Leuconostoc
78
Figura 9b. Colonias puntiformes en medio MRS aisladas en melaza y jugo de caa
tpicas de Lactobacillus
78
Figura 10. Crecimiento positivo en medio slido YM de la cepa de

Saccharomyces cerevisiae
81
Figura 11. Poblacin de BAL (ufc/ml) Vs Concentracin de antibitico (ppm)

en etapa de reproduccin con melaza (24 horas)
82
Figura 12. Poblacin de BAL (ufc/ml) Vs Concentracin de antibitico (ppm)

etapa de reproduccin con jugo de caa concentrado (24 horas)
84
Figura 13. Rendimiento (%) Vs concentracin de antibitico (ppm)

en etapa de fermentacin con melaza (30 horas)
85
Figura 14. Eficiencia (%) Vs Concentracin de antibitico (ppm) en etapa

de fermentacin con melaza (30 horas)
85
Figura 15. Productividad (g/L*h) Vs Concentracin de antibitico (ppm)

en etapa de fermentacin con melaza (30 horas)
15
86
Figura 16. Rendimiento (%) Vs Concentracin de antibitico (ppm)

en etapa de fermentacin con Jugo de caa concentrado (30 horas)
88
Figura 17. Eficiencia (%) Vs Concentracin de antibitico (ppm) en etapa

de fermentacin con jugo de caa concentrado (30 horas)
88
Figura 18. Productividad (g/L*h) Vs Concentracin de antibitico (ppm)

en etapa de fermentacin con jugo de caa (30 horas)
89
Figura 19. Poblacin de BAL (ufc/ml) Vs Tratamiento con pH en etapa

de reproduccin (24 horas)
91
Figura 20. Rendimiento (%) Vs Tratamiento con pH en etapa de fermentacin

con melaza y jugo de caa concentrado
92
Figura 21. Eficiencia (%) Vs Tratamiento con pH en etapa de fermentacin

con melaza y jugo de caa concentrado
92
Figura 22. Productividad (g/L*h) Vs pH del medio en etapa de fermentacin

con melaza y jugo de caa (30 horas)
93
16
ANEXOS
PAG
Anexo 1. Determinacin de la morfologa de la levadura
128
Anexo 2. Recuento en cmara de Neubauer y porcentaje de viabilidad
129
Anexo 3. Determinacin de la concentracin en medio solid de bacterias

acido lcticas
130
Anexo 4. Aislamiento en medio slido YM de levadura hidratada y recuento de levaduras

salvajes
132
Anexo 5. Pruebas adicionales para determinacin de contaminantes bacterianos
134
Anexo 6. Determinacin de acidez voltil en mieles y en vinos
136
Anexo 7. Mtodo de Fehling para determinacin de azucares totales reductores
138
Anexo 8. Determinacin de porcentaje de alcohol en vinos
140
Anexo 9. Registros de parmetros de ensayo etapa de reproduccin
141
Anexo 10. Registro de parmetros de ensayo etapa de fermentacin
147
Anexo 11. Muestra de Calculo para rendimiento, eficiencia y productividad
151
17
RESMEN
Ante el auge en la produccin de alcohol etlico en el pas, se han buscado diversas
alternativas para minimizar las prdidas de azcar fermentable y la contaminacin por
microorganismos durante el proceso de fermentacin alcohlica a partir de las diferentes
mieles de caa obtenidas por los ingenios azucareros, de manera que los compuestos
antimicrobianos han ganado importancia.
El objetivo de esta investigacin fue evaluar el efecto de dos compuestos antimicrobianos
(penicilina y virginamicina) en la fermentacin alcohlica realizada por una cepa comercial de
levadura activa seca de Saccharomyces cerevisiae en un sistema por lotes.
Adems del tratamiento con antibiticos, se evalu la variacin en el pH de los sustratos del
proceso con el fin de determinar si dicha variacin, tiene efecto sobre el rendimiento y
productividad de la fermentacin y conocer si puede constituirse como una alternativa
vlida para ser utilizada en sustratos como melaza y jugo de caa evaluando su incidencia
en la disminucin de los contaminantes tpicos (Bacterias cido lcticas-BAL).
Los antibiticos se evaluaron en las siguientes concentraciones: 0.5, 1.0 y 2.0 ppm. El
sustrato sin adicin del antibitico durante la etapa de propagacin de la levadura fue
utilizado como control.
La variacin del pH en los sustratos fue de 3.0, 3.5 y 4.0 utilizando como control el pH
normal manejado en planta: 4,6.
Para cada tratamiento se realiz la determinacin de rendimiento a partir del alcohol
generado, la eficiencia y la productividad del proceso.
Los resultados de rendimiento promedio se compararon mediante un anlisis de varianza de
doble va (ANOVA) para el caso de los tratamientos con antibitico y mediante anlisis de
18
varianza de una va (ANOVA) para el caso del tratamiento con pH para cada uno de los
sustratos (melaza y jugo de caa). Los anlisis se realizaron con un nivel de significancia de
0.05.
De acuerdo al anlisis estadstico de los datos resultantes de la presente investigacin se
puede decir que en fermentaciones con melaza, si existe diferencia significativa entre los
efectos generados por la adicin de las diferentes dosis de antibitico, sin embargo, no
existe diferencia significativa entre los efectos generados por la utilizacin de los
antibiticos (penicilina y virginamicina) sobre el rendimiento de la fermentacin, lo que
indica que cualquiera de los dos podra usarse y su seleccin podra estar basada en una
evaluacin econmica.
En el caso de la utilizacin de jugo de caa concentrado como sustrato de fermentacin, el
anlisis de varianza demuestra que no existe diferencia significativa entre los efectos
generados por el uso de diferentes dosis, pero si existe diferencia significativa entre los
efectos generados por el uso de los dos compuestos antibiticos (penicilina y
virginamicina) sobre el rendimiento de la fermentacin. Los resultados indican que
utilizando virginamicina a una concentracin entre 1.0ppm y 2.0ppm puede beneficiarse el
proceso de fermentacin.
La alternativa de utilizar un descenso de pH para controlar las poblaciones de bacterias
lcticas, especialmente del gnero Lactobacillus, no constituye un beneficio importante en el
proceso pues afecta la poblacin y viabilidad de la levadura que inciden en el
rendimiento y productividad del proceso especialmente cuando se utiliza melaza como
sustrato de fermentacin.
19
ABSTRACT
In view of the booming production of ethyl alcohol in the country, different alternatives
have been sought to minimize the losses of fermentable sugar, and the contamination by
microorganisms during the alcohol fermentation process, using the different cane syrups
obtained by the sugar mills, so that the antimicrobial compounds have become important.
The object of this investigation was to evaluate the effect of teo antimicrobial compounds
(penicillin and virginamicine) on the alcohol fermentation carried out by a commercial dry active
yeast satrain of Saccharomyces cerevisiae in a batch system.
In addition to the treatment with antibiotics, the variation in the pH of the process substrates was
evaluated, in order to determine if said variation affects the yield and productivity of the
fermentation, and to determine if it can be considered as a valid alternative to be used in substrates
such as molasses and cane juice, by evaluation its influence on the decrease of the typical
contaminants (Lactic Acid Bacteria-BAL).
The antibiotics were evaluated in the following concentrations: 0.5, 1.0 and 2.0 ppm. The
substrate without the addition of the antibiotic during the yeast propagation stage was used as the
control.
The variations of the pH in the substrates were 3.0, 3.5 and 4.0, with the Ph normally used in the
plant as the control (4.6).
For each treatment, the determination of yield, the efficiency and the productivity of the
process was carried out, based on the alcohol generated.
The results of the average yield were compared by means of an analysis of the double way
variance (ANOVA), in the case of the treatments with antibiotics; and by means of the
20
analysis of single way variance (ANOVA), in the case of the treatments with pH, for each one
of the substrates (molasses and cane juice). The analyses were carried out with a
significance level of 0.05.
According to the statistical analysis of data resulting from this investigation, it can be
concluded that in fermentations with molasses, there is a significant difference among the
effects generated by the addition of the different doses of the antibiotic. However, there is no
significant difference between the effects generated by the use of the two antibiotics
(penicillin and virginamicine) on the fermentation yield, which indicates that either one
could be used, and that its selection would be based on economic criteria.
In the case of using concentrated cane juice as the fermentation substrate, the variance
analysis demonstrates that there is no significant difference among the effects generated by the
use of the different doses, but that there is a significant difference between the effects
generated by the use of the two antibiotic compounds (penicillin and virginamicine) on the
fermentation yield. The results indicate that the use of virginamicine at a concentration
between 1.0ppm and 2.0ppm can benefit the fermentation process.
The alternative of using a decrease in the pH to control the lactic bacteria populations,
especially of the genus Lactobacillus, does not bring an important benefit to the process,
because it affects the population and the viability of the yeast, that influence the yield and
productivity of the process, especially when molasses is used as the fermentation substrate.
21
1. INTRODUCCION
La produccin de alcohol etlico es uno de los procesos biotecnolgicos que ha tomado
gran importancia en el pas, no slo por su valor econmico como producto final y de
acuerdo a la ley 693 de 2001 como alcohol carburante, sino como sustrato para la obtencin
de otros compuestos qumicos. Este alcohol, por ser obtenido a partir de uno de los
subproductos de la industria azucarera (principal industria en el Valle del Cauca),
constituye la base de la industria sucroqumica y la integracin de procesos qumicos y
biolgicos complejos.
El proceso de obtencin de este alcohol se puede realizar a partir de diversos sustratos
azucarados, sin embargo, gracias a su ubicacin geogrfica, SUCROMILES S.A. utiliza
como sustrato las mieles y melazas de caa suministradas por los ingenios azucareros del
Valle, a partir de ellas puede llevarse a cabo la propagacin del microorganismo
fermentador (Saccharomyces cerevisiae) y por consiguiente lograrse la obtencin final de
un vino con un porcentaje de alcohol considerable, el cul es separado tras procesos de
destilacin.
Durante el proceso de fermentacin es necesario controlar todos los factores que pueden
afectar el rendimiento final. Cada etapa, reproduccin y fermentacin, debe ser controlada.
Las condiciones requeridas por el microorganismo fermentador (pH, temperatura, niveles
de oxgeno, concentracin de azcar, etc) deben ser suplidas para que puedan obtenerse
buenos resultados.
A pesar que este microorganismo no es tan exigente metablicamente, existen factores que
lo pueden afectar, tal es el caso de los contaminantes bacterianos, los cuales tienen un
efecto negativo no slo a nivel de competencia por sustrato sino por produccin de
metabolitos indeseables que pueden llegar a afectar la viabilidad de la levadura y por ende
la fermentacin.
22
La alta concentracin de azcares en el sustrato puro genera elevada presin osmtica, y el bajo
contenido de agua son factores que no permiten la multiplicacin de microorganismos de tipo
bacteriano, sin embargo, la carga all presente se activa cuando el sustrato se diluye y el
contenido de agua permite su multiplicacin, de manera que se deben tomar medidas
preventivas y/o de control para que durante la etapa de reproduccin de la levadura no se
aumente de manera dramtica la poblacin bacteriana, la cual podra tener incidencia
negativa en la posterior fermentacin.
El objetivo de este trabajo de investigacin es cuantificar el efecto de diferentes cargas
bacterianas presentes en el inculo, sobre el resultado de la fermentacin en trminos de
porcentaje de alcohol en el vino al final del proceso y determinar si el uso de diversos
antibiticos a diferentes concentraciones y durante la etapa de reproduccin, sirve como
mecanismo de control de dichos contaminantes.
Tambin se pretende conocer la concentracin a la cual debe usarse cada producto
(penicilina y virginamicina) y establecer si estos compuestos afectan positivamente el
rendimiento global del proceso.
Finalmente, se pretende valorar si una variacin en el pH inicial del sustrato puede ser
utilizada como alternativa para el control de estos contaminantes bacterianos (bacterias
acido lcticas-BAL)
23
2. MARCO TERICO
A raz del continuo agotamiento global de los recursos y/o reservas de petrleo y el
consecuente aumento en su precio, la industria biotecnolgica ha encontrado prcticas
alternativas para que a partir de recursos renovables e incluso de subproductos de otras
industrias, pueda producirse alcohol etlico no slo para ser utilizado como combustible sino
para ser utilizado en la industria sucroqumica para la elaboracin de otros compuestos de
inters comercial (Converti et al, 2003).
A partir de este hecho y para lograr la produccin industrial de alcohol etlico a partir de
sustratos azucarados, ha de tenerse un sistema de fermentacin correctamente diseado y
preparado para manejar volmenes importantes de mosto y vino, los sistemas de
fermentacin usados en las destileras pueden dividirse en fermentacin por lotes y
fermentacin continua, en ambos casos, el control de las condiciones del proceso es
importante pues la finalidad es obtener el mximo rendimiento producto/sustrato
(Bellissimi & Ingledew, 2004).
2.1. Saccharomyces cerevisiae
La levadura Saccharomyces cerevisiae es uno de los microorganismos eucariticos mas
estudiados, ya que su uso a nivel industrial es muy variado, no solo a nivel de produccin de
etanol y CO2, sino de otros compuestos voltiles y no voltiles. Pertenece al reino Fungi y es de
tipo unicelular, es una levadura facultativa, es decir, su componente enzimtico y rutas
metablicas utilizadas le permiten habitar tanto en ambientes aerobios como anaerobios
(Jacques et al, 1999).
Su reproduccin puede ser de tipo sexual, asexual o incluso pueden presentar los dos tipos,
sin embargo, la reproduccin asexual por fisin binaria o gemacin es el tipo ms comn y
consiste en la divisin de la clula dando origen a una invaginacin que evoluciona hasta
24
obtenerse dos clulas idnticas con el mismo material gentico, proceso denominado
mitosis (Jacques et al, 1999).
Las clulas de Saccharomyces cerevisiae son generalmente redondeadas u ovaladas y su
tamao oscila entre 2-8 m de dimetro por 3-15 m de longitud segn la etapa de vida y
las caractersticas del medio de cultivo en el que se encuentren (Jacques et al, 1999).
2.2. BIOQUMICA DE LA PRODUCCIN DE ALCOHOL POR Saccharomyces
cerevisiae
La levadura Saccharomyces cerevisiae en su etapa de reproduccin, la cual lleva a cabo en
presencia de oxgeno, utiliza la gluclisis y el ciclo de Krebs como metabolismo oxidativo
para la generacin de energa y biomasa, y en ausencia de oxgeno, siempre y cuando
disponga de las condiciones adecuadas, realiza gluclisis en anaerobiosis y el piruvato
generado tras este proceso se convierte en etanol por accin enzimtica (Mathews et al,
2002).
La gluclisis, ruta por la cual se metabolizan las hexosas (ver figura 1), puede realizarse en
condiciones anaerobias, sin la oxidacin neta de los azcares sustrato as como tambin en
condiciones aerobias. La ruta se selecciona dependiendo de las condiciones y necesidades del
microorganismo (Mathews et al, 2002).
Adems de la gluclisis, dentro de las reacciones aerobias para la degradacin de los
azcares se encuentra el ciclo del cido ctrico ciclo de Krebs, el cual se constituye en la ruta
oxidativa central de la respiracin, pues a travs de ste, se catabolizan todos los
combustibles metablicos (carbohidratos, lpidos y protenas) en los organismos y tejidos
aerobios (Mathews et al, 2002).
Aunque la gluclisis y la respiracin conservan la energa liberada en forma de ATP, en la
gluclisis se genera una energa total mucho menor, es decir que por cada mol de sustrato
25
catabolizado, la gluclisis produce menos energa total que la respiracin completa

(Mathews et al, 2002).
Fuente: The alcohol textbook 3rd edition page 61.
Figura 1. Ruta Embden Meyerof Parnas para la utilizacin de la glucosa.
La reaccin global de gluclisis es la siguiente:

Glucosa + 2ADP + 2Pi + 2NAD+
2 Piruvato + 2ATP + 2NADH + 2H+ + 2H2O
Esta importante va metablica para la degradacin de hexosas es realizada por la levadura tanto
en la etapa de reproduccin como en la etapa de fermentacin para la produccin de etanol a
partir de sustratos azucarados
En condiciones de aireacin (presencia de oxgeno en el medio), despus de la generacin del
piruvato a travs de gluclisis al interior de la mitocondria de la levadura, el
microorganismo inicia su proceso de respiracin, la cual se realiza en tres etapas:
26
1) El piruvato, por accin del complejo piruvato deshidrogenada, es oxidado a Acetil-coA.

2) en el ciclo del cido ctrico, la oxidacin del carbono produce CO 2, transportadores
electrnicos reducidos una pequea cantidad de ATP y
3) los transportadores electrnicos reducidos se reoxidan, aportando energa para la sntesis de
mas ATP (Mathews et al, 2002).
El ciclo del cido ctrico (ver figura 2),
inicia en el momento en el que el piruvato
producido durante la gluclisis, sufre una decarboxilacin y deshidrogenacin mediante el

complejo piruvato deshidrogenada y es convertido en acetil-coA. Una vez este acetil-coA
entra al ciclo, es condensado con oxaloacetato por la accin de la citrato sintasa y se
produce citrato, el cual posteriormente sufre una deshidratacin a isocitrato gracias a la
accin reversible de la enzima aconitasa. Este isocitrato a su vez es oxidado por la isocitrato
deshidrogenada y es producido -cetoglutarato junto con CO2, el primero es
deshidrogenado y decarboxilado a CO2 y succinil co-A, el cual reacciona con ADP y forma ATP
y succinato, que luego es oxidado a fumarato por la succinato deshidrogenasa, con la
intervencin de FAD como cofactor. El fumarato es reversiblemente hidratado a L-malato tras
la accin de la fumarasa. Este nuevo intermediario es oxidado por la malato
deshidrogenasa y con produccin de NADH, regenerando oxaloacetato, el cual inicia un
nuevo ciclo (Nelson & Cox 2001).
El resultado final es producir alrededor de 38 ATPs por cada molcula de glucosa pues tras la
gluclisis slo se producen dos (2) ATPs a partir de una molcula de glucosa. Estas dos vas
metablicas (gluclisis y ciclo de Krebs ciclo de los cidos tricarboxlicos) ocurren al interior
de la clula ms especficamente en las mitocondrias y constituyen lo que se denomina la
respiracin celular de las levaduras durante los procesos fermentativos siempre y cuando las
condiciones de aireacin sean adecuadas y puedan darse las reacciones de oxidacin (Nelson
& Cox 2001).
27
Fuente: Bioqumica Harper 2004

Figura 2. Ciclo del cido ctrico Ciclo de Krebs
Esta es la va completa que sigue la degradacin de azcares bajo condiciones aerobias, es

decir condiciones de oxidacin de los compuestos, para generar la energa necesaria por los
organismos para producir intermediaros orgnicos y la generacin de estructuras celulares y por
ende para su reproduccin en un medio especfico (Mathews et al, 2002).
Por otro lado, en condiciones anaerobias, es decir condiciones de fermentacin, el
metabolismo del piruvato sigue otra va que se denomina va fermentativa, el piruvato tiene
numerosos destinos alternativos en los microorganismos anaerobios y microaeroflicos, en el
caso de las bacterias lcticas, reducen el piruvato a lactato en un solo paso, mientras las
levaduras convierten el piruvato en etanol en una ruta de dos pasos.
28
Esta fermentacin alcohlica comienza con la descarboxilacin no oxidativa del piruvato a

acetaldehdo, catalizada por la piruvato descarboxilasa, esta reaccin va seguida de la
reduccin del acetaldehdo a etanol que depende de NADH, catalizada por la enzima
alcohol deshidrogenada, reaccin expresada de la siguiente manera:
Alcohol deshidrogenasa
NADH + H+
Piruvato descarboxilasa
C3H3O3
Piruvato
C2H4O
CO2
C2H5OH
NAD+
Acetaldehdo
Etanol
Es as como el metabolismo del piruvato producido por gluclisis a partir de las hexosas,
dependiendo de la disponibilidad de oxgeno y de los microorganismos presentes en el
medio, puede tomar dos vas principales:
PIRUVATO
AEROBIOSIS
Ciclo de Krebs
ANAEROBIOSIS
Fermentacin Lctica
Fermentacin alcohlica
Lactato
Reproduccin de levadura
Bacterias lcticas
2.3. PARMETROS Y CONDICIONES EN LA FERMENTACIN
29
Etanol
Levaduras
La produccin de alcohol es un proceso multidisciplinario basado en la qumica,

bioqumica y microbiologa de diversos materiales, el metabolismo del microorganismo
ms estudiado y usado en este campo: Saccharomyces cerevisiae, la tcnica de destilacin
adecuada para separar el etanol de otros compuestos, y en general un sinnmero de
reacciones que originan el proceso y que permiten la obtencin de este valioso producto
Los mejoramientos a nivel de fermentacin han sido motivo de mltiples trabajos de
investigacin y se han hecho pruebas con cepas mutantes, desarrollo de cepas sobre
sustratos ms econmicos, uso de recursos renovables, diseo de reactores ms eficientes,
utilizacin de mejores nutrientes en el medio de cultivo para mejorar el crecimiento y
desarrollo celular, entre otros, todo con el fin de llegar a la optimizacin de los parmetros de
un proceso que conduzca al mximo aprovechamiento de las materias primas y al
mximo rendimiento y productividad (Pramanik, 2003).
Los principales parmetros a controlar en una fermentacin alcohlica son en esencia pH,
Temperatura, Concentracin de azcar, Tolerancia a concentraciones de alcohol producido
y constituyentes del medio de cultivo, as como durante la propagacin es esencial la
inyeccin de aire que permita el crecimiento del microorganismo fermentador (Pramanik,
2003).
2.3.1. pH
El efecto de pH en una fermentacin es realmente importante no slo en relacin con el
desarrollo de la levadura sino con la tasa de fermentacin y con la formacin de
subproductos.
En estudios realizados con cepas aisladas de ponches azucarados, se encontr que la
mxima produccin de alcohol se obtiene a pH 4.25 y la menor a pH 3.7, probablemente
porque este ltimo es demasiado bajo para lograr una activacin eficiente de las enzimas
necesarias para la fermentacin y el intercambio inico al interior de la clula sufre un
30
descontrol tal, que sta, concentra su energa, en regular su sistema y no en fermentar el

azcar presente en el sustrato (Pramanik 2003).
As mismo la inversin de la sacarosa, a sus componentes monomricos, presente en el
sustrato, aumenta a medida que el pH disminuye incidiendo en el tiempo de fermentacin. A
mayor inversin mayor disponibilidad para la levadura y mayor tasa de fermentacin al no
estar stos azucares expuestos a la contaminacin ya sea qumica o microbiolgica, adems,
pHs cercanos al neutro facilitan el desarrollo de flora microbiana contaminante del proceso y
por ende la formacin de subproductos indeseables.
De esta manera se demuestra la importancia del pH y su optimizacin no slo para que la
inversin del azcar sea eficiente sino tambin para un buen desarrollo de la cepa del
microorganismo fermentador y control de la formacin de productos no esperados (Jacques
et al, 1999).
2.3.2. Temperatura
La temperatura constituye un factor primordial tanto en la produccin de biomasa como de
etanol. Usualmente, la fermentacin alcohlica incrementa cuando la temperatura se
encuentra en un rango de 30-35C con una ptima de 32C, dependiendo de la cepa de
levadura utilizada.
El metabolismo aumenta su actividad paralelamente a la temperatura hasta llegar a ser
inhibitoria para la levadura (> a 37C) y este incremento amplifica la probabilidad de
desarrollo de microorganismos contaminantes que perjudican la fermentacin.
Estudios realizados con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae han demostrado que
cuando ocurre un sobrecalentamiento durante la fermentacin para la produccin de
alcohol, la eficiencia es menor debido a la baja de la actividad enzimtica y al estrs que sufre
el microorganismo por afeccin de sus estructuras celulares.
31
En fermentaciones con melazas, la temperatura ptima, a la cual se obtiene el mayor

rendimiento de alcohol a partir del sustrato ha sido 32C.
Esta temperatura es a la cual el microorganismo desarrolla un
mejor metabolismo
fermentativo, sin embargo el incremento en la temperatura es un fenmeno normal pues las

reacciones de fermentacin son exotrmicas (Pramanik, 2003), los mecanismos de control
para este parmetro a nivel de planta son la utilizacin de un serpentn interno en el
fermentador, chaqueta de enfriamiento externo, intercambiador de placas, etc, ste ltimo
es el ms usado en las destileras por su alto grado flexibilidad, fcil limpieza, permite
agitacin en el fermentador y alto coeficiente de transferencia de calor, entre otros (Jacques
et al, 1999).
2.3.3. Concentracin de azcar
La concentracin de sustrato fermentable al exterior de la clula, constituyen un punto
crtico en la actividad del microorganismo y por ende en el rendimiento en sustrato a partir
de l. En el caso de produccin de alcohol a partir de sustratos azucarados que tienen
concentraciones de sacarosa y/o glucosa significativamente altas, han de estandarizarse
dichas concentraciones para lograr una optimizacin del proceso y asegurar la eficiente
utilizacin del sustrato.
Los resultados obtenidos por Pramanik en el ao 2003 en una fermentacin por lotes
usando una cepa de Saccharomyces aislada de un sustrato azucarado muestran que la
concentracin de etanol incrementa cuando se eleva la concentracin de sustrato pero dicho
aumento repercute en el tiempo que toma la fermentacin afectando la productividad.
Tabla 1. Rendimiento de alcohol (%) a partir de concentraciones de azcar para una cepa de
Saccharomyces aislada de un sustrato especfico.
Concentracin de azcar
Rendimiento de alcohol
32
Tiempo de fermentacin
(g/L)
(%)
(horas)
250
43
121
200
47
105
Tomado de Pramanik, 2003.
En ambos casos, el porcentaje de conversin del sustrato fue del 100%, demostrando as
que la concentracin de sustrato, la produccin de alcohol y el tiempo de fermentacin son
directamente proporcionales y dependen de los requerimientos y capacidad de la industria.
A nivel industrial, esto tambin depende de la conservacin de la viabilidad de la levadura,
de la respuesta de la cepa a dichos cambios y de los niveles de contaminacin presentes en
los tanques, pues al aumentar el tiempo, puede posiblemente aumentar igualmente el
nmero de bacterias indeseables y sus subproductos, disminuyndose as el rendimiento de
alcohol y la actividad del microorganismo fermentador (Oliveira et al, 1999).
El efecto inhibitorio por altas concentraciones de azcar en el medio para fermentacin
alcohlica puede manifestarse en la plasmlisis celular y/o en el cese de la actividad
celular, es decir que las levaduras suspenden su metabolismo y como mecanismo de
resistencia dejan de intercambiar materia y energa con el medio, lo cual se traduce en la
interrupcin de la fermentacin y ha de diluirse dicho sustrato para lograr el acoplamiento y readaptacin microbiana para reiniciar el proceso (Pramanik, 2003).
2.3.4. Tolerancia a altas concentraciones de alcohol
El alcohol producido a partir del metabolismo de Saccharomyces cerevisiae puede en
algn momento ser inhibitorio e incluso txico para s misma pues afecta la traslocacin de
iones como Ca2+ y Mg2+, afecta la funcin y estabilidad de enzimas citoplasmticas e
incluso la funcin de los transportadores afectando el reconocimiento del sustrato, sin
embargo la resistencia de algunas cepas a altas concentraciones depende de la composicin
lipdica de su membrana:
33
Fosfolpidos: otorgan flexibilidad a la membrana, los principales son fosfatidilcolina,

fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina y fosfatidilinositol y se componen de cidos grasos
saturados e insaturados de 16 y 18 carbonos.
Esteroles: Aumentan la rigidez de la membrana y disminuyen su permeabilidad; el
principal esterol de membrana es el ergosterol y las levaduras al ser mas ricas en esteroles,
mantienen por ms tiempo su actividad fermentativa (Tomasso 2004).
En cultivo anaerbico, existe una correlacion positiva entre el contenido de esteroles y el
etanol producido y en cultivo aerbico esiste una correlacin negativa entre el contenido de
esteroles y el alcohol producido (Tomasso 2004).
La tolerancia al etanol es dependiente de la habilidad de la clula para exportar el etanol del
interior al medio externo, un proceso que depende de la composicin de la membrana y de su
fluidez, es decir de su contenido lipdico, no obstante otros factores como temperatura afectan
dicha resistencia, por ejemplo, a medida que se incrementa la temperatura, aumenta la
toxicidad del etanol frente a la clula y aquellas levaduras que son ms tolerantes al etanol
tambin lo son a la temperatura (Tomasso 2004).
Las tecnologas actuales permiten manipular el DNA de las levaduras a travs de tcnicas
especializadas como la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), la electroforesis en
campo pulsado (ECP), el estudio del DNA mitocondrial y el anlisis del polimorfismo del
fragmento de restriccin (RLPF) y mediante las cuales se logra un mejoramiento de las
cepas en diversas caractersticas que incluyen la resistencia al etanol en el medio y que le
permiten tolerar a la levadura incluso un 11% de alcohol (Bartra 2002).
Actualmente, en las destileras para produccin de alcohol a partir de melazas ya se usan
cepas seleccionadas, mejoradas y/o adaptadas de diferentes tipos: crema, comprimida,
activa seca o cepas purificadas del mismo proceso, las cuales no slo soportan altas
concentraciones de alcohol, sino que requieren de la presencia del mismo para desarrollarse
34
adecuadamente y fermentar de forma eficiente. Estudios han revelado que la presencia de

este metabolito en el medio en concentraciones alrededor al 1% v/v induce al
microorganismo a convertir rpidamente el cido pirvico a etanol y lograr un balance de
oxidacin y reduccin al interior de la clula (Jacques et al, 1999).
En cuanto al efecto inhibitorio del etanol, la mayora de cepas utilizadas para dicho proceso
soportan en promedio 9,5% v/v de alcohol en el vino, sin embargo, esta concentracin a
nivel de planta slo se obtiene cuando el sustrato es puro, se suministran concentraciones
de azcar controladas, no existe contaminacin bacteriana y el proceso est estandarizado,
de manera que con sustratos de baja pureza difcilmente se alcanzan estas concentraciones
de alcohol, adicional a esto las cepas comercialmente utilizadas son tolerantes, no tienden a
sufrir estrs o inhibicin por metabolito, en este caso por etanol (Bellisimi & Ingledew,
2005).
2.3.5. Requerimientos de oxgeno
El oxgeno como elemento, es requerido por la levadura para la sntesis de esteroles y
cidos grasos insaturados, componentes esenciales de sus membranas celulares, que le
permiten en algunos casos soportar factores de estrs como temperatura, concentraciones de
alcohol, sales, cidos, azucares, etc.
Saccharomyces cerevisiae logra propagarse ms eficientemente en condiciones aerbicas pues
la rata de crecimiento aumenta considerablemente siempre y cuando los nutrientes y el sustrato
azucarado sea moderado pero suficiente (aproximadamente 6-8% m/v azcar), es decir, que
cuando el oxigeno se reduce y los niveles de glucosa aumentan se produce etanol, de
manera que las condiciones para propagacin han de ser controladas y dirigidas estrictamente
al aumento de biomasa necesaria para la posterior fermentacin de concentraciones
superiores de azcar (Oliveira et al, 1999).
2.4. RENDIMIENTO DE ALCOHOL ETILICO
35
Diferentes variables son utilizadas para medir el resultado de una fermentacin:

A) Rendimiento (real), entendido como la cantidad de producto generado a partir de un
sustrato determinado.
La frmula para hallar el rendimiento de un proceso consiste en:
Moles o Gramos del producto
Moles o Gramos del sustrato
* 100
B) Eficiencia, relaciona el rendimiento real con el rendimiento terico y se expresa:

Rendimiento real
Rendimiento terico
* 100
Donde el rendimiento terico es el obtenido estequiomtricamente segn la ecuacin:

Glucosa (C6H12O6)
+ levadura
100g
2CO2 + Etanol ( 2C2H5OH) + calor

48,89g
+ levadura
51,11g
Sin embargo, segn Pasteur, slo puede lograrse un mximo de 95% del rendimiento terico,
es decir que a partir del azcar reductor que ingresa al proceso slo el 95% mximo, ha de
ser convertido a alcohol por parte de la levadura.
El 5% restante es empleado para
crecimiento celular, produccin de otros metabolitos como cidos orgnicos, consumo por
parte de la contaminacin bacteriana, conversin en productos infermentables, entre otros
C) Productividad, indica la relacin entre la masa de producto generado en cierto volumen de
fermentacin en un tiempo determinado:
Productividad
g de producto
Volumen(L) * Tiempo de fermentacin (h)
2.4.1. FACTORES QUE AFECTAN EL RENDIMIENTO DE ALCOHOL
36
Un gran nmero de factores pueden reducir el rendimiento de alcohol
y disminuir la
productividad de la planta. Estos factores deben ser controlados para minimizar las perdidas de
sustrato y maximizar las ganancias en trminos de producto.
2.4.1.1. Crecimiento Celular
Cuando la levadura se somete a un medio favorable de oxgeno, temperatura y pH, sta
puede crecer hasta agotar el sustrato y producir una cantidad excesiva de biomasa as como
de metabolitos que terminaran por cesar el proceso. En condiciones anaerbicas el
crecimiento de Saccharomyces cerevisiae esta seriamente relacionado con la produccin de
etanol, durante la fermentacin se espera que slo una mnima parte del sustrato (mximo
5%) sea utilizado para la produccin de la biomasa suficiente para iniciar la fermentacin.
Por esta razn es importante tomar el inculo en la fase exponencial o fase de crecimiento
mxima para garantizar una eficiente tasa de conversin del azcar en alcohol y, si se
proporcionan condiciones favorables para el crecimiento celular, la fuente de carbono ser
el recurso para crecimiento y no estar disponible para producir etanol.
Sin embargo, el alcohol no se produce si no existe un significante nmero de clulas y si no se
garantizan las condiciones mnimas para su estabilidad, es decir para que permanezcan
metablicamente activas durante el tiempo de fermentacin (Acevedo et al, 2003).
2.4.1.2. Generacin de alcoholes superiores
Alcoholes superiores o tambin denominados aceites fussel son el n-propanol, alcohol
amlico, alcohol isoamlico, isobutanol y feniletil alcohol, estos productos son elaborados
por va anablica a partir de alfa-cetocidos por va catablica directamente a partir de
algunos aminocidos. Un aminocido especfico es transaminado a su correspondiente alfacetocido y ste a su vez es decarboxilado formando un aldehdo el cual es reducido a
alcohol por una deshidrogenasa, dichas reacciones son influenciadas por bajos niveles de
nitrgeno disponible y puede controlarse supliendo las necesidades de nitrgeno en el
medio.
37
Estos alcoholes superiores se producen en altas tasas en sistemas de fermentacin por lotes
dependendiendo de la cepa de levadura, de altas temperaturas en la fermentacin, aireacin
y agitacin y lo ms importante, una baja disponibilidad de fuentes de Nitrgeno (Titica et
al, 2000).
Fuente: The alcohol textbook 3rd edition page 64.

Figura 3. Conversin de leucina en alcohol isoamlico como ejemplo de la produccin de alcoholes superiores
2.4.1.3. Generacin de cidos Orgnicos

El cido succnico, as como el cido pirvico, mlico, oxaloactico, propinico, lctico y
actico, entre otros, se producen durante la fermentacin de alcohol. Algunos de ellos se
generan debido a limitaciones durante el ciclo del cido ctrico y son productos indeseables pues
pueden afectar la calidad organolptica del producto.
Las bacterias contaminantes del proceso son las responsables directas de la produccin y/o
incremento del cido lctico y actico en las fermentaciones alcohlicas (Jacques et al,
1999).
Estos cidos, pueden inhibir el crecimiento de la levadura y existen estudios que sugieren
que a concentraciones superiores a 0.8% y 0.05% de lctico y actico respectivamente
pueden afectar de forma letal el desarrollo celular. Dichos niveles de cido lctico suelen
ser producidos por bacterias fermentadoras de carbohidratos que han sido aisladas en
diversas plantas productoras, que tienen su origen en los molinos de caa y otras fuentes de
sustratos azucarados y constituyen el principal grupo contaminante en la fermentacin de
alcohol. Son importantes no slo por la produccin de estos metabolitos sino por su
significante capacidad para tolerar concentraciones de etanol. (Acevedo et al, 2003).
La presencia de estos contaminantes constituye igualmente la razn principal de la
disminucin del crecimiento y viabilidad celular de la levadura pues se genera una gran
competencia entre los dos grupos microbianos por los factores de crecimiento en el medio de
fermentacin (Jacques et al, 1999).
Uno de los sustratos que por su origen y tratamiento presenta mayores problemas de
contaminacin por bacterias acido lcticas son las melazas de caa que se constituye como
el sustrato ms utilizado a nivel mundial para la produccin de alcohol (Koizumi 2005).
De esta manera, el concepto de acidez voltil constituye uno de los factores a controlar
durante la fermentacin alcohlica pues tiene incidencia en la calidad organolptica del
alcohol y su excesiva concentracin en una fermentacin alcohlica inhibe el desarrollo del
microorganismo fermentador.
La concentracin de cidos voltiles producidos est alrededor de
0.25- 0.50 g/L y
superiores dependiendo de las condiciones de fermentacin y en algunos casos incluso

pueden llegar a 1.5g/L (Bely et al, 2003).
Muchos autores han estudiado el origen de la acidez voltil a partir de la misma
Saccharomyces cerevisiae bajo ciertas condiciones de fermentacin y han encontrado que
39
esta acidez, adems de tener un impacto sobre las condiciones fisiolgicas, es generada al
inicio del crecimiento celular y es dependiente de la expresin de ciertos genes de la cepa de
levadura (Bellisimi & Ingledew, 2005).
Sin embargo, poco se conoce acerca del control de esta produccin bajo condiciones de
azcar alto en una fermentacin, probablemente la adicin de fuente de nitrgeno sea una
forma de controlar dicha produccin y en el caso de mostos de uvas, sta acidez debe ser
controlada eficazmente porque adems de deteriorar la materia prima y el producto, inhibe
considerablemente el desarrollo de la levadura.
La acidez voltil puede cuantificarse mediante mtodo rpido por cromatografa lquida de alta
resolucin (HPLC) mediante destilacin, el primer mtodo utiliza una fase mvil de cido
sulfrico y cuantifica de manera exacta los miligramos de cada cido voltil presente en la
muestra analizada, por su parte, el segundo mtodo involucra un proceso ms lento y permite
una cuantificacin de la acidez voltil total (sin separar los diferentes tipos de cidos
orgnicos) (Bellisimi & Ingledew, 2005).
2.5. MELAZAS COMO SUSTRATO DE FERMENTACION

Las melazas de caa son el principal subproducto de la industria azucarera y son la fuente de
azucares fermentables sin pretratamientos complejos, el azcar en estas materias primas se
encuentra como sacarosa, un disacrido que en contacto con agua se hidroliza y genera
molculas libres de glucosa y fructosa, cuya inversin se constituye en el sustrato listo para
iniciar la fermentacin. (Jacques et al, 1999).
2.5.1. Produccin de melazas de caa
Durante la produccin de azcar en los ingenios azucareros, la caa es exprimida en un
molino para obtener un jugo primario, este jugo es calentado y clarificado por filtracin y
40
adicin de cal para remover las fibras y el lodo, luego este jugo se evapora para concentrar el
azcar y ocasionar su cristalizacin.
El jugo que contiene los cristales de azcar es posteriormente centrifugado para separar los
cristales formados y el residuo de jugo es lo que se denomina Melaza tipo A, sta melaza es
evaporada y centrifugada nuevamente para cristalizar otra cantidad importante de azcar y
el jugo que resulta de este proceso se refiere a la melaza tipo B y dicho proceso se repite
nuevamente para lograr ms rendimiento en trminos de cristales de azcar logrando la
produccin de melaza tipo C como residuo (Jacques et al, 1999). Este jugo de caa es
normalmente evaporado y centrifugado mximo tres veces pero el nmero de tratamientos
depende de la eficiencia de los mismos y de la importancia econmica que stos implican.
Las repetidas evaporaciones y centrifugaciones disminuyen el contenido de azcar en las
melazas e incrementan la viscosidad y la concentraciones de sales y otras impurezas, el
resultado es un lquido viscoso, denso y de color caf cuyo contenido de azcar fermentable
depende no slo del contenido inicial de la caa que entr a la molienda sino del tipo de
tratamientos que recibi y no es constante a menos que el proceso de cristalizacin se
encuentre perfectamente estandarizado, sin embargo existen valores aproximados que se
consideran para una melaza tpica dependiendo de los tratamientos a los que fue sometida.
Tabla 2.
Composicin tpica de una Miel tipo A

CARACTERSTICA
ESPECIFICACIONES
Grados Brx mn
Azucares totales mn (%m/m)
Azucares no fermentables (%m/m)
Slidos directos (%m/m en base hmeda)
68
65
<1.0
2.0
41
Tabla 3.
Composicin tpica de una Miel tipo B
CARACTERSTICA
ESPECIFICACIONES
Grados Brx promedio

Slidos directos (%m/m en base hmeda)
70-75
57
<1.0
2.0 - 3.0
Tabla 4.
Composicin tpica de una Miel tipo C
CARACTERSTICA
ESPECIFICACIONES
Grados Brix mn
Cenizas mx (%m/m)
85
48
<5.0
16
Valores mximos y mnimos segn NTC

1846 (Miel A) y
departamento de calidad Sucromiles S.A. (Miel B).
587 (Miel C), Segn anlisis
2.5.2. Pretratamiento a las melazas de caa

Existen varios posibles tratamientos a las melazas antes de la fermentacin, dirigidos a la
reduccin de compuestos en suspensin, los cuales pueden causar el bloqueo de las
columnas de destilacin. El principal problema es la presencia de componentes de calcio
que se derivan de la
adicin de cal en el proceso de clarificacin del jugo de caa,
generalmente la especificacin para las melazas es no contener ms de 10% m/m de slidos

o metales y cenizas que puedan causar problemas en el escalamiento (Jacques et al, 1999).
Las incrustaciones que suelen formarse en las columnas de destilacin pueden controlarse
mediante acidificacin de melazas diluidas con cido sulfrico, el cual adems de controlar
la contaminacin de tipo bacteriano convierte las sales de calcio en sulfato de calcio,
compuesto insoluble que se sedimenta y puede ser removido de los tanques de
2.5.3. Manejo de nutrientes en la fermentacin con melazas
42
El uso de sustratos impuros como melazas de caa, constituye un medio complejo dado que
contiene microelementos y vitaminas que no deben ser adicionados durante la fermentacin
excepto las fuentes elementales de nitrgeno y fsforo para obtener ptimos resultados,
contrario a otros sustratos que por su pureza deben ser suplementadas con micronutrientes
especiales.
El nitrgeno necesario en la fermentacin puede ser adicionado en forma de urea, sulfato de
amonio, entre otras, teniendo en cuenta que sean de bajo peso molecular pues las levaduras no
generan proteasas para degradar fuentes de nitrgeno orgnicas complejas.
La fuente de nitrgeno ms utilizada es la urea, pues las sales de amonio puede causar
incrustaciones por la formacin de compuestos secundarios y el amonio lquido puede
elevar el pH favoreciendo la contaminacin (Acevedo et al, 2003).
En el caso de la produccin de alcohol para bebidas alcohlicas no se recomienda el uso de urea
pues se ha demostrado que esta conlleva a la formacin de etilcarbamato, compuesto
carcinognico indeseable (Acevedo et al, 2003).
Por su parte, el fsforo es adicionado en forma de fosfato diamnico por su demostrada
facilidad de absorcin por parte de la levadura favoreciendo, al igual que la fuente de
nitrgeno, su desarrollo celular (Acevedo et al, 2003).
En el caso de mieles de caa puras la situacin cambia porque este tipo de componentes se
encuentran en concentraciones bajas por lo tanto deben adicionarse en mayores cantidades
elementos como nitrgeno, fsforo y algunas trazas de elementos como el zinc. (Acevedo
et al, 2003)
Algunas vitaminas necesarias para el buen crecimiento de Saccharomyces cerevisiae como
la biotina, el pantotenato y inositol pueden estar presentes en las melazas o en su defecto
43
podran ser adicionadas lo cual a nivel industrial no es muy rentable, por lo cual se buscan
sustratos con dichas caractersticas nutricionales (Acevedo et al, 2003).
2.5.4. Ventajas del uso de melazas de caa como sustrato
Dentro de las ventajas del usos de melazas como material est la posibilidad de manejo a
travs de tuberas, la capacidad de almacenamiento durante periodos de tiempo
considerables, su viable esterilizacin por inyeccin de vapor, su contenido de vitaminas y
minerales que contribuyen a la nutricin del microorganismo, su bajo precio pues se
constituyen como subproducto de la industria azucarera y permiten altos rendimientos de
alcohol en corto tiempo, todo esto siempre y cuando se suministren las condiciones
necesarias y adecuadas para su aprovechamiento (Mohamed 1996).
2.6. CONTAMINACION BACTERIANA EN MELAZAS

Debido al tratamiento que reciben las melazas durante el proceso de cristalizacin, y por la
naturaleza misma de la caa, este sustrato puede contener varias formas de contaminacin
bacteriana, cuyo metabolismo, en trminos de produccin de cidos orgnicos implica la
disminucin en la actividad de Saccharomyces cerevisiae y por lo tanto la disminucin en el
rendimiento de alcohol a partir del sustrato as como tambin, la generacin de
caractersticas indeseables en el producto final (Ruckle 2005).
2.6.1. Fuentes de Contaminacin
Las melazas de caa por si mismas actan como un reservorio de contaminantes importante
desde el cultivo de la caa, por su contenido de azcar, constituyen en un medio de cultivo
por naturaleza para flora microbiana oportunista, adems, durante su procesamiento y/o
limpiezas poco eficientes conducen al mantenimiento eficiente de microorganismos
indeseables e incluso incontrolables a nivel de la fermentacin alcohlica (Jacques et al,
1999).
44
Igualmente, los residuos de materia prima que se adhieren a las lneas y la recirculacin y/o la
propagacin continua de levadura,
favorecen la contaminacin pues se proporcionan
constantemente las condiciones adecuadas para el crecimiento microbiano, la inoculacin de

bacterias paralelo a la levadura en los fermentadores constituye quizs uno de los ms graves
problemas en las destileras, pues despus que un tipo bacterial logra colonizar un sistema, es
difcilmente removible y controlable, de ah que los mecanismos de prevencin y control deban
tenerse en cuenta de manera constante, principalmente en los sistemas de fermentacin
continuos (Bellissimi & Ingledew, 2004).
2.6.2. Prdidas de Sacarosa
Una vez ocurre el corte de caa y se deterioran las estructuras vegetales externas que sirven de
proteccin, inician las prdidas de sacarosa a causa de altas temperaturas, causas
reacciones qumicas, deficiencias operativas y por supuesto por accin microbiana, ms an en
pocas de lluvia, donde la humedad favorece el desarrollo de microorganismos
indeseables. (Ravelo et al, 1991).
Mltiples estudios han demostrado que la accin microbiana es una de las causas
principales de prdidas de sacarosa en caa de azcar y que el principal microorganismo
causante es Leuconostoc mesenteroides, el cual induce la inversin y descompone la
glucosa en diversos productos como cido actico y/o lctico, los cuales disminuyen el pH
del jugo o miel, adems de producir la enzima dextransacarasa, la cual ocasiona la
polimerizacin de unidades de glucosa producindose la llamada dextrana cuya reaccin se
muestra a continuacin:
C12H22O11 + H2O Invertasa

Sacarosa
Agua
Dextran
(C6H12O6) + (C6H12O6) sacarasa
Fructosa
Glucosa
45
(C6H12O5)X
Dextrana
La dextrana es una sustancia mucilaginosa cuyo efecto perjudicial consiste en la prdida de

azcar fermentable y la generacin de una especie de pelcula superficial al mismo tiempo
aumenta la viscosidad del mosto de fermentacin y su produccin excesiva puede ocasionar
serios taponamientos de lneas y equipos de produccin (Mibielli & Filho 1999).
En cuanto a la accin trmica como tratamiento a los jugos de caa, sta puede eliminar la
mayora de los microorganismos pero ocasiona la descomposicin de la sacarosa para
formar compuestos polimricos y/o coloreados mediante reaccin de maillard que
constituyen los denominados infermentables aminoazcares en jugos y mieles de caa,
perjudiciales en cuanto a rendimiento se trata tanto en produccin de azcar como en
fermentacin para la produccin de alcohol (Mibielli & Filho 1999).
2.6.3. Bacterias lcticas como contaminantes
El grupo de bacterias lcticas est constituido por cocos y bacilos que comparten
propiedades fisiolgicas y bioqumicas y cuyo metabolismo generador de energa es
fermentativo. Los sustratos fermentables son azcares que incluyen variedad de
monosacridos, disacridos y polialcoholes y cuyo producto final principal es el cido
lctico y en algunos casos el nico dependiendo de la ruta metablica que utilicen para
convertir los carbohidratos, de ah que las bacterias lcticas pueden dividirse en dos grupos
segn los productos resultantes de la fermentacin de glucosa (Jacques et al, 1999).
2.6.3.1. Metabolismo Homofermentativo y Heterofermentativo

El grupo de bacterias lcticas denominado homofermentativo produce virtualmente un
nico producto de fermentacin: el cido lctico, mientras el grupo heterofermentativo
produce etanol y CO2 adems de cido lctico. Dicha diferencia est determinada por la
presencia o ausencia de la enzima aldolasa, una de las enzimas claves en la gliclisis.
46
Los microorganismos heterofermentadores, carentes de aldolasa, no pueden descomponer

el difosfato hexosa a fosfato triosa, en lugar de ello, oxidan la glucosa 6-fosfato a 6fosfogluconato y entonces lo dcarboxilan a pentosa fosfato, la cual se transforma en triosa
fosfato y acetilfosfato por medio de la enzima fosfocetolasa (Jacques et al, 1999).
Esta triosa fosfato se convierte finalmente en cido lctico con la produccin neta de 1
ATP, mientras el acetilfosfato acepta electrones del NADH generado durante la produccin de
pentosa fosfato y as se convierte en etanol sin produccin de ATP (Jacques et al, 1999). Debido
a esto, los homofermentadores producen slo un mol de ATP a partir de glucosa a diferencia
de los heterofermentadores que producen dos moles de ATP igualmente a partir de glucosa
Fuente: Modify of carbohydrate metabolism in lactic acid bacteria, 1983.
Figura 4. Fermentacin de glucosa por bacterias cido lcticas.
47
Estas rutas para el metabolismo de carbohidratos llevadas a cabo por las bacterias acido
lcticas pueden igualmente dividir este grupo en tres clases: homofermentativos obligados,
heterfermentativos facultativos y heterofermentativos obligados, las especies de
homofermentativos obligados el nico producto final a partir de hexosas es el cido lctico y la
va glicoltica es la nica utilizada, las especies de este grupo producen la enzima aldolasa
pero no producen la fosfocetolasa, lo cual las inhabilita para fermentar pentosas y gluconato
Las especies de heterofermentativos facultativos poseen las dos enzimas aldolasa y
fosfocetolasa inducible, pues logran fermentar pentosas y gluconato slo bajo ciertas
condiciones pues la ruta de a fosfocetolasa es inhibida en presencia de glucosa. (Jacques et
al, 1999) y finalmente, las especies lcticas heterofermentativas obligadas generan una
mezcla e productos finales bajo condiciones normales usando cualquiera de las vas
metablicas; estos productos finales incluyen cido lctico, cido actico, etanol y CO 2as
como pequeas cantidades de cidos frmico y succnico, estos organismos excepto
algunas cepas especficas, pueden fermentar pentosas y gluconato (Jacques et al, 1999).
Tabla 5.
Tipos bacterianos segn su metabolismo fermentativo.

Tipo
Homofermentativos obligados
Heterofermentativos facultativos
Heterofermentativos obligados
Ejemplos
L. delbrueckii, L. acidophilus, Pediococcus,
Streptococcus.
L.plantarum, L. casei, L. pentosus.
Leuconostoc, L.brevis, L.buchneri, L.
fermentum.
Tomado de: The alcohol textbook.
2.6.3.2. Requerimientos nutricionales de bacterias lcticas y subproductos

Las necesidades nutricionales de las bacterias lcticas son muy similares a las de las
levaduras convirtindose as en sus principales antagonistas por nutrientes esenciales y
factores de crecimiento que algunas veces estn presentes en cantidades limitadas en los
48
sustratos de fermentacin, as como que son capaces de metabolizar las mismas fuentes de
carbono para realizar su tipo de fermentacin (Jacques et al, 1999).
Nitrgeno: varios aminocidos y vitaminas son necesarias para el crecimiento de cido
lcticas, algunas homofermentativas y heterofermentativas poseen enzimas proteasas y
pueden degradar las protenas en formas asimilables de nitrgeno, sin embargo esta
caracterstica no es general y la mayora de ellas toman el nitrgeno necesario del medio de
cultivo en el que se hallen, de manera que en este sentido son fuertemente competitivas
frente a las levaduras en sistemas de fermentacin (Bely et al, 2003).
Oxgeno: las bacterias lcticas se han descrito como anaerobias, sin embargo se ha
demostrado que prefieren ambientes microaeroflicos y pueden sobrevivir en ambientes
donde el oxgeno est completamente ausente, manejando una tasa de crecimiento baja.
Este tipo bacteriano carece de las enzimas catalasa y superoxido dismutasa, las cuales son
usadas por bacterias aerbicas para convertir compuestos txicos: el perxido de hidrgeno
y el superxido respectivamente, ambos formados durante sus procesos respiratorios, sin
embargo L.plantarum y algunas especies de pediococcus pueden sintetizar la catalasa bajo
ciertas condiciones; los iones hierro y manganeso son importantes para la actividad de la
catalasa as como para neutralizar el radical superxido (O-) (Jacques et al, 1999).
Saccharomyces cerevisiae es catalasa positiva y crece adecuadamente bajo condiciones
aerobicas, con el oxigeno como requerimiento principal en los primeros estados de la
fermentacin por lo que constituye en otro ventaja competitiva de las bacterias lcticas bajo
condiciones anaerobias en la fermentacin de la levadura. (Jacques et al, 1999).
49
Fi
gura 5. Contaminantes bacterianos tpicos en las destileras.
Subproductos que pueden afectar la calidad del producto: la produccin de algunos

compuestos por bacterias contaminantes contribuye a la disminucin de la calidad del
producto final de la fermentacin as como el desarrollo mismo del proceso pues el
microorganismo fermentador puede ver afectada su fisiologa por la presencia de sustancias
extraas y/o en altas cantidades (Jacques et al, 1999).
Los cidos lctico y actico son productos que afectan notablemente las caractersticas
organolpticas del producto (etanol), pues se producen a partir de l, as como la acrolena
y el diacetil, una cetona que puede producirse durante la fermentacin cuando el piruvato es
convertido a cido lctico y algunas especies de Pediococcus y Lactobacillus son los
responsables de dicha produccin, no obstante, las levaduras producen diacetil durante los
primeros estados de la fermentacin pero este es removido por la accin de varias enzimas
y por la presencia de algunos aminocidos en el medio (Jacques et al, 1999).
50
Fuente: Alltechs Fifteenth Anual International Alcohol course. Lexington, Kentucky.EEUU, Octubre 16 al 20 de 1995.
Figura 6. Productos desarrollados por contaminantes bacterianos en la fermentacin.
2.7. TRATAMIENTO DE CONTAMINACION BACTERIANA

Los procedimientos de limpieza y sanitizacin para la remocin de contaminacin
bacteriana deben realizarse peridicamente y de acuerdo a las condiciones y necesidades
del proceso. En sistemas de fermentacin por lotes es ms sencillo disminuir niveles de
contaminantes que en un sistema de tipo continuo, en el ltimo se ocasiona un efecto
residual de diversos materiales en los tanques y cualquier sustancia, masa o partcula
contaminada que no se remueva a tiempo, constituye una fuente potencial de
contaminacin que se transmite al sustrato fresco que ingresa al proceso (Koizumi, 2005).
En la actualidad, las destileras utilizan diversos procedimientos para lograr una
disminucin de los efectos de la contaminacin bacteriana y por ende su efecto en el
desarrollo mismo del proceso, dentro de estos procedimientos se encuentra el uso de
sustancias bsicas, hipoclorito de sodio, aminas cuaternarias en el lavado de los tanques y la
51
adicin de agentes antimicrobianos que actan selectivamente sobre las bacterias y no

tienen efecto sobre la levadura (Koizumi 2005).
Las sustancias mas utilizadas en los procesos fermentativos son los antibiticos, que
adicionados en concentraciones adecuadas ayudan al control de los principales
contaminantes en el proceso, sin embargo, la resistencia que generan estos
microorganismos tras la constante exposicin a estos compuestos constituye uno de los
principales motivos de estudio y ha permitido incursionar en la obtencin de otros
compuestos que puedan complementar el tratamiento. En general, se recomienda hacer una
rotacin de los mismos (antibiticos) para evitar la generacin de dicha resistencia
(Koizumi 2005).
2.7.1. Antibiticos
Adems de los factores de control conocidos como la calidad de las materias primas,
pasteurizacin del mosto, higiene en la manipulacin, sanitizacin y buen mantenimiento, los
antibiticos son utilizados como medida complementaria durante la fermentacin de alcohol
(Ruckle, 2005).
Los antibiticos son compuestos naturalmente producidos por algunos microorganismos con
el propsito de inhibir a otros microorganismos, su objetivo en la naturaleza es la
competencia por nutrientes como mecanismo de supervivencia. Son producidos
industrialmente para ser utilizados en el tratamiento de infecciones tanto en humanos como en
animales, as como en procesos industriales donde una contaminacin constituye
prdidas en cuanto a rendimiento se refiere (Alcarde et al, 2003).
52
Los agentes antimicrobianos actan por una serie de mecanismos, muy diferentes entre
ellos y cuyos blancos se encuentran en diferentes regiones de la clula atacada. Las diversas
regiones de ataque antibacteriano se consideran en general:
Pared celular
Membrana celular
Sntesis de protenas
Sntesis de cidos nucleicos (Errecalde, 2004).
En la figura 7 se presentan los tipos ms comunes y sus blancos de accin dentro de la
estructura microbiana.
Fuente: Uso de Antimicrobianos en animales de consumo. Organizacin de las naciones unidas para la agricultura y la alimentacin. Errecalde J. 2004
Figura 7. Esquema de estructuras bacterianas atacadas por diversos antimicrobianos
2.7.1.1. Penicilina y Virginamicina

Dentro de los antibiticos ms utilizados en destileras para controlar la contaminacin por
bacterias lcticas se encuentra la penicilina, producido por algunas especies de Penicillum
como P.notatum y P.chrysogenum, es del tipo Beta-lactmico, su espectro de accin es
contra bacterias Gram positivas y su mecanismo consiste en inhibir la sntesis de la pared
celular limitndose la produccin de nuevas clulas (Kelsall, 1995).
53
Las dosis de adicin de este antibitico dependen de la concentracin inicial de

contaminantes en el proceso y generalmente oscila entre 0.5 y 2.0 ppm (recomendacin del
fabricante), sin embargo, a nivel de planta generalmente se requieren dosis ms altas, esto
debido a que la penicilina no es muy estable y se ve parcialmente inactivado bajo pHs
inferiores a 5.0 (Kelsall, 1995).
La estreptomicina es un antibitico del tipo aminoglucsido producido por especies del
gnero Streptomyces y su mecanismo de accin consiste en la apertura de poros en la pared
celular de bacterias Gram negativas cuyo resultado es la muerte celular en un corto periodo.
Debido a su corto espectro, en las destileras es utilizado con otros antibiticos para
producir un efecto sinrgico; la mezcla ms comn es penicilina/estreptomicina cuyo
sinergismo ha sido demostrado siempre y cuando los valores de pH del medio sean
inferiores a 7.0 (msterdam 1996).
2.7.1.2. Estreptograminas
Constituyen un amplio conjunto de pptidos cclicos con caractersticas muy peculiares
producidas por diversas especies de Streptomyces y cada miembro se conforma por una
combinacin de dos molculas o grupos: A y B, sin relacin estructural alguna, las cuales
corresponden
macrolactonas
poliinsaturadas
hexadepsipptidos
cclicos
respectivamente; de cualquier manera, ambas inhiben la sntesis proteica bacteriana,

actuando sobre el dominio de la peptidil-transferasa de la subunidad ribosomal 50S (Garza
et al, 2000).
Sin lugar a dudas, una de las propiedades ms atractivas de estos compuestos radica en el
hecho de que las molculas de ambos grupos actan de forma sinrgica en contra de los
agentes microbianos; ello origina su accin bactericida y reduce la posibilidad de que
sobrevivan bacterias resistentes que pudieran surgir hacia uno u otro componentes, cuyos
pesos moleculares fluctan alrededor de 500 y 800 Daltons dependiendo del grupo al que
54
pertenezcan. Diversos laboratorios de investigacin han logrado aislar numerosas

estreptograminas, encontrando que en realidad stas corresponden a un grupo poco
homogeneo, de hecho, slo se han obtenido algunas preparaciones comerciales utilizadas
principalmente en agricultura entre las que destacan la pristinamicina y la virginamicina, la
primera producida por Streptomyces pristinaespiralis y la segunda producida por
Streptomyces virginiae (Garza et al, 2000).
Uno de los rasgos de estos compuestos consiste en su baja hidrosolubilidad, sin embargo,
recientemente estudios realizados por Leclerq & Courvalin han permitido sintetizar
derivados hidrosolubles que son comunes comercialmente, su espectro es amplio dado que
su estructura est compuesta por dos grupos de molculas cuyo mecanismo de accin
consiste en la inhibicin de los eventos iniciales de la sntesis proteica en las bacterias
blanco, de manera que esto se traduce en la liberacin de cadenas peptdicas incompletas
que conducen a un bloqueo total de su desarrollo posterior (Crecy et al 1997).
En particular la virginamicina inhibe la peptidil transferasa afectando la sntesis de
protenas de bacterias principalmente Gram positivas aerobias y anaerobias, de manera que se
constituye como uno de los compuestos de inters industrial para el tratamiento de
contaminantes. Su uso fue prohibido en 1999 en Europa por considerarse causante de
algunos trastornos en los animales que consuman alimentos con este antimicrobiano como
promotor de crecimiento, a pesar de ello, en estados unidos an se utiliza en alimentos
suministrados a cerdos (Errecalde 2004).
Varios estudios han monitoreado resistencia frente algunos antibiticos, de bacterias
aisladas del agroecosistema de la caa de azcar en Brasil, por ejemplo se registr
crecimiento del 86% de las bacterias nativas en presencia constante de virginamicina y
crecimiento del 43% en presencia constante de penicilina y seran necesarias
concentraciones muy elevadas para lograr una inhibicin real y teniendo en cuenta que el
uso de estos compuestos debe ser mnimo, no es recomendable su adicin en grandes
55
cantidades como en el caso del uso de vinaza como fertilizante de cultivos, de ah la

bsqueda de compuestos naturales para reemplazar los antibiticos se haya intensificado
(Ruckle, 2005).
2.7.2. Otras Alternativas

A raz de los costos que implica el tratamiento de los contaminantes bacterianos en las
fermentaciones alcohlicas se han buscado nuevas alternativas diferentes al calentamiento
debido a su costo y a las prdidas de azcar que implica, adems, la inquietud en cuanto al
uso de los antibiticos en aplicaciones tcnicas y agrcolas va en aumento ante el
surgimiento de resistencias mltiples a los antibiticos y bacterias patognicas, esto ha
creado una fuerte demanda por alternativas naturales e inocuas pues los coproductos de la
fermentacin, ofrecen una contribucin importante a la eficiencia econmica de las
destileras y los productores de etanol, agregan valor, declarando que sus coproductos son
libres de antibiticos (Koizumi 2005).
Ejemplo de ello es la Unin Europea (UE) donde los productos que se usen para alimento
animal no pueden contener ningn tipo de antibitico; de hecho, a raz de estos cambios en
la legislacin de la UE, en EEUU tambin se est replanteando la utilizacin de antibiticos
en alimentacin animal. Concretamente, a partir del reglamento CE- 2821/98 del Consejo
del 17/12/1998 y del reglamento 2205/01 de la Comisin de l 14/11/2001 se ha prohibido el
uso de Bacitracina de zinc, Espiramicina, Virginamicina y Tilosina (Santom 2003).
Una de estas nuevas alternativas consiste en la utilizacin del lpulo, el cul posee una
propiedad conservante que los cerveceros han reconocido por ms de mil aos, a pesar que
slo en la ltima dcada dichas propiedades han sido propiamente entendidas; la empresa
Betatec HG produce una variedad de compuestos basados en lpulo que han mostrado una
capacidad para controlar el crecimiento de bacterias Gram positivas en varias aplicaciones.
56
Este tipo de productos antibacterianos naturales se obtienen del extracto de lpulo con CO 2
mediante un proceso totalmente acuoso y contienen en esencia, cidos de lpulo y son muy
activos contra una serie de bacterias que se encuentran tpicamente durante la fermentacin
alcohlica como Lactobacillus, una concentracin inhibitoria suficiente del antimicrobiano
lograr impedir la generacin de cido lctico y cido actico y por lo tanto contribuir a
prevenir las prdidas en el rendimiento de etanol (Ruckle, 2005).
Si se adiciona una concentracin bactericida al propagador es posible producir levadura
limpia y como los cidos de lpulo son muy selectivos y pueden eliminar bacterias sin que esto
afecte el rendimiento de la levadura, el resultado es una mejor propagacin de la misma y
por ende una fermentacin ms rpida (Ruckle, 2005).
Los componentes del lpulo que actan como agentes antimicrobianos estn contenidos en la
flor, en glndulas conocidas como lupulinas donde los alfa-cidos son isomerizados
mediante calentamiento a Iso-alfa-cidos, siendo estos ltimos los que realmente poseen
propiedades preservantes que consisten en el bloqueo de las membranas biolgicas de las
bacterias (Ruckle, 2005).
En 1993, W J Simpson, investig sobre la sensibilidad de las bacterias lcticas frente a los
cidos de lpulo, y demostr que stos actan como transportadores mviles de ionforos e
inhiben el crecimiento microbiano por disipacin del gradiente transmembranal de
protones, como consecuencia de esto, la asimilacin de azcar por las clulas bacterianas es
inhibida y por consiguiente a liberacin de sus metabolitos como
cido lctico y/o cido
actico no pueden ser producidos ni liberados al medio (Ruckle 2005).

En las plantas de alcohol carburante la infeccin bacteriana es monitoreada por recuento en
placa y los cidos generados son determinados mediante HPLC y dependiendo del volumen
de fermentacin se evalan las prdidas por contaminacin cuyo valor no debe superar el
0.5% m/v idealmente (Ruckle 2005).
57
No slo la utilizacin de compuestos qumicos sintticos o naturales, constituye la

alternativa para el control de las poblaciones bacterianas en una fermentacin alcohlica, en
un estudio realizado por Alcarde et al, 2002, pudo evaluarse la influencia de la radiacin en
la reduccin de algunas bacterias de los gneros Bacillus y Lactobacillus que usualmente
contaminan los jugos de caa y, efectivamente el tratamiento con este tipo de radiacin
reduce la concentracin bacteriana y como consecuencia, la acidez voltil producida es
menor y la viabilidad de la levadura no se ve afectada (Alcarde et al, 2002).
De esta forma se puede entonces afirmar que existen varias formas de controlar los
contaminantes en una fermentacin alcohlica y lo importante es escoger el tipo de
tratamiento adecuado no slo segn la flora microbiana presente y su incidencia en el
rendimiento del proceso sino de acuerdo a
volmenes de fermentacin.
58
los costos de inversin teniendo en cuenta
3. FORMULACION DEL PROBLEMA,
JUSTIFICACIN
ANTECEDENTES
3.1. FORMULACION DEL PROBLEMA
En la industria, el principal objetivo a nivel de produccin es aprovechar al mximo las
materias primas, de manera que el problema de contaminacin encontrado a nivel de planta
conduce a la evaluacin de la incidencia de los contaminantes bacterianos (Bacterias cido
lcticas) en el rendimiento del proceso de fermentacin, pues actualmente los sustratos
provenientes de la caa de azcar tienen baja oferta y sus costos son elevados de ah que deba
cuantificarse toda prdida en sustrato y tomarse medidas preventivas y/o de control durante
las etapas del proceso, adems de evaluarse los mtodos utilizados actualmente y verificarse
su efectividad, como es el caso del uso de antibitico durante el proceso de propagacin de
la levadura Saccharomyces cerevisiae.
3.2. JUSTIFICACION
Debido a los altos costos actuales de las materias primas para fermentacin alcohlica y a la
necesidad de aprovechar al mximo los contenidos de azcar fermentable en las mismas se
desarroll el presente trabajo de investigacin con el fin de determinar si el rendimiento de la
fermentacin se ve afectado por los niveles de contaminacin de bacterias acido lcticas
tpicamente encontrados a nivel de planta, tanto en la etapa de reproduccin como en la de
fermentacin, traducindose esto en prdidas de azcar que deberan ser
cuantificadas con el fin de tomar medidas al respecto y conocer si la utilizacin del
antibitico aporta un considerable beneficio al proceso.
El tipo de competencia microbiana entre bacterias contaminantes y levaduras en el proceso
es un tipo de antagonismo que se presenta comnmente cuando se fermentan sustratos
azucarados y con contenido de agua suficiente para albergar microflora, que en este caso
est conformado principalmente por las Bacterias Acido Lcticas (BAL), estas bacterias
59
son las principales contaminantes en el proceso de fermentacin debido a la condicin de

anaerobiosis, porque adems de consumir el sustrato, generan subproductos que pueden
inhibir la levadura y bajar la calidad organolptica del producto.
Adems, y debido a los tiempos de retencin del sustrato en los tanques, se favorece el
desarrollo de estos microorganismos anaerobios facultativos que soportan ambientes
extremos e incluso crean resistencia a diversos antimicrobianos luego de ser expuestos
constantemente a los mismos.
En caso de obtener resultados poco favorables en cuanto a la utilizacin de los antibiticos
podra tenerse en cuenta una variacin en las concentraciones y frecuencia de uso de los
mismos y/o la variacin en uno de los parmetros del proceso como por ejemplo un
descenso en el pH del sustrato para disminuir la carga microbiana presente.
3.3. ANTECEDENTES
En general, los niveles tpicos de bacterias lcticas en la etapa de propagacin de la
levadura estn en el orden de 104 y 106 UFC/ml, los cuales, cmparados con la poblacin de
levadura (108 UFC/ml) son significativamente altas.
Teniendo en cuenta el tiempo de duplicacin de bacterias menor frente al de levaduras,
stas podran alcanzar niveles superiores en el mismo tiempo y como ambas poblaciones
viven a expensas del mismo sustrato bajo competencia continua lo cual conlleva no slo a
la prdida de sustrato sino tambin a la generacin de compuestos indeseables en la
fermentacin alcohlica con la consecuente disminucin en el rendimiento de la misma.
Para el control de estas bacterias contaminantes en proceso, en las grandes destileras de
Brasil se han utilizado infinidad de compuestos antibiticos en los sistemas de
fermentacin, en especial sistemas de tipo contnuo donde se recircula la levadura, sin
60
embargo, con el tiempo de uso, stos pierden su efectividad sobre el grupo microbiano
determinado y dejan de ser un mecanismo de control adecuado (Ruckle, 2005).
Ante esta situacin, las destileras en Colombia han tomado en cuenta otras opciones de
tratamiento al sustrato antes de iniciar la fermentacin como aumento en los tiempos de
calentamiento de las mieles y jugos de caa, descenso importante del pH de los mismos
para garantizar que las bacterias no puedan reproducirse bajo estas condiciones, al mismo
tiempo que la levadura no se afecte en su desarrollo y fermentacin u opciones innovadoras
como son la utilizacin de compuestos orgnicos como extractos de plantas para evitar el
uso de compuestos con efecto residual que permanezcan en las vinazas, cuyo atractivo
comercial es ser un fertilizante de tipo orgnico libre de qumicos como es el caso de los
antibiticos (Ruckle, 2005).
61
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL

Evaluar la incidencia de contaminacin por bacterias cido lcticas en el rendimiento de la
fermentacin alcohlica, utilizando como sustrato los subproductos de extraccin de azcar a
partir de la caa y el uso de antibiticos durante la etapa de reproduccin de la levadura
Saccharomyces cerevisiae como mecanismo de control de dichos contaminantes.
4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
Determinar cuantitativamente cmo afectan los niveles de contaminacin el
rendimiento de la fermentacin en una planta de alcohol del Valle del Cauca.
Evaluar la efectividad del uso de antibiticos como medida de control de
contaminacin por bacterias cido lcticas durante el proceso de reproduccin de la
levadura.
Considerar el descenso del pH en los medios de reproduccin y fermentacin como
alternativa para el control de contaminantes de tipo cido lcticas.
5. MATERIALES Y MTODOS
62
5.1. UBICACIN Y DISEO DE LA INVESTIGACIN

La presente investigacin se llev a cabo en la planta alcoqumica de SUCROMILES S.A,
empresa biotecnolgica ubicada en la recta Cali-Palmira Km 18 Departamento Valle del
Cauca Colombia.
Las materias primas utilizadas para los diferentes ensayos dentro del diseo experimental
fueron caracterizadas previamente para garantizar la calidad de las mismas y se incluy el
anlisis microbiolgico de los sustratos y la levadura (Ver Anexos 3 y 4). El manejo y
almacenamiento de las muestras se realiz bajo condiciones de refrigeracin (7C) y en
material estril.
Dentro del experimento se distinguen dos etapas fundamentales: Etapa de reproduccin de la
levadura y Etapa de fermentacin.
Las fermentaciones se llevaron a cabo en un sistema de fermentacin por lotes simulando lo
que se lleva a cabo a nivel de planta en la cual existen una cuba madre donde se inicia la
reproduccin y se inocula la crema de levadura, dos cubas de reproduccin adicionales que
parten de esta cuba madre y son alimentadas constantemente con melaza miel de tercera
dilucin y donde se mantiene constantemente la levadura para realizar los inculos en seis
fermentadores, los cuales se alimentan con melaza o miel de segunda dilucin y en los que
se maneja un volumen efectivo de trabajo que oscila entre 230000 y 250000 litros y del
cual el 30% corresponde al inculo obtenido en las cubas de reproduccin.
Las melazas o mieles diluidas en el proceso pueden dividirse de la siguiente forma de
acuerdo a la etapa en la que son utilizadas:
Melaza miel de tercera dilucin: utilizada durante la etapa de reproduccin de la
levadura y la cual, tras adicin de agua, cido sulfrico y homogenizacin, registra
63
un % de azcares totales reductores entre 6%-8% m/v y cuya densidad depende del tipo
de miel utilizada.
Melaza miel de segunda dilucin: utilizada durante la etapa de fermentacin y la
cual tras adicin de agua, cido sulfrico y homogenizacin, registra un % de
azcares totales reductores entre 19%-22% m/v.
El esquema del proceso puede resumirse en la figura 8:
CO2
Melaza
o Miel
pura
H2SO4
Agua
Urea y Fosfato
de amonio
Aire
Antiespumante
Vino
Miel de tercera
dilucin
ATR 6-8% m/v
Fermentacin
alcohlica
Mx 30h
Reproduccin de
levadura
Mx 24h
Destilacin
30% inculo
Etanol
Miel de segunda
dilucin
ATR 19-22% m/v
Melaz
o Mie
pura
H2SO4
Vinaza
Sulfato de calcio + Levadura

muerta
Agua
Figura 8. Esquema del proceso de fermentacin por lotes
El diseo de cada etapa (reproduccin y fermentacin) se llev a cabo contemplando

parmetros (condiciones que se mantuvieron estables entre ensayos), variables de control
(condiciones a evaluar entre ensayos) y variables de respuesta a travs de las cuales se
determin el resultado de la evaluacin.
5.1.1. Parmetros y variables en la etapa de reproduccin
Parmetro
Temperatura
Valores
30-32
64
Unidades
C
pH
Aireacin
Nutrientes (urea y fosfato)
4.6
5
0,6 y 0,4
(respectivamente)
30
6-8
Antiespumante
Concentracin de azcares
reductores (ATR)
Poblacin inicial de levadura
3x108
Viabilidad inicial de levadura
>85%
Morfologa de la levadura
Homogenea/Heterogenea
Tiempo de reproduccin
24
Variables de control (independientes)
Concentracin de los compuestos
antibiticos
NA
L/mn
g/900ml
ppm
% m/v
UFC/ml
% celulas vivas
NA
horas
Valores
0.5, 1.0 y 2.0
Variables de Respuesta (dependientes)
Unidades
ppm
Unidades
Concentracin de microorganismos
contaminantes al final del proceso
Poblacin de levadura al final de la
propagacin
Acidez voltil al final del proceso
UFC/ml de Bacterias lcticas

UFC/ml de clulas de levadura
ppm
5.1.2. Parmetros y variables en la etapa de fermentacin

Parmetros
Volumen de inculo
Poblacin de levadura en el
inculo
Viabilidad de la levadura
Concentracin de azcares
reductores (ATR)
Adicin de antiespumante
Tiempo de fermentacin
Valores
30
>3x108
Unidades
% del volumen efectivo
de trabajo (VET)
clulas/ml
>85%
19-22%
% clulas vivas
% m/v
50
30
ppm
horas
Variables de control (independientes)

Poblacin inicial de contaminantes
bacterianos (BAL) en los diferentes
tratamientos.
Unidades
UFC/ml
65
Variables de respuesta (dependientes)

Porcentaje de alcohol al final de la
fermentacin
Azcar reductor residual (AR)
Poblacin de contaminantes bacterianos
(BAL)
Rendimiento del proceso de fermentacin
Eficiencia del proceso de fermentacin
Productividad
*NA: No Aplica.
Unidades
% v/v
% m/v
UFC/ml
%
%
g/L * h
5.2. METODOS
5.2.1. Pretratamiento del sustrato
En todos los casos se realiz precalentamiento por inyeccin de vapor alcanzando los 90C del
sustrato tanto para la etapa de reproduccin como para la etapa de fermentacin (mieles de
tercera y segunda dilucin respectivamente) para la produccin de alcohol con melaza y jugo de
caa concentrado, seguido de enfriamiento hasta 32C.
Etapa de Reproduccin
5.2.2. Tratamiento con Antibitico
5.2.2.1 Hidratacin de levadura activa seca
Se pesaron 4g de levadura activa seca (por cada ensayo) e hidrataron mediante agitacin
mecnica en un vaso de precipitado estril con agua a 41C. Se determin la poblacin y
viabilidad de la levadura hidratada mediante recuento en cmara de neubauer (Anexo 2).
5.2.2.2. Preparacin del sustrato para la reproduccin
El medio de cultivo para esta etapa del proceso correspondi a melaza de tercera dilucin
cuya densidad fue ^1.070g/ml y jugo de caa concentrado de tercera dilucin cuya
66
densidad fue
^1.030g/ml. Estas densidades
corresponden aproximadamente a un 6-8%
p/v de azcares totales reductores en cada uno de los casos. El pH inicial fue de 4.6
regulado por adicin de cido sulfrico.
Se inocularon 3ml de la levadura hidratada en 900ml de miel de tercera dilucin y se
adicionaron los nutrientes urea y fosfato de amonio a una concentracin de 1.1g/L y
0.67g/L respectivamente, las cuales equivalen a 1g de urea y 0.6g de fosfato de amonio por cada
900ml de medio.
Finalmente se adicionaron 30 ppm de antiespumante prosil (Certificado de calidad e
inocuidad para la levadura por: Protcnica Ingeniera Ltda) para evitar la formacin
excesiva de espuma y facilitar la medicin de los volmenes
deseados para iniciar su
propagacin.
La inoculacin de la levadura hidratada para los diversos tratamientos se realiz cuando la
melaza y/o jugo de caa de tercera dilucin (previamente precalentados a 90C) alcanzaron una
temperatura de 32C.
La temperatura se mantuvo constante a 30C en bao termostatado y el oxgeno necesario en
esta etapa se suministr mediante la inyeccin de aire a un flujo de 5 L/mn durante 24 horas de
proceso de reproduccin.
Al tiempo 0, as
como transcurrido el tiempo de reproduccin (24 horas) se realiz la
determinacin de la poblacin y viabilidad de la levadura (Anexo 2 ), Adicionalmente se

determinaron los niveles de contaminacin con los que se inici el proceso y se cuantific la
acidez voltil (anexos 3 y 6).
Los ensayos se dividieron de la siguiente manera segn la concentracin de antibitico
adicionada:
67
Tabla 6.
Tratamientos con antibitico para la etapa de propagacin con melaza y jugo

de caa
TRATAMIENTO CON
TRATAMIENTO CON
PENICILINA
VIRGINAMICINA
Control (0 ppm)
0.5 ppm
1.0 ppm
2.0 ppm
Control (0 ppm)
0.5 ppm
1.0 ppm
2.0 ppm
Cada ensayo tanto para penicilina como para virginamicina a las concentraciones
mencionadas (0.5, 1.0 y 2.0 ppm y su respectivo control) y para los dos sustratos de
estudio (melaza y jugo de caa concentrado) se llev a cabo en cuatro repeticiones bajo los
mismos parmetros.
5.2.2.3. Determinacin de los niveles de contaminacin

Adems de determinar la morfologa de la levadura hidratada que ingres al proceso, se
determinaron los niveles de contaminacin por bacterias acido lcticas en los sustratos sin
dilucin, la melaza y el jugo de caa de tercera dilucin tanto al iniciar (hora 0), como al
finalizar el proceso de reproduccin (24 horas despus) tras los diferentes tratamientos con el
antibitico respectivo al igual que en los controles.
Esta poblacin contaminante
(Bacterias cido lcticas-BAL) se determin mediante
recuento en placa (siembra en profundidad) en medio MRS a partir de diluciones decimales de

la muestra (Anexos 2 y 3).
Etapa de fermentacin
5.2.2.4. Determinacin del inculo para la fermentacin
68
Una vez se determin la poblacin y viabilidad de la levadura para cada ensayo, se midi el
volumen de inculo que se llev a la fermentacin (900ml) garantizando que el nmero de
levaduras inoculadas se encontrara alrededor de 3X10 8 clulas/ml, determinadas mediante
recuento en cmara de neubauer, para iniciar el proceso.
Igualmente, se determin mediante recuento en placa en medio MRS, el nmero de
bacterias contaminantes que ingresaron a la fermentacin como parte del inculo tras los
diferentes tratamientos con los antibiticos.
Para cada concentracin de penicilina virginamicina utilizada en esta etapa de
reproduccin, se realiz un ensayo de fermentacin con el fin de determinar el efecto del
mismo (tratamiento con el antimicrobiano) en el rendimiento final del proceso.
5.2.2.5. Preparacin del sustrato para la fermentacin
El sustrato para esta etapa del proceso fue melaza de segunda dilucin a una densidad se
1.100 - 1.120 g/ml y Jugo de caa concentrado de segunda dilucin cuya densidad estaba
entre 1.070 y 1.100, lo cual equivale a 19-22% (p/v) de azcares totales reductores.
El pH se ajust a 4.6 con la adicin de cido sulfrico, la determinacin del porcentaje de
azcar exacto alimentado a la fermentacin se realiz mediante titulacin por el mtodo de
felhing (Anexo 7), la densidad del sustrato fue directamente proporcional a la
concentracin de azcar que se determin previamente.
Las fermentaciones fueron alimentadas siguiendo el modelo utilizado en planta, el volumen
efectivo de trabajo (3000ml) se dividi en seis (6) volmenes iguales de 350ml para
alimentar cada hora, restando el volumen del inculo (900ml) el cual se adicion con la
primera alimentacin en la hora cero (simulando lo que se lleva a cabo en la planta), para
lograr una adaptacin lenta a la presin osmtica generada por la concentracin de azcares en el
sustrato y disminuir tiempo de fermentacin.
69
Durante el proceso de fermentacin se gener la condicin de anaerobiosis al sistema a

travs de un tapn hermtico en la parte superior de la botella Schoot pero permitiendo la
eficiente salida del CO2 generado en el proceso a travs de una extensin de la botella
conectada a una manguera.
Durante el tiempo de llenado se adicionaron 50 ppm del antiespumante para evitar prdidas
de sustrato por generacin de espuma, adems, se proporcion agitacin en forma circular
mediante plancha agitadora, para simular el sistema de recirculado que se lleva a cabo en
planta, de manera que la totalidad de la poblacin de levadura estuviera en contacto con el
sustrato a fermentar y sta, no tendiera a sedimentarse afectando el tiempo y/o desarrollo
del proceso.
5.2.2.6. Determinacin del Rendimiento (%), Eficiencia (%) y Productividad (g/L*h) del
proceso.
Para cada uno de los tratamientos con el antibitico y los controles respectivos, el
porcentaje de alcohol se expres en %v/v y el porcentaje de azcar residual en (p/v)
obtenidos despus de la fermentacin, a partir de estos resultados y teniendo en cuenta el
azcar reductor inicial que ingres al proceso, se calcul el rendimiento experimental de la
siguiente manera:
Rendimiento = Producto generado (g)_ x 100
Sustrato consumido (g)
Donde tanto el producto generado como el sustrato consumido fueron expresados en
gramos. El sustrato consumido result de la diferencia entre el sustrato inicial, incluyendo el
consumido en la etapa de reproduccin y el sustrato final, es decir, el azcar reductor presente
en la miel de tercera y segunda dilucin menos el azcar residual al final del proceso,
respectivamente.
Para la determinacin de la eficiencia global del proceso se reemplaz la masa de alcohol,
obtenida a travs del mtodo colorimtrico por destilacin con dicromato de potasio
70
(Anexo 8), generada en el proceso y la masa de alcohol esperada tericamente en la

frmula:
Eficiencia =
Rendimiento real
* 100
Rendimiento terico (Determinado estequiomtricamente a partir del azcar
ingresado al proceso y afectado en 0,95 de acuerdo a Pasteur)
Eficiencia =
Masa de alcohol producido (g)

Masa terica de alcohol a partir del sustrato (g)
* 100
Adems de rendimiento y eficiencia se calcul la productividad para cada una de las

fermentaciones, que se expres de la siguiente manera:
Productividad =
masa de alcohol producido(g)

(volumen total (L) * Tiempo de fermentacin(h)
Los resultados de rendimiento, eficiencia y productividad del proceso de fermentacin,

obtenidos para cada uno de los tratamientos con los antibiticos, se compararon entre s y
se determin el tipo de tratamiento adecuado a utilizar en la fermentacin alcohlica.
5.2.3. Tratamiento con descenso pH
Las condiciones y parmetros de fermentacin fueron similares a las utilizadas en el caso de
los tratamientos con el antibitico. La variacin de pH se realiz durante las dos etapas,
Reproduccin y Fermentacin:
Control: pH 4.6 (manejado en planta actualmente)
Tratamiento 1: pH 4.0
Para cada uno de los tratamientos se adicion cido sulfrico (H 2SO4) para alcanzar el pH
esperado (no se adicion antibitico durante la propagacin). Igualmente se determin la
71
concentracin de bacterias lcticas en los sustratos de tercera y segunda dilucin iniciales

(antes de adicionar el cido) y de esta forma se estableci la efectividad de este tratamiento en
el control de contaminantes y probablemente en el rendimiento de la fermentacin al igual
que para los tratamientos anteriores (antibitico a 0.5, 1.0 y 2.0ppm).
De cada ensayo (pH 3.0, 3.5 y 4.0 con su respectivo control) se realizaron cuatro
repeticiones bajo los mismos parmetros para obtener una matriz de datos representativa. Los
datos se registraron de forma codificada para su posterior anlisis.
5.2.3.1. Diseo Experimental

Tabla 7. Tratamiento con descenso de pH para la etapa de propagacin con melaza y jugo de
caa concentrado
TRATAMIENTO
DESCENSO DE pH
pH 3.0
pH 3.5
pH 4.0
Control (pH 4.6)
5.3. RECOLECCION DE LA INFORMACIN
72
Debido a que la investigacin es de tipo experimental, la recoleccin de la informacin se

llev a cabo paralelo a los ensayos, los datos arrojados por cada uno de ellos, se codificaron
y expresaron mediante una sigla con el fin de facilitar su tabulacin como se muestra a
continuacin:
Tratamiento con Penicilina (P)
Tratamiento con Virginamicina (V)
Tratamiento con pH (H)
Melaza como sustrato (A)
Jugo de caa concentrado como sustrato (B)
Concentracin de antibitico 0.5 ppm (1)
Control (sin adicin de antibitico) (4)
Tratamiento con pH 3.0 (1)
Utilizando esta codificacin se diligenciaron formatos (Ver Anexos 9 y 10) que incluy los
siguientes valores: la concentracin de azcar, la poblacin de levadura, la poblacin de
contaminantes, la acidez voltil, la densidad y dems datos que se obtuvieron tanto en el
proceso de reproduccin como en el de fermentacin para cada tratamiento as como para los
controles respectivos.
5.4. ANLISIS DE LA INFORMACIN
73
El anlisis de los datos obtenidos experimentalmente se realiz mediante anlisis de

varianza de doble va para cada uno de los sustratos evaluados (ANOVA, dos vas).
El anlisis se realiz con un nivel de significancia de 0.05, a partir de los datos de
rendimiento.
En el caso del tratamiento de disminucin de pH, las fuentes de variacin fueron los
diferentes valores de pH a los que se sometieron los sustratos de fermentacin as como el
efecto a partir de los mismos. El anlisis de varianza se realiz a partir del rendimiento
(producto/sustrato) calculado con los datos resultantes de cada ensayo con un nivel de
significancia de 0.05.
Para los datos de productividad en los que se involucra el tiempo de fermentacin, se
determinaron las medidas de tendencia central y se estableci cul tratamiento es el ms
efectivo teniendo en cuenta el sustrato y el producto evaluado.
6.
RESULTADOS
74
Los datos utilizados para la construccin tanto de las tablas como de las figuras que
aparecen en este captulo, salvo que se indique lo contrario en el texto, son los datos
promedio de las cuatro repeticiones realizadas para cada ensayo.
6.1. Caracterizacin del sustrato
Tabla 8. Caractersticas fsico-qumicas y microbiolgicas de melaza y jugo de caa
Parmetros
Azcares totales reductores (%m/m)
Grados Brix (%)
Densidad (g/ml)
Slidos directos (%m/m)
Slidos cidos (%m/m)
Acidez voltil (ppm)
Recuento de Bacterias Acido lcticas (UFC/g)
Recuento de coliformes totales (UFC/g)
Recuento de Levaduras salvajes (UFC/g)
Melaza
53.63
Jugo de caa
concentrado
72.70
85.80
72.80
1.41
1.34
5.30
0.67
8.77
0.58
6530
1602
7.1E+04
3.4E+02
<10
<10
<10
<10
En la caracterizacin de los sustratos puros antes de iniciar la fermentacin
(sin
calentamiento), que se resume en la tabla 10, puede observarse que los recuentos de
coliformes totales y levaduras salvajes son <10 UFC/g de muestra, mientras que los
recuentos de bacterias cido lcticas son del orden de 10 4 y 102 para melaza y jugo de caa
respectivamente. Los recuentos registrados en la tabla anterior para el jugo de caa
concentrado (sin dilucin ni calentamiento previo) corresponden al crecimiento de colonias
mucilaginosas en dilucin 101 de la muestra pura: estas colonias son tpicas del gnero
Leuconostoc (Ver figura 9a).
En las diluciones mayores, el crecimiento tpico observado correspondi al gnero
Lactobacillus (Ver figura 9b), es decir colonias pequeas puntiformes inmersas en el medio
75
de cultivo MRS, similares a las obtenidas en todas las diluciones para el caso de la melaza
de caa.
Para cada uno de los casos se realizaron pruebas confirmatorias (Anexo 5) para las colonias
presuntivas que se resumen en las Tabla 11.
Tabla 9. Pruebas de identificacin de los microorganismos aislados de los sustratos de
fermentacin
Pruebas
Gnero Leuconostoc
Gnero Lactobacillus
(Aislado en Jugo de caa
(Aislado en Melaza y Jugo de
concentrado)
caa concentrado)
Crecimiento en
Colonias mucilaginosas
Colonias muy pequeas blancas
medio MRS
transparentes redondas
puntiformes
similares a gotas de agua.
Coloracin de
Cocos Gram positivos
Bacilos Gram positivos
Gram
Crecimiento en
Crecimiento Positivo (+)
Crecimiento Negativo (-)
medio
Hipersacarosa
El tipo de crecimiento puntiforme en medio MRS de bacilos Gram positivos y cuya fuente de
aislamiento son sustratos azucarados como las mieles de caa, corresponde a presuntivo del
gnero Lactobacillus y normalmente se encuentra a lo largo de los procesos de
fermentacin. Estas bacterias lcticas se encuentran tanto en los medios de propagacin de la
levadura como en los vinos al final del proceso.
En las plantas industriales, el gnero Lactobacillus, gracias a su maquinaria metablica
logra crecer y/o mantenerse en ambientes aerobios, microaeroflicos e incluso en
anaerobiosis (Jacques et al, 1999).
76
Figura 9a. Colonias en medio MRS a partir de

jugo de caa concentrado sin calentamiento
tpicas del gnero Leuconostoc.
Figura 9b. Colonias puntiformes en medio

MRS aisladas en melaza y jugo de caa
tpicas del gnero Lactobacillus.
6.2. Dilucin de sustrato en la etapa de Reproduccin

Cada una de las mieles puras a utilizar como sustratos de fermentacin (melaza y jugo de
caa), se diluy con agua de pozo hasta lograr un porcentaje de azcares totales reductores
(ATR) entre 6 y 8% (p/v). Esta melaza o jugo de caa diluido se denomina miel de tercera
dilucin porque se obtiene despus de realizar dos diluciones previas.
En la tabla 12, se presentan las caractersticas iniciales de la miel de tercera dilucin con la que
se inici el proceso de propagacin de la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae a partir de
los dos sustratos. Estos datos iniciales permitieron conocer bajo qu condiciones inici el
proceso, para posteriormente ser comparados con los obtenidos tras los diferentes tratamientos
objeto de la presente investigacin.
Tabla 10.
Caractersticas iniciales de Miel de Tercera dilucin
Sustrato
Melaza
Jugo de Caa
Concentrado
Ensayos
Densidad
(g/ml)
Acidez Voltil
(ppm)
Penicilina
Virginamicina
pH
Penicilina
Virginamicina
pH
1.050
1.049
1.051
1.025
1.024
1.025
357
364
362
128
145
145
77
Concentracin
de BAL
(UFC/ml)
4.0 E+03
3.5 E+03
3.3 E+03
3.6 E+02
2.9 E+02
2.1 E+02
Los recuentos de bacterias lcticas corresponden a crecimiento de colonias planas

puntiformes tpicas del gnero Lactobacillus, confirmadas mediante coloracin de Gram y
crecimiento en Agar hipersacarosa (Anexo 5).
No se registra crecimiento de colonias mucilaginosas transparentes y grandes en el medio
de cultivo (MRS) despus del calentamiento (70C) de ninguno de los dos sustratos
evaluados.
Los valores de acidez voltil en melaza duplican los valores obtenidos para el jugo de caa
concentrado al inicio de la etapa de reproduccin, igualmente los recuentos de bacterias
lcticas en melaza, exceden en una unidad logartmica los registrados en el jugo de caa.
6.3. Dilucin de sustrato en la etapa de Fermentacin
A partir de las mieles concentradas (melaza y jugo de caa), se obtuvieron mieles de
segunda dilucin para iniciar la fermentacin a travs de la adicin de agua (cantidad
determinada a partir de los azcares totales reductores de la miel concentrada) logrando una
concentracin de azcares totales reductores entre 19 y 22% m/v.
Las caractersticas iniciales de las mieles de segunda dilucin con las que se realiz la etapa de
fermentacin se registran en la Tabla 11.
Tabla 11.
Caractersticas iniciales de Miel de Segunda dilucin
Sustrato
Melaza
Jugo de Caa
Concentrado
Ensayos
Densidad
(g/ml)
Acidez Voltil
(ppm)
Penicilina
Virginamicina
pH
Penicilina
Virginamicina
pH
1.099
1.100
1.100
1.081
1.080
1.078
705
814
816
338
334
332
78
Concentracin
de BAL
(UFC/ml)
2.1 E+03
2.0 E+03
3.4 E+03
3.4 E+02
3.0 E+02
2.2 E+02
Los recuentos de bacterias lcticas corresponden a crecimiento de colonias planas

puntiformes tpicas del gnero Lactobacillus, confirmadas mediante coloracin de Gram y
crecimiento en Agar hipersacarosa (Anexo 5).
Nuevamente se observa que los valores de acidez voltil as como los recuentos de
bacterias lcticas son ms altos en melaza que en jugo de caa.
6.4. Preparacin y alistamiento de la levadura

En cuanto a la cepa, se utiliz levadura activa seca del gnero Saccharomyces especie
cerevisiae. Previo a iniciar cada etapa de reproduccin en todos los ensayos, se realiz
recuento en cmara de Neubauer (Anexo 2) y aislamiento en medio YM (Anexo 4), una vez
se realiz la hidratacin de la levadura a 41C con el fin de determinar tanto la poblacin
como la viabilidad de la misma as como la homogeneidad de las colonias en medio slido.
La viabilidad de la levadura hidratada fue comprobada a travs del crecimiento en el medio
slido YM tal como se observa en la tabla 12, anlisis que expres que el microorganismo
fermentador se encontraba en condiciones adecuadas para iniciar el proceso en todos los
tratamientos, en la figura 10 se observan las colonias de la cepa de Saccharomyces
cerevisiae (levadura activa hidratada) en medio YM.
El recuento inicial de la levadura hidratada se realiz mediante recuento en cmara de
Neubauer (Anexo 2) y en general para todos los ensayos fue del orden de 10 9 UFC/ml de
muestra y el porcentaje de viabilidad en todos los casos fue superior al 90%.
79
Tabla 12. Crecimiento en medio slido de la levadura hidratada y recuento en cmara de

Neubauer
Ensayo
Melaza con penicilina

Melaza con Virginamicina
Jugo de caa con Penicilina
Jugo de caa con Virginamicina
Tratamiento con pH Melaza
Tratamiento con pH Jugo de
caa
Crecimiento en
medio YM
(Positivo/Negativo)
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Poblacin de la
levadura en cmara
de neubauer
(clulas/ml)
% de viabilidad de
la levadura en
cmara de
neubauer
2.4E+09
3.0E+09
3.1E+09
2.7E+09
2.7E+09
3.0E+09
92
94
92
93
91
92
Figura 10. Crecimiento positivo en medio slido YM de la cepa de Saccharomyces cerevisiae
6.5. TRATAMIENTO CON ANTIBITICO EN LA ETAPA DE REPRODUCCIN

6.5.1. Reproduccin con Melaza
Despus de los tratamientos con los antibiticos penicilina y virginamicina
en la
reproduccin de la levadura (24 horas) utilizando melaza de caa como sustrato azucarado, se
obtuvo la informacin registrada en las tablas 13 y 14, la cual corresponde a las variables de
respuesta frente a los parmetros controlados del proceso y pueden verse claramente los
resultados para cada concentracin en la figura 11.
Tabla 13.
Variables de respuesta etapa de reproduccin con Melaza tratada con

80
Tratamiento
Control P4A
P1A
P2A
P3A
Concentracin
de antibiotico
(ppm)
0.00
0.50
1.00
2.00
Recuento de
Levadura
neubauer
(clulas/ml)
3.0 E+08
3.1 E+08
3.1 E+08
2.9 E+08
Viabilidad
de Levadura
(%)
Recuento
BAL
(UFC/ml)
Acidez
Voltil
(ppm)
100
100
100
100
3.1 E+05
3.2 E+05
4.0 E+05
3.6 E+05
1618
1649
1595
1631
Tabla 14.
Variables de respuesta etapa de reproduccin con Melaza tratada con

Virginamicina (24 horas)
Recuento de
Concentracin
Viabilidad
Recuento
Acidez
Levadura
Tratamiento
de antibiotico
de Levadura
BAL
Voltil
neubauer
(ppm)
(%)
(UFC/ml)
(ppm)
(clulas/ml)
100
3.1 E+05
1458
Control V4A
0.00
3.1 E+08
3.1 E+08
100
3.4 E+05
1492
V1A
0.50
3.0 E+08
100
3.3 E+05
1481
V2A
1.00
V3A
2.00
3.3 E+08
100
3.2 E+04
1385
Recuento de Bacterias Acido Lacticas (ufc/ml) vs. Concentracin de antibitico

(ppm) etapa de reproduccin con Melaza
1,00E+07
1,00E+06
BAL (ufc/ml)
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
0,00
0,50
1,00
2,00
Concentracin de antibitico (ppm)

Melaza tratada con Penicilina
Melaza tratada con Virginamicina
Figura 11. Poblacin de BAL (ufc/ml) Vs Concentracin de antibitico (ppm) en etapa de reproduccin con melaza (24 horas)
Finalizada la etapa de reproduccin con melaza, los resultados de y gemacin de la

levadura fueron del 100% y morfologa homognea.
81
6.5.2. Reproduccin con Jugo de Caa Concentrado

En el caso de los tratamientos con los antibiticos penicilina y virginamicina durante 24
horas de reproduccin de la levadura utilizando jugo de caa concentrado como sustrato
azucarado, se obtuvo la informacin que se registra en las tablas 15 y 16 e igualmente
corresponde a las variables de respuesta frente a los parmetros controlados del proceso. La
concentracin de contaminantes (BAL) puede observarse en la figura 12.
Tabla 15.
Tratamiento
Control P4B
P1B
P2B
P3B
Variables de respuesta etapa de reproduccin con Jugo de caa concentrado

Concentracin
de antibiotico
(ppm)
Recuento de
Levadura
0.00
0.50
1.00
2.00
(clulas/ml)
3.0 E+08
3.0 E+08
3.1 E+08
3.0 E+08
neubauer
Tabla 16.
Viabilidad
de Levadura
(%)
Recuento
BAL
(UFC/ml)
Acidez
Voltil
(ppm)
100
100
100
100
3.8 E+06
3.5 E+06
3.7 E+06
3.3 E+05
2748
2844
2816
2774

Recuento de
Concentracin
Viabilidad
Recuento
Acidez
Levadura
Tratamiento
de antibiotico
de Levadura
BAL
Voltil
neubauer
(ppm)
(%)
(UFC/ml)
(ppm)
(clulas/ml)
100
3.0 E+06
2888
Control V4B
0.00
3.0 E+08
V1B
0.50
3.1 E+08
100
3.0 E+06
2922
V2B
1.00
3.0 E+08
100
3.0 E+05
2972
3.0 E+08
100
3.1 E+05
2872
V3B
2.00
82
Recuento de Bacterias Acido Lacticas (ufc/ml) vs. Concentracin de antibitico

(ppm) etapa de reproduccin con Jugo de Caa Concentrado
1,00E+07
1,00E+06
BAL (ufc/ml) 1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
0,00
0,50
1,00
2,00

Jugo de Caa tratado con Penicilina
Jugo de Caa tratado con Virginamicina
Figura 12. Poblacin de BAL (ufc/ml) Vs Concentracin de antibitico (ppm) etapa de reproduccin con jugo de caa
concentrado (24 horas)
En el caso de Jugo de caa como sustrato, despus de 24 horas de reproduccin, el

resultado de gemacin fue del 100% y morfologa homognea en todos los casos.
6.5.3. Fermentacin con Melaza

Tras 30 horas de fermentacin por la cepa de Saccharomyces cerevisiae
(ethanol
technology) utilizando melaza de caa como sustrato, se obtuvieron los valores

correspondientes a la concentracin de alcohol (%v/v) obtenido a partir del azcar reductor
presente en el medio de cultivo y con el inculo tratado previamente con los antibiticos
respectivos.
En las tablas 17 y 18 se muestran las variables de respuesta tras la fermentacin.
83
Tabla 17.
Tratamiento/
ppm
antibitico
Control
P4A/0.0
P1A/0.5
P2A/1.0
P3A/2.0
Tabla 18.
Tratamiento/
ppm
antibitico
Control
V4A/0.0
V1A/0.5
V2A/1.0
V3A/2.0
Variables de respuesta etapa de fermentacin de Melaza inoculo tratado con

Azcar
Alcohol
(% v/v)
Rendimiento
Residual
(%)
(% m/v)
8.07
8.08
8.31
8.38
Eficiencia
(%)
Productividad
(g/L*h)
1.80
39
81.01
2.13
2.07
1.88
1.92
40
41
41
81.16
83.44
84.17
2.13
2.19
2.21

Azcar
Alcohol
(% v/v)
Rendimiento
Residual
(%)
(% m/v)
8.04
8.05
8.24
8.35
Eficiencia
(%)
Productividad
(g/L*h)
1.86
40
82.56
2.12
1.83
1.78
1.86
41
41
42
82.64
84.64
85.71
2.12
2.17
2.20
Estos resultados de rendimiento, eficiencia y productividad del proceso pueden observarse en

las figuras 13, 14 y 15 respectivamente y para cada uno de los tratamientos.
Rendimiento (%) vs. Concentracin de antibitico (ppm) etapa de
Fermentacin con Melaza
60
40
Rendimiento
(%)
39
40
40
41
41 41
41
1,00
2,00
42
20
0,00
0,50

Melaza inoculo tratado con Penicilina
Melaza inoculo tratado con Virginamicina
Figura 13. Rendimiento (%) Vs concentracin de antibitico (ppm) en etapa de fermentacin con melaza (30 horas
84
Eficiencia (%) vs. Concentracin de antibitico (ppm) etapa de Fermentacin

con Melaza
100,0
80,0
81,0
82,6
81,2
82,6
83,4
84,6
84,2
85,7
60,0
Eficiencia (%)
40,0
20,0
0,0
0,00
0,50
1,00
2,00

Figura 14. Eficiencia (%) Vs Concentracin de antibitico (ppm) en etapa de fermentacin con melaza (30 horas)
Productividad (g/L*h) vs. Concentracin de antibitico (ppm) etapa de

Fermentacin con Melaza
3
2
2.13 2.12
2.13 2.12
0.00
0.50
Productividad
(g/L*h)
2.19
2.17
2.21
2.20
1
0
1.00
2.00

Figura 15. Productividad (g/L*h) Vs Concentracin de antibitico (ppm) en etapa de fermentacin con melaza (30 horas)
6.5.4. Fermentacin con Jugo de Caa Concentrado
85
En el caso de los tratamientos con los antibiticos penicilina y virginamicina utilizando jugo
de caa concentrado como sustrato de fermentacin, se obtuvo la informacin que puede
observarse en las tablas 19 y 20 que igualmente corresponden a las variables de respuesta
frente a los parmetros preestablecidos y adems registran cuantitativamente el rendimiento
final de fermentacin para cada uno de los tratamientos y la eficiencia y productividad
global del proceso a nivel de laboratorio.
Tabla 19. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Jugo de caa concentrado
inculo tratado con Penicilina (30 horas).
Tratamiento/
ppm
antibitico
Control
P4B/0.0
P1B/0.5
P2B/1.0
P3B/2.0
Concentracin
de antibitico
(ppm)
Alcohol
(% v/v)
0.00
7.69
0.50
1.00
2.00
7.68
7.82
7.88
Azcar
Rendimiento
Eficiencia
(%)
(%)
0.72
38
78.41
0.84
0.87
1.12
38
39
39
78.31
79.79
80.35
Residual (%
m/v)
Product
ividad
(g/L*h)
2.03
2.02
2.06
2.08

inculo tratado con Virginamicina (30 horas).
Tratamiento/
ppm
antibitico
Control
V4B/0.0
V1B/0.5
V2B/1.0
V3B/2.0
Concentracin
de antibitico
(ppm)
Alcohol
(% v/v)
Azcar
Residual (%
0.00
8.02
0.50
1.00
2.00
8.01
8.12
8.20
Rendimiento
Eficiencia
(%)
(%)
0.66
40
81.02
0.60
0.72
0.73
40
40
40
80.89
82.04
82.81
m/v)
Product
ividad
(g/L*h)
2.12
2.11
2.14
2.16
En las figuras 16, 17 y 18 pueden observarse los resultados de rendimiento, eficiencia y

productividad respectivamente para cada uno de los tratamientos.
86
Rendimiento (%) vs. Concentracin de antibitico (ppm) etapa de

Fermentacin con Jugo de Caa Concentrado
60
Rendimiento
(%)
40
40
38
40
38
39
40
39 40
20
0
0,00
0,50
1,00
2,00
Jugo de Caa inoculo tratado con Penicilina
Jugo de Caa inoculo tratado con Virginamicina
Figura 16. Rendimiento (%) Vs Concentracin de antibitico (ppm) en etapa de fermentacin con Jugo de caa concentrado (30 horas)
Eficiencia (%) vs. Concentracin de antibitico (ppm) etapa de Fermentacin

para Jugo de Caa Concentrado
100,0
80,0
60,0
78,4
81,0
78,3
80,9
79,8
82,0
80,4
82,8
Eficiencia (%)
40,0
20,0
0,0
0,00
0,50
1,00
2,00

Figura 17. Eficiencia (%) Vs Concentracin de antibitico (ppm) en etapa de fermentacin con jugo de caa concentrado (30 horas)
87
Productividad (g/L*h) vs. Concentracin de antibitico (ppm) etapa de

Fermentacin para Jugo de Caa Concentrado
3
2
Productividad
(g/L*h)
2.03
2.12
2.02 2.11
2.06
2.14
2.08
2.16
1
0
0.00
0.50
1.00
2.00

Figura 18. Productividad (g/L*h) Vs Concentracin de antibitico (ppm) en etapa de fermentacin con jugo de caa (30 horas)
88
6.6. TRATAMIENTO CON DESCENSO DE pH

6.6.1. Etapa de Reproduccin
Tabla 21.
Tratamiento
H1A
H2A
H3A
Control H4A
Tabla 22.
Tratamiento
H1B
H2B
H3B
Control H4B
Variables de respuesta etapa de reproduccin con Melaza bajo ajuste de pH

(24 horas)
Recuento de
Levadura
pH
3.0
3.5
4.0
4.6
neubauer
(clulas/ml)
2.0 E+06
3.4 E+07
3.6 E+08
3.8 E+08
Viabilidad de
Recuento BAL
Acidez Voltil
Levadura (%)
(UFC/ml)
(ppm)
78
78
100
100
3.2 E+04
4.6 E+04
3.3 E+05
3.3 E+05
1488
1483
1478
1477

bajo tratamiento de ajuste de pH (24 horas)
Recuento de
Levadura
pH
3.0
3.5
4.0
4.6
neubauer
(clulas/ml)
2.8 E+06
2.8 E+07
2.8 E+07
3.0 E+08
Viabilidad de
Recuento BAL
Acidez Voltil
Levadura (%)
(UFC/ml)
(ppm)
79
84
100
100
3.4 E+04
3.4 E+04
3.4 E+06
3.4 E+06
1816
1869
1867
2157
En las figura 19 pueden observarse los resultados de recuento de bacterias lcticas en etapa de
reproduccin para cada uno de los tratamientos con descenso de pH.
89
Recuento de Bacterias Acido Lacticas (ufc/ml) vs. pH del medio etapa de

reproduccin con Melaza y Jugo de Caa Concentrado
1,00E+07
1,00E+06
BAL ( ufc/ml) 1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
3
3,5
4,6
pH
Melaza tratada con pH
Jugo de Caa tratado con pH
Figura 19. Poblacin de BAL (ufc/ml) Vs Tratamiento con pH en etapa de reproduccin (24 horas)
6.6.2. Etapa de Fermentacin

Tabla 23.
Tratamiento
H1A
H2A
H3A
Control H4A

pH
3.0
3.5
4.0
4.6
Alcohol
(% v/v)
Azcar
Residual
(% m/v)
Rendimiento
Eficiencia
7.28
7.51
8.15
8.21
3.52
2.52
2.15
2.05
(%)
(%)
36
37
41
41
73.69
76.00
82.48
83.13
Productivi
dad
(g/L*h)
1.92
1.98
2.15
2.16

inoculo tratado con ajuste de pH (30 horas)
Tratamiento
H1B
H2B
H3B
Control H4B
pH
3.0
3.5
4.0
4.6
Alcohol
(% v/v)
Azcar
Residual
(% m/v)
Rendimiento
Eficiencia
(%)
(%)
7.65
7.78
7.94
8.05
1.30
1.19
0.81
0.80
38
38
39
39
75.03
76.31
77.85
78.90
90
Productivi
dad
(g/L*h)
2.01
2.05
2.09
2.12
Rendimiento (%) vs. pH del medio etapa de Fermentacin con Melaza y Jugo
de Caa Concentrado
60
40
41
36 38
Rendimiento
(%)
37
38
41
39
39
20
0
3
3,5
4,6
pH
Melaza inoculo tratado con pH
Jugo de caa inoculo tratado con pH
Figura 20. Rendimiento (%) Vs Tratamiento con pH en etapa de fermentacin con melaza y jugo de caa concentrado
Eficiencia (%) vs. pH del medio etapa de Fermentacin para Melaza y Jugo de
Caa Concentrado
100,0
80,0
82,5
73,7
75,0
76,0
76,3
77,9
83,1
78,9
60,0
Eficiencia (%)
40,0
20,0
0,0
3,5
4,6
pH
Jugo de Caa inoculo tratado con pH
Figura 21. Eficiencia (%) Vs Tratamiento con pH en etapa de fermentacin con melaza y jugo de caa concentrado
91
Productividad (g/L*h) vs. pH del medio etapa de Fermentacin para Melaza y

Jugo de Caa Concentrado
3
2
Productividad
(g/L*h)
2.01
1.92
2.15 2.09
1.98 2.05
2.16
2.12
3.5
4.6
pH
Jugo de Caa inoculo tratado con pH
Figura 22. Productividad (g/L*h) Vs pH del medio en etapa de fermentacin con melaza y jugo de caa (30 horas)
92
7. ANALISIS DE VARIANZA
7.1. ANOVA doble va
Los datos que registran en las tablas de anlisis de varianza doble va con nivel de
significancia de 0.05, corresponden a los obtenidos para porcentaje de rendimiento en cada uno
de los tratamientos con los dos antibiticos analizados.
Tabla 25. Frmulas generales para el anlisis de varianza de dos vas.
Recursos de
Variacin
Grados
de
Libertad
Suma de
Cuadrados
Media de
Cuadrados
Valor de
F
Tratamientos
(Dosis de
antibitico)
k-1
SSTR
MSTR=SSTR/k-1
MSTR/
MSE
Antibiticos
n-1
SSB1
MSB1=SSB1/n-1
Error
k(n-1)
MSB1/
MSE
SSE
SST=SSTR+SSB1+SSE
MSE=SSE/k(n-1)
Total
Donde:
n: nmero de observaciones
k: nmero de tratamientos
T: total
SST: Suma total de cuadrados
SSTr: Suma total de cuadrados entre tratamientos
SSE: Suma de cuadrados de error
SSB1: Suma de cuadrados del segundo recurso de variacin (antibiticos) MS:
Media de cuadrados
93
7.1.1. ANOVA doble va para Melaza como sustrato de fermentacin

Tabla 26. Datos de rendimiento (%) obtenidos con Melaza como sustrato de fermentacin
TAntibitico
Penicilina
Virginamicina
Total
Tratamiento (Dosis en ppm)

0,00
0,50
1,00
2,00
39
40
41
41
40
41
41
42
79
81
82
83
Total
161
164
325
Primer recurso de variacin

Hiptesis Nula para tratamientos (H0): No existe diferencia significativa entre los efectos de
las diferentes dosis de antibitico sobre el valor de rendimiento de fermentacin.
Hiptesis Alterna para tratamientos (H1): Existe diferencia significativa entre los efectos de las
diferentes dosis de antibitico sobre el valor de rendimiento de fermentacin.
Segundo recurso de variacin
Hiptesis Nula para los dos productos evaluados (H0): No existe diferencia significativa en el
efecto de los dos antibiticos evaluados sobre el rendimiento de fermentacin.
Hiptesis Alterna para los dos productos evaluados (H 1): Existe diferencia significativa en el
efecto de los dos antibiticos evaluados sobre el rendimiento de fermentacin.
CRITERIO DE ACEPTACIN: La hiptesis nula (H 0) se acepta slo si el valor de F

calculado no excede el valor de F tabulado y se rechaza si el valor de F calculado excede el
valor de F tabulado.
94
Tabla 27. ANOVA doble va (Melaza como sustrato de fermentacin)

Recursos de
Variacin
Tratamientos
(Dosis
antibitico)
Grados
de
Libertad
Suma de
Media de
Cuadrados Cuadrados
Valor de
F
F
Tabulado
4,38
1,46
12,17
9,28
1
3
7
1,13
0,36
5,87
1,13
0,12
9,42
10,10
Antibiticos
Error
Total
( = 0.05)

SE RECHAZA H0, se acepta H1, es decir, si existe diferencia significativa entre los
efectos de las diferentes dosis de antibitico para melaza como sustrato de fermentacin con
un nivel de significancia de 0.05.

SE ACEPTA H0, se rechaza H1, es decir, no existe diferencia significativa entre los
efectos de los antibiticos penicilina y virginamicina sobre el rendimiento de fermentacin
utilizando melaza como sustrato.
7.1.2. ANOVA doble va para Jugo de caa como sustrato de fermentacin

Tabla 28. Datos de rendimiento (%) obtenidos con Jugo de caa como sustrato de
fermentacin
95
Antibitico
Penicilina
Virginamicina
Total
Tratamiento (Dosis en ppm)

0,00
0,50
1,00
2,00
38
38
39
39
40
40
40
40
78
78
79
79
Total
154
160
314

Hiptesis Nula para tratamientos (H 0): No existe diferencia significativa entre los efectos de las
Hiptesis Alterna para tratamientos (H1): Existe diferencia significativa entre los efectos de las

Hiptesis Nula para los dos productos evaluados (H0): No existe diferencia significativa en el
efecto entre los dos antibiticos evaluados.
Hiptesis Alterna para los dos productos evaluados (H 1): Existe diferencia significativa en el
efecto entre los dos antibiticos evaluados.
Tabla 29. ANOVA doble va (Jugo de caa como sustrato de fermentacin)

Recursos de
Variacin
Tratamientos
(Dosis de
Grados
de
Libertad
3
Sumas de
Media de
Cuadrados Cuadrados
0,50
0,17
96
Valor de
F
F
Tabulado
1,00
9,28
antibitico)
Antibiticos
Error
Total
( = 0.05)
1
3
7
4,50
0,50
5,50
4,50
0,17
26,47
10,10

SE ACEPTA H0, se rechaza H1, es decir, no existe diferencia significativa entre los
efectos de las diferentes dosis de antibitico para Jugo de caa como sustrato de
fermentacin con un nivel de significancia de 0.05.
SE RECHAZA H0, se acepta H1, es decir, existe diferencia significativa entre los efectos de
los antibiticos penicilina y virginamicina sobre el rendimiento de fermentacin
utilizando Jugo de caa como sustrato.
7.2. ANOVA una va
97
Los datos que registran en las tablas de anlisis de varianza una va con nivel de
significancia de 0.05, corresponden a los obtenidos para porcentaje de rendimiento en cada
uno de los tratamientos con las variaciones de pH en los dos sustratos de fermentacin.
Tabla 30. Frmulas generales para anlisis de varianza una va.
Recursos de
Variacin
pH del
sustrato
Error
Total
( = 0.05)
Grados
de
Libertad
Suma de
Cuadrados
Media de
Cuadrados
k-1
SSTR
MSTR=SSTR/k-1
k(n-1)
kn-1
SSE
SST=SSTR+SSE
MSE=SSE/k(n-1)
Valor de
F
MSTR/
MSE
Donde
n: nmero de observaciones
k: nmero de tratamientos
T: total
SST: Suma total de cuadrados
SSTr: Suma total de cuadrados entre tratamientos
SSE: Suma de cuadrados de error
MS: Media de cuadrados
7.2.1. ANOVA una va para tratamiento con pH en Melaza como sustrato de

fermentacin
98
Tabla 31. Datos de rendimiento (%) obtenidos con Melaza como sustrato de fermentacin
Sustrato
Melaza
Total
pH
3,0
3,5
36
36
35
37
144
38
4,0
41
4,6
40
36
36
38
148
40
40
41
162
41
40
41
162
Total
155
153
151
157
616
Hiptesis Nula (H0): No existe diferencia significativa entre los efectos de los diferentes
valores de pH evaluados de sobre el rendimiento de fermentacin.
Hiptesis Alterna (H1): Existe diferencia significativa entre los efectos de los diferentes
valores de pH evaluados sobre el rendimiento de fermentacin.
Tabla 32. ANOVA una va Melaza como sustrato de fermentacin

Recursos de
Variacin
pH del
Sustrato
Error
Total
( = 0.05)
Grados
de
Libertad
Suma de
Media de
Cuadrados Cuadrados
66
22
12
15
8
74
0,67
Valor de
F
F
Tabulado
32,84
3,49
Se RECHAZA H0, se acepta H1, es decir, existe diferencia significativa entre los efectos de
los diferentes valores de pH evaluados sobre el rendimiento con melaza como sustrato de
fermentacin.
99
7.2.2. ANOVA una va para tratamiento con pH en Jugo de caa como sustrato de
fermentacin
Tabla 33. Datos de rendimiento (%) obtenidos con Jugo de caa concentrado como sustrato
de fermentacin
Sustrato
pH
3,0
3,5
Jugo de
Caa
39
39
35
Total
37
150
39
38
37
4,0
40
39
37
4,6
39
39
38
38
152
39
155
40
156
Total
157
155
147
154
613
Hiptesis Nula (H0): No existe diferencia significativa entre los efectos de los diferentes
valores de pH evaluados de sobre el rendimiento de fermentacin.
Hiptesis Alterna (H1): Existe diferencia significativa entre los efectos de los diferentes
valores de pH evaluados sobre el rendimiento de fermentacin.
Tabla 34. ANOVA una va (Jugo de caa como sustrato de fermentacin)

Recursos de
Variacin
Grados
de
Libertad
Suma de
Media de
Cuadrados Cuadrados
100
Valor de
F
F
Tabulado
pH del
Sustrato
Error
Total
5,69
1,90
12
15
19,75
25,44
1,65
1,15
3,49
Se ACEPTA H0, se rechaza H1, es decir, no existe diferencia significativa entre los
efectos de los diferentes valores de pH evaluados sobre el rendimiento con Jugo de caa
como sustrato de fermentacin.
7.3. Medidas de tendencia central para datos de productividad de las fermentaciones

Tabla 35. Medidas de tendencia central datos de productividad
Sustrato y Tratamiento del inculo
Melaza tratamiento con Penicilina
Melaza tratamiento con Virginamicina
Jugo de caa tratamiento con Penicilina
Jugo de caa tratamiento con Virginamicina
Melaza tratamiento con descenso de pH
Jugo de caa tratamiento con descenso de pH
Media aritmtica
Desviacin
Productividad (g/L*h)
estndar
2,165
0,0012
2,152
0,0011
2,040
0,00005
2,13
0,0003
2,05
0,0100
2,06
0,0010
8. DISCUSIN DE RESULTADOS
Para iniciar el proceso de reproduccin de la levadura en la fermentacin alcohlica a partir
de mieles de caa, fue necesario diluir tanto la melaza como el jugo concentrado para lograr
una menor concentracin de azcares totales reductores; al diluir estas mieles, la cantidad
101
de agua disponible para los microorganismos (Aw) aument y por ende se favoreci su
desarrollo.
La adicin de agua, de acuerdo a lo reportado por Jacques et al en 1999, adems de facilitar
la hidrlisis de la sacarosa presente en las mieles, probablemente ocasion la dilucin de
los dems componentes de las mismas, de manera que se redujo la presin osmtica y como
consecuencia, a travs de las paredes celulares de las levaduras y bacterias,
aument el
flujo de iones y molculas desde y hacia el interior celular, logrando as su activacin

metablica y consecuente divisin bajo condiciones de aireacin adecuadas para conseguir
la oxidacin de las molculas energticas presentes en el medio de cultivo (Jacques et al,
1999).
La consecuencia de este fenmeno de dilucin de las mieles sobre las poblaciones
bacterianas puede observarse en el notable incremento de bacterias lcticas tras 24 horas de
propagacin de la levadura en los diferentes ensayos, as mismo, fue directamente
proporcional el volumen de agua adicionada con respecto a la concentracin de azcares en
el sustrato puro, es decir que se adicion mayor cantidad de agua de dilucin al jugo de
caa que a la melaza para lograr un porcentaje de azcares totales reductores similar para
ambos casos.
El azcar propio de las mieles de caa es la sacarosa, disacrido no considerado como
azcar reductor, sin embargo, ste es fermentable por la levadura porque dentro de su
material enzimtico posee la enzima invertasa, la cual cataliza la reaccin en la que la
sacarosa se desdobla en dos azcares reductores: glucosa y fructosa.
No obstante, en la fermentacin alcohlica, la hidrlisis de sacarosa en las mieles de caa,
es facilitada a travs de la adicin de agua con la consecuente generacin de glucosa y
fructosa, ambos monosacridos ingresan en la va glucoltica para la generacin de energa
y dos molculas de piruvato, las cuales constituyen los precursores de las dos molculas de
etanol por cada hexosa que lleva a cabo esta va, de manera que todo el azcar reductor en
102
las fermentaciones del ensayo se asumieron como glucosa para efectos de balances
estequiomtricos teniendo en cuenta que ambos monmeros tienen la misma ruta final
dentro de la va metablica (Jacques et al, 1999).
Adems de hidrolizarse, el azcar propio de las mieles de caa se someti a la accin de
cido sulfrico, para lograr la disminucin del pH del medio y reducir los riegos de
contaminacin por microorganismos y facilitar la inversin de la sacarosa. Este descenso de
pH debe ser controlado para no ocasionar daos metablicos e inactivacin de la levadura,
pues algunas cepas comerciales toleran valores de pH especficos que por lo general son
superiores a 2.0 de manera que el criterio para la determinacin del pH del medio debe
incluir su inocuidad sobre la levadura, el control de los contaminantes bacterianos y la
inversin de la sacarosa presente en el sustrato (Jacques et al, 1999), as que los valores de
pH evaluados deberan cumplir con estas caractersticas para ser seleccionados como
aplicables al proceso, sin embargo, el pH estndar en planta es de 4.6 no slo por su
inocuidad sobre la levadura sino por costos teniendo en cuenta los altos volmenes de
mosto que se manejan.
Adicional a esto, el uso de cido sulfrico en el pretratamiento de las mieles de caa se
realiza para ocasionar la precipitacin de compuestos en suspensin que generan problemas
de taponamientos y bloqueos tanto en intercambiadores de calor como en columnas de
destilacin, especialmente el calcio que se adiciona en forma de cal durante la clarificacin
del jugo de caa para la extraccin de azcar. El cido sulfrico reacciona con el calcio de
algunas sales presentes en el medio formando sulfato de calcio, compuesto conocido como
yeso, el cual es insoluble y se precipita en los tanques facilitando su separacin y logrando
un vino libre de slidos suspendidos y por ende evitando problemas de operacin (Jacques
et al, 1999).
No obstante, la generacin de este sulfato de calcio disminuye cuando la temperatura del
medio aumenta, de manera que lo ideal es que una vez termine el tiempo de fermentacin,
103
el vino permanezca algunas horas en reposo antes de la destilacin (4-5 horas) para lograr la
disminucin de la temperatura del mismo con la consecuente decantacin del sulfato de calcio
(Ethanol technology guide 2001); esta disponibilidad de tiempo depende de la capacidad
de la destilera y de la existencia de un tanque de decantacin y una centrfuga que separe
estos compuestos slidos del vino de fermentacin.
La cepa de levadura utilizada para llevar a cabo las fermentaciones fue una cepa de
Saccharomyces cerevisiae activa seca que se suspendi en agua a 41C para lograr su
activacin metablica y que despus de la hidratacin registr una viabilidad superior al 90%
ya que dentro de los componentes en los que se halla suspendida se encuentran vitaminas
como biotina y otros nutrientes que al hidratarse, generan una crema reconstituyente
lista para iniciar procesos de propagacin(Ethanol technology guide 2001), esta cepa de
levadura es homognea y en medio slido especfico creci formando colonias cremosas,
redondas, de borde regular.
Dicha activacin metablica de las levaduras lleva consigo la preparacin de las paredes
celulares para el intercambio y asimilacin de nutrientes exteriores y activacin de las
enzimas necesarias para la degradacin de los compuestos orgnicos y consecuente
respiracin y divisin celular; estas clulas requieren este proceso de aclimatacin
metablica para recuperar su actividad y lograr una produccin de alcohol eficiente, el tipo
de levadura activa seca, favorece el hecho de disponer de levadura en momentos precisos y
disminuye costos de mantenimiento de banco de cepas, este proceso de propagacin es el
que permite obtener el nmero de clulas deseadas a expensas de un sustrato determinado,
sin embargo, este tipo de levadura es recomendada bsicamente para ser utilizada en
sistemas de fermentacin por lotes, pues en sistemas continuos, el riesgo de contaminacin
bacteriana es ms alto y normalmente se utilizan cepas propagadas por escalamiento
(Bellisimi & Ingledew, 2005).
104
El tiempo mximo de 24 horas como tiempo de propagacin en los ensayos se determin

partiendo de que la cepa comercial en este tipo de sustrato azucarado requiere de un tiempo de
adaptacin entre 2-4 horas pues no ha sido propagada de forma continua y su fase
exponencial bajo condiciones de alimentacin continua en la planta de produccin oscila
entre 12 y 18 horas dependiendo de la velocidad de alimentacin, suministro de aire y
temperatura adecuada (entre 28 y 30C), no obstante, en algunos casos la cepa no logra la
poblacin necesaria y/o los inculos tardan en ser solicitados y debe prolongarse el tiempo
(hasta 24 horas) y mejorarse las condiciones de mantenimiento.
Estos parmetros resultaron en un incremento considerable de clulas en fase de
crecimiento exponencial pues el nmero de clulas viables es indispensable a la hora de
determinar el inculo para fermentacin, sin embargo, el verdadero problema en la
industria sigue siendo la fase de adaptacin celular, pues las levaduras utilizan los
nutrientes de las mieles para sintetizar sus componentes celulares sin observarse un
incremento en la poblacin (Bellisimi & Ingledew, 2005).
Pasadas 24 horas a partir del momento en que la levadura tuvo contacto con las mieles de
tercera dilucin bajo parmetros controlados, la poblacin obtenida en el medio es del
orden de 108 clulas de levadura/ml, sta poblacin cuya viabilidad generalmente es
superior al 90%, fue suficiente para iniciar la fermentacin pues poblaciones superiores a 10 6
logran colonizar fcilmente el sustrato teniendo en cuenta que el volumen del inculo
corresponde al 30% del volumen efectivo de trabajo (VET) (Manual de Operaciones Planta
alcoqumica SUCROMILES S.A).
La contaminacin en melaza y jugo de caa correspondi a colonias presuntivas del gnero
Lactobacillus y en el caso de jugo de caa sin calentamiento se registr crecimiento de
colonias tpicas del gnero Leuconostoc.
105
El gnero Leuconostoc especie mesenteroides, es el microorganismo que normalmente se

asla en los derivados de caa de azcar, esta especie, tericamente puede eliminarse
cuando la temperatura del medio supera los 70C y cuando el pH es inferior a 4.5, sin
embargo, otros gneros de bacterias lcticas logran tolerar altas temperaturas gracias a la
resistencia de su material enzimtico y se activan una vez la temperatura desciende,
ejemplo de ello es el gnero Lactobacillus que se encuentra normalmente en lneas de
produccin que han sido sometidas a inyeccin de vapor y que alcanzan temperaturas de
incluso 100C (Jacques et al, 1999), de manera que as puede explicarse que durante las
fermentaciones slo se registr crecimiento tpico de Lactobacillus pues la temperatura
aplicada sobre los sustratos de tercera y segunda dilucin fue de aprox 70C garantizando
as la eliminacin del gnero Leuconostoc pero la permanencia de estos bacilos
termoresistentes.
La razn elemental por la cual debe eliminarse de los sistemas de fermentacin
Leuconostoc mesenteroides, mediante cualquier tipo de tratamiento, es su efecto nocivo y
colonizador que radica en la generacin de compuestos polimricos y ms especficamente
dextranas. Las dextranas son polmeros insolubles sintetizados a partir de la sacarosa y
cuyo efecto en el vino es perjudicial pues ocasiona prdidas de azcar para la fermentacin
alcohlica adems de causar encrustamientos que conllevan problemas de proceso a causa
del aumento de presin, adems, su presencia podra establecer un foco importante de
contaminantes microbianos por formar una masa compacta de difcil remocin
constituyndose en punto crtico en las industrias azucareras (Mibielli & Filho, 1999).
Para la deteccin oportuna de este microorganismo en un sistema de fermentacin

alcohlica existen diversos mtodos, algunos se basan en la estructura de su DNA, por
ejemplo PCR especfica de especie en la que se detectan las enzimas del metabolismo del
cido lctico y se da un amplificado de DNA fcilmente detectable por electroforesis
(Reguant et al, 2003), no obstante, stas tcnicas moleculares no estn disponibles a nivel
106
industrial debido a sus altos costos, por esta razn, los mtodos de identificacin de estas
especies bacterianas en las plantas productoras de vinos se realiza mediante mtodos
tradicionales como recuentos en placa en medios especficos y por determinacin qumica de
los polmeros producidos por los microorganismos. (Mibielli & Filho, 1999).
En el caso de Leuconostoc mesenteroides, las dextranas pueden identificarse mediante
hidrlisis cida con la consecuente liberacin de azcares reductores mediante el cultivo del
microorganismo en medios lquidos y/o agarizados con sacarosa donde la generacin de dextrana
es visible (Mibielli & Filho, 1999).
De otro lado, el gnero Lactobacillus, encontrado en todos los ensayos tanto en etapa de
reproduccin como en fermentacin e identificado claramente como bacilos Gram
positivos, son los causantes de las colonizaciones ms importantes sobre las mieles de caa
debido a la simplicidad de su metabolismo pues el piruvato generado por gluclisis lo
reducen a lactato cuando las condiciones de oxgeno son insuficientes para oxidar todo el
NADH formado y se origina la denominada fermentacin lctica (Mathews et al, 2002). Su
crecimiento es rpido en cuanto a nmero de clulas/ml se refiere contrario a gneros como
Leuconostoc, cuyo efecto nocivo principal es la polimerizacin de la sacarosa en el medio
(Mibielli & Filho, 1999).
Teniendo en cuenta que tanto la melaza como el jugo de caa de tercera dilucin sometidas
a calentamiento previo a 70C registraron crecimiento de Lactobacillus, una vez
adicionados los productos antibiticos ya exista una poblacin inicial capaz de resistir esta
temperatura de calentamiento y de reproducirse de manera que el antibitico no caus
efecto sobre la misma, probablemente si se utilizaran concentraciones ms altas de estos
antibiticos se lograra controlar la propagacin de esta poblacin contaminante inicial.
El comportamiento de la poblacin bacteriana actividad en el jugo de caa, tratado con
virginamicina a concentraciones iguales o superiores a 1ppm indic que la estructura
107
molecular de este antibitico logra una mayor efectividad sobre las bacterias lcticas
presentes en este sustrato azucarado, pues ste acta sobre la sntesis proteica bacteriana,
especficamente sobre el dominio de la peptidil-transferasa de la subunidad ribosomal 50S
(Garza et al, 2000), y adems, el bajo contenido de slidos del jugo de caa, pudo haber
favorecido la solubilidad de este producto antibitico y por ende su dispersin en todo el
medio lquido, razn por la cual tuvo mayor contacto con los microorganismos presentes.
Adicional a esto, puede suponerse que el contenido de iones en el sustrato influye de
manera importante en el desarrollo tanto de la levadura como de la microflora
contaminante, se deduce que es ms fcil desarrollarse en melazas con alto contenido
inico, sales minerales y slidos que en jugos o mieles puras. En promedio, los datos para
de cationes en jugos de caa concentrados registran 941ppm de Potasio, 8ppm de Hierro,
190ppm de magnesio y 400ppm de Calcio (Registros laboratorio Investigacin y Desarrollo
Qumico SUCROMILES S.A) y teniendo en cuenta que estos componentes se concentran a
medida que se somete a calentamiento el sustrato, en una melaza pueden registrarse valores
de 26000ppm de potasio, 700ppm de magnesio y 1000ppm de Calcio (PRAJ Technical
Analytical Report, 1999).
En los valores de rendimiento y productividad de las fermentaciones puede aplicarse este
concepto, pues independientemente de los niveles de contaminacin, la produccin de
alcohol fue significativamente ms alta cuando se utiliz melaza como sustrato en este tipo
de sistemas de fermentacin, el mximo valor de rendimiento fue de 42% obtenido con
melaza (inculo tratado con virginamicina 2.0 ppm) mientras el mximo obtenido con jugo
de caa fue de 40%.
Los inculos previamente tratados con penicilina y virginamicina y llevados a
fermentacin, influyeron de manera positiva en el rendimiento y productividad de la
fermentacin con melaza, sta era la suposicin planteada desde el inicio de la
investigacin y los resultados tras 30 horas de proceso revelaron que efectivamente si existe
108
diferencia significativa entre los efectos de las diferentes dosis de cada antibitico para
melaza de caa con un nivel de significancia de 0.05 (P=0.05), es decir que el rendimiento
de la fermentacin vari con respecto a las dosis aplicadas durante la etapa de reproduccin
de la levadura.
Adicional a esto, se evidenci que no hay diferencia significativa entre los efectos de los dos
antibiticos analizados, es decir, que el rendimiento de la fermentacin bajo los mismos
parmetros no mostr que la penicilina tiene un mejor efecto que la virginamicina en el
control de las bacterias lcticas en el proceso y viceversa, de manera que la eleccin entre uno
y otro
producto
podra depender bsicamente de su
costo
comercial
y de la
disponibilidad de los mismos.

Los valores de productividad de las fermentaciones con melaza no varan
significativamente entre s con las diferentes dosis de los antibiticos adicionados durante
la etapa de propagacin
los valores oscilan entre 2.12 y 2.21 g de alcohol/ litro de
vino*hora de fermentacin, los datos no se dispersan significativamente alrededor de su

media pues su desviacin estndar es de 0.001 g. La produccin de alcohol en todos los
casos fue similar durante las 30 horas de fermentacin, este tiempo es el mximo utilizado
en planta para lograr una fermentacin total de los azcares y consecuentemente un mnimo
de azcar residual.
Normalmente en fermentaciones con melaza en sistemas de fermentacin por lotes, el
porcentaje de azcar residual es superior al 2% (p/v) con un mximo de 2.4% (p/v) en
condiciones apropiadas, sin embargo, en las fermentaciones a nivel de laboratorio este
residual fue menor en la mayora de los casos pues los volmenes inferiores permiten un
mayor control de los parmetros del proceso y una vez se realiza el escalamiento, las
concentraciones de azcar pueden lograr la inhibicin por metabolito, pues la levadura se
satura y deja de fermentar, este fenmeno metablico se debe a que las enzimas
catalizadoras en las diferentes vas sufren una represin por exceso de sustrato o exceso de
109
actividad, adems, la clula al no tener oxgeno disponible y realizar exclusivamente

metabolismo fermentativo entra en una fase de latencia, momento en el cul, cesa la
conversin de azcar en alcohol y se genera este porcentaje de azcar no fermentado
El rendimiento terico esperado corresponde al 51.1% a partir de la glucosa fermentable,
sin embargo y teniendo en cuenta el aporte de Pasteur que consiste en que slo el 95% de
los azcares totales reductores son convertidos en alcohol por la levadura Saccharomyces
cerevisiae, el 5% restante es utilizado para crecimiento del microorganismo, produccin de
otros metabolitos, consumo por parte de contaminantes bacterianos y conversin en
productos infermentables, entre otros (Jacques et al, 1999), fenmeno que evidentemente se
dio en las fermentaciones del ensayo pues ningn rendimiento fue superior al 42%, de
manera que ms del 5% de azcares totales reductores fueron utilizados para la generacin
no slo de biomasa en propagacin sino que
adicionalmente otra parte del azcar fue
utilizado para la generacin de otros compuestos diferentes al alcohol durante las

fermentaciones tales como cidos orgnicos y alcoholes superiores, indeseables en el
proceso .
Los rendimientos obtenidos estuvieron entre el 38-42%, lo cual es menor en un 13,1% y un
9,1% respectivamente al mximo posible, esto debido adicionalmente a que la poblacin
bacteriana increment con respecto a la inicial presente en el sustrato lo cual a su vez fue una
evidencia indirecta del consumo de azcar por contaminacin, as como el incremento de
acidez voltil en el medio de fermentacin.
Normalmente la produccin de acidez voltil es atribuda a contaminantes bacterianos, sin
embargo, la bibliografa reporta que en las mieles de caa y por ende en un mosto
fermentado pueden encontrarse tres (3) categoras bsicas de cidos: cidos orgnicos
naturales que son los que proceden directamente del sustrato azucarado, normalmente son
de origen vegetal y se encuentran en la mayora de mostos de fermentacin, dentro de estos
110
se encuentran los cidos tartrico, mlico y ctrico; cidos orgnicos derivados, aquellos
producidos durante los procesos fermentativos a los que es sometido el mosto y son
fundamentalmente los cidos actico, lctico y succnico y finalmente, los cidos
inorgnicos cuyo origen es mineral, entre los que se destaca el cido sulfrico, presente
normalmente en forma de sulfatos (Blasco 2001).
En el caso de acidez voltil para los sustratos concentrados, se tiene que para la melaza de
caa utilizada el valor inicial fue de 6530 ppm, significativamente superior al registrado por
el jugo de caa concentrado (1602 ppm), sta acidez, entendida como el contenido de
cidos orgnicos presentes en la muestra puede asociarse a la presencia de contaminantes
bacterianos pero adicionalmente al mismo origen de las mieles pues durante los cultivos de
caa pues el desarrollo de compuestos qumicos es diverso y as como sucede con los
viedos donde las plantas durante su proceso de maduracin natural, generan cidos
detectados posteriormente en el vino (Blasco 2001), en la caa podra presentarse una
situacin similar, de manera que en un jugo o miel de primera extraccin, donde el
contenido de agua no es suficiente para el desarrollo de bacterias y la presin osmtica es
tan alta, la accin bacteriana sobre la produccin de acidez voltil es incierta por lo que se
podra inferir que una parte de la acidez voltil contenida en la melaza es de origen vegetal
y la otra parte corresponde a la accin microbiana y al tratamiento de la misma durante el
proceso de extraccin del azcar.
En el caso de mieles y vinos el mtodo utilizado ms comnmente para medir acidez voltil
es el mtodo por arrastre de vapor de agua y posterior titulacin con una solucin bsica
(Blasco 2001), sin embargo, este resultado arroja valores de cidos totales y no permite
conocer cul es el cido especfico que se encuentra en mayor concentracin en una
muestra, probablemente este sea un punto clave a desarrollar para conocer la incidencia de
esta variable en el anlisis de rendimiento del proceso fermentativo en estudio.
111
La concentracin de acidez voltil tras la etapa de reproduccin de la levadura en melaza

excedi en 1177 ppm (promedio de observaciones para todos los ensayos) a los valores
promedio del sustrato inicial: melaza de tercera dilucin, de manera que estos cidos
voltiles fueron generados durante sta etapa del proceso por las bacterias contaminantes.
Estudios realizados por Remize et al en el ao 2000, revelan que algunas cepas de levadura,
denominadas levaduras salvajes silvestres de tipo Saccharomyces y No Saccharomyces,
tambin producen cantidades importantes, usualmente entre 57 y 145ppm, de estos cidos
orgnicos en especial actico, que establece un balance organolptico de la fermentacin y
que para le levadura constituye una especie de regulacin metablica frente a la acidez
exterior, pero aumenta la acidez voltil que sumada a la generada por las bacterias
contaminantes constituye el total de acidez en el proceso y por ende prdidas de azcar
fermentable (Remize et al, 2000).
La produccin de cido actico por la levadura es controlada por ella misma durante el
metabolismo fermentativo, en la fermentacin alcohlica, el acetato es generado por
Saccharomyces cerevisiae y a travs del complejo enzimtico piruvato descarboxilasa,
acetaldehdo deshidrogenada y acetil-CoA sintasa se da el transporte acetil-coA desde la
mitocondria hacia el citosol, de manera que en este compartimiento de la clula de levadura
se origina la formacin de acetato lo que conduce adems a la regeneracin de equivalentes
reducidos: NADH y NADPH para mantener el balance redox al interior celular, de forma
que la importancia fisiolgica de la produccin del acetato dentro de la clula es
inminente.(Remize et al, 2000).
No obstante, cuando la produccin de cido actico es excedida por parte de la levadura,
ste es expulsado al exterior para mantener el balance interno y es justo en este momento
cuando se generan los altos valores de acidez voltil en vinos, estos estudios se han
realizado en vinos de uva y fermentaciones con cebada donde las concentraciones de cidos
orgnicos son controladas drsticamente, sin embargo, los estudios en fermentaciones para
112
la produccin de alcohol con mieles de caa no enfatizan en la produccin innata de cidos

orgnicos por parte de la levadura Saccharomyces cerevisiae, esta produccin normalmente se
atribuye a bacterias contaminantes y levaduras salvajes presentes durante la
fermentacin alcohlica (Remize et al, 2000).
Estudios realizados en algunos mostos y vinos de uvas se confirma que el cido actico es
producido por la levadura fermentadora: rangos de 200-400ppm se producen normalmente por
Saccharomyces cerevisiae durante la fermentacin, los vinos dulces son ms propensos a
niveles elevados de acidez voltil, niveles de 1000ppm fueron obtenidos durante la
fermentacin en mostos de alta concentracin (>15% m/v azcar reductor) a partir de uvas de
primera calidad (Rodriguez & Smith, 2001).
Huang et al, 1994, observaron variaciones en el nivel de cido actico tan altas como
4000ppm debidas al aumento en los cultivos de Lactobacillus durante la primera
fermentacin de los vinos, adems, se indica que la actividad de estos microorganismos es
la causa principal de acidez voltil y su origen en las uvas se atribuye al deterioro por parte
de insectos que posiblemente llevan consigo este tipo de bacterias y a tratamientos de
control ineficientes durante la cosecha de las mismas (Rodriguez & Smith, 2001).
De acuerdo con los resultados de rendimiento en fermentaciones a partir de jugo de caa

concentrado bajo tratamiento con virginamicina (40% de rendimiento en todos los
tratamientos), este antibitico, utilizado en concentraciones superiores a 0.5ppm favorece
que el inculo mejore sus caractersticas microbiolgicas, pues controla la poblacin de
bacterias lcticas (poblacin de BAL del orden de 105), contrario a lo que ocurri en
fermentaciones cuyo inculo fue tratado con penicilina a concentraciones de 0.5ppm en las
que se obtuvo un rendimiento del 38% y concentraciones de 1.0ppm y 2.0ppm en las que se
obtuvo un rendimiento mximo de 39% y cuya poblacin de BAL ambos casos fue del
orden de 106.
113
Los porcentajes de azcar residual tras las 30 horas de fermentacin con jugo de caa
fueron inferiores al 1.2%(p/v), de manera que se esperaba que todo el azcar que ingres al
proceso se convirtiera en alcohol, es decir que el rendimiento sera de aproximadamente
48.5% (segn Pasteur), sin embargo, esto no ocurri pues el mximo valor alcanzado fue de
40%.
Estos resultados evidencian que las condiciones de proceso permitieron prdidas de azcar
probablemente por: generacin de otros compuestos diferentes al etanol por parte de los
microorganismos contaminantes que son en esencia bacterias lcticas en jugo de caa como
sustrato de fermentacin; consumo de azcar por parte de la levadura para su
multiplicacin (durante la fermentacin la tasa de respiracin y multiplicacin de la
levadura es baja, sin embargo, ocurre para evitar la muerte celular) y factores de operacin,
constituyen prdidas de rendimiento superiores al 7%.
Infortunadamente, el recuento inicial en fermentacin no se tuvo en cuenta una vez se
inocul con la levadura y consecuentemente el recuento final no permiti conocer el
incremento de biomasa con respecto al inicial, adems, tras las 30 horas de fermentacin, la
biomasa en el medio tiende a sedimentarse y al entrar en su fase estacionaria su viabilidad
disminuye hasta ser del 20-30% que comparada con la inicial (100%) es significativamente
baja (Cuando se realizaron los anlisis al vino en los ensayos, sta biomasa ya haba sido
separada del mismo).
En la industria, la biomasa al final de la fermentacin slo se tiene en cuenta tras
centrifugacin cuando se recupera mezclada con el sulfato de calcio generado, no se realiza
recuento de clulas en el vino, se conoce por histricos que la viabilidad es baja pero no se
determina poblacin de manera constante.
114
Los valores de acidez voltil en el jugo de caa despus de la etapa de reproduccin en los
diferentes tratamientos son altos (entre 2748-2972ppm) comparados con los obtenidos
despus de la etapa de reproduccin con melaza (Entre 1385-1649ppm), evidenciando que
la produccin de estos metabolitos por accin bacteriana es importante y teniendo en cuenta
que los valores de cido lctico y cido actico tolerables por la levadura son de 8000ppm y
500ppm respectivamente se sugiere que esta acidez voltil bsicamente corresponde al
primero (Bely et al 2003), el cul fue producido durante las fermentaciones por la
poblacin de Bacterias cido lcticas (BAL) presente en el sustrato.
En la caracterizacin de los sustratos iniciales no se realiz determinacin de bacterias
acticas debido a que normalmente en los controles microbiolgicos de rutina no se
encontraban bacterias Gram negativas
a lo largo del proceso. Esta determinacin de
bacterias acticas debera incluirse dentro del seguimiento microbiolgico al proceso y

descartar cualquier posibilidad de su presencia en el mismo.
En los ensayos a partir de melaza son similares a los obtenidos con jugo de caa de manera
que podra asumirse que por un lado la misma naturaleza de la melaza ocasiona prdidas
por generacin de azcar residual tras la fermentacin, mientras que las prdidas con jugo
de caa como sustrato, corresponden a la capacidad de este medio diluido para facilitar la
proliferacin de poblaciones de bacterias lcticas y por ende la prdida de azcar por la
generacin de biomasa, nuevamente se contemplara la posibilidad de medir biomasa al
final de cada fermentacin mediante recuento pues en esta investigacin el objetivo era
esencialmente evaluar las poblaciones de bacterias lcticas en etapa de reproduccin tras el
tratamiento con antibiticos y su repercusin en el rendimiento de la fermentacin
En la evaluacin de alternativas para el control de la poblacin contaminante, el tratamiento
de descenso del pH tanto del medio de propagacin como de fermentacin con melaza y
jugo de caa se obtuvo que en este caso la cepa comercial (activa seca) de Saccharomyces
cerevisiae utilizada, es sensible a pH 3.0 y 3.5 ya que tanto la poblacin como la viabilidad
115
se vieron afectadas al utilizar este pH en el medio, el intercambio de los iones H + con el

medio probablemente generaron en las clulas un desequilibrio inico que bloque los
canales de intercambio celular pues un medio hipertnico ocasiona una respuesta repulsiva por
parte de la clula, seguramente la maquinaria enzimtica igualmente se vio afectada por estos
valores de pH y la actividad metablica general de la levadura entr en un estado de inercia
(Blumberg & Alder, 1997).
Paralela a la disminucin de poblacin y viabilidad de la levadura, la poblacin de bacterias
cido lcticas
disminuy de la misma forma, recuentos en el orden de 10 4 fueron los
obtenidos cuando el pH del medio fue de 3.0 y 3.5, comparados con los obtenidos a pH 4.0
y 4.6, sin embargo los valores de acidez voltil son similares entre uno y otro tratamiento
pues su rango fue de 11ppm entre s de manera que estos valores no podran atribuirse
nicamente a la accin bacteriana; nuevamente cabe la posibilidad que el mtodo para la
determinacin de acidez voltil pueda tener la limitante de determinar acidez voltil total
sin discriminacin del tipo de cido encontrado en mayor concentracin.
A partir de estos resultados durante la etapa de reproduccin tanto para melaza como para
jugo de caa concentrado a valores de pH 3.0 y 3.5, se obtuvieron como consecuencia
rendimientos inferiores en la fermentacin: 36 y 37% para melaza y 38% para jugo de caa,
comparados con los obtenidos a pHs 4.0 y 4.6: 41% para melaza y 39% para jugo de caa.
Los valores de azcar residual al final de las fermentaciones aumentaron conforme la
poblacin de levadura fue menor al final de la etapa de reproduccin en cada caso, es decir
que con pH de 3.0 y 3.5 tanto para melaza como para jugo de caa, las poblaciones fueron
menores y por ende los valores de azcar residual al final de la etapa de fermentacin
fueron mayores, corroborando que para esta relacin en fermentacin por lotes (30%
inculo: 70% mosto), la poblacin adecuada de levadura es del orden de 10 8 celulas/ml
para garantizar la conversin eficiente del azcar presente en el mosto fermentable (Jacques
et al, 1999).
116
El anlisis estadstico muestra que utilizando jugo de caa como sustrato de fermentacin
sometido a cambios de pH s existe diferencia significativa entre los efectos de los valores
de pH evaluados sobre el rendimiento de la fermentacin debida a la disminucin de la
capacidad metablica y reproductiva de la levadura, cuyo efecto inmediato es la
incapacidad para fermentar los azcares reductores del sustrato, los valores de
productividad son inferiores a pH 3.0 y 3.5, de manera que el efecto de este descenso de pH
no favorece el proceso y por el contrario incluye un consumo adicional de cido sulfrico.
Ante estos resultados, la opcin de utilizar el descenso de pH sobre los dos sustratos de
fermentacin evaluados no representa beneficios importantes en cuanto a rendimiento de
fermentacin se refiere, por el contrario afecta el proceso de manera considerable ms
ampliamente en melaza, pues los valores de rendimiento a pHs 4.0 y 4.6 con este sustrato de
fermentacin son significativamente ms altos que los obtenidos con jugo de caa
concentrado 41% Vs 39% respectivamente; esto podra indicar que bajo descenso de pH no hay
una relacin directamente proporcional entre las poblaciones de bacterias
y el
rendimiento de las fermentaciones con los dos sustratos mencionados, probablemente se trata
de otros factores que afectan dichos resultados.
Una explicacin a este evento podra ser que en sistemas de fermentacin por lotes, el
tiempo de retencin de la levadura en reproduccin as como el tiempo que tardan los vinos
fermentados en ser destilados es menor con respecto a sistemas continuos donde suele ser ms
importante
el
control de los contaminantes
bacterianos,
pues bsicamente
las
poblaciones bacterianas no permanecen el tiempo suficiente en el sistema para lograr la

colonizacin de los sustratos y reproducirse a tal punto que logren afectar el rendimiento de la
Probablemente la utilizacin de compuestos antibiticos para generar levadura limpia e
iniciar la etapa de propagacin debe hacerse a concentraciones superiores a 2.0ppm para
lograr un mejor efecto en el control de las bacterias cido lcticas contaminantes y evitar
117
prdidas de azcar en etapa de reproduccin, adems, la acidulacin del sustrato de

fermentacin debe ser constante como control de los contaminantes, como mecanismo
facilitador para la inversin de la sacarosa y precipitacin de la levadura y las sales de
calcio (sulfato de calcio generado) sin que se afecte su metabolismo y sin ocasionar
prdidas por consumo innecesario.
De esta manera, el estndar de pH que hasta el momento se ha manejado para melaza (4.6)
en planta es el adecuado en el proceso sin que la cepa de levadura actual vea afectada en su
metabolismo y el consumo de cido sulfrico sea razonable, sin embargo, cuando exista la
posibilidad de usar jugo de caa concentrado como sustrato de fermentacin, la opcin de
disminuir el pH del medio puede ser favorable pues el incremento de la poblacin de
bacterias lcticas es superior cuando se utiliza este sustrato debido a sus caractersticas y al
nivel de agua que debe adicionarse para lograr una concentracin de azcar determinada.
118
9. CONCLUSIONES
Se demostr que la poblacin de bacterias acido lcticas presentes naturalmente en
las mieles de caa utilizadas como sustratos de fermentacin para la produccin de
alcohol, en sistemas de fermentacin por lotes pueden ser controladas con el uso de
antibiticos, sin embargo, sta poblacin contaminante a niveles menores o iguales
a 106 en el inculo, no afect significativamente el rendimiento de la fermentacin.
Se pudo constatar que el uso de penicilina y virginamicina puede tenerse en cuenta
como medida de control de contaminacin por bacterias acido lcticas, no obstante,
las concentraciones sugeridas por el fabricante en este caso no fueron suficientes y
no aportaron un beneficio significativo al proceso.
Se observ que el tratamiento de descenso de pH (3.0 y 3.5) en los medios de
reproduccin y fermentacin con melaza y jugo de caa no constituye una
alternativa o medida favorable para el control de bacterias lcticas, pues afecta la
poblacin y viabilidad de la levadura y por ende repercute en el rendimiento y
productividad de la fermentacin.
El uso de virginamicina en jugo de caa concentrado como sustrato de fermentacin
a concentracin de 1.0ppm y 2.0ppm logr disminuir una unidad logartmica el
recuento de bacterias lcticas en la etapa de propagacin con respecto al control
donde no se utiliz ningn antibitico, sin embargo, el rendimiento y productividad
de las fermentaciones inoculadas bajo estas condiciones no vari significativamente.
119
10. RECOMENDACIONES
En la fermentacin alcohlica a partir de mieles de caa es necesario disminuir
principalmente la poblacin contaminante inicial, pues es a partir de esta es que se
incrementan los niveles a lo largo del proceso ya que las condiciones del mismo son
favorables no slo para la levadura sino para bacterias acido lcticas; para lograr
esta disminucin, sera necesario reevaluar y estandarizar el tiempo de exposicin a
temperatura de 70C y lograr el calentamiento suficiente de manera que la poblacin
inicial sea tan baja que no logre incrementar dramticamente durante el tiempo de
propagacin de la levadura.
Realizar ensayos a escala piloto utilizando concentraciones de antibitico similares
y concentraciones ms altas para evaluar si favorecen la disminucin de la
poblacin de bacterias lcticas y conocer si con el escalamiento, los resultados son
ms efectivos y el inculo que se obtiene tras la propagacin representa la obtencin
de valores de rendimiento y productividad ms altos.
Evaluar si se est generando exceso de biomasa en fermentacin ya que este podra
ser un factor importante a tener en cuenta a la hora de analizar prdidas de azcar
pues la divisin celular puede estar ocurriendo durante el tiempo de fermentacin y
esta medicin podra constituir otro dato importante para el anlisis de resultados de
rendimiento y productividad de las fermentaciones.
El mtodo actual con el que se determina acidez voltil en mieles y vinos es general,
no indica cual es el cido que se produce en mayor cantidad, sera conveniente
hacer esta determinacin mediante HPLC para lograr una aproximacin ms real al
origen de valores de acidez voltil en mieles y su drstico incremento en vinos de
fermentacin.
120
Sera favorable validar y estandarizar el mtodo para la deteccin de bacterias

acticas durante la etapa de reproduccin de la levadura y contemplar el hecho que
estas bacterias puedan constituir un riesgo para la prdida de azcar en el proceso y
en caso de presentarse, si los metabolitos que producen inciden en los valores de
acidez voltil normalmente registrados en proceso.
121
11. REFERENCIAS
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126
12. ANEXOS
ANEXO 1
DETERMINACION DE LA MORFOLOGIA DE LA LEVADURA
Mezclar vigorosamente la muestra ya que la levadura se precipita fcilmente.
Tomar una gota de la muestra y colocarla sobre una lmina portaobjetos y cubrir
con una laminilla.
Montar la lmina en el microscopio y enfocar en el objetivo de 10X, despus pasar
al objetivo de 40X donde se realiza la observacin.
Determinar el porcentaje de gemacin y homogeneidad de la levadura.
127
ANEXO 2
RECUENTO EN CMARA DE NEUBAUER Y PORCENTAJE DE VIABILIDAD
Levadura Hidratada:
Dilur 11g de levadura hidratada
en un frasco de vidrio, adicionando 99g de agua
de pozo.
Mezclar hasta obtener una solucin homognea.
Tomar 1cm3 de a solucin de levadura hidratada II y llevar a un baln aforado de
100 cm3 adicionado con azul de metileno al 1%.
Montar la muestra en la cmara de recuento y realizar el recuento en el cuadrante
del centro y teniendo en cuenta las clulas que estn gemando a partir del tamao de
las mismas.
El recuento de clulas obtenidas se multiplica por el factor de dilucin 10 7 y se
expresa en clulas/ cm3.
El porcentaje de viabilidad se obtiene multiplicando el nmero de clulas vivas *
100 y dividiendo por el nmero de clulas totales.
Levadura en Proceso de Reproduccin y Fermentacin:
Mezclar vigorosamente la muestra de la cuba a analizar.
Tomar 1 cm3 de muestra de la cuba de reproduccin o el fermentador utilizando una
pipeta graduada y verter en un baln aforado de 100 cm 3 adicionado con azul de
metileno al 1%.
Se realiza el mismo montaje del anterior literal.
El recuento de clulas obtenidas se multiplica por el factor de dilucin y el factor de
la cmara.
El porcentaje de viabilidad se obtiene multiplicando el nmero de clulas vivas *
100 y dividiendo por el nmero de clulas totales.
128
ANEXO 3
DETERMINACION DE LA CONCENTRACION EN MEDIO SLIDO DE BACTERIAS
CIDO LCTICAS
A. MUESTREO
La toma de muestras debe realizarse bajo condiciones de esterilidad y con instrumentos
previamente esterilizados 15 minutos a 15 libras de presin y 121C, segn los niveles
esperados de contaminantes y dependiendo del tratamiento previo de cada muestra se
realizan diluciones seriadas en agua tamponada agua peptonada con ayuda de micropipeta
y dentro de una cmara de flujo laminar previamente limpia, cada una de las diluciones
deseadas se vierte en cajas de petri estriles en los volmenes adecuados para la dilucin.
B. SIEMBRA EN PLACA
Para el aislamiento e identificacin de bacterias acidolcticas se utiliza el medio de cultivo
agarizado MRS /Marca Difco) y la tcnica de siembra en profundidad, el cual se prepara
utilizando 70g/L del medio de cultivo slido, calentamiento hasta ebullicin, adicin de
antifngico y posterior autoclavado15 minutos a 15 libras de presin y 121C, enfriamiento
hasta 37C, pH final 6.5 y bajo cmara de flujo laminar se vierte el medio sobre las cajas de
petri previamente adicionadas con la muestra, se espera su solidificacin y se adiciona una
segunda capa sellante para garantizar la condicin de anaerobiosis.
C. INCUBACIN
Cuando el medio de cultivo ya se ha solidificado, las cajas se invierten y se incuban en
cmaras de anaerobiosis a 37C por 48 horas, luego de transcurrido este tiempo las colonias de
bacterias acidolcticas tienen un tamao considerable y entonces se procede a realizar el
recuento teniendo en cuenta la correspondiente dilucin realizada a la muestra.
129
D. EXPRESIN DE RESULTADOS
Los resultados del recuento se expresan en UFC de bacterias acidolcticas/ml para muestras
lquidas y deben reportarse con una sola cifra decimal y el exponente que corresponda.
Composicin MEDIO MRS
g/L
Peptona
10.0
Extracto de Levadura
5.0
Extracto de Carne
5.0
D(+) glucosa
20.0
Hidrogeno fosfato dipotsico
2.0
Tween 80
1.0
Citrato diamnico
2.0
Acetato sdico
5.0
Sulfato de magnesio
0.05
Sulfato de manganeso
0.1
Agar agar
12.0
Esterilizar a 121 oC y 15 libras de presin. Adicionar ciclohexamida al 0.1 %.
ANEXO 4
AISLAMIENTO EN MEDIO SLIDO YM DE LEVADURA HIDRATADA
A. MUESTRA
130
La muestra de la levadura hidratada en agua a 41C se toma con un asa estril y se siembra por
aislamiento en el medio slido especfico, en este caso medio YM.
B. INCUBACIN
Las cajas de petri sembradas con el microorganismo se incuban de 30-32C durante 48
horas y tras este tiempo se realiza la observacin directa de las colonias.
C. INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Las colonias redondas, grandes que presenten color crema y borde uniforme corresponden a la
levadura evaluada, las colonias ms pequeas que puedan crecer en el medio
corresponder a colonias bacterianas, sin embargo para evitar este crecimiento puede
adicionarse al medio un antibitico que evite falsos positivos y facilite el crecimiento de la
levadura nicamente ( Ej. novobiocina).
Sin embargo, es recomendable realizar una coloracin simple con cristal violeta de las
diferentes colonias para verificar su morfologa microscpicamente.
Composicin MEDIO YM
g/L
Extracto de levadura
3.0
Extracto de malta
3.0
Peptona
5.0
Dextrosa
10
Agar-agar
20
pH 6.2
Esterilizar a 121 oC y 15 libras de presin. Adicionar novobiocina al 0.1 %.
RECUENTO DE LEVADURAS SALVAJES
A. MUESTRA
La muestra corresponde a las mieles de caa utilizadas como sustratos de fermentacin.
131
B. INCUBACIN
Las cajas de petri sembradas con la muestra se incuban a 30C durante 48 horas y tras este
tiempo se realiza la observacin directa de las colonias.
C. INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Cualquier colonia que crezca en este medio de cultivo es presuntiva de levadura salvaje
debido a su composicin especial diferencial, de manera que a partir de las colonias que se
registren, se realiza una coloracin simple con cristal violeta de las diferentes colonias para
verificar su morfologa microscpicamente, las levaduras salvajes presentan morfologas
variadas, algunas son alargadas, romboides, cncavas, sin embargo pueden tener
morfologa similar a la de Saccharomyces cuando se encuentran en condiciones ideales.
132
ANEXO 5
PRUEBAS
ADICIONALES
PARA
DETERMINACIN
DE
CONTAMINANTES
BACTERIANOS
Coloracin de Gram
Tomar con asa estril la colonia que desea identificarse y suspenderla en un
portaobjetos con una gota de agua estril.
Fijar la solucin en calor
Adicionar el colorante cristal violeta durante 1 minuto, lavar con agua destilada,
adicionar lugol y poner en contacto por 1 minuto, lavar con agua destilada,
decolorar con alcohol acetona por 15 segundos, lavar con agua destilada, anadir
colorante fucsina bsica, lavar con agua destilada y secar a temperatura ambiente.
Observar al microscopio y determinar morfologa celular (cocos, bacilos, cocobacilos) y comportamiento frente a coloracin (Gram negativos: color rosado, Gram
positivos: color violeta).
Siembra en Agar hipersacarosa
Tomar la colonia a evaluar con asa estril
Sembrar por aislamiento en el medio agarizado Hipersacarosa
Incubar 24-48 horas a 30C
Leer e interpretar los resultados: colonias transparentes, opacas, productoras de
goma tpicas de leuconostoc, de hecho bsicamente slo este gnero puede crecer en
este medio.
Medio de cultivo Hipersacarosa
Composicin
g/L
Extracto de carne
10
Extracto de levadura
133
Bacto peptona
2.5
Sacarosa
150
Fosfato dipotsico
Cloruro de sodio
pH final
6.8 +/- 0.2
ANEXO 6
134
DETERMINACION DE ACIDEZ VOLTIL EN MIELES Y EN VINOS
Medir volumtricamente 100ml de la muestra de miel diluida vino y adicionarlos

en un baln de 500 1000ml fondo redondo.
Adicionar a la muestra, 200ml de H2SO4 1% ( esta solucin no debe tener contacto

con las paredes del valn, para evitar la formacin de trixido de azufre dixido
de azufre que pueden ser arrastrados por el destilado originando lecturas de
destilacin errneas.
Conectar el baln al equipo de destilacin cuidando de no tener ningn escape de la

muestra ni de los vapores originados. (ver figura).
Mantener en agitacin constante mediante plancha agitadora y la manta de

calentamiento debe estar en 70C.
Recolectar 200ml del destilado en erlenmeyer de vidrio correctamente lavado y

seco.
Adicionar al destilado 5 gotas del indicador fenoftalena.
Titular con NaOH 0,1 meq/ml hasta que el color rosa permanezca durante 30
segundos.
Realizar un blanco de correccin asi:

100ml de agua destilada + 200ml de H 2SO4 1% y determinar el blanco de titulacin
de la misma manera que se titula la muestra.
Restar la lectura de titulacin del blanco, de la lectura de titulacin de la muestra y

calcular.
CALCULOS:
AV en ppm: (Vtm - Vtb) * FD * 171.4
Donde:
Vtm: Volumen de titulacin de la muestra
Vtb: Volumen de titulacin del blanco
135
FD: Factor de dilucin

171.4: Constante
136
ANEXO 7
METODO DE FELHING PARA DETERMINACION DE AZUCARES TOTALES
REDUCTORES
Pesar 10g de miel, dilur en 100ml de agua destilada y transferir a un baln aforado
de 500ml, llevar a ese volumen con agua destilada y agitar.
En un balon aforado de 100ml, adicionar 25ml de la solucin anterior, 10ml de agua

y 10ml de HCl al 25%, mezclar y calentar en bao termostatazo a 70C durante 30
minutos.
Enfriar y adicionar 3 gotas de fenoftalena 1% m/v.
Neutralizar el exceso de HCl adicionando NaOH 25% hasta un viraje rosa y luego
lentamente HCl hasta su desaparicin.
Enfriar y completar el volumen a 100ml con agua destilada.
Transferir la solucin invertida y neutralizada a una bureta.
En un erlenmeyer de 500ml mezclar 5ml de solucin felhing A y 5ml de solucin

felhing B y adicionar con la bureta aproximadamente 10-15ml de la solucin
dependiendo de la miel.
Mezclar en plancha agitadora y calentar a ebullicin por dos minutos, adicionar 6

gotas de azul de metileno 1% m/v y continuar agitando.
Comenzar a titular gota a gota lentamente con la solucin invertida hasta la

aparicin de un color rojo ladrillo incluso en la espuma.
Mantener la emisin de vapor que evitar la oxidacin regresiva que podra

ocasionar el aire sobre la solucin.
Repetir la titulacin utilizando como volumen inicial el volumen hallado

anteriormente menos 1ml, promediar estos valores de titulacin y calcular.
137
CALCULOS:
%m/m ATR: FF * (VFA + VFB) * FD * 100/Vt
Donde:
FF: factor de estandarizacin de la solucin de felhing.
VFA + VFB: volumen de la solucin de felhingA + felhingB FD:
factor de dilucin de la miel
Vt: Volumen de la solucin invertida gastado en la titulacin.
En el caso de vinos y diluciones de las mieles el % de ATRs debe calcularse a partir de un
volumen definido de la muestra, cuyo tratamiento ser el mismo que para mieles puras y el
volumen de aforo ser de 100ml:
Vino 25ml/100ml
Miel de segunda dilucin (aprox 22%): 3ml/100ml
Miel de tercera dilucin (aprox 7%): 5ml/100ml.
La variacin en el clculo ser el factor de dilucin: (100/volumen de la muestra)
138
ANEXO 8
DETERMINACION DE PORCENTAJE DE ALCOHOL EN VINOS
Enfriar la muestra entre 20-25C y homogenizar.
En un enlenmeyer de 250ml adicionar 20ml de dicromato de potasio 0.2meq/ml,
25ml de agua destilada y 10ml de cido sulfrico concentrado, dejar enfriar esta
mezcla.
Medir volumtricamente 0.5ml de la muestra de vino y adicionarlos aun baln de
fondo plano de 250ml que contenga perlas de vidrio y 25ml de agua destilada.
Conectar estas soluciones con una manguera y tapn hermtico y calentar la
muestra a ebullicin recogiendo los vapores en la solucin de dicromato de potasio
hasta la tercera parte del volumen inicial de la mezcla.
Dejar enfriar despus de la destilacin y titular el exceso de dicromato de potasio
con una solucin de sulfato ferroso amnico (0,15meq/ml) estandarizada, utilizando
tres gotas ferrona como indicador hasta el viraje de ste a color mbar (caf-rojizo).
Hacer un blanco con agua destilada y calcular.
CALCULOS:
(Vb - Vt) * N * pmOH *
%v/v:
4000
* 100
dOH________
Vol Muestra (ml)

Donde:
Vb: volumen del blanco
Vt: Volumen de titulacin del vino
N: Normalidad del sulfato ferroso
pmOH: 46.07
Densidad del etanol puro (dOH): 0.79 g/ml
ANEXO 9
139
REGISTROS DE RESULTADOS DE ENSAYO ETAPA DE REPRODUCCION
Tabla 36.
Caractersticas iniciales de Miel de Tercera dilucin

Acidez
Antibitico /
Densidad
Sustrato
Voltil
Ensayo
pH
(ppm)
(g/ml)
354
1
1.049
358
2
1.052
Penicilina
355
3
1.051
362
4
1.048
365
1
1.048
370
2
1.050
Melaza
Virginamicina
356
3
1.050
364
4
1.049
359
1
1.050
2
1.052
368
pH
3
1.050
358
4
1.051
361
1
1.025
129
2
1.023
127
Penicilina
3
1.025
131
4
1.026
124
1
1.022
152
Jugo de Caa
2
1.024
141
Virginamicina
Concentrado
3
1.025
138
4
1.025
149
1
1.026
150
2
1.024
142
pH
3
1.024
148
4
1.026
141
Tabla 37.
Caractersticas iniciales de Miel de Segunda dilucin
140
Concentracin
de BAL
(UFC/ml)
5.0 E+03
2.0 E+03
2.1 E+03
7.0 E+03
4.0 E+03
4.0 E+03
3.1 E+03
3.0 E+03
3.1 E+03
3.3 E+03
4.0 E+03
2.8 E+03
1.1 E+02
4.5 E+02
3.2 E+02
5.4 E+02
1.1 E+02
3.6 E+02
2.6 E+02
4.1 E+02
1.8 E+02
3.4 E+02
1.3 E+02
1.8 E+02
Sustrato
Antibitico /
pH
Ensayo
Virginamicina
pH
Penicilina
Jugo de Caa
Concentrado
Virginamicina
pH
Tabla 38.
Ensayo
1
2
(g/ml)
1.100
1.098
1.098
1.098
1.100
1.100
1.098
1.100
1.100
1.110
1.100
1.100
1.081
1.082
1.080
1.081
1.080
1.081
1.079
1.080
1.077
1.079
1.078
1.078
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
Penicilina
Melaza
Densidad
Acidez
Voltil
(ppm)
714
701
689
714
802
816
841
795
809
830
822
804
338
351
342
319
340
335
331
328
327
332
345
322
Concentracin
de BAL
(UFC/ml)
1.1 E+03
1.0 E+03
2.0 E+03
4.1 E+03
3.2 E+03
1.6 E+03
1.9 E+03
1.4 E+03
2.6 E+03
3.2 E+03
3.6 E+03
4.1 E+03
2.6 E+02
3.1 E+02
3.7 E+02
4.0 E+02
2.6 E+02
4.2 E+02
3.7 E+02
1.5 E+02
1.2 E+02
1.5 E+02
3.1 E+02
3.1 E+02
Variables de respuesta etapa de reproduccin de Melaza tratado con

Recuento Viabilidad
Tratamiento
Concentracin
de antibitico
(ppm)
Control P4A
P1A
P2A
P3A
Control P4A
0.00
0.50
1.00
2.00
0.00
de
Levadura
(UFC/ml)
3.1 E+08
3.2 E+08
3.1 E+08
2.9 E+08
3.0 E+08
141
de
Levadura
(%)
100
100
100
100
100
Recuento
BAL
(UFC/ml)
Acidez
Voltil
(ppm)
3.5 E+05
2.9 E+05
4.0 E+05
3.3 E+05
2.6 E+05
1624
1641
1580
1661
1642
Tabla 39.
Ensayo
P1A
P2A
P3A
Control P4A
P1A
P2A
P3A
Control P4A
P1A
P2A
P3A
0.50
1.00
2.00
0.00
0.50
1.00
2.00
0.00
0.50
1.00
2.00
3.1 E+08
2.9 E+08
2.9 E+08
3.0 E+08
3.1 E+08
3.2 E+08
2.9 E+08
2.9 E+08
2.8 E+08
3.1 E+08
2.9 E+08
Concentracin
de antibitico
(ppm)
Control V4A
V1A
V2A
V3A
Control V4A
0.00
0.50
1.00
2.00
0.00
V1A
V2A
V3A
Control V4A
0.50
1.00
2.00
0.00
2.9 E+08
2.9 E+08
3.1 E+08
3.3 E+08
V1A
V2A
V3A
Control V4A
V1A
V2A
V3A
0.50
1.00
2.00
0.00
0.50
1.00
2.00
3.3 E+08
3.4 E+08
2.8 E+08
2.7 E+08
3.1 E+08
3.2 E+08
3.3 E+08
3.1 E+05
3.9 E+05
4.1 E+05
2.5 E+05
3.4 E+05
4.0 E+05
4.0 E+05
3.6 E+06
3.3 E+05
3.8 E+05
2.9 E+04
1615
1511
1596
1608
1700
1689
1664
1598
1640
1600
1602
Variables de respuesta etapa de reproduccin de Melaza tratado con

Recuento Viabilidad
de
Levadura
(UFC/ml)
3.1 E+08
3.0 E+08
2.8 E+08
3.2 E+08
3.4 E+08
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
Tratamiento
142
de
Levadura
Recuento
BAL
(UFC/ml)
Acidez
Voltil
(ppm)
3.2 E+05
3.6 E+05
2.9 E+05
3.1 E+04
3.3 E+05
1412
1450
1532
1405
1507
100
100
100
100
3.8 E+05
3.6 E+05
3.4 E+04
3.0 E+05
1521
1489
1427
1408
100
100
100
100
100
100
100
2.9 E+05
3.2 E+05
3.2 E+04
2.8 E+05
3.4 E+05
3.5 E+05
3.2 E+04
1521
1472
1308
1504
1475
1429
1398
(%)
100
100
100
100
100
Tabla 40.
Ensayo
Variables de respuesta etapa de reproduccin de Jugo de caa concentrado

Recuento Viabilidad
Tratamiento
0.00
de
Levadura
(UFC/ml)
3.0 E+08
P1B
P2B
P3B
Control P4B
P1B
P2B
P3B
Control P4B
P1B
P2B
P3B
Control P4B
0.50
1.00
2.00
0.00
0.50
1.00
2.00
0.00
0.50
1.00
2.00
0.00
3.1 E+08
3.1 E+08
2.9 E+08
3.0 E+08
3.2 E+08
3.1 E+08
3.0 E+08
2.9 E+08
2.9 E+08
3.0 E+08
2.9 E+08
3.0 E+08
(%)
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
P1B
P2B
P3B
0.50
1.00
2.00
2.9 E+08
3.0 E+08
3.0 E+08
100
100
100
Control P4B
1
Tabla 41.
Ensayo
Concentracin
de antibitico
(ppm)
de
Levadura
Recuento
BAL
(UFC/ml)
3.9 E+06
2.8 E+06
3.1 E+06
2.5 E+05
3.8 E+06
3.9 E+06
4.2 E+06
3.1 E+05
3.3 E+06
3.2 E+06
3.6 E+06
3.5 E+05
4.1 E+06
4.0 E+06
3.9 E+06
4.0 E+05
Acidez
Voltil
(ppm)
2714
2904
2876
2708
2729
2859
2814
2759
2802
2755
2802
2806
2745
2856
2771
2821

Recuento Viabilidad
Tratamiento
Concentracin
de antibitico
(ppm)
de
Levadura
(%)
100
100
100
100
100
Recuento
BAL
(UFC/ml)
Acidez
Voltil
(ppm)
0.00
0.50
1.00
2.00
0.00
de
Levadura
(UFC/ml)
2.9 E+08
3.0 E+08
3.0 E+08
3.0 E+08
3.0 E+08
Control V4B
V1B
V2B
V3B
Control V4B
2.7 E+06
2.9 E+06
3.3 E+05
3.1 E+05
3.5 E+06
2914
2925
3004
2906
2778
V1B
V2B
V3B
0.50
1.00
2.00
3.1 E+08
2.8 E+08
2.9 E+08
100
100
100
3.4 E+06
2.8 E+05
3.2 E+05
2894
2994
2870
143
Control V4B
0.00
2.9 E+08
100
2.4 E+06
3002
V1B
V2B
V3B
Control V4B
0.50
1.00
2.00
0.00
2.9 E+08
2.8 E+08
3.0 E+08
3.0 E+08
100
100
100
100
2.3 E+06
2.6 E+05
2.5 E+05
3.3 E+06
3009
2994
2708
2856
V1B
V2B
V3B
0.50
1.00
2.00
3.1 E+08
3.1 E+08
3.1 E+08
100
100
100
3.4 E+06
3.2 E+05
3.5 E+05
2859
2896
3002
Tabla 42.
Ensayo
Variables de respuesta etapa de reproduccin de Melaza con ajuste de pH

(24 horas)
Recuento
Viabilidad
de
Levadura
(%)
74
Recuento
BAL
(UFC/ml)
Acidez
Voltil
(ppm)
3.0
de
Levadura
(UFC/ml)
1.4 E+06
3.1 E+04
1498
H2A
H3A
Control H4A
H1A
H2A
H3A
Control H4A
H1A
H2A
H3A
Control H4A
H1A
3.5
4.0
4.6
3.0
3.5
4.0
4.6
3.0
3.5
4.0
4.6
3.0
3.0 E+07
3.6 E+08
4.0 E+08
2.1 E+06
4.1 E+07
3.3 E+08
3.8 E+08
1.8 E+06
2.9 E+07
4.2 E+08
4.1 E+08
2.7 E+06
76
100
100
79
79
100
100
80
81
100
100
77
4.4 E+04
2.8 E+05
3.8 E+05
4.2 E+04
4.7 E+04
1.0 E+05
1.8 E+05
2.3 E+04
3.9 E+04
5.8 E+05
4.6 E+05
3.0 E+04
1502
1470
1485
1479
1509
1418
1475
1492
1514
1481
1439
1481
H2A
H3A
Control H4A
3.5
4.0
4.6
3.6 E+07
3.3 E+08
3.1 E+08
77
100
100
5.2 E+04
3.6 E+05
2.8 E+05
1408
1584
1508
Tratamiento
H1A
pH
144
Tabla 43.
Ensayo

con ajuste de pH (24 horas)
Recuento
Viabilidad
de
Levadura
(%)
78
Recuento
BAL
(UFC/ml)
Acidez
Voltil
(ppm)
3.0
de
Levadura
(UFC/ml)
2.9 E+06
3.5 E+04
1860
H2B
H3B
Control H4B
H1B
H2B
H3B
Control H4B
H1B
H2B
H3B
Control H4B
H1B
3.5
4.0
4.6
3.0
3.5
4.0
4.6
3.0
3.5
4.0
4.6
3.0
2.6 E+07
2.7 E+07
2.9 E+08
2.8 E+06
3.1 E+07
3.0 E+07
2.9 E+08
2.5 E+06
2.6 E+07
2.5 E+07
2.8 E+08
2.9 E+06
86
99
100
79
86
100
100
79
81
99
100
81
3.7 E+04
2.8 E+06
3.2 E+06
4.1 E+04
3.8 E+04
3.9 E+06
3.6 E+06
2.6 E+04
2.7 E+04
3.4 E+06
3.0 E+06
3.4 E+04
1900
1870
2100
1794
1879
1855
2021
1809
1824
1861
2300
1800
H2B
H3B
Control H4B
3.5
4.0
4.6
2.8 E+07
3.1 E+07
3.1 E+08
84
100
100
3.2 E+04
3.3 E+06
3.6 E+06
1872
1880
2205
Tratamiento
H1B
pH
145
ANEXO 10
REGISTROS DE RESULTADOS DE ENSAYO ETAPA DE FERMENTACION
Tabla 44.
Ensayo
Tratamiento
Control
P4A
P1A
P2A
P3A
Control
P4A
P1A
P2A
P3A
Control
P4A
P1A
P2A
P3A
Control
P4A
P1A
P2A
P3A
Tabla 45.
Ensayo

Concentracin
de antibitico
(ppm)
0.00
0.50
1.00
2.00
0.00
0.50
1.00
2.00
0.00
0.50
1.00
2.00
0.00
0.50
1.00
2.00
Alcohol
producido
(% v/v)
Azcar
Residual
despus de
30h de
fermentacin
(% m/v)
8.06
2.01
8.11
8.29
8.35
2.32
1.96
1.43
8.13
2.08
8.09
8.30
8.34
2.00
2.00
2.41
7.92
1.76
8.00
8.25
8.39
1.78
1.84
1.89
8.15
1.35
8.12
8.38
8.43
2.18
1.70
1.96
Miel 3
dilucin
(% m/v
de
azcar
reductor)
6.78
7.08
6.84
7.02
Miel 2
dilucin
(% m/v
de
azcar
reductor)
20.32
21.01
19.61
19.81
Rendimiento
(%)
Eficiencia
(%)
39
80.66
40
41
41
81.16
82.96
83.57
38
78.62
38
39
39
78.23
80.27
80.65
39
81.71
40
41
42
82.52
85.12
86.55
40
83.05
42
42
40
82.74
85.41
85.91

Tratamiento
Control
V4A
V1A
V2A
V3A
Concentracin
de antibitico
(ppm)
0.00
0.50
1.00
2.00
Alcohol
producido
(% v/v)
8.04
8.11
8.25
8.48
Azcar
Residual
despus de
30h de
fermentacin
(g/ml)
Miel 3
Miel 2
dilucin
(% m/v
dilucin
(% m/v
de
de
azcar
reductor
g/ml)
azcar
reductor
g/ml)
2.01
1.76
1.92
2.05
146
6.78
19.20
Rendimiento
Eficiencia
(%)
(%)
42
85.23
42
43
44
85.87
87.46
89.90
Control
V4A
V1A
V2A
V3A
Control
V4A
V1A
V2A
V3A
Control
V4A
V1A
V2A
V3A
Tabla 46.
Ensayo
0.00
8.09
1.38
0.50
1.00
2.00
8.03
8.23
8.34
1.76
1.28
1.32
0.00
0.50
1.00
2.00
7.95
8.02
8.21
8.26
1.86
2.01
1.9
1.94
0.00
0.50
1.00
2.00
8.09
8.05
8.28
8.31
2.19
1.78
2.02
2.14
7.01
20.02
6.69
20.07
6.81
19.80
40
81.67
40
40
41
81.06
83.09
84.19
39
40
41
41
80.56
81.27
83.29
83.71
40
40
41
41
82.77
82.36
84.71
85.02
Variables de respuesta etapa de fermentacin de Jugo de caa concentrado

inoculo tratado con Penicilina (30 horas)
Tratamiento
Control
P4B
P1B
P2B
P3B
Control
P4B
P1B
P2B
P3B
Control
P4B
P1B
P2B
P3B
Control
P4B
P1B
P2B
P3B
Alcohol
producido
(% v/v)
Azcar
Residual
despus de
30h de
fermentacin
(g/ml)
0.00
0.50
1.00
2.00
7.73
0.86
7.67
7.80
7.86
0.87
0.92
0.99
0.00
0.50
1.00
2.00
7.61
0.07
7.70
7.90
7.91
0.69
0.93
0.84
0.00
0.50
1.00
2.00
7.68
0.93
7.64
7.77
7.84
1.01
0.80
1.95
0.00
0.50
1.00
2.00
7.72
1.00
7.69
7.81
7.89
0.78
0.81
0.68
Concentracin
de antibitico
(ppm)
147
Miel 3
Miel 2
dilucin
(% m/v
dilucin
(% m/v
de
de
azcar
reductor
g/ml)
azcar
reductor
g/ml)
6.92
6.83
6.93
6.79
19.50
19.40
20.08
20.40
Rendimiento
(%)
Eficiencia
(%)
38
79.97
38
39
40
79.35
80.70
81.32
38
79.22
39
40
40
80.16
82.24
82.35
38
77.45
37
38
39
77.04
78.35
79.06
37
76.98
37
38
38
76.68
77.88
78.67
Tabla 47.
inoculo tratado con Virginamicina (30 horas)
Ensayo
Tratamiento
Control
V4B
V1B
V2B
V3B
Control
V4B
V1B
V2B
V3B
Control
V4B
V1B
V2B
V3B
Control
V4B
V1B
V2B
V3B
Tabla 48.
Ensayo
Concentracin
de antibitico
(ppm)
0.00
0.50
1.00
2.00
0.00
0.50
1.00
2.00
0.00
0.50
1.00
2.00
0.00
0.50
1.00
2.00
Alcohol
producido
(% v/v)
Azcar
Residual
despus de
30h de
fermentacin
(g/ml)
8.05
0.30
7.99
8.19
8.23
0.46
0.72
0.91
8.04
0.92
7.98
8.19
8.15
0.75
0.63
0.62
7.99
0.70
8.05
7.93
8.18
0.78
0.91
0.61
8.01
0.71
8.02
8.18
8.23
0.41
0.62
0.78
Miel 3
dilucin
(% m/v
Miel 2
dilucin
(% m/v
de
de
azcar
reductor
g/ml)
azcar
reductor
g/ml)
6.60
6.56
7.20
6.72
19.92
20.01
20.54
20.01
Rendimiento
(%)
Eficiencia
(%)
40
82.25
39
41
41
81.63
83.68
84.09
40
81.89
40
41
40
81.28
83.41
83.09
38
78.61
39
38
39
79.21
78.02
80.48
40
81.34
40
40
41
81.44
83.06
83.57

Tratamiento
H1A
H2A
H3A
Control
H4A
H1A
H2A
H3A
Control
H4A
pH
Alcohol
producido
(% v/v)
Azcar
Residual
despus de
30h de
fermentacin
(g/ml)
Miel 3
Miel 2
dilucin
(% m/v
dilucin
(% m/v
de
de
azcar
reductor
g/ml)
azcar
reductor
g/ml)
7.04
19.70
Rendimiento
Eficiencia
(%)
(%)
36
38
41
73.67
77.15
83.18
3.0
3.5
4.0
7.20
7.54
8.13
4.6
3.0
3.5
4.0
8.10
7.35
7.41
8.17
2.08
40
82.87
3.49
2.72
2.25
36
36
40
74.01
74.6
82.26
4.6
8.25
2.11
41
83.06
3.38
3.01
2.21
148
7.20
20.00
H1A
H2A
H3A
Control
H4A
H1A
H2A
H3A
Control
H4A
Tabla 49.
Ensayo
3.0
3.5
4.0
7.15
7.37
8.04
3.55
2.01
2.01
35
36
40
72.31
74.54
81.31
4.6
8.13
3.0
3.5
4.0
7.41
7.70
8.24
2.04
40
82.22
3.64
2.34
2.13
37
38
41
74.77
77.70
83.15
4.6
8.36
1.98
41
84.36
6.96
6.94
20.00
20.06

inoculo tratado ajuste de pH (30 horas)
Tratamiento
H1B
H2B
H3B
Control
H4B
H1B
H2B
H3B
Control
H4B
H1B
H2B
H3B
Control
H4B
H1B
H2B
H3B
Control
H4B
pH
3.0
3.5
4.0
4.6
3.0
3.5
4.0
4.6
3.0
3.5
4.0
4.6
3.0
3.5
4.0
4.6
Alcohol
producido
(% v/v)
Azcar
Residual
despus de
30h de
fermentacin
(g/ml)
7.74
7.77
7.95
1.32
1.02
0.85
7.92
Miel 3
dilucin
(% m/v
Miel 2
dilucin
(% m/v
de
de
azcar
reductor
g/ml)
azcar
reductor
g/ml)
6.78
19.81
Rendimiento
(%)
Eficiencia
(%)
39
39
40
79.23
79.54
81.38
0.86
39
81.07
7.91
7.83
8.04
1.41
1.28
0.72
39
38
39
71.95
71.22
73.13
8.04
0.91
39
73.13
7.41
7.81
7.89
1.21
1.40
0.72
35
37
37
72.23
75.83
76.60
8.11
0.78
38
78.74
7.53
7.72
7.88
1.24
1.04
0.95
37
38
39
76.72
78.66
80.29
8.11
0.64
40
82.64
149
6.91
6.86
6.91
20.10
21.00
19.85
ANEXO 11
Muestra de Calculo para rendimiento, eficiencia y productividad
Reproduccin
% azcar reductor en Miel 3 dilucin * Volumen de medio para reproduccin
100%
=mazcar
reductor
Fermentacin
% azcar reductor en Miel 2 dilucin * Volumen de medio para fermentacin
100%
m azcar reductor de
reproduccin
m azcar total *
entra al proceso
PM etanol
PM azcar
Volumen de medio
para reproduccin
=mazcar
reductor
m azcar reductor de
fermentacin
m azcar total que

entra al proceso
m alcohol terico
Rendimiento
pasteur
Volumen de medio
para fermentacin
% de alcohol producido * Volumen efectivo de trabajo =

100%
Volumen efectivo de
trabajo
Volumen de alcohol
producido (al 100% producido)
Volumen de alcohol producido * densidad de alcohol puro = m de alcohol producido
Rendimiento
m alcohol producido * 100

(m azcar total que entra al proceso - m azcar residual)
Eficiencia
m alcohol producido * 100 m
alcohol terico
Productividad
m producto/volumen * tiempo
150
(g/L* h)
Ejemplo
Reproduccin
6.92 % g/ml * 900 ml = 62.28 g azcar reductor
100%
Fermentacin
19.5 % g/ml * 2100 ml = 409.5 g de azcar reductor
62.28 g + 409.5 g = 471.78 g azcar total
471.78 g azcar *
92 g etanol * 0.95 = 229.08 g de alcohol terico

180 g azcar
7.67 % ml/ml * 3000 ml = 230.1 ml de alcohol (al 100% de produccin)

100 %
230.1 ml * 0.79 g/ml = 181.78 g de alcohol producido
Rendimiento
181.78 g de alcohol
(471.78 g azcar - 0.87)
* 100
39 %
Eficiencia
181.78 g de alcohol
229.08 g de alcohol terico
100
Productividad
181.78 g de alcohol
3 Litros * 30 horas
2.01g alcohol
L* h
151
79.35 %

Miel

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EVALUACION DEL USO DE ANTIBIOTICOS COMO MECANISMO PARA EL

CONTROL DE CONTAMINANTES BACTERIANOS

NAYDA MILENA CALDERN PREZ

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

EVALUACION DEL USO DE ANTIBIOTICOS COMO MECANISMO PARA EL

NAYDA MILENA CALDERN PREZ

ANA LUCA GMEZ SCHOUBEN

JOAQUN QUINTERO GARCA

BALKYS QUEVEDO HIDALGO

IVONNE GUTIERREZ ROJAS

EVALUACION DEL USO DE ANTIBIOTICOS COMO MECANISMO PARA EL

NAYDA MILENA CALDERN PREZ

DRA. ANGELA UMAA MUOZ

DR. LUIS DAVID GMEZ

2.1. Saccharomyces Cerevisiae

2.2. Bioqumica de la produccin de alcohol por Saccharomyces Cerevisiae

2.3. Parmetros y condiciones en la Fermentacin

2.3.3. Concentracin de azcar

2.3.4. Tolerancia a altas concentraciones de alcohol

2.3.5. Requerimientos de oxigeno

2.4. Rendimiento de alcohol etlico

2.4.1. Factores que afectan el rendimiento de alcohol

2.4.1.1. Crecimiento celular

2.4.1.2. Generacin de alcoholes superiores

2.4.1.3. Generacin de cidos orgnicos

2.5. Melazas como sustrato de fermentacin

2.5.1. Produccin de melaza de caa

2.5.2. Pretratamiento a las melazas de caa

2.5.3. Manejo de nutrientes en la fermentacin con melaza

2.5.4. Ventajas del uso de melazas de caa como sustrato

2.6. Contaminacin bacteriana en melaza

2.6.1. Fuentes de contaminacin

2.6.2. Prdidas de sacarosa

2.6.3. Bacterias lcticas como contaminantes

2.6.3.1. Metabolismo homofermentativo y heterofermentativo

2.6.3.2. Requerimientos nutricionales de bacterias lcticas y subproductos

2.7. Tratamientos de contaminacin bacteriana

2.7.1.1. Penicilina y virginamicina

2.7.3. Otras alternativas

3. Formulacin del problema, justificacin y antecedentes

3.1. Formulacin del problema

4.1. Objetivo General

4.2. Objetivos Especficos

5.1. Ubicacin y diseo de la investigacin

5.1.1. Parmetros y variables en la etapa de reproduccin

5.1.2. Parmetros y variables en la etapa de fermentacin

5.2.1. Pretratamiento del sustrato

5.2.2. Tratamiento con antibitico

5.2.2.1. Hidratacin de levadura activa seca

5.2.2.2. Preparacin del sustrato para la reproduccin

5.2.2.3. Determinacin de los niveles de contaminacin

5.2.2.4. Determinacin del inculo para la fermentacin

5.2.2.5. Preparacin del sustrato para la fermentacin

5.2.2.6. Determinacin de rendimiento (%), eficiencia (%) y

5.2.3.1. Diseo Experimental

5.3. Recoleccin de la informacin

5.4. Anlisis de la informacin

6.1. Caracterizacin del sustrato

6.2. Dilucin de sustrato en etapa de reproduccin

6.3. Dilucin de sustrato en etapa de fermentacin

6.4. Preparacin y alistamiento de la levadura

6.5. Tratamiento con antibiticos en la etapa de reproduccin

6.5.1. Reproduccin con melaza

6.5.2. Reproduccin con jugo de caa concentrado