UNIVERSIDADE TECNOLGICA FEDERAL DO PARAN

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA ELTRICA E

INFORMTICA INDUSTRIAL CPGEI








LUCIANA MARTINS PEREIRA DE ARAJO









Anlise de Deteco de Fluorescncia para Aplicao em
Sistemas de Diagnstico em Sade






DISSERTAO















CURITIBA
2010

LUCIANA MARTINS PEREIRA DE ARAJO















Anlise de Deteco de Fluorescncia para Aplicao em
Sistemas de Diagnstico em Sade






.




















CURITIBA
2010


Dissertao apresentada ao Programa de Ps-
Graduao em Engenharia Eltrica e Informtica
Industrial da Universidade Tecnolgica Federal do
Paran, como requisito parcial para a obteno
do grau de Mestre em Cincias rea de
Concentrao: Engenharia Biomdica.

Orientador: Prof. Dr. Fbio Kurt Schneider
Coorientador: Prof. Dr. Gilberto Branco













Ficha catalogrfica elaborada pela Biblioteca da UTFPR Campus Curitiba


















A663 Arajo, Luciana Martins Pereira de

Anlise de deteco de fluorescncia para aplicao em sistemas de
diagnstico em sade / Luciana Martins Pereira de Arajo. 2010.
93 f. : il. ; 30 cm

Orientador: Fbio Kurt Schneider
Co-orientador: Gilberto Branco
Dissertao (Mestrado) Universidade Tecnolgica Federal do Paran.
Programa de Ps-graduao em Engenharia Eltrica e Informtica Industrial.
rea de concentrao: Engenharia biomdica, Curitiba, 2010.
Bibliografia: f. 82-9

1. Espectroscopia fluorescente. 2. Eurpio. 3. Agentes luminescentes Uso
em diagnstico. 4. Corantes fluorescentes Uso em diagnstico. 5.
Engenharia eltrica Dissertaes. I. Schneider, Fbio Kurt, orient. II.
Branco, Gilberto, co-orient. III. Universidade Tecnolgica Federal do Paran.
Programa de Psgraduao em Engenharia Eltrica e Informtica Industrial.
III. Ttulo.

CDD (22. ed.) 621.3







































Dedico esta dissertao a Deus, pois sem Ele, nada seria
possvel.

minha famlia pelo incentivo e confiana.

Ao meu esposo e minha filha, pelo apoio incondicional,
compreenso e motivao.

Enfim, a todos que de alguma forma tornaram este caminho
mais fcil de ser percorrido.
AGRADECIMENTOS

Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior - CAPES,
pelo suporte e apoio financeiro a esse projeto.
Ao Professor Dr. Fbio Kurt Schneider, pela orientao e confiana.
Ao Professor Dr. Arandi Ginane Bezerra Junior e o Dr. Gilberto Branco, pela co-
orientao, apoio, dedicao e partilha.
Aos colegas do CPGEI pelo companheirismo, convvio, estmulo e partilha, em
especial, Cladio Marquetto, Joyce Klock, Terezinha Strapasson, Leonardo
Zanin, Neusa Grando e Joaquim de Mira.
Aos alunos de Iniciao Cientfica, Vincius Oliveira e Eduardo Almeida dos
Santos, pelo apoio e aprendizado partilhado.
Ao colega Wellington Celestino dos Santos, pelo apoio e pela partilha de
aprendizado.
Aos professores, pelo conhecimento compartilhado.
Ao meu esposo Walter Duarte e minha filha Lvia Helena que colaboraram em
todos os momentos, pela pacincia, incentivo e amor.
Agradeo a Deus que me deu fora e sempre esteve presente em minha vida.
Aos meus pais Evandro Reis Pereira (in memorian) e Maria da Piedade Martins
que sempre me deram fora para continuar perseverando rumo ao objetivo a
ser alcanado.



RESUMO


ARAJO, Luciana M. P. Anlise de deteco de Fluorescncia para Aplicao
em Sistemas de Diagnstico em Sade 2010. Dissertao (Programa de Ps-
Graduao em Engenharia Eltrica e Informtica Industrial da Universidade
Tecnolgica Federal do Paran). Curitiba, 2010.



A tcnica de espectroscopia de emisso de fluorescncia tem sido
utilizada para caracterizar molculas e compostos moleculares, pois propicia
que fluorforos sejam usados como elementos de marcao de antgenos e/ou
anticorpos, que serviro para a identificao de doenas. Assim, o objetivo
desta dissertao analisar a emisso de fluorescncia a partir de um novo
composto molecular, desenvolvido pelo Laboratrio de Polmeros Paulo Scarpa
(LaPPS/UFPR) em funo do elemento qumico eurpio, denominado
complexo LaPPS34M, por meio de um sistema de deteco em estado slido
resolvido no tempo. As caractersticas pticas como: o espectro de absoro, o
espectro de fluorescncia, o deslocamento de Stokes e os tempos de vida de
luminescncia resultaram nos parmetros importantes do complexo para
potenciais aplicaes em sistemas biomdicos atravs do projeto INDI-
SADE/PR.


Palavras-Chave: Fluorescncia, Fluorforo, Espectroscopia, Diagnstico,
Sade Pblica.




ABSTRACT



ARAJO, Luciana M. P. Fluorescence detection analysis for Application in
Diagnostic Systems in Health. 2010. Graduate Program in Electrical
Engineering and Computer Science Industrial of the Federal Technological
University of Parana). Curitiba. 2010.


The technique of fluorescence emission spectroscopy has been used to
characterize molecules and molecular compounds. Fluorophores can be used
as markup elements of antigens and / or antibodies for identification of disease.
Thus, the objective of this dissertation is to analysis the fluorescence emission
from a new molecular compound, developed by the Laboratory of Polymers
Paulo Scarpa (Lapps / UFPR) according to the chemical element europium,
called complex LaPPS34M, through a solid state detection system resolved
in time. The optical characteristics as: absorption spectrum, fluorescence
spectrum, the Stokes shift and the lifetime of luminescence have resulted in
importants parameters of the complex for potential applications in biomedical
systems by designing INDI-SADE/PR.


Keywords: Fluorescence, Fluorophore, Spectroscopy, Diagnosis, Public
Health.



LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Esquema representativo da marcao do complexo antgeno-
anticorpo por fluorforo. ................................................................................... 25
Figura 2 - Apresentao do diagrama de Jablonski. ........................................ 26
Figura 3 - Ilustrao do deslocamento de Stokes entre o pico de absoro
mxima e o pico de emisso mxima. ............................................................. 32
Figura 4 - Ilustrao da estrutura molecular do fluorforo comercial Cy3. O N
+

o smbolo do on nitrognio e o I
-
o smbolo do on iodo. .............................. 38
Figura 5 - Estrutura molecular do complexo LaPPS34M, com os elementos N
(nitrognio) e O ( oxignio), as cadeias aromticas (representada pelos
hexgonos). ...................................................................................................... 39
Figura 6 - Dimenses, formas e tamanhos das nanopartculas metlicas. ...... 42
Figura 7 - Esquema do processo de FRET entre dois fluorforos, a fluorescena
doadora) e a rodamina (receptora), onde r a distncia de mnima de FRET. 44
Figura 8 - Descrio do processo de FRET pelo de diagrama de Jablonski. ... 45
Figura 9 - Desenho esquemtico do espectrofotmetro de duplo feixe ........... 49
Figura 10 - Espectro de absoro do fluoroforo Cy3 obtido pelo
espectrofotmetro. ........................................................................................... 51
Figura 11 - Espectro de absoro do complexo LaPPS34M obtido pelo
espectrofotmetro ............................................................................................ 51
Figura 12 - Representao esquemtica do sistema de deteco proposto .... 52
Figura 13 - Desenho esquemtico do sistema experimental por vlvula
fotomultiplicadora R928 (de alta sensibilidade) ................................................ 53
Figura 14 - Desenho esquemtico do sistema com o uso da vlvula
fotomultiplicadora miniatura (R5600U-01). ....................................................... 54
Figura 15 - Desenho esquemtico do sistema experimental por fotodiodo ...... 55
Figura 16 - (a) Dispositivo OPT 301 apresenta um fotodiodo integrado com
amplificador conversor corrente-tenso, (b) resposta espectral do OPT 301, (i)
emisso de luminescncia do indicador (LAPPS34M ~ 615 nm) (ii) excitao do
indicador (LAPPS34M ~ 350 nm). .................................................................... 56
Figura 17 Espectro de emisso da lmpada xenon ...................................... 58
Figura 18 - Espectro de emisso de led azul, com comprimento de onda do
pico 440 nm. .................................................................................................. 59
Figura 19 - Espectro de emisso de led ultravioleta, com comprimento de onda
do pico 400 nm. ............................................................................................. 59
Figura 20 - Espectro de transmitncia do filtro de interferncia na regio do
vermelho........................................................................................................... 61
Figura 21 - Diagrama representativo da transmitncia de luz pela amostra na
cubeta .............................................................................................................. 63
Figura 22 - llustrao do espectro de transmitncia da cubeta de quartzo ...... 63
Figura 23 - Representao do processo de gerao e multiplicao de eltrons
em uma vlvula fotomultiplicadora ................................................................... 64
Figura 24 - Circuito de Implementao do Amplificador de Transimpedncia . 65
Figura 25 - Espectro de fluorescncia do fluorforo Cy3 obtido pela FASE I
(vlvula fotomultiplicadora R928) ..................................................................... 68
Figura 26 - Espectro de absoro e emisso de fluorforo Cy3 demonstrando o
deslocamento de Stokes obtido pela FASE I. .................................................. 68
Figura 27 - Espectro de fluorescncia do complexo LaPPS34M obtido pela
FASE I. ............................................................................................................. 69
Figura 28 - Espectro de absoro e emisso de LaPPS34M demonstrando o
deslocamento de Stokes obtido pela FASE I ................................................... 70
Figura 29 - a)Espectro de Fluorescncia do fluorforo Cy3 e b) o espectro de
fluorescncia do Fluorforo Cy3 conjugado com Nanopartcula de Ouro obtido
pela FASE I. ..................................................................................................... 71
Figura 30 - Espectro de fluorescncia (em preto) do complexo LaPPS34M e o
espectro de fluorescncia do LaPPS34M ( em verde) conjugado com
nanopartculas de prata obtido pela FASE I. .................................................... 72
Figura 31 - Decaimento de Fluorescncia do Complexo LaPPS34M com o uso
da vlvula fotomultiplicadora R928 obtido pela FASE I .................................... 74
Figura 32 - Decaimento exponencial de emisso de luminescncia do indicador
LaPPS34M pela vlvula fotomultiplicadora miniatura R5600U-01 obtido pela
FASE II. ............................................................................................................ 75
Figura 33 - Sinal eltrico aplicado ao led para excitao do indicador (linha
contnua), sinal de sada do detector na ausncia do fluorforo (linha tracejada)
e sinal de luminescncia na presena do fluorforo (linha contnua) obtido pela
FASE III. ........................................................................................................... 76
Figura 34 - Exponencial de decaimento de emisso de luminescncia do
indicador LaPPS34M pelo uso detectores de fotodiodo obtido pela FASE III .. 77
Figura 35 - A) Tamanho das nanopartculas de ouro por DLS, B) Espectro de
absoro das nanopartculas de ouro e C) Espectro de absoro linear para o
colide de prata ................................................................................................ 95



LISTA DE TABELAS


Tabela 1 - Caractersticas dos Fluorforos Comerciais em relao aos
comprimentos de onda de absoro e de emisso de fluorescncia ............... 31
Tabela 2 - Caractersticas pticas relevantes para um fluorforo da famlia Cy-
corante ............................................................................................................. 39
Tabela 3 - Relao entre as fases da pesquisa e os resultados do tempo de
vida de Luminescncia ..................................................................................... 77



LISTA DE FOTOGRAFIAS


Fotografia 1 - Espectrofotmetro de Duplo Feixe UV-Vis. ................................ 50
Fotografia 2 - Montagem do uso das lentes convergentes no experimento de
fluorescncia. ................................................................................................... 60
Fotografia 3 - Monocromador do tipo Czerny-Turner. ...................................... 62


LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS


INDI-SADE Instituto Nacional de Inovao em Sade Pblica
NAT Teste de cido Nuclico
DNA cido Desoxirribonuclico
HIV Human Immunodeficiency Virus
Intensidade do Campo Eltrico [V/m]
H Intensidade do Campo Magntico [A/m]
RNA cido Ribonuclico
ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
Cy3 Fluorforo Comercial Cianina (Cyanine)
Cy4 Fluorforo Comercial Cianina (Cyanine)
Cy7 Fluorforo Comercial Cianina (Cyanine)
LaPPS34M Complexo de Eurpio/ Bipiridina/ Dibenzolmetano
PH Pontecial Hidrogeninico
NADH Quinona Oxidorredutase
FAD Dinucleotdeo Flavina Adenina
NP Nanopartculas
DLS Espalhamento Dinmico da Luz
FRET Transferncia de Energia de Ressonncia de
Fluorescncia
Ln Familia dos elementos quimicos dos Lantandeos
Lu Elemento Qumico Lutcio
Y Elemento Qumico trio
Sc Elemento Qumico Escndio
Na Elemento Qumico Sdio
K Elemento Qumico Potssio
Sb Elemento Qumico Antimnio
Cs Elemento Qumico Csio
Eu Elemento Qumico Eurpio
Eu
3+
Representao do Elemento Eurpio
Tb
3+
Representao do Elemento Trbio
C Elemento Qumico Carbono
H Elemento Qumico Hidrognio
O Elemento Qumico Oxignio
Au Elemento Qumico Ouro
Ag Elemento Qumico Prata
Ni Elemento Qumico Nquel
Cu Elemento Qumico Cobre
La Famlia dos lantandeos
N Elemento Qumico Nitrognio
Z Nmero Atmico dos Elementos Qumicos
RMN Ressonncia Magntica Nuclear
led Light Emitting Diode
Orbital pi Ligante e Antiligante
* Orbital pi Antiligante
Comprimento de Onda
S Estado Singleto
S
1
Primeiro Estado Singleto Excitado
S
2
Segundo Estado Singleto Excitado
S
0
Estado Singleto Fundamental
THF Tetrahidrofurano
UV-Vis Espectroscopia na Regio do Ultravioleta-Visvel
OEM Onda Eletromagntica
PCR Polimerase Chain Reaction
PMT Photo Multiplier Tube
USB Universal Serial Bus
Gap Fosfeto de Glio
DC-DC Conversor de Corrente Contnua
UFPR Universidade Federal do Paran
PR Estado do Paran
CI Converses Internas
CSI Cruzamento Interno
LASER Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation
UTFPR Universidade Tecnolgica Federal do Paran
DMSO Dimetilsulfxido
RMSE Quadrado Mdio do Erro
LaPPS Laboratrio de Polmeros Paulo Scarpa
DO Densidade ptica
FITC Isotiocianato de Fluorescena
RITC Rodamina
AT Amplificador de Transimpdancia
a.u Arbitraries Unites (Unidades Arbitrrias)
Z
X
A
Representao do elemento qumico (Z o nmero
atmico e A o nmero de massa)


SUMRIO

1. INTRODUO ........................................................................................... 19
1.1. MOTIVAO ............................................................................................. 19
1.2. JUSTIFICATIVA ......................................................................................... 20
1.3. OBJETIVOS ............................................................................................... 21
1.3.1. Objetivo Geral ...................................................................................... 21
1.3.2. Objetivos Especficos .......................................................................... 21
1.4. ESTRUTURA DA DISSERTAO ............................................................ 23
2. FLUORESCNCIA E FLUORFORO ....................................................... 24
2.1. INTRODUO ........................................................................................... 24
2.2. COMPLEXO ANTGENO- ANTICORPO.................................................... 24
2.3. O FENMENO DE FLUORESCNCIA ..................................................... 25
2.4. FLUORFOROS ....................................................................................... 29
2.4.1. Caractersticas pticas dos Fluorforos .............................................. 29
2.4.2. Propriedades dos Fluorforos Comerciais e dos Complexos
Biomarcadores ................................................................................................. 34
2.4.2.1. Fluorforo Comercial Cy3 .................................................................... 37
2.4.2.2. Complexo LaPPS34M ......................................................................... 39
2.5. NANOPARTCULA .................................................................................... 41
2.5.1. Fluorforo na Presena de Nanopartculas ......................................... 43
2.6. RESUMO ................................................................................................... 46
3. SISTEMAS DE AQUISIO DE LUMINESCNCIA.................................. 47
3.1. INTRODUO ........................................................................................... 47
3.2. DETERMINAO DO ESPECTRO DE ABSORO DO CY3 E DO
COMPLEXO LaPPS34M .................................................................................. 47
3.2.1. Espectrofotmetro de Duplo Feixe ...................................................... 48
3.2.1.1. Espectro de Absoro ......................................................................... 50
3.3. SISTEMA DE AQUISIO DE SINAL DE FLUORESCNCIA .................. 52
3.4. SISTEMA DE DETECO DE FLUORESCNCIA ................................... 57
3.4.1. Fonte ptica ........................................................................................ 57
3.4.2. Lentes Convergentes e Filtros ............................................................. 59
3.4.3. Monocromador .................................................................................... 61
3.4.4. Cubeta ................................................................................................. 62
3.4.5. Vlvulas Fotomultiplicadoras ( PMTs) ................................................. 63
3.4.6. Amplificador de Transimpedncia........................................................ 65
3.4.7. Aquisio do Processamento do Sinal ................................................ 66
3.5. RESUMO ................................................................................................... 66
4. RESULTADOS .......................................................................................... 67
4.1. INTRODUO ........................................................................................... 67
4.2. ESPECTROS DE FLUORESCNCIA........................................................ 67
4.3. ESPECTROS DE FLUORESCNCIA COM NANOPARTCULAS
METLICAS ..................................................................................................... 71
4.4. TEMPOS DE VIDA DE LUMINESCNCIA DO FLUORFORO E DO
COMPLEXO LaPPS34M .................................................................................. 73
5. DISCUSSO E CONCLUSO ................................................................... 78
5.1. INTRODUO ........................................................................................... 78
5.2. CARACTERIZAO DE BIOMARCADORES ........................................... 78
5.3. SISTEMAS DE CUSTO REDUZIDO .......................................................... 80
5.4. LIMITAES DO ESTUDO ....................................................................... 81
5.5. TRABALHOS FUTUROS ........................................................................... 81
5.6. PUBLICAES ......................................................................................... 83
6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .......................................................... 84
7. ANEXOS .................................................................................................... 92



19
1. INTRODUO


1.1. MOTIVAO


Muitas doenas infecciosas, comuns em diversas regioes de pases em
desenvolvimento, so tratveis por meio de medicaes apropriadas. Isto tem
prevenido e diminudo, significativamente, a mortalidade e a morbidade das
populaes infectadas residentes nestas reas de risco (MABEY, 2004). Os
mtodos de diagnsticos mais rpidos certamente auxiliaro para que as
doenas infecciosas, que apresenta significantes consequncias para a sade
pblica, sejam eficientemente controladas se identificadas precocemente
(NICHOL, 2000).
As tcnicas tradicionais de diagnstico laboratorial incluem os mtodos
diretos: como a identificao direta do microrganismo por meio da microscopia
ptica, e mtodos indiretos: como a inoculao de amostras potencialmente
infectadas em animais e meios de cultura. Alm destes, nos ltimos vinte anos,
tambm houve o desenvolvimento de mtodos rpidos de diagnstico, que
proporcionaram um avano importante, pois os resultados podem ser obtidos
em poucas horas ou at mesmo em minutos (PERUSK, 2003).
Atualmente, vrias doenas infecciosas e parasitrias so pesquisadas
pelos mtodos imunolgicos. Graas sua simplicidade, o mtodo ELISA
(Enzyme LinkedImmuno Sorbent Assay) permite reconhecer e quantificar
antgenos atravs de uma reao enzimtica (ENGVALL, 1971). Este mtodo
usado para analisar grande nmero de indivduos com um volume pequeno
de amostra (PERUSK, 2003). Os testes moleculares como o PCR (Polimerase
Chain Reaction) em tempo real e os microarranjos lquidos possibilitaram a
marcao do complexo antgeno-anticorpo por sondas fluorescentes com
diferentes espectros de emisso (YANG, 2004).
Ao aplicar os fluorforos nos estudos diagnsticos, recorre-se a uma
rea que est em franca expanso. Novas tecnologias esto sendo
empregadas procura de diagnsticos mais rpidos e precisos. Neste sentido,
a utilizao conjunta da fluorescncia atravs dos fluorforos levou a criao
20
de outra rea de pesquisa, chamada de imunofluorescncia, que a ligao do
antgeno e anticorpo atravs da marcao do anticorpo marcado com uma
molcula fluorescente (VALEUR, 2002),(LAKOWICZ,1999).


1.2. JUSTIFICATIVA


O esforo do sistema nacional de sade em ampliar o setor de
diagnsticos e conjuntamente integrar a produo acadmica com o setor
produtivo possibilitou a criao do Instituto Nacional de Inovao em Sade
Pblica (INDI-SADE), que se situa no Instituto Carlos Chagas Curitiba/PR
(2008). Assim sendo, o objetivo do INDI-SADE, consiste na implantao de
novas tecnologias para a produo de sistemas de diagnstico centrados em
doenas causadas por microrganismos importantes para a sade pblica no
Brasil. Uma das metas do Instituto a nacionalizao de insumos e sistemas
de diagnstico relevantes para a sade pblica, envolvendo mtodos rpidos
para utilizao no local de tratamento (point of care) (INDI, 2008).
Adicionalmente, pretende-se obter procedimentos de multitestes para o
diagnstico e controle do sangue, ou seja, aqueles capazes de detectar mais
de uma doena simultaneamente.
Os sistemas de diagnsticos desenvolvidos pela Instituto tero seu
alicerce no diagnstico molecular, como os microarranjos lquidos, por ser o
mtodo moderno para deteco e quantificao de doenas por
microrganismos, como por exemplo doena de chagas e dengue (INDI, 2008).
Um dos estudos do Instituto Nacional de Inovao em Sade Pblica
a marcao do complexo antgeno-anticorpo atravs de fluorforos para
detectar doenas por meio de fluorescncia. Essa dissertao representa um
dos projetos a serem desenvolvidos pelo INDI-SADE atravs do complexo
LaPPS34M, desenvolvido pelo laboratrio de polmeros Paulo Scarpa da UFPR
ser realizado um estudo de comparao com um fluorforo comercial Cy3,
amplamente utilizado na tecnologia de microarranjos. Algumas caractersticas
pticas tais como deslocamento de Stokes e o tempo de vida de luminescncia
21
so avaliados para o estudo do potencial de aplicao do complexo LaPPS34M
como fluorforo.


1.3. OBJETIVOS


1.3.1. Objetivo Geral


O objetivo principal deste trabalho analisar a deteco de
fluorescncia para aplicao em sistemas de diagnsticos com nfase em um
novo composto molecular - desenvolvido em funo do elemento qumico
eurpio (Eu - grupo dos lantandeos) - denominado complexo LaPPS34M por
meio de um sistema de excitao e deteco em estado slido resolvido no
tempo.


1.3.2. Objetivos Especficos


Os objetivos especficos so:
1. Determinar os espectros de absoro do fluorforo Cy3 e do complexo
LaPPS34M e a relao entre os picos mximos de absoro para as
amostras.
2. Determinar a relao entre os espectros de fluorescncia do fluorforo
Cy3 e do complexo LaPPS34M e os picos mximos de emisso das
amostras
3. Avaliar a relao entre a fluorescncia de Cy3 e de LaPPS34M na
presena de nanopartculas e suas implicaes na intensidade de
fluorescncia.
4. Analisar a deteco de fluorescncia com o uso de fotodetectores
(vlvula fotomultiplicadora R928, vlvula fotomultiplicadora miniatura
22
R5600U-01 e de detector optoeletrnico OPT301) e utilizando uma
instrumentao de baixo custo.
5. Determinar o tempo de vida de luminescncia do complexo LaPPS34M.


23
1.4. ESTRUTURA DA DISSERTAO


O trabalho est dividido em 5 captulos, onde neste captulo 1 so
expressas as motivaes, as justificativas e os objetivos gerais e especficos
desta dissertao. O captulo 2, apresenta uma reviso sobre a luminescncia,
com nfase para a fluorescncia e suas propriedades fsicas. Descreve-se
ainda alguns fluorforos e os fatores que afetam o desempenho dos
fluorforos.
O captulo 3 apresenta o uso do sistema para a identificao de
emisso fluorescente; com fonte ptica composta de diodos emissores de luz
violeta, chaveados (e controlados) para excitar substncias fluorescentes em
soluo aquosas; e deteco com sensor optoeletrnico.
O captulo 4 apresenta os resultados usando a instrumentao
implementada quanto deteco da fluorescncia para atingir os objetivos
especficos previamente listados.
Finalmente, o captulo 5 apresenta uma discusso e as principais
concluses do trabalho.




24
2. FLUORESCNCIA E FLUORFORO


2.1. INTRODUO


O captulo versar sobre a espectroscopia de fluorescncia, os
fluorforos e as propriedades pticas dos fluorforos comerciais e do complexo
LaPPS34M.


2.2. COMPLEXO ANTGENO- ANTICORPO


Na descricao de imunologia, a interao do antgeno com o anticorpo
fundamental. Essa relao denominada de complexo antgeno-anticorpo ou
complexo imune (ALBERTS et al ,1995). A maior parte dos mtodos de
diagnsticos baseia-se na deteco do complexo antgeno-anticorpo, ou seja,
quando um antgeno, que definido como uma substncia estranha que induz
uma resposta imune, causa uma produo de anticorpos e/ou linfcitos
sensibilizados que reagem especificamente com a substncia ingressa num
organismo (VOET, 1995).
O sistema imunolgico do corpo inicia a produo de anticorpos, que
so protenas que reconhecem um antgeno de forma especfica e com alta
afinidade e so produzidos pelos linfcitos B, que se originam na medula ssea.
Os anticorpos so ento distribudos pelo organismo inteiro atravs do sistema
linftico para neutralizar a ao do antgeno (VOET, 1995). Para que haja
deteco do complexo antgeno-anticorpo necessrio que este esteja
conjugado com um indicador, conforme apresentado na Figura 1.
Os fluorforos so compostos que emitem luz em certo comprimento
de onda quando excitados por uma radiao luminosa de outro comprimento
de onda, e podem atuar como biomarcadores, quando conjugados com o
complexo antgeno-anticorpo ou estruturas internas de clulas.
25
A marcao descrita na Figura 1 descreve a ligao entre um anticorpo
especfico, geralmente de uma espcie diferente da clula, e outro anticorpo,
que seja anti o anticorpo utilizado anteriormente, sendo este novo anticorpo
de uma terceira espcie e tendo sido tambm previamente marcado por algum
fluorforo, desta maneira, formam-se complexos antgeno-anticorpo marcados,
de forma que esta estrutura bem mais eficiente na deteco de doenas por
fluorescncia e seu uso em diagnsticos.


Figura 1 - Esquema representativo da marcao do complexo antgeno-anticorpo por
fluorforo.
Fonte: Modificado de FERREIRA, 2001


2.3. O FENMENO DE FLUORESCNCIA


Quando os ftons so absorvidos por uma molcula, a mesma levada
a um estado excitado. Aps um determinado tempo, h o retorno da molcula
ao estado fundamental (ou estado no excitado) com a possvel emisso de
parte da energia absorvida na forma de energia radiante (WILLARD, 1988).
Uma forma mais clara de visualizao dos estados de excitao das
molculas apresentada pelo diagrama de Jablonski (Erro! Fonte de referncia no
26
encontrada.), que relaciona as transies que ocorrem entre os nveis bsicos de
energia e os nveis excitados, bem como as reemisses de energia radiante
(ATVARS, 2002).
Inicialmente, a partir da absoro de radiao, a molcula promovida
para um estado excitado singleto S
n
(Erro! Fonte de referncia no encontrada.).
Posteriormente, a molcula se desativa por relaxamento, atravs dos nveis
vibracionais de estados eletrnicos, at atingir o primeiro nvel vibracional do
estado excitado singleto de menor energia S
1
. Este processo de relaxamento
recebe o nome de converso interna (EISBERG, 1988).



Figura 2 - Apresentao do diagrama de Jablonski.
Fonte: Prpria

A partir do estado singleto S
1
, existem alguns caminhos possveis para
a molcula retornar ao estado fundamental:
(a) se no h diferena de energia entre o estado excitado e estado
fundamental existi a possibilidade de sobreposio de nveis vibracionais, a
molcula pode ser levada ao mais baixo nvel vibracional do estado excitado
por relaxamento vibracional sem emisso de radiao eletromagntica, ou seja,
ocorre um cruzamento interno.
(b) se, no entanto, a diferena energtica entre o estado excitado e
estado fundamental for relativamente grande, a desativao para o estado
fundamental se d com emisso de radiao na forma de fluorescncia
27
(VALEUR, 2002). Isto quer dizer que o spin
1
do estado excitado mantm sua
orientao original e h uma maior probabilidade de acontecer essa
configurao. Corresponde a um fenmeno rpido, na ordem de 10
-9
a 10
-7

segundos (EISBERG, 1988).
(c) se ocorrer um cruzamento entre sistemas, que a transferncia de
eltrons entre estados de diferentes multiplicidades de spins. Outro fenmeno
de desativao se faz presente a fosforescncia. Esta representa emisso de
ftons aps as transies do estado singleto para o estado tripleto, isto , neste
tipo de fenmeno o spin se mantm de forma contrria da sua posio inicial e
o tempo de durao maior, na ordem de 10
-3
s a 10 s (AMANDO,2004).
O uso da fluorescncia um dos mtodos para aplicao em sistemas
de diagnsticos, utilizados pelo Instituto Nacional de Inovao para
Diagnsticos em Sade Pblica do Paran (INDI-SADE/PR), que busca
sondas fluorescentes de baixo custo que possam ser utilizadas em kits
diagnsticos para a deteco de doenas por microorganismos demandas do
sistema de sade pblica nacional.
O complexo LaPPS34M faz parte das sondas fluorescentes compostas
de Eurpio (Eu3 +) ou Trbio (Tb3 +) que esto sendo estudados para
aplicao em sistemas biomdicos (ALBANI, 2007). Os tempos de vida dos
fluorforos destes elementos esto na escala de tempo de milisegundos e
surgem de transies entre os orbitais f dos tomos. Possuem caractersticas
pticas relevantes na marcao de doenas, pois tm grande fotoestabilidade.


a) Fatores que afetam a fluorescncia


H uma grande variedade de fluorforos e, consequentemente, uma
gama de espectros de absoro e emisso, alm de uma diferenciao dos

1
O spin corresponde a um grau de liberdade interno do eltron,e, embora seja descrito como
de forma aproximada com o movimento do eltron em torno do seu prprio eixo, uma
propriedade intrnseca da partcula (CARUSO, 2006).

28
tempos de vida de luminescncia para cada biomarcador. A deteco de
fluorescncia pode ento sofrer modificaes na sua intensidade com as
mudanas de temperatura, pH, a possibilidade de interao com solvente,
viscosidade, polarizao, presso e suas interaes com os solutos
(VALEUR,2002),(LAKOWICZ,1999).
O aumento da temperatura tem como consequncia um aumento na
eficincia dos processos de converses internas (CI) na desativao do estado
excitado (Figura 02). No entanto, por ser um fenmeno de tempo de vida
relativamente curto, esse fator menos crtico no caso da fluorescncia, o que
permite fcil observao do fenmeno na temperatura ambiente (BASSI, 2001).
Para o caso do pH, a fluorescncia de compostos aromticos com
funcionalidades cidas ou bsicas apresentam forte dependncia com o pH,
desta forma, importante manter o pH das amostras sempre constante.
A presena de outros grupos qumicos, como o oxignio dissolvido,
pode levar a uma diminuio da fluorescncia pelo aumento do cruzamento
inter sistemas (CSI), conforme Erro! Fonte de referncia no encontrada..
O decrscimo na viscosidade da soluo que possui o fluorforo leva a
diminuio da taxa de colises moleculares levando a uma diminuio da
difuso dos ftons de fluorescncia
Os solventes contendo tomos pesados acarretam na diminuio da
energia relativa do estado excitado. Essa diminuio de energia pode levar a
um aumento da eficincia das converses internas (CI) e em contrapartida a
diminuio da fluorescncia (BASSI, 2001).
Todos os fatores acima mencionados contribuem para que a
fluorescncia seja atenuada. Os testes foram realizados a temperatura
ambiente, com o pH 7 fixo, a viscosidade mantida constante e a diluio foi
realizada para manter a razo entre solvente e soluto sempre a mesma. Nesta
dissertao as condies acima elencadas foram necessrias para manter o
sistema constante ao longo das experincias ora realizadas




29
2.4. FLUORFOROS


Os fluorforos formam um grupo qumico que fluoresce quando
exposto a luz de um determinado comprimento de onda. Cada fluorforo tem
um espectro de emisso e de excitao caracterstico.
Prasad (2003) classifica os fluorforos em duas categorias, os
fluorforos intrnsecos ou naturais, e os fluorforos biomarcadores, no
naturais.
Os fluorforos intrnsecos so aqueles que ocorrem naturalmente. As
protenas como triptofano, tirosina e a fenilalamina, e algumas enzimas NADH,
FAD e Ribofavin encontrados dentro das clulas e dos tecidos so
caracterizados como fluorforos intrnsecos, alguns destes fluorforos
encontram-se ilustrados no anexo A. Eles podem ser usados para estudar as
estruturas dinmicas das clulas e das protenas. Tambm servem como
parmetros para os estudos de autofluorescncia (LAKOWICZ,1999).
Os fluorforos extrnsecos so aqueles que so adicionados a uma
amostra e chamados tambm de biomarcadores. Os fluorforos comerciais
como a famlia das sondas cyanines so representativas desse grupo,
representados no anexo B. As fluorescncias advindas de sondas
fluorescentes apresentam alta intensidade, so estveis durante iluminao
contnua e no perturbam o processo ou a biomolcula onde est sendo
estudada (LAKOWICZ,1999).
O fluorforo comercial Cy3 e o complexo LaPPS34M so sintetizados
em laboratrios e classificam-se como fluorforos extrnsecos, sendo
caracterizados como biomarcadores.


2.4.1. Caractersticas pticas dos Fluorforos


Algumas propriedades, como os espectros de absoro e de emisso, o
deslocamento de Stokes e o tempo de vida de luminescncia, fazem com que
os fluorforos tenham grande aplicao na biologia molecular, medicina e
30
engenharia biomdica principalmente relacionada aos diagnsticos e
tratamentos de vrias doenas, tais como doena de chagas, dengue e
hepatite (HAUGLAND,1996).


a) Absoro e Emisso


A intensidade do feixe luminoso diminui ao atravessar qualquer meio
absorvente, de acordo com a seguinte lei exponencial geral.

(Eq.1)

em que

e so respectivamente as intensidades do feixe incidente e do

feixe transmitido, o coeficiente de absoro (cm
-1
), dependente do
comprimento de onda e o comprimento do meio absorvente (cm).

Define-se a transmitncia como:

(Eq. 2)

e absorbncia (Abs) ou densidade ptica (DO) como:

(Eq. 3)

Quando o meio absorvente uma soluo com uma dada concentrao c,
comum relacionar com a concentrao, sendo:


(Eq. 4)

31
Onde se designa por coeficiente de extino molar ou absortividade molar
e c a concentrao da soluo em estudo. Se a concentrao for expressa
em M (mol
-1
), ser expresso em M
-1
cm
-1
.

Usando as relaes anteriores pode-se ento escrever:


(Eq. 5)

Esta relao representa a forma usual da Lei de Beer, que prev para solues
diludas em apenas uma espcie de absorvente, uma proporcionalidade direta
entre a concentrao e a absorbncia. A constante de proporcionalidade o
coeficiente de extino molar, , que a medida da intensidade da banda de
absoro, ou seja, a intensidade de energia da transio para cada
comprimento de onda.
Na Tabela 1 esto listados os comprimentos de onda de absoro e
emisso de fluorescncia para alguns fluorforos encontrados comercialmente.

Tabela 1 - Caractersticas dos Fluorforos Comerciais em relao aos comprimentos de
onda de absoro e de emisso de fluorescncia
Fluorforos

Acridime Orange 502 526
Alexa Fluor 532 532 553
Cy3 548 562
Cy7 710 805
FITC 490 520
RITC 570 595
FDA 495 520
Fonte: Modificado de HAUGLAND, 1996


b) Deslocamento de Stokes


A natureza do solvente e o ambiente local produzem profundos efeitos
sobre o espectro eletrnico das molculas. Esses efeitos so a origem do
32
deslocamento de Stokes (), que a diferena do comprimento de onda entre
as posies do mximo dos espectros de excitao e emisso, da mesma
transio eletrnica. Esta foi uma das primeiras observaes do fenmeno
conhecido como fluorescncia, descrito pelo fsico irlndes G. G. Stokes, em
1852 (LAKOWICZ, 1999), (ABBYAD et al, 2007). Uma causa comum para o
deslocamento de Stokes a rpida relaxao da estrutura para nveis
vibracionais mais baixos a partir de S
1
demonstrado na Figura 2.
A Figura 3 representa um desenho esquemtico de um exemplo dos
espectros tpicos de fluorescncia para molculas, onde podemos ver
representado o deslocamento de Stokes (Stokes Shift). Essa caracterstica
ptica importante para diferenciar os espectros de absoro e emisso para
cada molcula estudada. No caso especfico desta dissertao o complexo
LaPPS34M ser responsvel por um deslocamento de Stokes de
aproximadamente 200 nm.



Figura 3 - Ilustrao do deslocamento de Stokes entre o pico de absoro mxima e o
pico de emisso mxima.
Fonte: Modificado de MGUILBAULT, 1990


Para aplicaes em sistemas biomdicos e biolgicos necessrio que
os espectros de absoro e emisso sejam localizados em comprimentos de
onda distintos no espectro eletromagntico para que haja uma facilidade na
deteco de fluorescncia por parte da instrumentao. No caso do complexo
33
LaPPS34M a absoro se d na regio do azul (350 nm) e a emisso se d na
regio do vermelho (615 nm).
A equao 6 descreve as transies possveis para que ocorra o
deslocamento de Stokes. O comprimento de onda de absoro (ou o espectro
de absoro da molcula) descreve a variao de energia entre dois estados.

(Eq. 6)

Onde:
E
1
corresponde ao nvel de energia fundamental [J];
E
2
o nvel de energia do estado excitado [J]
a constante de Planck [6,62 x 10
-34
J.s]
c a velocidade de propagao da luz [ km/s]

o

comprimento de onda de emisso [nm]



c) Tempos de Vida de Luminescncia


A fluorescncia tem sido usada para estudar vrios sistemas qumicos,
fsicos e biolgicos (LAKOWICZ,1991), (JAMESON,1991). Apesar da grande
quantidade de informaes que se consegue com medidas estticas,
interessante examinar tambm a fluorescncia resolvida no tempo, ou seja,
atravs da anlise do tempo de vida possvel verificar se uma amostra
contm vrios fluorforos distintos, pois neste caso o que se espera mais de
um tempo de vida. No caso de um nico tipo de fluorforo, os dados resolvidos
no tempo podem indicar a influncia do meio em que se encontra o fluorforo
uma vez que isto pode alterar o tempo de vida de luminescncia.
H duas tcnicas para se obter dados de fluorescncia resolvidos no
tempo. Na primeira, uma amostra excitada com um pulso de luz e observa-se
a fluorescncia em funo do tempo. Na segunda tcnica, a amostra excitada
34
com luz modulada e a fluorescncia em funo do tempo obtida da resposta
em frequncia da emisso. Nos dois casos o objetivo obter os parmetros
que descrevem a fluorescncia em funo do tempo.
Os tempos de vida de luminescncia dos fluorforos podem variar de
10
-12
a centenas de 10
-9
s. Este tempo corresponde ao intervalo temporal para
que haja um decaimento exponencial partindo do valor mximo at 36,8%.
(isto , 1/e).
A equao a seguir relaciona os parmetros para a obteno dos
valores do tempo de vida de luminescncia dos fluorforos.

(Eq. 7)


Onde

a intensidade de luminescncia inicial no instante de t igual a 0, e
seguido de que o tempo de vida de luminescncia do fluorforo. Esta
varivel pode tambm ser descrita como

+ krn)
1
.

(Eq. 8)

Onde representa taxa de emisso do fluorforo e k
rn
a taxa de decaimento
no radiativa do estado fundamental.
Geralmente, para os fluorforos comerciais os tempos de vida esto
em torno de 10
-9
s. O Cy3 tem o tempo de vida de luminescncia em torno de
0,3 ns e utilizado na marcao de complexos imunes, pois invarivel ao pH
(entre 3 a 7) e a temperatura, mantendo sua estabilidade perante outros
fluorforos, tais como a fluorescena (MUJUMDAR et al, 1996).


2.4.2. Propriedades dos Fluorforos Comerciais e dos Complexos
Biomarcadores


35
A seleo de um marcador ou de um complexo biomarcador,
influenciada por fatores tais como as caractersticas espectrais. As
caractersticas do instrumento de deteco so fundamentais para que haja
preciso na coleta dos dados. Os parmetros dos instrumentos a serem
considerados incluem o tipo de fonte de excitao, os filtros pticos utilizados
para a discriminao do sinal e de sensibilidade, e os detectores, ou seja, a
forma como ser adquirido os dados.
As caractersticas importantes dos marcadores na otimizao so o
espectro de excitao, o deslocamento de Stokes, a emisso espectral e o
tempo de vida de luminescncia. Outros fatores, incluindo o coeficiente de
extino, o rendimento quntico de fluorescncia, fotoestabilidade e a
sensibilidade ambiental, determinam a intensidade de luminescncia de
biomolculas marcadas. Alm disso, os efeitos das caractersticas fsicas do
marcador sobre a rotulagem influenciam na eficincia e estrutura biolgica das
molculas (HAUGLAND,1996).
Uma abordagem utilizada amplamente determinar qual o marcador
ou quais os marcadores que so mais adequados para uma determinada
aplicao. O desempenho de um fluorforo est diretamente relacionado com
as propriedades qumicas e seus conjugados de cidos nuclicos
(HAUGLAND,1996).
O rendimento quntico de fluorescncia uma medida da eficincia
com que a molcula excitada capaz de converter a radiao luminosa
absorvida em emitida. definida como a frao de ftons absorvidos que so
convertidos em emisso de fluorescncia. O rendimento quntico muito
sensvel ao ambiente, ao pH, a temperatura e a estrutura do fluorforo
(PRASAD, 2003).
Fotoestabilidade a capacidade que tem um fluorforo de sofrer
repetidos ciclos de excitao e de emisso sem ser destrudo, enquanto no
estado excitado.
O ambiente tem um forte efeito em alguns fluorforos e mnimos sobre
outros. Os mais fortes fatores ambientais que afetam o rendimento de
fluorescncia so o pH e a escolha do solvente.
36
O coeficiente de extino molar () a capacidade que um mol
2
de uma
substncia tem em absorver luz num dado comprimento de onda, ou o quo
fortemente uma substncia absorve radiao a uma determinada frequncia.
Esta capacidade muito importante na determinao da quantidade de
radiao luminosa que pode gerar uma molcula atravs da emisso de
fluorescncia (PRASAD, 2003).
A maioria dos fluorforos de uso comercial ou complexos
biomarcadores tm coeficientes de extino molar em seu comprimento de
onda de absoro mxima variando entre 5.000 e 200.000 L mol
1
cm
1

(HAUGLAND, 1996). Em geral, marcadores, com grandes deslocamentos de
Stokes tendem a ter coeficientes de extino relativamente pequenos,
enquanto que os marcadores com pequenas mudanas no deslocamento de
Stokes tendem a ter coeficientes de extino relativamente grandes.
Algumas caractersticas dos fluorforos para que se possa ter
biomarcadores de qualidade, so:

1) Os marcadores devem produzir sinais luminosos, que so
espectralmente distinguveis da excitao e da emisso;
2) Fluorforos devem ser compatveis com a instrumentao disponvel;
3) Os marcadores e seus conjugados devem ser estveis em relao ao
pH, temperatura e condies de iluminao necessria para a anlise.

Alm disso, alguns dos fatores que influenciam no desempenho dos
fluorforos, so:

1) Os espectros de excitao e emisso de acordo com a fonte de
excitao e filtro de comprimentos de onda de emisso;
2) O rendimento quntico de fluorescncia do marcador;
3) A fotoestabilidade do marcador;
4) O meio onde o marcador se encontra, e

2
O mol definido como sendo a quantidade de matria de um sistema que contm tantas
entidades elementares quantos so os tomos contidos em 0,012 kg de carbono 12
(SOLOMONS, 2009).

37
5) O coeficiente de extino molar.

A banda espectral e a pureza do corante tambm so fatores
importantes que afetam a anlise do fluorforo. A importncia da largura de
banda espectral, especialmente no espectro de emisso, concentra-se na
capacidade dos instrumentos em distinguir um marcador do outro (PRASAD,
2003).
O uso dos fluorforos como biomarcadores abre a possibilidade de
pesquisas de como novos fluorforos podem se enquadrar nas caractersticas
necessrias para aplicao em sistemas biomdicos. Nesta dissertao
analisa-se o complexo LaPPS34M em comparao com o fluorforo Cy3 para
demonstrar as possveis aplicaes deste novo complexo em biomdica e
tambm nos projetos desenvolvidos pelo Instituto Nacional de Inovao em
Sade Pblica (INDI-SADE).


2.4.2.1. Fluorforo Comercial Cy3


H uma grande quantidade de marcadores ou fluorforos. A famlia
Cyanine (Cy) so marcadores fluorescentes. Esta famlia de fluorforos tem
grande intensidade de fluorescncia em relao emisso de cores, possuindo
faixas espectrais distintas e esto disponveis em diferentes composies
qumicas permitindo rotulagem via amina ou grupos tiol. O fluorforo Cyanine
proporciona alta sensibilidade e fotoestvel (ERNST,1989).
O marcador Cy3 tem emisso na regio do verde e pode ser
sintetizado com grupos reativos em cada um dos radicais [R] ou ambas as
cadeias laterais, de modo que o fluorforo pode ser quimicamente ligado a
qualquer cido nuclico ou molculas de protenas (ERNST,1989). Na Figura 4
apresenta-se a estrutura molecular do Cy3. Os Radicais [R] representam os
grupos aminas ou tiol aos quais a molcula pode se ligar. Os nmeros 1, 2 e 3
representam as posies das ramificaes que compem a estrutura molecular
do fluorforo.

38


Figura 4 - Ilustrao da estrutura molecular do fluorforo comercial Cy3. O N
+
o
smbolo do on nitrognio e o I
-
o smbolo do on iodo.
Fonte: Modificado de LAUREN et al,1988

O Cy3 constitui uma famlia molecular com solubilidade em gua, e
tolerncia ao Dimetilsulfxido (DMSO), com comprimento de onda de excitao
da ordem de 550 nm e de emisso da ordem de 570 nm (ambos na faixa de
emisso do verde). A marcao em sistemas mdicos e biolgicos
direcionada para identificao e quantificao do complexo antgeno-anticorpo
ou de estruturas internas da clula. Os Cy3 so usados em uma ampla
variedade de aplicaes. Para rotulagem de protenas e cidos ncleicos tal
como descrito pelos trabalhos de WILTSHIRE, 2000, e para localizao de
DNA e RNA (XIAO, 2007).
Esta classe de marcadores insensvel ao pH na faixa entre 3-10 e
fotoestvel. A fluorescncia advinda desse marcador permanece por mais
tempo, caracterizado pela fotoestabilidade. As caractersticas pticas da famlia
de Cys, que refletem a qualidade de um fluorforo, so apresentadas na
Tabela 2.







39
Tabela 2 - Caractersticas pticas relevantes para um fluorforo da famlia Cy-corante
Cy-
corante
Peso
Molecular
[u]

ABS

[nm]

Em
[nm]
Rendimento
Quntico
Coeficiente
de
extino
molar
[M
-1
.cm
-1
]
Tempo
de
vida
[ns]

Cy3 765,9 548 562 <0,3 0.04 0,30
Cy4 791,9 646 664 1.0 0.24 0,25
Cy5 792,1 649 670 0,28 0,15 1,0
Fonte: adaptada de Mujumdar, R.B., et al,1993


2.4.2.2. Complexo LaPPS34M


O complexo tem a estrutura molecular composta por
eurpio/bipiridina/dibenzolmetano na concentrao de 1:1:3. A estrutura
molecular demonstrada na Figura 5, e apresenta a faixa de comprimento de
onda de absoro na regio do azul e emisso de fluorescncia na regio do
vermelho (AKCELRUD, 2010)..



Figura 5 - Estrutura molecular do complexo LaPPS34M, com os elementos N (nitrognio)
e O ( oxignio), as cadeias aromticas (representada pelos hexgonos).
Fonte : Lapps/UFPR,(2010)

O elemento qumico eurpio (
63
Eu
152
) pertence famlia dos
lantandeos que compreende os elementos do lantnio (
57
La
138,9
) ao lutcio
40
(
71
Lu), entre os quais se incluem o trio (
39
Y
89
) e o escndio (
21
Sc
45
),(LEE,
1999).
Esses elementos so aplicados na investigao das propriedades e
funes de sistemas biomdicos e na identificao de substncias biolgicas.
Eles so usados principalmente como sondas espectroscpicas no estudo de
biomolculas e suas funes, por exemplo em marcadores biolgicos para
acompanhar o caminho percorrido pelos medicamentos no homem e em
animais; tambm como marcadores em imunologia e, como agentes de
contraste em diagnstico no invasivo de patologias em tecidos por imagem de
ressonncia magntica nuclear (MARTINS, 2005).
A semelhana entre as caractersticas fsicas e qumicas dos
elementos lantandeos (S, 2000) faz com que eles sejam mais estveis. LUI
(1997) descreve o estudo de fluorescncia resolvida no tempo onde se
encontrou os tempos de vida de luminescncia dos sistemas contendo eurpio
em torno de microsegundos. A presena do elemento eurpio em alguns
complexos ou polmeros faz com que a luminescncia esteja presente (LIMA,
2005). H uma transferncia de energia intramolecular do on metlico central e
esse efeito chamado de efeito antena
3
.
Dentre os lantandeos, os ons Eu(III) e Tb(III), so os mais utilizados
como sondas espectroscpicas, nas quais os elementos considerados
quelatos
4
destes elementos so os mais convenientes como sondas
luminescentes para sistemas biolgicos. Isto se deve ao fato de os mesmos
serem estveis e a transferncia de energia do quelato para o on Ln poder
atingir eficincia de aproximadamente 100% (BNZLI, 1989), fazendo com que
a luminescncia seja intensa, apresentando assim, alto rendimento quntico.
Os tempos de vida de luminescncia destes complexos so longos (100 a
1000 s); a diferena de energia entre a absoro do ligante e a emisso do
on (deslocamento de Stokes) muito grande, acima de 200 nm; possuem alta

3
O processo de converso de luz, chamado de efeito antena, envolve a absoro de radiao
ultravioleta atravs dos ligantes, que atuam como antenas, a transferncia de energia do
estado excitado do ligante para os nveis 4f do on metlico e a emisso de radiao se d no
visvel, caracterstica do on metlico ( LIMA, 2005)
4
Quando, em uma molcula, o tomo de metal possui ligantes coordenados a ele,sendo que,
cada um desses ligantes efetua duas ligaes ou mais com este metal, essa molcula
considerada um quelato ( SALIBA,2009)
41
sensibilidade de deteco; tm facilidade de se ligarem ao reagente
bioanaltico para marcao de antgenos e/ou anticorpos (BNZLI, 1989).
O complexo LaPPS34M que estudado em relao ao fluorforo
comercial Cy3, apresenta maior tempo de luminescncia, em torno de 110 s a
114,5 s, como est demonstrado nas figuras 30 e 32.


2.5. NANOPARTCULA


A nanotecnologia refere-se tcnica utilizada para manipular
estruturas na ordem de 10
-9
m, tornando possvel a criao de estruturas
funcionais em nano escala. Elas podem ser produzidas a partir de diferentes
materiais e formas (LIU, 2006).
As nanopartculas so utilizadas em uma grande variedade de reas,
incluindo materiais avanados, eletrnica, magnetismo, optoeletrnica,
biomedicina, frmacos e cosmticos (ZUO et al, 2007). H vrias
nanopartculas como as de materiais metlicos, por exemplo: ouro (Au), prata
(Ag), nquel (Ni), cobre (Cu), semicondutores e os polmeros.
A Figura 6 apresenta as nanopartculas metlicas em diferentes
dimenses, formas e composies e produzem materiais com distintas
propriedades de disperso da luz. Outra caracterstica visvel na figura a
variao na cor das nanopartculas metlicas (ROSI et al, 2005).


42

Figura 6 - Dimenses, formas e tamanhos das nanopartculas metlicas.
Fonte: Modificado de ROSI et al, (2005)

A utilizao de nanopartculas possibilita que ao conjug-las
conjuntamente com fluorforos, h um aumento da intensidade de
fluorescncia (LAKOWICZ, 2001). A intensificao do sinal permite que a
deteco de fluorescncia seja ampliada por causa da transferncia de energia
de ressonncia.
As aplicaes dessa tecnologia so a caracterizao e o
aprimoramento de novos biomarcadores, como por exemplo, para o
diagnstico de cncer e a deteco de doenas infecciosas por micro-
organismos (SOKOLOV, 1998) e (SIWACH, 2009).
O aumento da intensidade de fluorescncia do fluorforo Cy3 e do
complexo LaPPS34M foi realizado com o uso de nanopartculas de ouro e
prata e serviro de parmetros para a otimizao do sistema de
instrumentao desenvolvido com a finalidade de obter as caractersticas
pticas das amostras. As nanopartculas utilizadas foram produzidas pela
UFPR e sua produo e caracterizao esto apresentadas no anexo C.


43
2.5.1. Fluorforo na Presena de Nanopartculas


A transferncia de energia de ressonncia de fluorescncia
(Fluorescence Resonance Energy Transfer - FRET) uma tcnica para a
caracterizao de interaes distncia. uma das poucas ferramentas
disponveis que capaz de medir as interaes intermoleculares e a distncia
intramolecular tanto in vivo quanto in vitro (SELVIN, 2000). um processo pelo
qual um doador no radiativo do estado excitado (e.g., um fluorforo) transfere
energia para um estado receptor atravs de interaes de longo alcance
dipolo-dipolo (LAKOWICZ, 1999).
A FRET envolve a excitao de um fluorforo doador por incidncia de
luz dentro do seu espectro de absoro. Essa absoro de radiao eleva o
fluorforo a uma maior energia, estado excitado, que normalmente decai
(retorno ao estado fundamental) com um espectro de emisso caracterstico.
Se, no entanto, outro fluorforo ou nanopartculas (o receptor) existe nas
proximidades do doador h uma sobreposio do espectro de absoro do
receptor ao espectro de emisso do doador e, em seguida a possibilidade de
transferncia de energia no-radiativa entre o doador e o receptor (PRASAD,
2003).
A Figura 7 mostra a sobreposio do espectro de absoro da protena
fluorescente fluorescena e do espectro de emisso da protena fluorescente
rodamina possibilitando uma forte interao FRET.





44

Figura 7 - Esquema do processo de FRET entre dois fluorforos, a fluorescena doadora)
e a rodamina (receptora), onde r a distncia de mnima de FRET.
Fonte: Modificado de SAPSFORD et al, 2006.

Em geral, o doador e o receptor so diferentes. O FRET detectado
pelo aparecimento de fluorescncia do receptor ou por extino de
fluorescncia do doador.
Em uma molcula os eltrons migram do estado fundamental (S
o
) para
um nvel de vibrao mais elevada, de forma rpida com tempos da ordem de
pico segundos. Estes eltrons decaem para o nvel mais baixo de vibrao (S
1
)
e, eventualmente, dentro de nanosegundos, voltam para o estado (S
o
) e um
fton de luz emitido (LAKOWICZ et al, 2008).
Na transferncia de energia de ressonncia o fton no emitido, mas
a energia transferida para a molcula receptora, cujos eltrons por sua vez,
tornam-se excitados. Isto est apresentado na Figura 6, por meio de um
diagrama de Jablonski para o processo de FRET.
45





Figura 8 - Descrio do processo de FRET pelo de diagrama de Jablonski.
Fonte: Prpria

O FRET pode resultar em uma diminuio da fluorescncia da
molcula doadora como em um aumento da fluorescncia do receptor. O
mtodo estabelece a medida da interao entre o fluorforo e a superfcie das
nanopartculas A taxa de transferncia de energia dependente de muitos
fatores, tais como o grau de sobreposio espectral entre o doador e o
receptor, a orientao relativa dos dipolos de transio, e mais importante, a
distncia entre o doador e receptor nas molculas. Geralmente o FRET ocorre
nos sistemas biomdicos em dimenses (r) em torno de 2 a 10 nm (CHEN,
2007).
Quando se conjuga as nanoparticulas com fluorforos ou complexos
h um aumento da intensidade de fluorescncia. A Figura 30 representa o
resultado do fenmeno de FRET para o caso de nanopartculas de prata
conjugadas com o bioindicador LaPPS34M.

46
2.6. RESUMO


Neste captulo, apresentou-se que a medio de fluorescncia apresenta
potencialidade para sistemas de diagnsticos rpidos utilizando um
biomarcador fluorescente.
Para a caracterizao ptica deste indicador fluorescente utilizou-se os
espectros de absoro e emisso da substncia ou complexo, o deslocamento
de Stokes entre a absoro e emisso e o tempo de vida do emisso de
luminescncia.
Normalmente, o Cy3 o indicador mais utlizado para a marcao do
complexo antgeno-anticorpo, entretanto, este trabalho utililizar o novo
complexo LaPPS34M (Lapps/UFPR) para a emisso de fluorescncia devido
ao maior tempo de emisso (na ordem de 100s) e deslocamento de Stokes
(em torno de 200 nm).
Adicionalmente, o uso de nanopartculas possibilitar a intensificao
do sinal de fluorescncia quando houver a conjugao de fluorforos com as
nanopartculas.
No captulo a seguir, apresenta-se uma descrio dos elementos
utilizados na implementao de um sistema de aquisio de fluorescncia.



47
3. SISTEMAS DE AQUISIO DE LUMINESCNCIA


3.1. INTRODUO


Neste captulo apresentado o sistema implementado para a deteco
da emisso de fluorescncia dos fluorforos Cy3 e LaPPS34M. Dentro deste
sistema, utilizou-se para a deteco de fluorescncia, a vlvula
fotomultiplicadora R928 e a vlvula fotomultiplicadora miniatura R5600U-01 e,
posteriormente, por um componente optoeletrnico OPT 301.

3.2. DETERMINAO DO ESPECTRO DE ABSORO DO CY3 E DO
COMPLEXO LaPPS34M


A anlise de elementos qumicos, as estruturas internas dos compostos
e o levantamento de dados fsico-qumicos da absoro, emisso e disperso
da interao da luz com as amostras so essenciais para descrever o
comportamento e natureza dos compostos orgnicos (LEE, 1999).
A absoro de radiao eletromagntica que acontece na regio do
ultravioleta e tambm do visvel, estudada atravs da espectroscopia de
absoro. Se o objeto de interesse a emisso, obtm-se tal espectro pela
espectroscopia de emisso. H outros tipos de espectroscopia como de
infravermelho, de microondas, Raman, de fluorescncia, de raios x, de plasma,
fotoacstica e de ressonncia magntica (OKUNO, 1982).
Para que haja interao entre a luz incidente e a amostra deve haver
ressonncia. A radiao eletromagntica e as partculas da amostra devem ter
a mesma frequncia, e isto s possvel se a energia de excitao for maior
que a fundamental levando s transies eletrnicas entre os nveis de energia
(EISBERG, 1988).
A absoro molecular se d atravs da soma das contribuies de
vrios nveis de energia, a rotacional, vibracional e eletrnica. O movimento de
translao da molcula como um todo no modifica as posies relativas das
48
partculas que a constituem, entretanto as ligaes intermoleculares e os
ngulos entre as ligaes vibram, enquanto que a estrutura nuclear gira como
um todo. Podemos desprezar os movimentos de rotao e vibrao das
molculas, pois as velocidades eletrnicas so pelo menos mil vezes maiores
que as nucleares (BASSI, 2001).


3.2.1. Espectrofotmetro de Duplo Feixe


Para a determinao o espectro de absoro e emissao dos fluorforos
Cy3 e LaPPS34M, utilizou-se um espectrofotmetro para as regies do
ultravioleta, do visvel e do infravermelho.
O espectrofotmetro apresenta uma fonte de radiao eletromagntica
de espectro contnuo, um porta amostra, um monocromador e um detector
(Figura 9). Nos espectrofotmetros de feixe simples a radiao s atravessa a
amostra e nos espectrofotmetros de feixe duplo mede-se simultaneamente a
intensidade transmitida pela amostra e a transmitida por um padro de
referncia, a diferena das duas intensidades aquela absorvida pela amostra.

49


Figura 9 - Desenho esquemtico do espectrofotmetro de duplo feixe
Fonte: Prpria

O equipamento disponvel no laboratrio de ptica da UTFPR consiste
em um espectrofotmetro de duplo feixe UV-VIS, modelo DB 1880S,
composto de duas fontes ticas, uma lmpada de tungstnio halognio ( para
a regio do visvel) e outra de deutrio (para a regio do ultravioleta). Tem-se
internamente dois monocromadores que permitem a passagem de uma faixa
estreita do espectro da energia incidente com um comprimento de onda
especfico, que varia de 190 nm a 1100 nm. A cubeta onde se coloca a amostra
de quartzo com volume de 3,5 ml e o comprimento do caminho ptico, pelo
qual se dar a interao da radiao e a substncia da amostra, definido pelo
dimetro interno da cubeta na ordem de 10 mm. A fotografia 1 representa o
equipamento disponvel no laboratrio de ptica da UTFPR.






50


Fotografia 1 - Espectrofotmetro de Duplo Feixe UV-Vis.
Fonte: Prpria

O sistema descrito foi utilizado para se obter os espectros de absoro
do fluorforo comercial Cy3, o espectro de absoro do complexo LaPPS34M,
e a resposta espectral dos filtros utilizados no experimento.


3.2.1.1. Espectro de Absoro


Os espectros de absoro do fluorforo comercial Cy3 e o do complexo
LaPPS34M foram obtidos pelo espectrofotmetro descrito no item 3.2.1. O
fluorforo Cy3 foi diludo em uma soluo tampo na proporo 1:1, isto , 1 ml
de soluto em 1 ml de solvente e colocado na cubeta de quartzo e transportada
ao espectrofotmetro. Observa-se que a absoro do fluorforo Cy3 acontece
na regio compreendida entre 530nm e 560nm, com um pico mximo em
550 nm, conforme vizualiza-se na Figura 6. O espectro de absoro do
complexo LaPPS34M foi obtido diluindo a amostra em soluo de
tetrahidrofurano (THF), seguindo o mesmo procedimento no qual foi obtido o
espectro de absoro do fluorforo Cy3. A Figura 6 representa o grfico do
complexo LaPPS34M com um pico mximo (principal) em 400nm e outro
secundrio em 300nm.
51


Figura 10 - Espectro de absoro do fluoroforo Cy3 obtido pelo espectrofotmetro.
Fonte: Prpria


Figura 11 - Espectro de absoro do complexo LaPPS34M obtido pelo espectrofotmetro
Fonte: Prpria


Os resultados indicam que no caso do fluorforo Cy3, os dados
coletados no laboratrio da UTFPR correspondem ao disponvel na literatura,
pois o pico mximo de absoro se encontra em 550 nm, conforme
apresentado na Erro! Fonte de referncia no encontrada.. Para o estudo do
complexo LaPPS34M percebe-se a presena de dois picos, sendo que a maior
52
absorbncia se encontra em 400 nm, como demonstrado na Erro! Fonte de
referncia no encontrada..


3.3. SISTEMA DE AQUISIO DE SINAL DE FLUORESCNCIA


Para a deteco da luminescncia, foi implementado um sistema de
deteco de acordo com a Figura 12. O sistema composto por (a) uma fonte
ptica acoplada a um gerador de sinais utilizado para a excitao do fluorforo,
(b) um fluorforo em uma cubeta posicionada de forma que o caminho ptico
de excitao e de deteco formem um ngulo de 90 graus para minimizar a
energia de excitao que incide no sensor de luminescncia, (c) lente
convergente para orientar o feixe incidente d) Monocromador ou filtro ptico
para emisso, (e) um fotodetector de estado slido, (f) um amplificador de
transimpedncia, (g) e (h) representam o sistema de aquisio e
processamento de sinais atravs do osciloscpio e computador padro.

Figura 12 - Representao esquemtica do sistema de deteco proposto
Fonte: Prpria


O mtodo proposto ser dividido em trs fases devido a utilizao de
trs distintos optodetectores (vlvula fotomultiplicadora R928, vlvula
fotomultiplicadora miniatura R5600U-01 e detector optoletrnico OPT301):

53
A fase I constituda da coleta de dados a partir da instrumentao
com o uso da vlvula fotomultiplicadora R928, conforme pode ser visto na
Figura 13




Figura 13 - Desenho esquemtico do sistema experimental por vlvula fotomultiplicadora
R928 (de alta sensibilidade)
Fonte: Prpria

A instrumentao descrita na Figura 13 possibilita a obteno do
espectro de fluorescncia e o tempo de vida de luminescncia da amostra
LaPPS34M na fase 1, bem como o espectro de fluorescncia do fluorforo
comercial Cy3, cujo sistema de deteco baseia-se na utilizao da vlvula
fotomultiplicadora grande. O sistema composto por (a) uma fonte ptica
acoplada a um gerador de sinais utilizado, neste caso leds ultravioleta e azul
(b) uma cubeta de quartzo contendo a amostra, (c) uma lente convergente d)
um monocromador para selecionar o comprimento de onda de emisso modelo
SpectraPro 275 (Acton Research Co., U.S.A) com distncia focal de 275 mm,
sistema ptico do tipo Czerny-Turner, (d) uma vlvula fotomultiplicadora grande
tipo janela lateral R928 (Hamamatsu Co.,U.S.A), (e) um amplificador de
transimpedncia, (f) e (g) um sistema de aquisio e processamento de sinais.
A fase II constituda de (a) uma fonte ptica composta de um diodo
emissor de luz ultravioleta,(b) uma cmara de amostra que contm sada que
direcionam o feixe de luz do diodo emissor de luz para o filtro, (c) um filtro que
54
serve para selecionar o comprimento de onda de emisso de fluorescncia, (d)
uma vlvula fotomultiplicadora miniatura em modelo R5600U-01 ultra compacto
com 10 mm de comprimento, 15 mm de dimetro e janela ptica (fotocatodo)
de 8 mm de dimetro. So ainda componentes da fase II, (e) um amplificador
de transimpedncia usado para converte o sinal luminoso em tenso eltrica (f)
um osciloscpio que permite a captao dos sinais e (g) um computador
padro para realizar o tratamento dos dados.
O tamanho reduzido da vlvula e do filtro de interferncia permitiu a
acomodao deste conjunto em uma das sadas da cmara de amostras,
configurando um sistema compacto conforme o esquema apresentado na
Figura 14.

Figura 14 - Desenho esquemtico do sistema com o uso da vlvula fotomultiplicadora
miniatura (R5600U-01).
Fonte: Prpria

No caso especfico do sistema com o uso da vlvula fotomultiplicadora
miniatura (R5600U-01), a cmara de amostra adaptada para que a amostra
seja utilizada em um tubo de ensaio, tamanho de 2 cm de dimetro e 10 cm de
altura. O complexo LaPPS34M foi diludo em tetrahidrofurano (THF) colocado
no tubo de ensaio e posteriormente na cmara de amostra. Atravs da
configurao descrita na Figura 14, permite-se obter o tempo de vida de
luminescncia.
55
A fase III corresponder pelo uso da mesma instrumentao com
detector optoleletrnico, a ilustrao do desenho esquemtico do sistema
apresentada na Erro! Fonte de referncia no encontrada..



Figura 15 - Desenho esquemtico do sistema experimental por fotodiodo
Fonte: Prpria

A instrumentao descrita na Erro! Fonte de referncia no encontrada.
possibilita a obteno do tempo de vida de luminescncia da amostra
LaPPS34M na fase 3, cujo sistema de deteco baseia-se na utilizao do
fotodiodo OPT301. O sistema composto por (a) uma fonte ptica acoplada a
um gerador de sinais utilizado para a excitao do indicador, (b) um indicador
em uma cubeta posicionada de forma que o caminho ptico de excitao e de
deteco formam um ngulo de 90 graus, (c) filtro ptico para permitir a
emisso, (d) um fotodetector de estado slido, (e) amplificador de
transimpedncia utilizado para converter o sinal luminoso em sinal eltrico (f)
um sistema de aquisio e processamento de sinais.
A fonte ptica corresponde ao diodo emissor de luz na faixa do violeta
com comprimento de onda para o pico de emisso em 400 nm. Aplica-se um
sinal com frequncia de 100Hz (periodo de 10 ms) e duty cicle de
aproximadamente 15%, isto , pulso de 1.5 ms. Esse sinal foi aplicado
utilizando-se o gerador de sinais AFG3000 da Tektronix.
A amostra LaPPS34M. foi diluda em uma soluo de tetrahidrofurano
(THF) na proporo 1:1, isto , 10 ml de soluto em 10 ml de solvente e
colocada num tubo de ensaio de 2 mm de dimetro.
56
No caminho ptico da emisso foi acrescido um filtro de interferncia
com o espectro de transmitncia apresentado na Figura 20. Observa-se que a
resposta desse filtro apresenta elevada transmitncia na regio de emisso do
complexo LAPPS34M. O filtro foi adicionado ao sistema com a inteno de
minimizar qualquer interferncia da energia de excitao no fotodetector
permitindo a passagem da energia emitida pelo indicador.
A deteco do sinal de fluorescncia foi obtida por um fotodiodo
OPT301, com janela fotosensvel de 2,29 mm x 2,29 mm (OPT301, 1994). O
fotodetector tem um amplificador conversor corrente-tenso integrado no
mesmo encapsulamento. A Erro! Fonte de referncia no encontrada.a
apresenta o circuito interno do OPT301 e a Erro! Fonte de referncia no
encontrada.b a resposta espectral do sensor.







Figura 16 - (a) Dispositivo OPT 301 apresenta um fotodiodo integrado com amplificador
conversor corrente-tenso, (b) resposta espectral do OPT 301, (i) emisso de
luminescncia do indicador (LAPPS34M ~ 615 nm) (ii) excitao do indicador (LAPPS34M
~ 350 nm).
Fonte: Burr-Brown Corporation, 1994

Da figura 16(b), a resposta espectral do detector optoreletrnico
apresenta: (a) uma boa resposta para a emisso de luminescncia do indicador
(LAPPS34M ~ 615 nm) e (b) uma resposta inferior para a excitao do
indicador (LAPPS34M ~ 350 nm).

Os sinais foram adquiridos com um osciloscpio digital modelo
TDS2002B (Tektronix, Beaverton, OR, U.S.A.). Os sinais so digitalizados e
(i)
(ii)
57
armazenados em um dispositivo via interface serial USB. Aps transferidos
para um computador os dados so processados utilizando uma funo
Dynamic Fit Wizard do programa Sigmaplot 11.0 para determinao dos
parmetros de uma ou mais exponenciais. O parmetro de tempo de
decaimento da exponencial corresponde ao tempo de vida de luminescncia do
indicador LaPPS34M.
Na fase I, II e III com a utilizao dos sistemas descritos nas figuras 13,
14 e 15 foram coletadas as caractersticas pticas necessrias para
caracterizar o fluorforo estudado, ou seja, o complexo LaPPS34M.
O levantamento dos espectros de absoro, de emisso de
fluorescncia e os tempos de vida de luminescncia so os parmetros
relevantes para a consolidao das caractersticas pticas de um fluorforo. A
descrio do uso de nanopartculas de ouro e prata serviro para demonstrar a
possibilidade de intensificar o sinal de intensidade de fluorescncia nos
sistemas utilizados.


3.4. SISTEMA DE DETECO DE FLUORESCNCIA


Em um sistema de deteco de luminescncia tpico, um feixe de luz
de alta intensidade passa atravs de lentes convergentes para orientar o feixe
a passar pela cubeta. O feixe de luz de excitao passa atravs de uma cubeta
contendo a amostra (Figura 12). Para evitar a deteco do feixe incidente,
pode-se fazer a observao da fluorescncia em ngulo reto com o feixe
incidente, pois a amostra ir emitir em todas as direes. A luz emitida
(luminescncia) passa atravs de um monocromador para a anlise do
comprimento de onda e depois vai para um detector fotossensvel (vlvula
fotomultiplicadora). Os comprimentos de onda so detectados e apresentam a
intensidade de emisso como uma funo do comprimento de onda da luz
emitida (WILLARD, 1988).
e: Prpria
3.4.1. Fonte ptica

58

A fonte ptica deve ceder energia radiante para a faixa de comprimento
de onda de absoro do estudo. H vrios tipos de fontes pticas que podem
ser utilizadas para obter a fluorescncia como: diodos emissores de luz Light-
Emitting Diodes (led) e os dispositivos de Light Amplification by Stimulated
Emission of Radiation (LASER).
A excitao advinda dos marcadores fluorescentes gera pulsos na faixa
de nano segundos. A fonte ptica deve ser capaz de fornecer um espectro de
energia abrangente. Os diodos representam a fonte ptica escolhida por
apresentarem um baixo custo e grande diversidade de comprimentos de onda.
Para a obteno do tempo de vida de luminescncia da molcula
LaPPS34M utilizou-se uma lmpada xnon de arco curto (1,5 mm) para
excitao pulsada tipo FX-249 (EG&G ELETRO-OPTICS, U.S.A). A Figura 17
representa o espectro de emisso. Esta lmpada possibilita excitaes na faixa
de 7J e potncia mdia de 20 W e trabalha com tenses de at 1500 V com
taxas de repeties de at 500 Hz. A faixa espectral est entre 310 a 1100 nm.

Figura 17 Espectro de emisso da lmpada xenon
Fonte: Prpria

Utilizou-se conjuntamente uma fonte de disparo da lmpada tipo PS-
302 (EG&G ELETRO-OPTICS, U.S.A), a tenso de sada pode ser regulada
entre 400 e 1500 V, com pulsos com tenso de 3V com durao de 1 a 100 s.
300 400 500 600 700 800
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
E
m
i
s
s

o

R
e
l
a
t
i
v
a

[
a
.
u
]
Comprimento de Onda [nm]
59
As figuras 18 e 19 representam os espectros de emisso dos dois leds
utilizados no experimento, os espectros de emisso do led azul e do ultravioleta
foram obtidos utilizando o sistema descrito pela Figura 12.



Figura 18 - Espectro de emisso de led azul, com comprimento de onda do pico 440 nm.
Fonte: Prpria



Figura 19 - Espectro de emisso de led ultravioleta, com comprimento de onda do pico
400 nm.
Fonte: Prpria

3.4.2. Lentes Convergentes e Filtros


60
A lente convergente utilizada no experimento de fluorescncia serviu
para redirecionar a luz que vem da fonte ptica, neste caso do diodo emissor
de luz (led) para o foco. A amostra era colocada na posio focal em relao
lente. Foram utilizadas duas lentes convergentes de 15 cm e 5 cm de distncia
focal respectivamente, como mostra o esquema de montagem do sistema de
deteco representado na Fotografia 2.


Fotografia 2 - Montagem do uso das lentes convergentes no experimento de
fluorescncia.
Fonte: Prpria

Os filtros em geral selecionam os comprimentos de onda que so
transmitidos atravs de absoro, pela interao da energia radiante incidente
com o material do filtro. Eles possibilitam a passagem de comprimentos de
onda acima ou abaixo de um valor especfico; caracterizam-se por no serem
sensveis ao ngulo de incidncia da radiao e so muito utilizados em
sistemas ticos para selecionar as faixas de frequncia desejveis.
No experimento de fluorescncia, para a obteno do tempo de vida do
complexo LaPPS34M foram utilizado filtros de 614 nm e 640 nm. A Figura 20
61
representa o espectro de transmisso de um filtro de interferncia na regio do
vermelho.

Figura 20 - Espectro de transmitncia do filtro de interferncia na regio do vermelho
Fonte: Prpria


3.4.3. Monocromador


A funo de um monocromador permitir a passagem de uma faixa
estreita do espectro da energia radiante centrada em um comprimento de onda
especfico. O monocromador utilizado no experimento de deteco de
fluorescncia foi o SpectraPro 275 (Acton Research Co., U.S.A) com distncia
focal de 275 mm, sistema ptico do tipo Czerny-Turner, conforme mostra a
Fotografia 3. O equipamento permite o controle local ou remoto da velocidade
de varredura, comprimentos de onda inicial e final, avano passo a passo, para
uma das duas grades possveis de serem acopladas.
A 1

Grade possui 1200 ranhuras/mm, comprimento de onda de
transmisso de 300nm, e a 2 Grade possui 1200 ranhuras/mm, comprimento
de onda de 500 nm (Acton Research Co., 1992). As fendas foram fixadas em
3,0 mm, tanto na entrada com na sada, possibilitando um controle da faixa de
passagem do comprimento de onda e da resoluo. A resoluo mxima est
em torno de 0,1 nm medido para um comprimento de onda a 435,8 nm com
uma grade difratora de 1200 ranhuras/mm.
600 700 800 900 1000 1100
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
T
r
a
n
s
m
i
t

n
c
i
a

[
%
]
Comprimento de Onda [nm]
62
Para o experimento foi escolhida a grade 1 por estar de acordo com a
regio do espectro do de fluorescncia desejado com a largura da fenda
mantida constante em 3 mm.




Fotografia 3 - Monocromador do tipo Czerny-Turner.
Fonte: Prpria


3.4.4. Cubeta


A cubeta do tipo 111OS (Hellmasulamericana Ltda) para os estudos
de fluorescncia possui todas as laterais polidas de quartzo, possibilitando que
a transmitncia seja alta para a faixa de comprimento de onda de excitao e
emisso, permitindo que a luz de excitao entre em uma direo e possa ser
detectada em outra direo, perpendicular a da excitao, diminuindo assim a
incidncia de radiao de excitao no detector. A cmara de amostra utilizada
possui um caminho ptico de 10 mm, conforme ilustrado na Figura 21.
Na Figura 22 representado o espectro de transmitncia da cubeta de
quartzo. Na faixa correspondente a absoro da amostra LaPPS34M, a cubeta
de quartzo apropriada, pois tem pouca absoro no ultravioleta.

63



Figura 22 - llustrao do espectro de transmitncia da cubeta de quartzo
Fonte: BRANCO, 1997


3.4.5. Vlvulas Fotomultiplicadoras ( PMTs)



Figura 21 - Diagrama representativo da transmitncia de luz pela amostra na cubeta
Fonte: Modificado de BRANCO, 1997
64
A deteco realizada atravs da transformao dos sinais pticos em
sinais eltricos com o uso de sensores opto-eletrnicos. Um dos sensores
utilizados foi uma vlvula fotomultiplicadora tipo janela lateral R928
(Hamamatsu Co.,U.S.A) com sensibilidade do catodo de 352 A/lmen, com
corrente de anodo na ausncia de energia radiante incidente de 4,5 nA. O
tempo de subida do sinal de 2,2 ns e a resposta espectral ptica varia de 190
a 900 nm. Utilizou-se uma fonte de alta tenso para a polarizao da vlvula,
conversor DC-DC tipo C1309-04 ( Hamamatsu Co., U.S.A) com tenso de
entrada de 13 a 24 V e corrente de 160 mA. A tenso de sada regulada foi de
190 a 1100 V.
As vlvulas fotomultiplicadoras (PMT - photo multiplier tube) combinam
uma camada fotosensvel de metais alcalinos (multialkali: Na-K-Sb-Cs)
denominada de fotocatodo, e um multiplicador de eltrons que consiste em
uma srie de dinodos cobertos com um material de alta emisso secundria
(metal channel dynode). O fotocatodo converte ftons incidentes em
fotoeltrons e estes so multiplicados de dinodo para dinodo atingir o anodo,
conforme a Figura 23.

Figura 23 - Representao do processo de gerao e multiplicao de eltrons em uma
vlvula fotomultiplicadora
Fonte: BRANCO,1997
Um conjunto de resistores divide a tenso de polarizao para os
diversos dinodos. O ganho total (G) da vlvula corresponde ao nmero de
estgios n multiplicado pelo fator de emisso secundria por estgio f , sendo
dado por:
65
G f
n

(Eq.12)

Os valores assumidos por f apresentam-se na faixa de 3 a 10, sendo
que para dinodos recobertos com GaP (Fosfeto de Glio), o fator de emisso
secundria pode alcanar 50. Esta larga capacidade de amplificao interna,
permite a utilizao das PMTs na medio de sinais luminosos com baixos
nveis de intensidade, na faixa de 10
-14
a 10
-4
lmens, sendo que 1 lmen
corresponde a 1,47 mW (BRANCO, 1997).


3.4.6. Amplificador de Transimpedncia


Para converter a corrente do sensor optoeletrnico em um nvel de
tenso, utiliza-se um amplificador de transimpedncia.
O circuito apresentado na Figura 24 foi montado em circuito impresso e
introduzido numa caixa metlica. O circuito possui capacitores para estabilizar
a tenso de alimentao, diodos (1N4148) de proteo na entrada e diodo para
alimentao da tenso de sada. O amplificador operacional foi o OP 627 com
baixa corrente de fuga e offset e alta impedncia de entrada com baixo valor
capacitivo, alto ganho de malha aberta, ampla largura de banda de 16 MHz
assim como variao da tenso de sada.



Figura 24 - Circuito de Implementao do Amplificador de Transimpedncia
Fonte: SCHNEIDER, 1995
66


3.4.7. Aquisio do Processamento do Sinal


Os sinais foram adquiridos com um osciloscpio digital modelo
TDS2002B (Tektronix, Beaverton, OR, U.S.A.). Os sinais so digitalizados e
armazenados em um dispositivo via interface serial USB. Depois de
transferidos para um computador os dados so processados. Utilizou-se uma
funo Dynamic Fit Wizard do programa Sigmaplot 11.0 para determinao dos
parmetros de uma exponencial


3.5. RESUMO

Implementou-se um sistema de deteco de fluorescncia com 3
distintos detectores pticos, denominados de fases I (vlvula fotomultiplicadora
R928), II (vlvula fotomultiplicadora miniatura R5600U-01) e III (detector
optoeletrnico OPT301). De acordo com os detectores e as suas medidas dos
tempo de emisso de fluorescncia, estes serviro de referncia para a
construo de equipamentos de baixo custo e maior resistncia mecnica.
O captulo 4 a seguir apresenta os ensaios realizados para a
determinao dos tempos de vida da fluorescncia com a instrumentao
implementada e o marcador LaPPS34M.



67
4. RESULTADOS


4.1. INTRODUO

No sistema desenvolvido, a deteco de fluorescncia foi feita por
meio de (a) vlvulas fotomultiplicadoras e (b) um detector optoeletrnico. Os
resultados deste trabalho so apresentados neste captulo na seguinte
sequncia:
a) Os espectros de emisso de Fluorescncia do Cy3 e do complexo
LaPPS34M;
b) Os espectros de emisso de fluorescncia conjugados com
nanopartculas do Cy3 e do complexo LaPPS34M;
c) O tempos de vida de luminescncia do complexo LaPPS34M.


4.2. ESPECTROS DE FLUORESCNCIA


a) Fluorforo Cy3


Os espectros de fluorescncia de Cy3 foram obtidos atravs da fase I
descrita no item 3.3. A amostra de fluorforo comercial Cy3 foi diluda em
soluo tampo na proporo de 1:1 e colocada na cubeta de quartzo. A Figura
25 representa o grfico da regio do espectro de emisso.
O fluorforo Cy3 apresenta excitao na regio do azul e regio
espectral de emisso variando de 530 nm a 580 nm, com um pico mximo em
564 nm. Os dados experimentais foram obtidos com pulsos de 75 s com
frequncia de 147,3 Hz. A vlvula fotomultiplicadora R928 foi mantida a 800 V
e as fendas do monocromador mantidas com abertura de 3 mm.
O deslocamento de Stokes do fluorforo Cy3 pequeno entre a
excitao e a emisso, em torno de aproximadamente 15 nm, indicando a
aproximao entre os picos do espectro de excitao e emisso concentrando-
68
se na regio do verde, com a excitao na regio do azul, isto dificultaria, no
filtro ptico, separar emisso de recepo.


Figura 25 - Espectro de fluorescncia do fluorforo Cy3 obtido pela FASE I (vlvula
fotomultiplicadora R928)
Fonte: Prpria


A Figura 26 representa o deslocamento de Stokes do fluorforo Cy3
demonstrando a variao para o complexo em torno de 20 a 50 nm.


Figura 26 - Espectro de absoro e emisso de fluorforo Cy3 demonstrando o
deslocamento de Stokes obtido pela FASE I.
Fonte: Prpria


520 540 560 580 600 620
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
E
m
i
s
s

o

d
e

F
l
u
o
r
e
s
c

n
c
i
a

[
a
.
u
]
Comprimento de Onda [nm]
69
b) Complexo LaPPS34M


Na Fase I descrita no item 3.3 o complexo LaPPS34M foi diludo em
soluo de tetrahidrofurano (THF) cuja a frmula molecular representada por
C
4
H
8
O, na proporo de 1:1. Pulsos pticos de 3 ms com frequncia de
114 Hz foram obtidos de forma experimental. A vlvula fotomultiplicadora R928
foi mantida em 700 V e a abertura das fendas do monocromador em 3 mm. A
regio espectral de emisso acontece entre 600 nm e 630 nm, com um pico
mximo em 615 nm conforme a Figura 27. Essa caracterizao ptica indica
que a molcula tem um grande O deslocamento de Stokes entre os picos do
espectro de excitao e emisso, e esta variao ocorre entre a regio do azul
(excitao) e a regio do vermelho (emisso).


Figura 27 - Espectro de fluorescncia do complexo LaPPS34M obtido pela FASE I.
Fonte: Prpria

A Figura 28 representa o deslocamento de Stokes do complexo
LaPPS34M demonstrando a variao para o complexo em torno de 200 a 250
nm.

580 590 600 610 620 630 640
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
E
m
i
s
s

o

d
e

F
l
u
o
r
e
s
c

n
c
i
a

[
a
.
u
]
Comprimento de onda [nm]
70


Figura 28 - Espectro de absoro e emisso de LaPPS34M demonstrando o
deslocamento de Stokes obtido pela FASE I
Fonte: Prpria

71
4.3. ESPECTROS DE FLUORESCNCIA COM NANOPARTCULAS
METLICAS


a) Fluorforo Cy3


O fluorforo Cy3 foi conjugado com nanopartculas de ouro e a Figura
29 representa os espectros de fluorescncia. No anexo C segue a descrio da
formao e caracterizao das nanopartculas. Segundo a teoria de FRET
descrita na seo 2.7.1 quando um fluorforo se encontra na presena de
nanopartculas pode haver um aumento da intensidade de fluorescncia e um
decrscimo do tempo de vida.
O grfico da Figura 29 demonstra que o fluorforo comercial Cy3 na
presena de nanopartculas de ouro apresenta um deslocamento espectral, no
sentido de menores comprimentos de onda, com um aumento de
aproximadamente 170% no valor da intensidade de fluorescncia, demonstrada
pelo aumento da intensidade de sinal do sistema, confirmando a teoria de que
a presena de nanopartculas modifica a fluorescncia.





Figura 29 - a)Espectro de Fluorescncia do fluorforo Cy3 e b) o espectro de fluorescncia do
Fluorforo Cy3 conjugado com Nanopartcula de Ouro obtido pela FASE I.
Fonte: Prpria

520 540 560 580 600 620
12
14
16
18
20
22
24
26
E
m
i
s
s

o

d
e

F
l
u
o
r
e
s
c

n
c
i
a

[
a
.
u
]
Comprimento de Onda [nm]
500 520 540 560 580 600
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e

d
e

F
l
u
o
r
e
s
c

n
c
i
a

[
a
.
u
]
Comprimento de Onda [nm]
72
b) Complexo LaPPS34M


No estudo do complexo LaPPS34M, a escolha das nanopartculas de
prata se deu em virtude de que o espectro de absoro destas nanopartculas
ocorre na regio do espectro de absoro do complexo, o que segundo a teoria
de FRET (seo 2.5.1) ocasiona uma intensificao da fluorescncia. Neste
caso, a absoro das nanopartculas de prata acontece em 400 nm e a
absoro do complexo est na faixa de 350 nm a 400 nm.
A Erro! Fonte de referncia no encontrada. representa o grfico do espectro
de fluorescncia do complexo LaPPS34M, demonstrando que h uma
modificao do sistema com a introduo das nanopartculas de prata. A
amostra foi diluda em etanol na proporo de 1:1, isto , 10 ml de soluto em 10
ml de solvente. E posteriormente a colocao de nanopartculas de prata na
proporo de 1 ml para 2 ml da soluo de LaPPS+Etanol numa cubeta de
quartzo de 3.5 ml.
O sistema foi iluminado com diodo ultravioleta usando a
instrumentao descrita na seo 3.4.1. Observa-se um aumento da
intensidade de fluorescncia com a conjugao do LaPPS34M com
nanopartculas de prata, em torno de 15% do valor inicial. Esta constatao
condiz perfeitamente com o esperado pela teoria descrita por LAKOWICZ,
1999.

Figura 30 - Espectro de fluorescncia (em preto) do complexo LaPPS34M e o espectro
de fluorescncia do LaPPS34M ( em verde) conjugado com nanopartculas de prata
obtido pela FASE I.
740 760 780 800 820 840 860 880 900
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
LaPPS34M
LaPPS34M com Ag
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e

d
e

F
l
u
o
r
e
s
c

n
c
i
a

[
a
.
u
]
Comprimento de Onda [nm]
73
Fonte: Prpria


4.4. TEMPOS DE VIDA DE LUMINESCNCIA DO FLUORFORO E DO
COMPLEXO LaPPS34M


a) Fluorforo Cy3


Geralmente para os fluorforos comerciais os tempos de vida esto em
torno de 10
-9
s. O Cy3 tem o tempo de vida de 0.3 ns (HAHN, 2000). A medida
do tempo de vida do fluorforo comercial Cy3 no foi possvel de ser realizada
pela instrumentao construda para a deteco de fluorescncia, uma vez que
o sistema de deteco no capaz de observar eventos to rpidos em funo
da resposta em frequncia do circuito optoeletrnico.


b) O complexo LaPPS34M


O complexo LaPPS34M utilizado para estudar a fluorescncia permite
uma estabilidade maior e tambm, como visto anteriormente, possui o tempo
de vida de luminescncia em torno de 100 a 1000 s (BNZLI, 1989). A
instrumentao descrita na fase I (seo 3.2) desta dissertao possibilitou a
medida do tempo de vida do complexo e confirmou o dado que consta na
literatura. Na Figura 31 est apresentado o grfico de decaimento de
fluorescncia do complexo LaPPS34M observado com o sistema de aquisio
com a vlvula fotomultiplicadora R928 descrita na Figura 13. O tempo de vida
de luminescncia obtido de 110 s.

74


Figura 31 - Decaimento de Fluorescncia do Complexo LaPPS34M com o uso da vlvula
fotomultiplicadora R928 obtido pela FASE I
Fonte: Prpria

Para o caso da fase II com o uso de uma vlvula fotomultiplicadora
miniatura, conforme descrita na figura 15, o valor do tempo de vida de
luminescncia dado por 109,5 s, confirmando os dados relatados nas fases I
anterioremente mencionada e tambm descrito por BNZLI, 1989, que o tempo
de vida de luminescncia longo para composto na presena de eurpio em
sua estrutura molecular. A Figura 32 ilustra o decaimento exponencial de
emisso de luminescncia do indicador LaPPS34M pela vlvula
fotomultiplicadora miniatura R5600U-01. O valor do tempo de vida foi obtido
atravs da composio duas funes exponenciais (tempo de vida de
fluorescncia e resposta temporal da Val/vula fotomultiplicadora miniatura).

0,0000 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,0010
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e

d
e

S
i
n
a
l

[
a
.
u
.
]
Tempo [s]
75

Figura 32 - Decaimento exponencial de emisso de luminescncia do indicador LaPPS34M
pela vlvula fotomultiplicadora miniatura R5600U-01 obtido pela FASE II.
Fonte: Prpria

A partir da fase III a Erro! Fonte de referncia no encontrada. apresenta o
sinal eltrico aplicado ao diodo emissor de luz (led) para excitao do indicador
(linha contnua), o sinal de sada do detector na ausncia do fluorforo (linha
tracejada) e o sinal de luminescncia na presena do fluorforo (linha
contnua). Todos os sinais foram normalizados para apresentarem valor igual a
1 antes do incio do decaimento.


0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,0010
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e

R
e
l
a
t
i
v
a

d
e

S
i
n
a
l

[
a
.
u
]
Tempo [s]
76

Figura 33 - Sinal eltrico aplicado ao led para excitao do indicador (linha contnua),
sinal de sada do detector na ausncia do fluorforo (linha tracejada) e sinal de
luminescncia na presena do fluorforo (linha contnua) obtido pela FASE III.
Fonte: Prpria

Na Erro! Fonte de referncia no encontrada. possvel observar que a
resposta do circuito detector no to rpida quanto a que seria observada
utilizando detectores de maior velocidade (e.g., vlvula fotomultiplicadora).
possvel observar a resposta temporal referente luminescncia do complexo
LaPPS34M destacada da resposta do sistema sensor na ausncia do
complexo. Sabe-se, portanto, que a luminescncia desse complexo pode ser
observada por detectores de estado slido de baixo custo que tenham
sensibilidade aproximada a do fotodetector utilizado (i.e., 0.47A/W para
comprimento de onda de 650nm) mas que tenham uma resposta temporal mais
rpida que a do OPT301 (i.e., tpico rise time de 90 s, tempo para transio
de 10% a 90% do sinal).
Aps o tratamento dos dados obteve-se o tempo de vida de
fluorescncia do complexo LaPPS34M, correspondendo ao valor de 114,5 s.
A Erro! Fonte de referncia no encontrada. apresenta os detalhes dos pontos
amostrados para o decaimento de luminescncia e a curva exponencial
ajustada (linha contnua). O valor do tempo de vida foi obtido atravs da
77
composio duas funes exponenciais (tempo de vida de fluorescncia e
resposta temporal do fotodiodo).




Figura 34 - Exponencial de decaimento de emisso de luminescncia do indicador
LaPPS34M pelo uso detectores de fotodiodo obtido pela FASE III
Fonte: Prpria

Por fim possvel estabelecer que h uma correlao entre os tempos
de vida de luminescncia para as trs fases estudadas ao longo dessa
dissertao. A Tabela 3 representa os resultados encontrados.

Tabela 3 - Relao entre as fases da pesquisa e os resultados do tempo de vida de
Luminescncia
Mtodo de Medio Tempo de Vida de Luminescncia [s]
FASE I (vlvula fotomultiplicadora R928) 110,0
FASE II (vlvula fotomultiplicadora R5600U-01) 109,5
FASE III (detector optoeletrnico OPT301) 114,5
Fonte : Prpria

78
5. DISCUSSO E CONCLUSO


5.1. INTRODUO


A deteco usando vlvula fotomultiplicadora e fotodiodo possibilitou a
medio de parmetros para avaliar a utilizao de novas molculas e/ou
complexo em sistemas biolgicos ou mdicos. A obteno dos espectros de
absoro, de emisso de fluorescncias, de emisso de fluorescncias na
presena de nanopartculas e os tempos de vida de luminescncia demonstram
que o complexo LaPPS34M assim como o fluorforo comercial Cy3 possuem
caractersticas pticas necessrias para serem biomarcadores.


5.2. CARACTERIZAO DE BIOMARCADORES


a) Fluorforo Cy3


A fase I possibilitou fazer a caracterizao de possveis fluorforos para
aplicao em sistemas biomdicos e de diagnsticos em sade. O estudo do
fluorforo Cy3 e tambm do complexo LaPPS34M demonstra a necessidade de
obter as caractersticas pticas que so importantes para a utilizao de
biomarcadores.
Os espectros de absoro e de emisso do fluorforo comercial Cy3
demonstram que h um deslocamento de Stokes pequeno, correspondente a
um deslocamento de 20 a 50 nm. Essa variao muito pequena e dificulta a
deteco quando a instrumentao de baixa resoluo. Adicionalmente, a
proximidade dos espectros de absoro e de emisso dificulta at mesmo
diferenciar o espectro de emisso do diodo utilizado, escolhido para emitir na
regio de absoro do marcador, do espectro de fluorescncia do fluorforo
Cy3.
79
Os espectros de fluorescncia do marcador conjugado com
nanopartculas metlicas, sejam elas de prata ou de ouro, sinalizou uma
varivel para caracterizar os candidatos a novos fluorforos. A utilizao de
nanopartculas, que pode resultar no aumento de intensidade de fluorescncia,
possibilita que o sistema de deteco de fluorescncia possa ser mais simples
permitindo que um fotosensor com uma menor sensibilidade seja utilizado.
Pode-se observar que o fluorforo comercial Cy3 conjugado com nanopartcula
de ouro propicia um aumento da intensidade de fluorescncia de
aproximadamente 170% em relao ao espectro de fluorescncia na ausncia
de nanopartcula.


b) Complexo LaPPS34M


O grande deslocamento de Stokes do complexo LaPPS34M garante
que a absoro e a emisso se daro em regies distantes do espectro. Essa
variao espectral permite uma preciso do sinal de fluorescncia que
fundamental para sistemas de deteco que utilizam detectores por vlvulas
fotomultiplicadoras, vlvulas fotomultiplicadoras miniaturas ou fotodiodos. Um
dos erros associados deteco de fluorescncia o mascaramento do sinal
de fluorescncia pelo sinal advindo dos diodos, impossibilitando a
confiabilidade na instrumentao desenvolvida.
Outro aspecto verificado no caso do complexo LaPPS34M o
deslocamento do comprimento de onda de 615 nm para 820 nm na presena
de diferentes solventes conforme observa-se nas figuras 27 (espectro de
fluorescncia em tetrahidrofurano) e a figura 30 (espectro na presena de
etanol). Alguns fatores devem ter contribudo para tal mudana, como: a
diluio do complexo em diferentes solventes e a presena de nanopartculas
de prata.
O tempo de vida de luminescncia fornece informaes que
possibilitam identificar e quantificar o tempo mdio que a molcula passa no
estado excitado antes de retornar ao estado fundamental. No caso do
80
fluorforo comercial Cy3, o tempo de vida de luminescncia se encontra em
torno de 0,3 ns, o que representa um tempo de luminescncia curto.
No caso do complexo LaPPS34M verificou-se atravs do grfico do
tempo de vida de luminescncia, demonstrado na figura 31, 32 e 34, que o
tempo de decaimento da amostra varia entre 110 s ( com o uso de vlvula
fotomultiplicadora R928), 109,5 s ( com o uso da vlvula fotomultiplicadora
miniatura R5600U-01) e 114,5 s (com uso do detector optoeletrnico OPT301)
Esse tempo elevado de luminescncia adequado para aplicaes
biomdicas, onde interessante o uso de molculas com tempos de vida de
luminescncia maiores, caracterizando uma nova classe interessante de
fluorforos.


5.3. SISTEMAS DE CUSTO REDUZIDO


As fases I, II e III evidenciam a busca por um sistema de deteco de
fluorescncia que reduza os custos de aquisio e processamento de dados.
Na fase I o uso da vlvula fotomultiplicadora R928 encarece o sistema
proposto, tendo em vista a necessidade futura de se projetar equipamentos de
deteco de fluorescncia que sejam compactos e tenha um custo reduzido.
Na fase II com o uso da vlvula fotomultiplicadora miniatura R5600U-01 que
mais barata que a anteriormente mencionada, possvel obter dados
confiveis com uma reduo de custo em torno de 30%. A fase III demonstra a
possibilidade de reduo ainda maior dos custos utilizando detectores
optoeletrnicos. Nos trs casos o estudo da fluorescncia resolvida no tempo,
garante a escolha de um sistema eficiente pra a deteco de fluorescncia.
Concluiu-se que a identificao de fluorescncia por meio do uso do
complexo LaPPS34M possibilita a indicao da amostra estudada para
aplicaes em sistemas biomdicos que necessitem de biomarcadores, pois as
caractersticas pticas relevantes como espectro de absoro e emisso, o
deslocamento de Stokes e o tempo de vida de luminescncia apresentam
superioridade nas caractersticas pticas em relao aos fluorforos comerciais
81
j em uso, como o Cy3. O complexo apresenta caractersticas pticas
importantes para estudos de identificao e quantificao de microorganismos.
Assim, desta maneira, sinalizamos o uso do complexo de eurpio LaPPS34M
para utilizao nos projetos do Instituto Nacional de Inovao em Sade
Pblica (INDI-Sade), que se situa no Instituto Carlos Chagas Curitiba/PR.


5.4. LIMITAES DO ESTUDO


Um dos fatores limitantes observado neste estudo foi necessidade de
contornar obstculos referentes deteco do sinal de fluorescncia utilizando
um equipamento de baixo custo. O sistema utilizado, baseado na vlvula
fotomultiplicadora encarece o processo e inviabiliza equipamentos de leitura do
tipo point-of-care.
A necessidade de se testar a emisso de fluorescncia para outros
detectores, como fotodiodos, se tornam fundamentais quando estamos
interessados em sistemas de leituras pticas de baixo custo, e que possam ser
colocados em equipamentos que faam interpretaes de diagnsticos nos
locais de atendimento do paciente.
Outra limitao que os fluorforos utilizados devem apresentar
grandes deslocamentos de Stokes para que os sistemas de deteco de
fluorescncia dos equipamentos possam com preciso distinguir os espectros
de absoro e emisso sem a necessidade de uso de componentes especiais
e de custo elevado.


5.5. TRABALHOS FUTUROS


Os resultados deste estudo sugerem novos trabalhos que incorporem a
necessidade de testar novos complexos, aproveitando que o laboratrio de
Polmeros Paulo Scarpa LaPPS, da Universidade Federal do Paran, possui
um acervo de complexos e polmeros que podem desempenhar o papel de
82
possveis biomarcadores, tanto nos processos industriais como em processos
biolgicos e mdicos. Essa interao entre as instituies faz com que novos
estudos possam ser direcionados na busca de efetivar a participao desses
novos complexos em estudos que priorizem o diagnstico e tratamento de
doenas.
Salienta-se tambm que a insero dessa dissertao nos estudos do
Instituto Nacional de Inovao em Sade Pblica (INDI-Sade), possibilita
contribuir com novos trabalhos relacionados ao tema e tambm servir de
alicerce para o desenvolvimento de equipamentos de deteco de
fluorescncia de baixo custo, condio primordial para o avano tecnolgico do
pas visando a independncia externa relacionada aos sistemas de
identificao e tratamento de doenas.



83
5.6. PUBLICAES


1 - Arajo, L.M.P.; Oliveira. S.V.; Schneider, F.K.; Bezerra-Jr, A.G.; Gewehr,
P.M; Turchett D.A.; Akcelrud, L.C. Optical Characterization of the Molecule
Lapps34m for use as a New Fluorophore. Latin America Optics and
Photonics Conference (LAOP), September 27-30, 2010, Recife, Brasil.


2- Oliveira, V. S.; Arajo, L.M.P; Schneider, F.K.; Bezerra-Jr, A.G. Sistema
para Estudo da Fluorescncia de Marcadores para Diagnsticos em
Sade Pblica. I CICPG - I Congresso de Iniciao Cientfica e Ps-
Graduao, 13 a 16 de setembro de 2010, Florianpolis, Santa Catarina, Brasil.


3- Arajo, L.M.P.; dos Santos, E. A. ; Schneider, F.K.; Branco,G.; Turchett D.A.;
Akcelrud, L.C.; Bezerra-Jr, A.G. Sistema de Deteco de Fluorescncia para
Aplicao em Sistemas de Diagnstico em Sade. XXII Congresso
Brasileiro de Engenharia Biomdica, 21 a 25 de novembro de 2010, Tiradentes,
MG.


4- Dos Santos, E. A.; Schneider, F.K.; Arajo, L.M.P.; Branco,G.; Simas, A. G.;
Branco,G.; Sistema de Deteco de Fluorescncia para Anlise de
Complexo Antgeno-Anticorpo com Indicadores Fluorescentes. Seminrio
de Iniciao Cientfica e Tecnolgica (SICITE 2010), realizado de 06 a 08 de
Outubro, no Campus de Cornlio Procpio/ UTFPR, Paran, 2010.



84
6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS


ALBANI, J. R. Principles and applications of fluorescence spectroscopy.
Blackwell Science, a Blackwell Publishing company, 2007.


ALBERTS, B, DENNIS, B., LEWIS, J., RAFF, M., ROBERTS, K., WATSON, J.
D., Molecular Biology of the Cell, 3rd Ed. Garland Publ. New York,1995.


ABBYAD,P.; CHILDS,W.; SHI,X. and BOXER,S. G. Dynamic Stokes shift in
green fluorescent protein variants, PNAS, vol. 104, no. 51, p.p. 20189
20194. , December 18, 2007.


ALCANTARA, P.Jr. Espectroscopia Molecular. Departamento de Fsica,
UFPA Curso Fsica Moderna II , maro 2002.


An Introduction to fluorescence spectroscopy . PerkinElmer Life and
Analytical Sciences. PerkinElmer Ltd, 2000.


ANDRADE, C. Compndio de Nomenclatura Macromolecular, UNLZ,
Zamora, 1995


ARAJO, L.M.P.; OLIVEIRA. S.V.; SCHNEIDER, F.K.; BEZERRA-JR, A.G.;
GEWEHR, P.M; TURCHETT, D.A.; AKCELRUD, L.C. (2010), Optical
Characterization of the Molecule LaPPS34M for use as a New Fluorophore.
Latin America Optics and Photonics Conference (LAOP), September 27-30,
Recife, Brasil.


ATVARS, T.D.Z.; MARTINELLI, C. Espectroscopia de Luminescncia .
Chemkeys, 2002.


AKCELRUD, L. C. Cartilha do Laboratrio de Polmeros Paulo Scarpa.
Curitiba, 34 p, 2010.


BASSI, A.B.M.S. Conceitos Fundamentais em Espectroscopia .Chemkeys,
2001.


BRANCO, G. Novo Instrumento para Monitorizao de O
2
Gasoso atravs
de Fosforescncia Resolvida no Tempo. Curitiba, 1997. Dissertao
85
( Mestrado em Cincias, Engenharia Biomdica) Centro Federal de Educao
Tecnolgica do Paran.


BRASIL. Ao Civil Pblica n. 200500761820, de outubro de 2005, o Juzo
da 9. Vara Cvel da Comarca de Goinia. Ministrio Pblico Federal, Goinia,
GO, 10 Julho de 2006.


BioProbes 23, 1996, p. 01 Disponivel em: www.invitrogen.com .Acesso em
16 de maio de 2010.


BNZLI, J.-C. G.; Choppin, G. R.; Lanthanide Probes in Life, Chemical and
Earth Sciences, Theory and Practice, Elsevier: New York, 1989.


CARUSO, F; OGURI, V. Fsica Moderna: Origens Clssicas e Fundamentos
Qunticos. Rio de Janeiro: Editora Campus, 2006. 606 p.


CHEN,Y.; MUNECHIKA,K.; GINGER, D.S. Dependence of Fluorescence
Intensity on the Spectral Overlap between Fluorophores and Plasmon
Resonant Single Silver Nanoparticles. Nano Lett., Vol. 7, No. 3, 2007.


DUNBAR, S.A; JACOBSON, J.W. (2000), Application of the Luminex
LabMAP in rapid screening for mutations in the cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator gene: A pilot study. Clin Chem.Sep,
46(9): 1498-500.


EISBERG, R & RESNICK, R. Fsica Quntica. Traduo: Paulo Costa Ribeiro
e Enio Frota da Silveira. Editora Campus. Rio de Janeiro. 1988.


ENGVALL, E.; PERLMANN, P. Enzime-linked immunosorbent assay
(ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry 8: 871-
874, 1971.


Espectroscopia de Fluorescncia. Disponvel em:
http://espectrometriadefluorescencia/espectrometria_com.mht. Acesso em 10
de junho de 2009.


Espectro de Fluorescncia do Triptofano. Disponvel em:
www.chemkeys.com, acesso 16 de Maio de 2010.


86
ERNST, L. A.; GUPTA, R.K. ; MUJUMDAR, R. B. and WAGGONELR, A. S.
Cyanine Dye Labeling Reagents for Sulfhydryl Groups, Cytometry 10:3-10
(1989).


Estrutura Molecular de Fluorforo Comercial Cy3. Disponvel em:
www.visaoportal.com.br/blog/.../For_as%20intermoleculares.pdf, acesso em
10 de Junho de 2010.


FERREIRA, A.W.; VILA, S.L.M. Diagnstico imunolgico das principais
doenas infecciosas e parasitrias. 2. ed., Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 2001.


FULTON, R.J. et al ( 1997), Advanced multiplexed analysis with the
FlowMetrix system. Clin Chem. Sep,43(9): 1749 -56.


GALO, A. L.; COLOMBO, M. F. Espectrofotometria de longo caminho
ptico em espectrofotmetro de duplo-feixe convencional: uma
alternativa simples para investigaes de amostras com densidade ptica
muito baixa. Quim. Nova, Vol. 32, No. 2, 488-492 (2009).


GUILBAULT, G.G. Practical Fluorescence, Second Edition, Marcel Dekker,
Inc., New York, 1990.


HAHN, C.D.; RIENER, C. K.; GRUBER, H.J. Labeling of Antibodies with
Cy3-, Cy3.5-, Cy5-, and Cy5.5-monofunctional Dyes at Defined Dye/Protein
Ratios. Bioconjugate Chem., 11, 696-704, 2000.


HAUGLAND, R.P. Molecular Probes Handbook for Fluorescent Probes and
Research Chemicals, 6th Edition (1996).


INSTITUTO NACIONAL DE INOVAO EM DIAGNSTICOS PARA A SADE
PBLICA, INDI-SADE , projeto apresentado ao edital 015/2008.


ITO, J.A. Tcnicas Espectroscpicas em Biofsica .Caderno de Fsica
UEFS, 03(01): 21-28, 2004.


JAMESON, D. M.; Hazlett, T. L.; In Biophysical and Biochemical Aspects of
fluorescence Spectroscopy; Dewey, T. G.; Ed.; Plenum Press; New York
1991; p 105.

87

JACKSON IMMUNORESEARCH. Disponvel em: "Cyanine Dyes (Cy2, Cy3,
and Cy5)". http://www.jacksonimmuno.com/technical/f-cy3-5.asp. Acesso em 11
de Agosto de 2010.


KRENKE, B.E et al. Development of a novel, fluorescent, two primers
approach to quantitative PCR. Profiles in DNA, Promega Corporation, Vol.8,
N.1, pp.3-5, 2005.


LAKOWICZ, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Chapter 3:
Fluorophores. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 1999.


_________. Radiative Decay Engineering: Biophysical and Biomedical
Applications, Analytical Biochemistry 298, 124 (2001).

LAKOWICZ, J. R.; RAY,K.; CHOWDHUR, M.;, SZMACINSKI,H.; YI FU, J. Z.
and NOWACZYK,K. Plasmon-controlled fluorescence: a new paradigm in
fluorescence spectroscopy, Analyst. 2008 October ; 133(10): 13081346.


LAKOWICZ, J. R.; Gryczynski, I. In Topics in Fluorescence Spectroscopy
Vol 1; Lakowicz, J. R.; Ed.; Plenum Press; New York 1991; p 293.


LAWSON, C. L. and Hanson, R. J. Solving Least Squares Problems,
Prentice-Hall,1974, Chapter 23.


LEE, J. D.; Qumica Inorgnica no to Concisa; Traduo: Toma, H. E.;
Rocha, R. C.; Edgard Blcher Ltda.: So Paulo, 1999, cap. 29.


Lei de Beer-Lambert. Disponvel em:http://pt.wikipedia.org/wiki/Lei_de_Beer-
Lambert.Acesso em 08 de Junho de 2010.


LIMA, Patrcia P.; MALTA, Oscar L. and ALVES, Severino J. Estudo
spectroscpico de complexos de Eu
3+
, Tb
3+
E Gd
3+
com ligantes derivados
de cidos dicarboxlicos. Qum. Nova [online]. 2005, vol.28, n.5, pp. 805-808.


LIU, W.T. Nanoparticles and Their Biological and Environmental
Applications, Journal of bioscience and bioengineering, vol. 102, no. 1, 17,
2006.


88
LIU, X.J., LI, Y.Z., CI, Y.X. Time-resolved Fluorescence Studies of the
interation of the Eu
3+
complexes of Tetracycline Analogues with DNA.
Analytica Chimica Acta 345, 213-217, 1997.


MABEY, D.; PEELING, R.W.; UOWSKI, A.; PERKINS, M.D. Diagnostics for
the developing world. Nat Ver Microbiol 2: 231-240, 2004.


MARTINS, T. S.; ISOLANI, P. C. Terras raras: aplicaes industriais e
biolgicas.Qumica Nova, So Paulo, v. 28, n 1, p. 111-117, 2005.


MUJUMDAR, R. B. et al. Cyanine labelling reagents: sulfobenzindocyanine
succinimidyl esters. Bioconjug. Chem. 4, 105-111, 1993.


_________________. Cyanine labelling reagents: sulfobenzindocyanine
succinimidyl esters, Bioconjugate Chem. 3(7), 365-36, 1996.


MULLIS, K.B. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci Am
262: 56-65, 1990.


NOVAIS, M. C., ALVES, M.P. PCR em Tempo Real. Revista Biotecnologia
Cincia & Desenvolvimento, Edio 33, 2004.


NICHOL, S.T.; ARIKAWA, J.; KAWAOKA, Y. Emerging viral diseases. Proc
Natl Acad Sci USA 97:12411-12412, 2000.


OKUNO, E. et al .Fsica para Cincias Biolgicas e Biomdicas. Editora
Harbra, So Paulo, 1982.


OPT301, Burr-Brown Corporation, U.S.A. January, 1994.


PERUSK ,A.H.; PERUSKI, L.F. Immunological methods for detection and
Identification of Infectious disease and biological warfare agents. Clin Diag
Lab Immunol 10: 506-513, 2003.


PRASAD, Paras N., Introduction to Biophotonics, Wiley- Interscience,
(2003).


89
RAOULT, D.; FOURNIER, P.E.; DRANCOURT, M. (2004),What does the
Future hold for Clinical Microbiology?. Nat Rev.Microbiol 2: 151-159.


RICHARDSON, F. S.(1982), Terbium(III) and Europium(III) ions as
Luminescent Probes and Stains for Biomolecular Systems, Chem. Rev., 82
(5), pp 541552.


REITZ, J. R. MILFORD, F. J. e CRISTY, R. W. Fundamentos de Teoria
Eletromagntica, Editora Campus, Rio de Janeiro, 1991.


RIFFITHS et al. Introduo gentica, 8 Edio, Guanabara Koogan, 2006.


ROSI, N. L. and MIRKIN, C. A. Nanostructures in Biodiagnostics, Chem.
Rev. 2005, 105, 1547-1562.


S,G.F; MALTA, O.L.; DONEGA, C.. M.; SIMAS, A.M.; LONGO, R.L;SANTA-
CRUZ, P.A. e SILVA, E.F. Spectroscopic properties and design of highly
luminescent lanthanide coordination complexes. Coordination Chemistry
Reviews. 196. 165195. 2000.


SALIBA, Lucas. F. Interao do complexo luminescente [Eu(tta)3] com
slica mesoporosa. Dissertao ( Mestrado em Cincias de Materiais)
Universidade Estadual Paulista. Jlio de Mesquita Filho., Faculdade de
Engenharia UNESP, Ilha Solteira, 2009.


SANCHEZ, M.C.A. Testes sorolgicos. In: Diagnstico laboratorial das
principais doenas infecciosas e auto-imunes 2. ed., Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2001.


SANTOS, Wellington C. Produo e Caracterizao de nanopartculas por
ablao a laser em meio lquido. 2010. Dissertao (Mestrado em Fsica)
Instituto de Fsica, Universidade Federal do Paran, Curitiba, 2010.


SAPSFORD ,K. E. ; BERTIL. and MEDINTZ ,I. L. Materials for Fluorescence
Resonance Energy Transfer Analysis: Beyond Traditional Donor
Acceptor Combinations, Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 4562 4588.


SELVIN, P. R. The Renaissance of Fluorescence Resonance Energy
Transfer, Nature Structural Biology, Vol. 7, No. 9, pp. 730-734 (2000).
90


SIERRA, M.M.S.; GIOVANEL, M.; DONARD, F.X. e BELIN, C. A utilizao da
Espectroscopia de fluorescncia no Estudo da Matria Orgnica
dissolvida nas guas naturais: Evoluo e Perspectivas .Qumica Nova,
19(3), 1996.


SIWACH, O.P.; SEN,P. Fluorescence properties of Ag nanoparticles in
water, methanol and hexane. Journal of Luminescence 129 (2009) 611.


SKOOG, D.A.; Leary J.J. Anlisis Instrumental, 4 ed.; Ed. McGraw-Hill
(1994), pgs. 201-219.


SOKOLOV,K.; CHUMANOV,G.; COTTON, M.T. Enhancement of Molecular
Fluorescence near theSurface of Colloidal Metal Films. Anal. Chem. 1998,
70, 3898-3905


SPECTOR, N. Manual para a redao de teses, dissertaes e projetos de
pesquisa. Rio de Janeiro : Guanabara Koogan, 1997.


ULLMANN, M.; FRIEDLANDER, S.K.; SCHMIDT-OTT, A. Nanoparticle
formation by laser ablation. Journal of Nanoparticle Research 4: 499509,
2002.


VALEUR,B. Molecular Fluorescence: Principles and Applications,. Chapter 3:
Characteristics of Fluorescence Emission, Wiley-VCH, Weinheim, Germany,
2002.


VOET, D. VOET, J., Biochemistry, 2nd Ed. John Wiley & Sons, New York,
(1995).


XIAO, M.; PHONG A.; HA, C.; CHAN, T.F.; CAI, D.; LEUNG, L.; WAN, E.;
KISTLER, A.L.; DERISI, J.L.; SELVIN, P.R.; KWOK, P.Y. Rapid DNA
mapping by fluorescent single molecule detection. Nucleic Acids Research
2007 35(3).


YAGER P.; EDWARDS T.; FU E.; HELTON K.; NELSON K.; TAM M. R. &
WEIGL B. H. Microfluidic diagnostic technologies for global public health.
Nature, vol. 442, july 2006.
91

ZHANG, J.; LAKOWICZ, J. R. Metal-enhanced fluorescence of an organic
fluorophore using gold particles. OPTICS EXPRESS, Vol. 15, No. 5, 2007.


ZUO, L.; WEI, W.; MORRIS,M.; WEI,J.; GORBOUNOV. M. New Technology
and Clinical Applications of Nanomedicine, Med Clin N Am 91, 845
862(2007).


YANG, S.; ROTHMAN, R. PCR-based diagnostics for infections diseases:
uses, limitations and future applications in acute-care settings. Lancet 4:
337-348, 2004.


WANG, D.; COSCOY, L.; ZYLBERBERG, M.; AVILA, P. C.; BOUSHEY, H.A.;
GANEM, D.; DERISI, J.L.(2002), Microarray-based detection and
genotyping of viral pathogens. Proc Natl Acad Sci U.S.A . Nov 26,99(24):
15687-92.


WILLARD, H.H., MERRIT Jr., L.L., DEAN, J. A. & SETTLE Jr.,F. A.
Instrumental Methods of Analysis, 7
th
. Edn. Belmont: Wadsworth, ( 1988).


WILSON, D. Hiv Epidemiology: A Review of Recent Trends and Lessons.
Global HIV/AIDS Program.The World Bank. 2006.


WILTSHIRE, S.; OMALLEY, S.; LAMBERT,J.; KUKANSKIS, K.; EDGA, D.;
KINGSMORE,S.F.; SCHWEITZER,B. Detection of Multiple Allergen-specific
IgEs on Microarrays by Immunoassay with Rolling Circle Amplification.
Clinical Chemistry 46, No. 12, 2000.




92
7. ANEXOS

ANEXO A FLUORFOROS INTRNSECOS







93
ANEXO B FLUORFOROS EXTRNSECOS OU
BIOMARCADORES












FLUORESCENA
Rodamina B
94
ANEXO C PRODUO E CARACTERIZAO DAS
NANOPARTCULAS

A produo e caracterizao das nanoparticulas (NP) se deram por
ablao a laser em meio lquido utilizando alvos metlicos (ULLMANN, 2002).
Os alvos utilizados foram de Au, e Ag. A ablao foi realizada usando a
linha de emisso 1064 nm de um laser Nd:YAG Quantronix Model 117
operando em modo Q-switched, com durao de pulso de 150 ns e taxa de
repetio de 300 Hz. O feixe laser foi guiado para a amostra atravs de dois
espelhos e focalizado por uma lente de 50 mm de distncia focal formando um
spot de 40 m. Para todos os alvos foi utilizada gua bidestilada como meio
liquido. A coluna de gua formada sobre a superfcie dos alvos era de 2 mm,
exceto para o alvo de ouro onde a coluna era de 3 mm.
A caracterizao das partculas foi realizada utilizando as tcnicas de
espalhamento dinmico de luz (DLS) para obteno da distribuio de tamanho
das partculas, e por absoro linear de luz (UV-VIS) para estudo das
atividades pticas. O DLS foi realizado com o equipamento BI-200SM ver. 2.0
da Brookhaven utilizando como fonte de luz a emisso de 632.8 nm de um
laser de HeNe com potncia de 75 mW mxima. em modo continuo (CW). A
obteno da distribuio de tamanho foi atravs do modelo NNLS
5
.
Os grficos abaixo representam os resultados dos espectros de
absoro das nanopartculas de ouro e prata, e tambm a caracterizao por
DLS do tamanho das nanopartculas de ouro, que fazendo aproximao para
as nanopartculas de prata o tamanho se mantm constante.



5
O modelo NNLS (Non-Negative Least-Squares) constitui em uma distribuio no negativa
dos mnimos quadrados para mostrar a distribuio do tamanho das nanopartculas, funo do
MATLAB, construdo por CL Lawson, RJ Hanson, 1974. (LAWSON, 1974)
95

(A) (B)


( C )

Figura 35 - A) Tamanho das nanopartculas de ouro por DLS, B) Espectro de absoro
das nanopartculas de ouro e C) Espectro de absoro linear para o colide de prata
Fonte: (SANTOS, 2010)