Licenciatura en ingeniera biolgica Dr.

Gabriel Vigueras
PRACTICA No. 2 EXTRACCIN Y PRECIPITACIN DE ADN

Introduccin
El cido desoxirribonucleico (ADN) es la biomolcula que contiene la informacin
gentica que dirige las funciones de las clulas y algunos virus. El ADN esta formado
por un largo polmero de nucletidos el cual consta de una base nitrogenada, azcar y
un grupo fosfato. Las cuatro bases nitrogenadas esenciales del ADN son la adenina
(A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). Dentro de las clulas, dos cadenas
antiparalelas de ADN se unen por puentes de hidrgeno formando una estructura de
doble hlice. La informacin del ADN puede ser replicada formando copias del ADN, o
transcrita a RNA y posteriormente traducida a protenas. En las clulas eucariotas
(animales, plantas y hongos) la mayora del ADN se encuentra dentro del ncleo y una
pequea parte en algunos orgnulos como las mitocondrias. Mientras en las clulas
procariotas se encuentra altamente condensado en el citoplasma.

Los avances en el conocimiento del ADN ha permitido conocer los mecanismos de
replicacin y expresin de genes, incluso se conocen las secuencias completas de
diversos organismos. Actualmente existen tcnicas para cuantificar la expresin de un
gen en tiempo real (RTPCR o QPCR) la cual se basa en la reaccin en cadena de la
polimerasa. En la ingeniera gentica, medicina, criminalistica y otras, se utiliza esta
tcnica adems de otras como el Southern blot y chips de ADN.
Por otro lado aprovechando las propiedades polimricas del ADN ya se realizan
estudios en el rea de los biomateriales y nanotecnologa.
De ah la importancia de conocer las propiedades fsicas y qumicas que permitan
establecer mtodos para extraer, precipitar y purificar estas biomolculas
Un mtodo simple para extraer el ADN de clulas animales consiste utilizar un
detergente que permita solubilizar los lpidos de la membrana nuclear y celular.
Posteriormente se utilizan proteasas para liberar el ADN de las protenas que lo
mantienen sperenrollado. Finalmente se utiliza alcohol fri y una alta concentracin
de sal para precipitar el ADN.

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Objetivos

Extraer y precipitar ADN genmico de clulas epiteliales de la boca.
Conocer las propiedades bioqumicas y fisicoqumicas del ADN.

Materiales

Por grupo

Agua purificada
Alcohol (Isopropanol o Etanol)
Hielo
Tris
HCl
SDS
Ablandador de carne solucin ReNu Plus
Parafilm
Por equipo

1 tubo con 10 mL de buffer de
lisis.
1 tubo con 5 mL de solucin
proteasa+sal
Gradilla para tubos de 15 mL
4 vasos de plstico desechables
4 tubos de 15 mL
6 pipetas Pasteur
Botellas de vidrio de 1.5 mL
para almacenamiento de DNA,
con tapn.
Marcador permanente
Tijeras
Piseta con agua destilada
Bao de agua a 50C
Termmetro

Normas de seguridad y manejo de residuos
Antes de colocar el agua purificada en su boca, asegrese que realmente sea agua
purificada.

Notas importantes:
Identifique cada material con un marcador indeleble.
Colocar el alcohol en el congelador 1 hora antes de iniciar la prctica.

Soluciones.

HCl 6N
Buffer Tris-HCl 100mM pH 7 ajustado con HCl 6N
Buffer de lisis (SDS al 1% p/v en buffer Tris-HCl 100mM pH 7.0)
Solucin de proteasas+sal. Ablandador de carne al 10% (p/v) solucin
ReNu Plus para limpieza de lentes de contacto.









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Procedimiento

1. Marque un tubo falcn de 15 mL con sus iniciales.

2. Obtencin de clulas epiteliales de la boca usando el mtodo A o B.

Mtodo A. Enjuague con agua
En un vaso desechable coloque 3 mL de agua purificada.
Cuidadosamente mordisquee el interior de los cachetes por al menos 30
segundos. No sirve de nada sacar sangre!
Coloque el agua del vaso en su boca y enjuague por al menos 30 segundos
para obtener una abundante cantidad de clulas de la mucosa bucal.
Regrese el lquido al vaso y cuidadosamente virtalo al tubo de 15 mL.

Metodo B. Hisopado
Con suavidad raspe con un hisopo estril el interior de la mejilla derecha, y el
espacio situado entre la mejilla y la enca durante 1 minuto; trate de recoger la
mayor cantidad de clulas posible.
Coloque el hisopo con las clulas de la mucosa en el tubo que contiene 3 mL
de agua. Agite para liberar las clulas del hisopo. Frote el hisopo contra el
borde del tubo para transferir la mayor cantidad posible de clulas en el tubo.
Usando un segundo hisopo limpio, raspe suavemente las clulas del interior de
la mejilla izquierda, entre la mejilla y la enca, por el paladar, y debajo de la
lengua durante 1 minuto; de nuevo, trate de recoger la mayor cantidad posible
de material. Coloque el hisopo en el mismo tubo de antes y transfiere las
clulas a su interior.

3. Extraccin ADN
Aada 2 mL de bfer de lisis al tubo que contiene el extracto celular.
Cierre el tubo e invirtalo suavemente para mezclar los componentes. (No lo
mezcle muy duro!).
Observe su tubo Ve algunos cambios? Antelos.
Aade 5 gotas de solucin de proteasas+sal a su tubo.
Cierre el tubo y voltelo suavemente varias veces.
Coloque su tubo en un bao de agua e incube a 50C por 10 minutos.
Lentamente aada 10 ml de alcohol fri manteniendo el tubo a un ngulo de
45. Este paso va a requerir de varias adiciones utilizando una pipeta Pasteur.
Deje reposar el tubo en posicin vertical en la gradilla a temperatura ambiente,
durante 5 minutos Que ve?

4. Precipitacin ADN
Cierre el tubo y voltelo de lado y de regreso en posicin vertical, con mucho
cuidado, unas 10 veces, hasta que las fases de agua y alcohol queden
mezcladas y el ADN salga de solucin.

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CONSIDERAR EN EL REPORTE
Dibujar o tomar fotografas de sus obsevaciones.
Analizar los resultados y compararlos con la literatura respectiva.

CUESTIONARIO
1. Escribe cmo explicaras con palabras sencillas la diferencia entre
cromosomas, genes y ADN.

2. Contiene una clula heptica los mismos cromosomas que una clula de la
mucosa bucal?

3. Si quisieras aislar una copia del gen que codifica una protena encontrada en el
estmago, podra estar ese gen en las clulas de la mucosa bucal? Razona tu
respuesta.

4. Busca y pega un esquema de una clula animal e indica cuales son la
membrana celular, el citoplasma, el ncleo, aparato de golgi, mitocondrias,
citosol.

5. En qu compartimento celular esperas encontrar tu ADN?

6. Por qu es necesario un intermediario como el ARNm para pasar de la
informacin del ADN a la sntesis de las protenas?

7. Una vez que las membranas se han roto, el ADN queda libre en la solucin, al
igual que otras molculas celulares. Haz un listado de las molculas que junto
con el ADN esperas encontrar en la clula.

8. Qu mtodo o agente crees que se puede usar para eliminar esas molculas
que no nos interesan?

9. Qu protenas podran estar asociadas al ADN en la clula?

10. La proteasa utilizada en este protocolo tiene un funcionamiento ptimo a 50 C.
Crees que esta enzima se ha aislado de E. coli? Razona tu respuesta.

11. Describa en 5 lneas la funcin, propiedades bioqumicas y fisicoqumicas del
ADN.

12. Con fundamentos fisicoqumicos y bioqumicos explique qu pasa en cada
paso del protocolo (que hace el SDS, para que se usan proteasas, que es el
saltig-out, por que incubar a 50C por 10 minutos, para que alcohol frio, etc.)

13. Que mtodos se aplica para purificar el ADN.

14. De dos ejemplos de aplicaciones de la tecnologa del ADN

15. Cul es la formulacin del ReNu Plus.

Bibliografa