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OFICINA ESPAOLA DE
PATENTES Y MARCAS
ESPAA
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Nmero de publicacin: 2 251 738

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Int. Cl.
7
: C12N 15/82, C07K 14/415
C12Q 1/68, C07K 16/16
C12N 1/21, C12N 9/26
A01H 5/00
12

TRADUCCIN DE PATENTE EUROPEA T3

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Nmero de solicitud europea: 97935555 .9

86

Fecha de presentacin : 30.07.1997

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Nmero de publicacin de la solicitud: 0956357

87

Fecha de publicacin de la solicitud: 17.11.1999

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Ttulo: Inhibidor de la invertasa.

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Prioridad: 30.07.1996 DE 196 30 738

07.10.1996 DE 196 41 302
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Fecha de publicacin de la mencin BOPI:

01.05.2006
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Fecha de la publicacin del folleto de la patente:

01.05.2006
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Titular/es: Universitt Heidelberg

Grabengasse 1
69117 Heidelberg, DE
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Inventor/es: Rausch, Thomas;

Krausgrill, Silke y
Greiner, Steffen
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Agente: Garca-Cabrerizo y del Santo, Pedro

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicacin en el Boletn europeo de patentes, de
la mencin de concesin de la patente europea, cualquier persona podr oponerse ante la Ocina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposicin deber formularse por escrito y estar motivada; slo se
considerar como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposicin (art. 99.1 del
Convenio sobre concesin de Patentes Europeas).
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Venta de fascculos: Ocina Espaola de Patentes y Marcas. P de la Castellana, 75 28071 Madrid
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DESCRIPCIN
Inhibidor de la invertasa.
La presente invencin se reere a un cido nucleico, que contiene al menos una secuencia de cidos nucleicos que
codica para un polipptido, siendo el polipptido capaz de reducir la actividad enzimtica de una invertasa, al propio
polipptido, as como a las plantas transgnicas que contienen esta secuencia de cidos nucleicos. Adems, la presente
invencin se reere a un procedimiento para la produccin de tales plantas transgnicas con una prdida reducida de
sacarosa debida al almacenamiento.
Durante el almacenamiento de la remolacha azucarera (Beta vulgaris), en el intervalo de tiempo entre la recolec-
cin y el procesamiento, se llega debido a la respiracin o metabolismo de la sacarosa a una prdida de sacarosa de
aproximadamente el 0,02% al da. Esta prdida va acompaada adems de una reduccin signicativa de la calidad
debido al incremento del azcar reductor, especialmente fructosa y glucosa (Burba, M. (1976) Atmung und Saccharo-
sestoffwechsel lagernder Zuckerrben. Zeitschrift fr die Zuckerindustrie 26: 647-658). La primera etapa metablica
en la descomposicin de la sacarosa durante el almacenamiento de la remolacha es la hidrlisis enzimtica por medio
de una invertasa vacuolar. Esta enzima se sintetiza de novo en el tejido de la remolacha tras su herida (Milling, R. J.,
Leigh, R. A., Hall, J. L. (1993) Synthesis of a vacuolar acid invertase in washed discs of storage root tissue of red beet
(Beta vulgaris L.). J. Exp. Bot. 44: 1687-1694). Ya que la masa principal de la sacarosa de remolacha se localiza en las
vacuolas celulares, la invertasa vacuolar inducida (por herida) desempea un papel central para la prdida de sacarosa
debida al almacenamiento.
Por el momento no hay ninguna solucin satisfactoria para el problema de las prdidas de sacarosa debidas al
almacenamiento (Burba, 1976). Las medidas ms importantes en el estado de la tcnica consisten en el mantenimiento
a temperaturas bajas (por debajo de 12C) y de una humedad atmosfrica denida (entre el 90 y el 96%). Sin embargo,
todas las medidas establecidas hasta el momento para la reduccin de las prdidas debidas al almacenamiento son
insatisfactorias.
Una conversin de la sacarosa en las hexosas, glucosa y fructosa, debida al almacenamiento y, por ello, una pr-
dida de sacarosa tiene lugar tambin durante la llamada edulcoracin en fro (cold sweetening) en patatas. Como
consecuencia del tratamiento de fro, se induce en los tubrculos de la patata una invertasa vacuolar, que determina
la razn entre sacarosa y hexosas (Zrenner, R., Schler, K., Sonnewald, U. (1996) Soluble acid invertase determines
the hexose-to-sucrose ratio in coldstored potato tubers. Planta 198: 246-252). La formacin de las hexosas como con-
secuencia de la edulcoracin en fro conduce a una prdida de la calidad en la produccin de, por ejemplo, patatas
fritas.
Los frutos de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) presentan un alto contenido en agua. Este est condicionado
parcialmente por los azcares endgenos osmticamente activos (sacarosa y hexosas). Un decremento del contenido
total de azcar por medio de la inhibicin de la hidrlisis de la sacarosa mediada por la invertasa conduce a frutos ms
pequeos y pobres en agua (Klann, E. M., Hall, B., Bennett, A. B., (1996) Antisense acid invertase (TIV1) gene alters
soluble sugar composition and size in transgenic tomato fruit. Plant Physiology 112: 1321-1330). Una disminucin
del contenido en agua de los frutos de tomate conduce a un ahorro en los costes energticos en la produccin de
concentrados de frutos (por ejemplo, ketchup). Dado que la reduccin de la actividad de la invertasa vacuolar sobre la
expresin antisentido de la invertasa se lleva a cabo slo de manera incompleta con motivo de la presencia de distintas
isoformas, la introduccin transgnica de un inhibidor de la invertasa podra aportar grandes ventajas, especialmente
si ste inhibe las distintas isoformas en la misma medida.
De esta manera, la presente invencin se basa en el objetivo de proporcionar un nuevo sistema que esencialmente
no produzca prdidas de sacarosa en plantas debidas al almacenamiento.
Este objetivo se alcanza por medio de los objetos de la presente invencin caracterizados en las reivindicaciones.
Un primer objeto segn la invencin se reere a un cido nucleico, que contiene al menos una secuencia de cidos
nucleicos que codica para un polipptido, siendo el polipptido capaz de reducir o disminuir la actividad enzimtica
de una invertasa.
Los conceptos cido nucleico y secuencia de cidos nucleicos signican molculas de cido nucleico naturales
o semisintticas o sintticas o modicadas de desoxirribonucletidos y/o ribonucletidos y/o nucletidos modicados.
El concepto polipptido comprende polipptidos presentes de forma natural y polipptidos recombinantes. Po-
lipptidos recombinantes designan un constructo producido con tcnicas biolgicas moleculares, que se basa en el
ADN natural del genoma original o en el ADN natural modicado con una secuencia de ADN extrao, y que pue-
de recombinarse, por ejemplo, con plsmidos, y que puede replicarse y expresarse en un sistema husped apropia-
do.
La expresin un polipptido capaz de reducir la actividad enzimtica de una invertasa signica un polippti-
do que, como consecuencia del enlace con una invertasa, reduce su actividad enzimtica, de modo que es posible
una inhibicin completa con una cantidad suciente de la protena inhibidora. Preferiblemente, se debe alcanzar una
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inhibicin de la invertasa vacuolar de aproximadamente el 90% mediante la expresin del inhibidor en la planta
transgnica.
En una forma de realizacin de la presente invencin se localiza la invertasa en la vacuola en una clula vege-
tal. En otra forma de realizacin, se localiza la invertasa en la membrana celular. En otra forma de realizacin, se
localiza la invertasa en el citosol. La invertasa procede preferiblemente de la remolacha azucarera, de la patata o del
tomate.
En una forma de realizacin preferida de la presente invencin, el cido nucleico comprende las secuencias de
cidos nucleicos mostradas en las guras 1 (SEQ ID N 1), 3 (SEQ ID N 2), 12 (SEQ ID N 3) y 14 (SEQ ID
N 4) o segmentos o fragmentos de las mismas, as como secuencias de cidos nucleicos que pueden hibridar con
las secuencias complementarias de las secuencias de cidos nucleicos mostradas en las guras 1, 3, 12 y 14 o con
segmentos o fragmentos de las mismas.
En otra forma de realizacin, el cido nucleico segn la invencin contiene otra secuencia de cidos nuclei-
cos que codica para una secuencia diana. El concepto secuencia diana signica una secuencia de aminocidos
que proporciona el control objetivo en un compartimento celular denido, por ejemplo, el control objetivo en la
vacuola.
En una forma de realizacin preferida de la presente invencin, la secuencia diana comprende la secuencia diana
vacuolar de la lectina de cebada con la secuencia de aminocidos siguiente:
LEGVFAEIAASNSTLVAE
En otra forma de realizacin, el cido nucleico segn la invencin contiene otra secuencia de cidos nucleicos
que codica para un pptido seal. El concepto pptido seal signica una secuencia de aminocidos hidrfoba,
reconocida por la partcula de reconocimiento de seal (SRP). La SRP proporciona la sntesis del polipptido completo
en el retculo endoplasmtico (RE) rugoso, con la consecuencia de que el polipptido que se genera se libera en el
lumen del RE.
En otra forma de realizacin, el cido nucleico segn la invencin contiene una secuencia de cidos nucleicos que
codica para una secuencia de retencin del RE.
En una forma de realizacin preferida, el pptido seal procede de una invertasa, preferiblemente de la invertasa
de la membrana celular del tabaco.
En otra forma de realizacin de la presente invencin, el cido nucleico contiene otra secuencia de cidos nucleicos
que comprende un promotor apropiado para la expresin en plantas. Este promotor o secuencia del promotor procede
preferiblemente de la misma planta que la invertasa. En una forma de realizacin especialmente preferida de la presente
invencin, el promotor es un promotor especco de la patata o de la remolacha azucarera.
Resumiendo, el cido nucleico segn la invencin puede comprender la secuencia de cidos nucleicos que codica
para el polipptido, denida anteriormente y, dado el caso, la secuencia de cidos nucleicos que codica para una
secuencia diana denida anteriormente y/o la secuencia de cidos nucleicos que codica para un pptido seal y/o
el promotor denido anteriormente, estando dispuestas preferiblemente todas las secuencias de cidos nucleicos que
codican para una secuencia de aminocidos en el marco de lectura y pudiendo ser degeneradas segn el cdigo
gentico.
Otro objeto de la presente invencin es un vector que contiene el cido nucleico segn la invencin, denido
anteriormente, para la expresin del polipptido recombinante en clulas husped procariticas o eucariticas. El
vector segn la invencin puede contener preferiblemente elementos reguladores apropiados, tales como promotores,
potenciadores, secuencias de terminacin. El vector segn la invencin puede ser, por ejemplo, un vector de expresin
o un vector para la integracin preferiblemente estable del cido nucleico segn la invencin en el material gentico
de una clula husped. Un sistema de expresin apropiado comprende, por ejemplo, el plsmido Ti o un sistema
plasmdico binario en Agrobacterium tumefaciens como vector para la integracin estable del cido nucleico segn
la invencin en el material gentico de una planta. Adems tambin, puede introducirse el cido nucleico segn la
invencin por ejemplo mediante el plsmido Ri de Agrobacterium rizogenes, mediante transferencia gentica directa
por medio de polietilenglicol, mediante electroporacin o mediante bombardeo de partculas en el material gentico
de una planta.
Otro objeto de la presente invencin es una clula husped que contiene el cido nucleico segn la invencin o el
vector segn la invencin. Son clulas husped apropiadas, por ejemplo, procariontes, como E. coli, o clulas husped
eucariticas como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris
y clulas de insectos infectadas con Bacculovirus.
Otro objeto segn la presente invencin es el propio polipptido, que se codica por la secuencia de cidos nu-
cleicos denida anteriormente, pudiendo ser la secuencia de cidos nucleicos degenerada segn el cdigo gentico. El
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polipptido segn la invencin contiene al menos un segmento de una secuencia de aminocidos capaz de reducir la
actividad enzimtica de una invertasa. En una forma de realizacin especialmente preferida, el polipptido comprende
las secuencias de aminocidos mostradas en las guras 1 (SEQ ID N 5), 3 (SEQ ID N 6), 12 (SEQ ID N 7) y 14
(SEQ ID N 8) o segmentos o fragmentos de las mismas. Adems, el concepto polipptido comprende, por ejem-
plo, isoformas de la misma planta as como secuencias del inhibidor homlogas de otros tipos de plantas, siendo la
homologa en el plano de las protenas preferiblemente > 70%.
En una forma de realizacin segn la invencin, el polipptido contiene adems una secuencia de aminocidos
dispuesta en el extremo C-terminal del polipptido, que comprende una secuencia diana denida anteriormente y/o
una secuencia de retencin del RE, por ejemplo KDEL, y/o una secuencia de aminocidos dispuesta en el extremo
N-terminal del polipptido, que comprende un pptido seal denido anteriormente.
La secuencia de cidos nucleicos segn la invencin, el vector segn la invencin, as como el polipptido segn
la invencin pueden producirse mediante los procedimientos conocidos en el estado de la tcnica.
Otro objeto de la presente invencin es una planta transgnica que contiene al menos el cido nucleico segn la
invencin denido anteriormente.
El concepto planta transgnica o planta comprende la planta completa como tal, as como sus partes, como la
raz, el tallo, la hoja, el tejido de un rgano especco o las clulas, su material apto para la multiplicacin, especial-
mente las semillas, y sus plntulas. Adems, este concepto comprende tubrculos y races de almidn, por ejemplo,
patatas, batatas y mandioca, y plantas de azcar, por ejemplo caa de azcar y remolacha azucarera, as como el tomate
y el maz.
En una forma de realizacin preferida de la presente invencin, el tipo natural de la planta transgnica es una
remolacha azucarera, un tomate o una patata.
Otro objeto de la presente invencin se reere a un procedimiento para la produccin de la planta transgnica segn
la invencin, en el que se transforma una clula vegetal mediante la integracin estable del cido nucleico denido
anteriormente en el material gentico y se regenera la clula vegetal transformada en la planta transgnica. Se conocen
en el estado de la tcnica procedimientos para la produccin de plantas transgnicas.
Otro objeto de la presente invencin se reere al uso del cido nucleico denido anteriormente para la produccin
de una planta transgnica con una prdida reducida de sacarosa debida al almacenamiento.
Segn la invencin, puede constatarse que la disminucin de las prdidas de sacarosa debidas al almacenamiento
mediante la expresin del polipptido denido anteriormente como protena inhibidora de la invertasa en plantas
transgnicas representa sorprendentemente un procedimiento altamente especco y menos contaminante para la me-
jora de la calidad de los tubrculos, por ejemplo, de la remolacha azucarera o la patata. Para la remolacha azucarera
se posibilita una disminucin del uso de medios de produccin gracias al aumento de la ecacia de la obtencin de
azcar con el nivel de rendimiento prejado. En el caso de la patata, se aumenta la calidad del producto de las patatas,
especialmente para la produccin de patatas fritas, mediante la reduccin de la formacin de hexosa inducida por
fro. En el caso del tomate, se disminuye el contenido en agua del fruto de tomate mediante la reduccin de hexosa
osmticamente activa.
Mediante la combinacin de la secuencia de cidos nucleicos que codica para el inhibidor de la invertasa con
una secuencia de cidos nucleicos que codica para una secuencia diana apropiada, puede lograrse por ejemplo un
control objetivo vacuolar correcto del inhibidor de la invertasa expresado y, de esa manera, limitarse espacialmente
la expresin del inhibidor de la invertasa. Adems, puede limitarse temporalmente la expresin del inhibidor de la
invertasa mediante el uso de, por ejemplo, promotores especcos para la remolacha o para los tubrculos.
Las guras muestran:
La gura 1 muestra el ADNc que codica para el inhibidor de la invertasa de Nicotania tabacum con una longitud
de 1701 pb, de modo que el marco de lectura abierto (open reading frame, ORF) comprende 477 pb con el
nucletido de inicio 1. El inhibidor de la invertasa codicado por esta secuencia de cidos nucleicos presenta 159
aminocidos con un peso molecular M calculado de 18.915 y un punto isoelctrico calculado de 10,13.
La gura 2 muestra la produccin esquemtica del constructo del inhibidor de una forma de realizacin preferida
segn la invencin para la transformacin de plantas.
La gura 3 muestra otro ADNc que codica para un inhibidor de la invertasa localizado en la membrana celular
de clulas de tabaco con una longitud de 631 pb (sin poli-A). La secuencia seal utilizada para la secrecin en la
membrana celular est marcada con grasa. El sitio de corte, que es idntico al extremo N-terminal secuenciado de la
protena madura, est marcado con una echa.
La gura 4 muestra la expresin del inhibidor recombinante de la invertasa del tabaco en E. coli. El ADNc repre-
sentado en la gura 3 se clon en el vector pQE (Qiagen, Hilden, Alemania). La protena recombinante se expres
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como protena de fusin etiquetada con his. A: M, marcador del peso molecular; 1: Bacterias no inducidas; 2: Bacterias
inducidas con IPTG; 3: Inhibidor recombinante de la invertasa del tabaco puricado por cromatografa de anidad (Ni-
NTA). B: Anlisis de Western Blot de las fracciones 1-3 de A con un antisuero policlonal dirigido contra el inhibidor.
La gura 5 muestra la inhibicin dependiente de la dosis de la invertasa de la membrana celular del tabaco mediante
la protena inhibidora recombinante. Los puntos muestran la inhibicin tras la incubacin previa de ambas protenas
sin sacarosa, los cuadrados muestran la inhibicin sin incubacin previa.
La gura 6 muestra la induccin de la actividad de la invertasa cida en remolachas azucareras tras su herida.
La gura 7 muestra la inhicin de la actividad total de la invertasa de remolachas azucareras heridas mediante el
inhibidor de la invertasa obtenido a partir de cultivos celular de tabaco.
La gura 8 muestra la inhibicin de la invertasa de la membrana celular de la remolacha azucarera median-
te el inhibidor recombinante de la invertasa del tabaco (vense las guras 3-5). Los puntos muestran la inhibi-
cin tras la incubacin previa de ambas protenas sin sacarosa, los cuadrados muestran la inhibicin sin incubacin
previa.
La gura 9 muestra la inhibicin de la actividad total de la invertasa de remolachas azucareras heridas (invertasa
vacuolar + invertasa de la membrana celular) mediante el inhibidor recombinante de la invertasa del tabaco (vense las
guras 3-5). Los puntos muestran la inhibicin tras la incubacin previa de ambas protenas sin sacarosa, los cuadrados
muestran la inhibicin sin incubacin previa.
La gura 10 muestra la identicacin inmunolgica de la invertasa vacuolar (IV) de los frutos de tomate, as como
la deteccin de un inhibidor del tomate (INH) homlogo al inhibidor de la invertasa del tabaco. Ambas protenas
fueron detectadas con antisueros policlonales monoespeccos. La IV muestras dos productos de descomposicin de
52 y 20 KD segn SDS-PAGE y Western Blot. La IV se une completamente a la concavalina A Sepharose, mientras
que el inhibidor de la invertasa del tomate est presente en proporciones aproximadamente iguales en la fraccin que
se une a ConA y en la que no se une a ConA.
La gura 11 muestra la inhibicin de los tomates IV mediante el inhibidor recombinante de la invertasa del tabaco
(vense las guras 3-5). Los puntos muestran la inhibicin tras la incubacin previa de ambas protenas sin sacarosa,
los cuadrados muestran la inhibicin sin incubacin previa.
La gura 12 muestra la secuencia de un ADNc parcial para el inhibidor de la invertasa del tomate, que se amplic
con RT-PCR a partir de ADNc de ores de tomate.
La gura 13 muestra la comparacin de dos clones parciales (idnticos) del inhibidor de la invertasa del tomate
con el inhibidor de la invertasa del tabaco (vese la gura 3).
La gura 14 muestra la secuencia de ADNc de un homlogo citoslico para el clon del inhibidor de la invertasa de
la gura 3. La protena codicada mediante ese clon es capaz de inhibir invertasas citoslicas.
Mediante el siguiente ejemplo se explica la presente invencin con mayor detalle.
Ejemplo
Todos los mtodos para la produccin de los constructos genticos necesarios, que son de aplicacin en el siguiente
ejemplo, corresponden a procedimientos estndar del trabajo en biologa molecular (Ausubel, F., Brent, R., Kingston,
R. E. Moore, D. D., Seidmann, J. G. Smith, J. A., y Struhl, K. (1987-1996) Current Protocols in Molecular Biology,
Greene Publishing). La operacin de trabajo se subdivide esencialmente en las siguientes secciones:
(1) La protena inhibidora se purica hasta la homogeneidad con elusin salina selectiva de la protena de la
membrana celular, doble cromatografa de intercambio inico y posterior electroforesis en gel de poliacri-
lamida SDS.
(2) La protena inhibidora homognea se digiere trpticamente y los pptidos de la protena inhibidora obteni-
dos se secuencian mediante degradacin de Edman.
(3) Partiendo de las secuencias de pptidos obtenidas se sintetizan cebadores degenerados y con su ayuda se
amplican fragmentos de ADN del ADNc del inhibidor con PCR a partir del ADNc completo.
(4) A partir de cultivos celulares de tabaco se produce un biblioteca de ADNc (en un vector de expresin; ZAP
Express

, Empresa Stratagene).
(5) Las secuencias parciales del ADNc del inhibidor obtenidas (vese (2)) se usan para la seleccin del banco
de ADNc.
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(6) El clon de longitud completa obtenido se conrma tras la expresin en E. coli (clonacin en el vector pQE
de la empresa Qiagen) en cuanto a su funcin (inhibicin de la invertasa).
(7) El segmento del clon de ADNc (gura 1) que codica para la protena inhibidora se amplica con PCR.
Para esto, se usan cebadores con sitios de corte de restriccin, que permiten la posterior ligacin con las
secuencias seal y diana. En el extremo 5 se liga con la secuencia seal, en el extremo 3 con la secuencia
diana para la vacuola.
Obtencin de la secuencia seal: La secuencia seal se amplica por medio del PCR a partir del ADNc
de la invertasa de la membrana celular del tabaco (Greiner, S., Weil, M., Krausgrill, S., Rausch, T. (1995)
Plant Phisiology 108: 825-826) (Regin: Met
1
-Val
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). Para esto se usan cebadores con sitios de corte de
restriccin, que permiten la posterior ligacin con el ADNc del inhibidor. Obtencin de la secuencia diana:
La secuencia diana se amplica a partir del ADNc para la lectina de cebada (Bednarek, S. Y., Taikhel, N.
V. (1991) Plant Cell 3: 1195-1206). Para esto se usan tambin cebadores con sitios de corte de restriccin,
que permiten la posterior ligacin con el ADNc del inhibidor.
Para la clonacin sentido del cido nucleico de la gura 3 (SEQ ID N 2) se corta el cido nucleico completo
con ayuda de endonucleasa de restriccin BamH I y Xba I del vector pBK-CMV (ste se genera tras la
excisin in vivo a partir del ZAP Express Paguen (empresa Stratagene)). El fragmento de ADN obtenido se
liga ahora con un vector de transformacin binario cortado BamH I/Xba I y posteriormente se transforma
en bacterias.
Para la clonacin antisentido del cido nucleico de la gura 3 (SEQ ID N 2) se emplean las endonucleasas
de restriccin BamHI y Kpn I. Por lo dems, la manera de proceder es la misma que en la clonacin sentido.
La clonacin sentido y antisentido del cido nucleico de la gura 14 (SEQ ID N 4) se lleva a cabo de forma
anloga.
Los constructos as obtenidos se usan para la transferencia gentica de Agrobacterium tumefaciens en
plantas (por ejemplo, remolacha azucarera, patata y tomate).
La introduccin de la secuencia diana vacuolar para el cido nucleico de las guras 3 y 4 se lleva a cabo tal
como se describe para el cido nucleico de la gura 1.
(8) El constructo gentico mencionado en (7) se liga en el lado 5 con un promotor especco de la remolacha
y el constructo obtenido se clona en un vector de expresin binario.
(9) La planta objetivo se transforma mediante una tcnica de transformacin apropiada, conocida en el estado
de la tcnica. La estructura del constructo gentico necesario para la transformacin se representa en la
gura 2.
Se produjo un antisuero para la seleccin de un banco de ADNc contra el inhibidor de la invertasa que se expresa
en las clulas de tabaco. Adems de esto, se realizaron reacciones de PCR para la obtencin de una sonda de ADNc
homloga con oligonucletidos derivados a partir de secuencias de aminocidos parciales. Adems, se realiz una
deteccin de oligmeros Con la deteccin de oligmeros se aisl el clon de la gura 1. Con RT-PCR se amplic un
fragmento de 300 pb, que se us luego como sonda para la seleccin del banco de ADNc. De esta manera se aisl
el clon de la gura 3. Por ltimo se expres en E. coli como protena de fusin etiquetada con His (gura 4). La
protena recombinante inhibidora inhibe la invertasa de la membrana celular del tabaco, observndose una proteccin
del substrato parcial para esta isoforma de la invertasa (gura 5), que sin embargo no aparece en otras invertasas
localizadas en la vacuola o en la membrana celular (vese a continuacin). Adems, se aisl un homlogo localizado
citoslicamente del clon del inhibidor representado en la gura 3 (gura 14). La protena codicada mediante ese clon
puede actuar como inhibidor de invertasas citoslicas.
La actividad de la invertasa en remolachas azucareras heridas (gura 6) puede inhibirse mediante la protena
inhibidora aislada a partir de clulas de tabaco (gura 7). Las cinticas enzimticas con protena recombinante del
inhibidor del tabaco conrman que tanto la actividad total de la invertasa (gura 9) en remolachas azucareras heridas,
como la invertasa de la membrana celular de la remolacha (gura 8) parcialmente puricada pueden inhibirse mediante
el inhibidor de la invertasa del tabaco.
En los frutos de tomate se expresa, en primer lugar, la invertasa vacuolar, que en la separacin por SDS-PAGE se
descompone en dos productos de descomposicin (52 y 20 KD; gura 10). Junto a la invertasa vacuolar se expresa
tambin un inhibidor de la invertasa localizado supuestamente en la membrana celular de aproximadamente 19 KD,
que interacciona con el antisuero contra el inhibidor de la invertasa del tabaco (gura 10). La invertasa vacuolar aislada
a partir de frutos de tomate se inhibe tambin mediante el inhibidor recombinante de la invertasa del tabaco (gura
11). La llamativa homologa secuencial de una secuencia parcial de ADNc de tomate obtenida por RT-PCR con la
secuencia del inhibidor de la invertasa del tabaco (guras 12 y 13) apoya la suposicin de que el inhibidor de la
invertasa del tomate que se expresa en los frutos podra estar compartimentado (en el espacio de la membrana celular)
frente a la invertasa vacuolar y, por ello, no inhibe la invertasa vacuolar in vivo.
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Resumiendo, puede establecerse que el inhibidor apoplstico de la invertasa del tabaco (gura 3) puede inhibir
completamente, tal como se ha demostrado, tanto las invertasas de la membrana celular como las invertasas vacuo-
lares, especialmente de la remolacha azucarera y del tomate. Partiendo de una seleccin celular diana correcta, el
inhibidor de la invertasa del tabaco puede, de esta manera, usarse para la disminucin de las invertasas localizadas
en la vacuola o en la membrana celular en plantas transgnicas (remolacha azucarera, patata, tomate). El inhibidor de
la invertasa localizado en el citosol (gura 14) regula las invertasas citoslicas. Su inhibicin en plantas trangnicas
puede repercutir ventajosamente en la razn sacarosa/hexosa.
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REIVINDICACIONES
1. Uso de un cido nucleico que codica para un polipptido capaz de reducir la actividad enzimtica de una
invertasa, para la produccin de una planta transgnica con prdida de sacarosa reducida debida al almacenamiento.
2. Uso de un cido nucleico que codica para un polipptido capaz de reducir la actividad enzimtica de una
invertasa, para la reduccin de la formacin de hexosa inducida por el fro en patatas.
3. Uso segn la reivindicacin 1 2, en el que el cido nucleico contiene al menos las secuencias de cidos
nucleicos que codican para un polipptido mostradas en las guras 1 (SEQ ID N 1), 3 (SEQ ID N 2), 12 (SEQ ID
N 3) o 14 (SEQ ID N 4) o segmentos de las mismas o que contiene una secuencia de cidos nucleicos que puede
hibridar con las secuencias complementarias de las secuencias de cidos nucleicos mostradas en las guras 1 (SEQ ID
N 1), 3 (SEQ ID N 2), 12 (SEQ ID N 3) o 14 (SEQ ID N 4) o segmentos de las mismas, siendo capaz el polipptido
de reducir la actividad enzimtica de una invertasa.
4. Uso segn la reivindicacin 3, en el que la invertasa est localizada en la vacuola, el citosol o la membrana
celular de una clula vegetal.
5. Uso segn la reivindicacin 3 4, en el que la invertasa procede de la remolacha azucarera, de la patata o del
tomate.
6. Uso segn una de las reivindicaciones 3 a 5, en el que el cido nucleico contiene adems al menos una secuencia
de cidos nucleicos que codica para una secuencia diana.
7. Uso segn la reivindicacin 6, en el que la secuencia diana comprende la secuencia diana vacuolar de la lectina
de cebada siguiente:
LEGVFAEIAASNSTLVAE
8. Uso segn una de las reivindicaciones 3 a 7, en el que el cido nucleico contiene adems al menos una secuencia
de cidos nucleicos que codica para un pptido seal.
9. Uso segn la reivindicacin 8, en el que el pptido seal procede de una invertasa.
10. Uso segn la reivindicacin 8 9, en el que el pptido seal procede de la invertasa de la membrana celular del
tabaco.
11. Uso segn una de las reivindicaciones 3 a 10, que contiene adems al menos una secuencia de cidos nucleicos
que codica para una secuencia de retencin del RE.
12. Uso segn una de las reivindicaciones 3 a 11, que contiene adems al menos una secuencia de cidos nucleicos
que comprende un promotor apropiado para la expresin en plantas.
13. Uso segn la reivindicacin 12, en el que el promotor procede de la misma planta que la invertasa.
14. Uso segn la reivindicacin 12 13, en el que el promotor es un promotor especco de la patata, del tomate o
de la remolacha azucarera.
15. Procedimiento para la disminucin de las prdidas de sacarosa debidas al almacenamiento, que comprende la
expresin de un polipptido codicado por un cido nucleico en un planta transgnica, que contiene al menos el cido
nucleico denido segn una de las reivindicaciones 1 a 14 integrado establemente en el material gentico, en el que el
polipptido es capaz de reducir la actividad enzimtica de una invertasa.
16. Procedimiento para la mejora de la calidad de la remolacha azucarera, que comprende la expresin de un
polipptido codicado por un cido nucleico en un planta transgnica, que contiene al menos el cido nucleico denido
segn una de las reivindicaciones 1 a 14 integrado establemente en el material gentico, en el que el polipptido es
capaz de reducir la actividad enzimtica de una invertasa y en el que la planta transgnica es una remolacha.
17. Procedimiento para la mejora la calidad del tubrculo de la patata, que comprende la expresin de un polipp-
tido codicado por un cido nucleico en un planta transgnica, que contiene al menos el cido nucleico denido segn
una de las reivindicaciones 1 a 14 integrado establemente en el material gentico, en el que el polipptido es capaz de
reducir la actividad enzimtica de una invertasa y en el que la planta transgnica es una patata.
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