Proyecto v.4.0 05.09.2012. HFN

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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS

Aplicacin de la metodologa
cientfica para evaluar la
eficacia de un quelato frrico
de nueva sntesis en su uso
como fertilizante de
micronutrientes.

PROYECTO FIN DE CARRERA
Elena Formaux Nieto
Madrid, Septiembre 2012

Tutor: Dr. Felipe Yunta Mezquita.
Dpto. Geologa y Geoqumica.
Universidad Autnoma de Madrid.

Co-tutor: Dra. Paloma Nadal Ruiz.
Dpto. Qumica Agrcola.
Universidad Autnoma de Madrid.
Aplicacin de la metodologa cientfica para evaluar la eficacia de un quelato frrico de
nueva sntesis en su uso como fertilizante de micronutrientes.
2012

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PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA MEMORIA

Ponencias y comunicaciones en congresos.

Martin, I.; Grate, A.; Lucena, J.J.; Formaux, E. y Yunta, F.; 2012.
Evaluacin preliminar de un mtodo de lavado para estudiar la
efectividad de la aplicacin foliar de fertilizantes de micronutrientes. XIV
Simposio Hispano-Luso de nutricin mineral de las plantas. Universidad
Autnoma de Madrid. 23al 26 julio 2012. Poster

Publicaciones en Libros Colectivos

I Martn, A Grate, JJ Lucena, E Formaux, F Yunta 2012. Evaluacin
preliminar de un mtodo de lavado para estudiar la efectividad de la
aplicacin foliar de fertilizantes de micronutrientes. En. Nutricin Mineral
de las Plantas como base de una Agricultura Sostenible. Libro de
Comunicaciones del XIV Simposio Hispano-Luso de nutricin mineral de
las plantas. ISBN: pendiente. Edi.

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AGRADECIMIENTOS

Existen muchas personas a quienes nombrar en el presente trabajo por
todo el apoyo que he recibido en su realizacin y, por ende, resulta
imposible nombrarlas a todas.

Aun as, mi primer agradecimiento he de dedicrselo al Doctor Felipe
Yunta, mi tutor en este proyecto. Gracias por tu paciencia, que ha sido
infinita, por darme la oportunidad de trabajar contigo y, sobre todo, gracias
por ser un gran docente.

En segundo lugar, quiero nombrar a mi hermano Pedro, quien, a pesar
de no haber estado presente en muchos momentos, s que se sentir muy
orgulloso de m, y que me ha enseado que, a pesar de los obstculos que
nos encontremos, debemos luchar para conseguir aquello que queremos.

En tercer lugar, a mi cuada Celia, y a mis sobrinas Carolina y Laura, por
haberme apoyado en los momentos ms difciles, y por haberme dado un
capn bien merecido cuando me he desviado de mi camino.

En cuarto lugar, a mi familia, mi madre, mi padre, mi abuela, mis
hermanos (Sandra, Salomn, Ezequiel, Bacambe), porque s que para ellos
es un orgullo que siga adelante en mi formacin acadmica con xito.
Menciono, especialmente, a mi hermana Sandra y su marido Juan, quienes
siempre me han ayudado en todo lo posible, tanto moralmente como
econmicamente, para poder llevar a cabo esta gran tarea. Y, por supuesto,
a mis sobrinas Kendra y Nerea.

En quinto y ltimo lugar, a todos mis amigos: Rubn, Laura, Elena,
David, Mohamed, Olga, Estefana, Carlos y Juan Carlos, porque gracias a los
momentos de felicidad que me han aportado, y a las largas charlas que he
tenido con todos y cada uno de ellos, he podido seguir adelante a pesar de
las adversidades. Recibe especial mencin mi amiga Elena, quien me ha
acompaado durante este arduo y largo camino, apoyndome
incondicionalmente, y hacindome ver que puedo hacer lo que me
proponga.

Gracias a todos y cada uno de vosotros, hoy soy quien soy, y es por eso
que os dedico este trabajo a todos. Gracias.

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La naturaleza benigna provee de manera que, en
cualquier parte, halles algo que aprender.

- Leonardo Da Vinci-

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ndice

PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA MEMORIA .........................1
ndice ........................................................................................5
1. Introduccin ......................................................................7
2. Objetivo del ensayo .........................................................21
3. Materiales y mtodos ......................................................22
3.1. Aplicacin edfica sobre un suelo agronmico. ............22
3.2. Aplicacin foliar del agente quelante en hojas de vid ...31
4. Resultados y discusin ....................................................38
4.1. Ensayo en suelo agronmico. .......................................38
4.2. Ensayo de aplicacin foliar............................................56
5. Conclusiones ....................................................................65
5.1. Ensayo en suelo agronmico ........................................65
5.2. Ensayo en aplicacin foliar............................................66
6. Bibliografa. ......................................................................68

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Abreviaturas

AAS: Espectrometra de Absorcin Atmica.
BPDS: cido Batofenantrolindisulfnico.
CEN-EN: Comit Europeo de Normalizacin. Normativa a nivel europeo.
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C-RMN: Resonancia Magntica Nuclear de Slido.
DOUE: Diario Oficial de la Unin Europea.
DTPA: cido Dietilen-Triamin-Pentaactico.
EDDHSA: cido Etilen-Diamin-bis (2-hidroxi-5-sulfonatoetil) actico.
EDDS: cido Etilen-Diamino-Disuccnico.
EDTA: cido Etilen-Diamino-Tetraactico.
HEDTA: cido 2- hidroxi-etilendiamino-triactico.
ICP-MS: Espectrometra de Masas con fuente de Plasma de Acoplamiento
Inductivo.
IDHA: cido Imino-Disuccnico.
LS: Lignosulfonato.
o,o EDDHA: cido o,o Etilen-Diamino-Dihidroxi-Fenilactico.
o,p EDDHMA: cido etilendiamino-di (o-hidroxi-p-metilfenilactico)
OMS: Organizacin Mundial de la Salud.

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1. Introduccin

El hierro (Fe) es un micronutriente esencial en los organismos vivos por ser un
constituyente indispensable de un gran nmero de enzimas que intervienen en su
metabolismo. En el caso concreto de las plantas, este elemento participa en la
sntesis de la clorofila, siendo esencial en el proceso de fotosntesis y en el
mantenimiento de la estructura del cloroplasto (Abada et al., 2004). Interviene,
adems, en procesos como la respiracin, la fijacin de nitrgeno (Clark, 1983) y
en la sntesis de ADN y hormonas (Briat y Lobraux, 1997).
La deficiencia de este micronutriente es, por tanto, una alteracin nutricional
que debe ser solventada debido, precisamente, a las funciones que realiza. A esta
deficiencia se la denomina clorosis frrica, y se manifiesta por un amarilleamiento
en las zonas intervenales de las hojas jvenes, permaneciendo los nervios con
tonalidad verde. La principal consecuencia de esta deficiencia en las plantas es la
disminucin en la produccin agrcola, que se debe, sobre todo, a la reduccin en la
produccin de los fotosintatos necesarios para el crecimiento y desarrollo de la
planta (Miller et al., 1984). En el caso de los rboles frutales, el efecto sobre la
produccin es muy significativo, ya que disminuyen tanto la produccin del fruto
como su calidad (lvarez-Fernndez et al., 2003; lvarez-Fernndez et al., 2006).
Otra consecuencia relevante de esta deficiencia, es que las plantas son la principal
fuente de hierro en la dieta de la poblacin mundial, por lo que bajos niveles de
este alimento acabaran afectando a la salud humana. De hecho, segn la
Organizacin Mundial de la Salud (OMS), 2 billones de personas en el mundo
sufren anemia por la carencia de este nutriente (Santi y Schmidt, 2009).
Esta alteracin afecta a una gran variedad de especies y regiones geogrficas,
como Espaa, Italia, Francia, EE.UU, Turqua, etc., siendo las especies vegetales ms
susceptibles a sufrirla la soja (Glycine max), el cacahuete (Arachpis hypogaea), el
frijol (Phaseolus vulgaris), el sorgo (Sorghum bicolor), el arroz (Oryza sativa), los
ctricos, el melocotonero, la vid (Vitis vinfera) y el tomate (Orera, I., 2010).

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Es importante mencionar, adems, el impacto econmico que supone esta
deficiencia en agricultura, debido no slo a que se produce un descenso en la
produccin y el valor nutricional de las partes de la planta, sino tambin al elevado
precio de algunos fertilizantes frricos (estimado en 200-400 ha
-1
para rboles
frutales (Rombol y Tagliavini, 2006)).

Causas de la deficiencia de Fe
La deficiencia de este micronutriente en las plantas se debe, generalmente, a la
combinacin de varios factores:

- Baja disponibilidad de Fe en los suelos. Los suelos contienen, por norma
general, elevadas concentraciones de hierro, pero en muchos de ellos, su
disponibilidad es muy baja. Esto sucede principalmente en suelos alcalinos
y calizos (pH 7,5-8,5), en los que el hierro se encuentra en forma de xidos e
hidrxidos poco solubles (Lindsay y Schwab, 1982). Su elevado contenido
en caliza (CaCO3) produce un efecto tampn que dificulta la solubilizacin
de estos xidos e hidrxidos. As, los factores que determinan la
disponibilidad de Fe en el suelo son el pH, el tipo de mineral del que
procede el Fe (ya que cuanto ms soluble sea el mineral, mayor
concentracin de Fe habr disponible en el suelo), y la superficie especfica
del mineral (ya que, cuanto menor sea sta, ms lenta ser la liberacin del
Fe (Schwermann, 1991)).
La presencia del in bicarbonato en los suelos influye negativamente en la
biodisponibilidad del Fe, ya que consumir los protones que se puedan
producir, evitando as la participacin de stos en la solubilizacin de los
hidrxidos frricos (Lucena, 2003). Puede afectar, adems, al crecimiento y
metabolismo de las races (Yang et al., 1994), al transporte de Fe a la parte
area, y a la disponibilidad fisiolgica del Fe en las hojas (Alhendawi et al.,
1997). Igualmente, la presencia de este in puede producir la alcalinizacin
del apoplasto y el citoplasma de las clulas vegetales, lo que podra causar
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la precipitacin del Fe en dichos compartimentos (Romera et al., 1992) y
una disminucin de la actividad reductasa frrica de la raz (Susn et al.,
1996).
Asimismo, otras caractersticas del suelo, como la elevada proporcin de
arcilla y carbonato (Kashirad y Marschner, 1974; Kolesch et al., 1987a,b),
falta de materia orgnica, alta humedad, poca aireacin, elevada salinidad
(Award et al., 1988) y alta concentracin de fosfatos (Lindsay y Schwab,
1982), afectan negativamente a la disponibilidad del Fe.
- Factores relacionados con la absorcin y metabolismo del Fe. Dentro
de estos factores destacan los que inhiben el crecimiento de las races, tales
como la compactacin y encharcamiento del suelo (Chen y Barak, 1982), las
bajas temperaturas y la adicin de herbicidas (Chaney, 1984), y los que
inhiben la absorcin del Fe, como la presencia de fosfatos y metales pesados
(Lucena, 2003).
- Factores que afectan a la actividad del Fe dentro de la planta. Se ha
observado en frutales crecidos en el campo que el contenido de Fe en las
hojas de las plantas deficientes puede ser similar o incluso algo superior al
de las hojas verdes y, sin embargo, presentar sntomas de deficiencia de Fe
(Orera, I., 2010). Este fenmeno es conocido como la paradoja de la
clorosis frrica (Morales et al., 1998) y sugiere que el Fe podra acumularse
en alguna zona de la hoja (principalmente en los nervios principal y
secundarios (Jimnez et al., 2009)) en una forma no asimilable por la planta.
Adems, se ha propuesto que los fosfatos y un elevado pH del apoplasto
podran provocar la precipitacin del Fe en el exterior de la clula
impidiendo su utilizacin (Mengel y Geurtzen, 1986).

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Adquisicin de hierro por la raz en condiciones de deficiencia de hierro
La toma de hierro por parte de las plantas se realiza directamente de la
solucin del suelo mediante un proceso de absorcin activa a travs de las races
(Uren, 1984), principalmente en su forma de Fe (II) (excepto en el caso de las
gramneas, que lo toman en forma de Fe (III)). Cuando hay elevada concentracin
de Fe disponible, las plantas tienden a utilizar sistemas de transporte de Fe de baja
afinidad y a absorber tan slo la cantidad necesaria para su crecimiento. Cuando
hay escasez de Fe biodisponible, las plantas pueden permanecer indiferentes
(plantas no eficientes) o desarrollar mecanismos de adaptacin para aumentar su
capacidad de adquirir Fe del suelo (plantas eficientes). Dependiendo del
mecanismo de adaptacin desarrollado por la planta para la adquisicin de Fe en
ambientes deficientes en este elemento, las plantas se clasifican en dos grupos
distintos:

- Plantas de Estrategia I. A este grupo pertenecen las plantas dicotiledneas
y monocotiledneas no gramneas. Se caracterizan por desarrollar, en
condiciones de deficiencia de Fe, una serie de respuestas que afectan a la
fisiologa, estructura y morfologa de las races, incluyendo un incremento
en la reduccin de los quelatos de Fe (III) a Fe (II) en la superficie de la raz,
y el transporte del Fe (II) a travs de la membrana celular de la epidermis
de la raz. Los genes que codifican la enzima Fe (III)-quelato reductasa
localizada en la membrana plasmtica de las clulas de la raz (FCR o FRO2
(Robinson et al., 1999)) y el transportador del in ferroso (IRT1) (Conolly et
al., 2003) han sido identificadas en la especie Arabidopsis (Nadal et al.,
2009). El aislamiento de estos genes y su implantacin en estos cultivos,
puede tener implicaciones para la generacin de cultivos con un mecanismo
de adquisicin de Fe mejorado.
- Plantas de Estrategia II. Las plantas gramneas producen y secretan a la
rizosfera compuestos de bajo peso molecular llamados fitosiderforos (PS).
Debido a su alta afinidad por el Fe, los fitosiderforos quelan y solubilizan
de forma muy eficaz el Fe (III) del suelo, formando complejos de
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Fe (III)-fitosiderforo (Fe(III)-PS) que son tomados por la raz a travs de
un sistema de transporte de alta afinidad.
Correccin de la deficiencia de Fe
Existen diferentes metodologas para prevenir y/o tratar la clorosis frrica:

- Mejora gentica y seleccin de cultivares existentes. Estas tcnicas son
de carcter preventivo, por lo que deben adoptarse antes de la implantacin
del cultivo. Solventan la deficiencia de hierro mediante el cultivo de
especies resistentes, obtenidas tanto por tcnicas tradicionales de seleccin
como por modificacin gentica (Charlson et al., 2003).
- Prcticas agrcolas apropiadas. Utilizadas en cultivos ya establecidos,
estas prcticas consisten en eliminar los riesgos de alcalinizacin,
compactacin y encharcamiento del suelo (Romera y de la Guardia, 1992),
favoreciendo un buen drenaje (Chen y Barak, 1982). Otra prctica habitual
en rboles frutales y viedos es su cultivo junto con otras plantas anuales,
reduciendo as la compactacin y aumentando la porosidad, filtracin y
contenido en materia orgnica suelo (Tagliavini y Rombol. 2001). Entre
estas plantas anuales se incluye el cultivo de especies con Estrategia II, que
excretan fitosiderforos capaces de aumentar la solubilidad del Fe en el
suelo (Rombol y Tagliavini, 2006). La adicin de enmiendas como la
materia orgnica (sustancias hmicas) y acidificantes se lleva a cabo para
favorecer la solubilizacin del Fe existente en el suelo pero que no est
disponible para las plantas.
- Fertilizantes. Actualmente, la adicin de productos fertilizantes es la
tcnica ms eficaz y comn para corregir deficiencias de Fe en cultivos ya
establecidos, aunque depende de la forma en que se adiciona el Fe:

o Sales inorgnicas de hierro: El sulfato ferroso se ha aplicado
tradicionalmente al suelo para corregir las carencias de hierro
(Rombol y Tagliavini, 2006), aunque esta prctica resulta
ineficiente, ya que el Fe
2+
del sulfato ferroso se oxida rpidamente a
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o Fe
3+
y precipita en forma de hidrxido frrico, dejando de estar
disponible para la planta.
o Complejos de hierro: Al igual que los quelatos, que explicaremos a
continuacin, los complejos son molculas formadas por un in
metlico aceptor de electrones y por una sustancia orgnica capaz de
compartir los electrones con el metal. La diferencia entre quelatos y
complejos est basada en la fortaleza del enlace y en su naturaleza
sinttica o natural.
o Quelatos sintticos: Constituyen la tcnica ms eficiente para
corregir la clorosis frrica (Chen y Barak, 1982). Por tratarse de los
productos utilizados en el presente ensayo, se les dedicar una
mayor atencin en las siguientes pginas.
Formacin y propiedades de los quelatos.
La quelatacin es la capacidad de un compuesto qumico para formar una
estructura en anillo con un in metlico, dando como resultado un compuesto
organometlico con propiedades diferentes de las que tena anteriormente,
secuestrando al in metlico en cuestin e impidiendo que ste siga sus
reacciones qumicas normales. La estructura del quelato tiene forma de anillo, en
cuyo interior queda englobado el in metlico (Figura 1.1).
Figura 1.1: Estructura de un quelato de Fe (Fe-o,oEDDHA) usado como fertilizante. (Fuente:
lvarez-Fernndez et al., 2006).
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En condiciones normales, los metales estn presentes en la solucin del suelo
en su forma hidratada, esto es, rodeados de molculas de agua. Ante la presencia
de un agente quelante, estas molculas son reemplazadas por dicho agente
quelante, al que se denomina ligando (que posee dos o ms grupos funcionales
capaces de compartir pares de electrones con un in metlico central (Shenker y
Chen, 2005)), y producindose entonces el fenmeno de formacin del quelato
(Yunta et al. 2003b).

Propiedades de los quelatos
Estequiometra
Muchos quelatos se forman en una proporcin molar 1:1 metal:ligando (M:L).
Dependiendo de las condiciones existentes, pueden formarse complejos estables
con una mayor proporcin de in metlico o una mayor proporcin de ligando.

Constantes de estabilidad
La formacin de un quelato es una reaccin de equilibrio y, por lo tanto,
reversible hacia la formacin/disolucin del quelato:
M+L <==> ML
La determinacin de la constante de estabilidad de un quelato puede obtenerse
a partir de la siguiente expresin:

Esta constante determina la afinidad de la molcula de agente quelante por el
in metlico (lvarez-Fernndez et al., 2006).
En el mbito de los quelatos frricos, los quelatos de EDTA, DTPA y HEDTA no
son estables al pH de los suelos calizos, ya que a pH superiores a 6 el zinc, el
manganeso o el calcio desplazan al hierro de la molcula de quelato (lvarez-
Fernndez et al., 2006). Por otro lado, el Fe-o,o-EDDHA y el Fe-o,p-EDDHMA son
estables en el intervalo de pH de 4 a 9, habiendo demostrado ser muy eficaces en
la correccin y control de la clorosis frrica (lvarez-Fernndez et al., 2006).
Cte. Estabilidad = Log K =

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Orden de quelatacin
Si en el medio se encuentra ms de un metal, el quelato que se forme
inicialmente ser aqul que tenga una constante de estabilidad mayor, es decir, el
metal que posea una mayor constante de estabilidad en la formacin de complejos
desplazar a aquellos metales que tengan una constante de estabilidad menor.
Yunta et al., (2003 a, b, c) realizaron la sntesis y la posterior determinacin de las
constantes de protonacin y estabilidad de agentes quelantes y quelatos de Fe, Ca,
Mg y Cu anlogos al o,o-EDDHA.

Fuerza de la quelatacin
La fuerza de los agentes quelantes se clasifica atendiendo a sus constantes de
disociacin. Esta propiedad debe tenerse muy en cuenta a la hora de aplicar el
quelato, puesto que el hecho de que sea un agente demasiado estable puede
provocar que no se libere el metal y, por lo tanto, deje de ser activo para la planta
(Yunta et al. 2003b).

Tipos de quelatos
Los quelatos pueden ser de origen natural (complejos) o sinttico (quelatos
sintticos).
Aquellos que son de origen natural, y que son permitidos en nuestro pas para
aplicaciones foliares y fertirrigacin, incluyen el cido lignosulfnico, el cido
glucnico, el cido heptaglucnico, las sustancias hmicas, los aminocidos libres y
el cido ctrico (Rodrguez-Lucena, 2010). Para la correccin de la clorosis frrica,
los lignosulfonatos (polmeros naturales que se obtienen como subproducto de la
industria del papel y pueden formar complejos con metales) han demostrado ser
eficaces en peral cuando los complejos eran aplicados por va foliar (Raese y Staiff,
1988).
Los agentes quelantes de origen sinttico son los ms utilizados a pesar de su
elevado coste, ya que son muy eficientes a la hora de suministrar micronutrientes a
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la planta, siendo los ms utilizados los cidos poliaminocarboxlicos. Este grupo
se clasifica en dos grandes subgrupos dependiendo de la presencia o ausencia de
grupos fenlicos en su estructura, siendo el principal agente quelante no fenlico el
EDTA, y el principal fenlico, el o,o-EDDHA.
Para el caso concreto del hierro, los quelatos sintticos ms usados son el
Fe (III)-EDTA, Fe (III)-o,o-EDDHA, Fe (III)-DTPA, Fe (III)-EDDHSA y Fe (III)-o,o-
EDDHMA. Sin embargo, debido a su escasa biodegradabilidad y, por consiguiente,
al problema medioambiental que generan, se estn proponiendo nuevos quelatos
sintticos ms biodegradables, entre los que destacan el cido iminodisuccnico
(IDHA) y el cido etilendiaminodisuccnico (EDDS; Rodrguez-Lucena et al.,2010 y
Villn et al., 2007).

Evaluacin de la eficacia de los quelatos
La eficacia de un quelato para suministrar un determinado nutriente a la planta
depende de la calidad de formacin, de su estabilidad, de la persistencia del metal
quelado en la solucin del suelo y de la capacidad del quelato para aportar el in a
la planta en las condiciones de cultivo. Los tres primeros factores se pueden
estudiar desde un punto de vista qumico, mientras que para estudiar el ltimo se
precisa de una evaluacin agronmica. Yunta et al. (2003c) reportaron una
metodologa cientfica para la determinacin de las constantes de estabilidad y de
protonacin de dichos agentes quelantes, y su posterior evaluacin en condiciones
de suelo/planta mediante el uso de modelos computacionales. Aun as, es
necesario conocer su comportamiento en condiciones agronmicas.

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Evaluacin qumica
Segn el Reglamento de la UE (DOUE, 2003) los agentes quelantes deben ser
identificados y cuantificados con los mtodos descritos en las normas CEN-EN
13368-1 (2001a) para los compuestos a base de EDTA. DTPA y HEDTA, y en la
CEN-EN 13368-2 (2001b), especfico para las molculas de Fe-EDDHA y Fe-
EDDHMA. Para evaluar este ltimo mtodo de anlisis, se hizo un estudio (Garca-
Marco et al., 2003) que consisti en pruebas inter-laboratorios en las que se
comparaba dicho mtodo por el desarrollado por Lucena et al., en 1996 (lvarez-
Fernndez et al., 2006). Ambos mtodos dieron resultados similares cuando se
aplicaron a compuestos de EDDHA-Fe, pero en las formulaciones a base de Fe-
EDDHMA, el contenido del componente activo determinado por el mtodo de
Lucena et al. (1996) era inferior al propuesto por el mtodo de la Unin Europea
(Garca-Marco et al., 2003). El motivo de estos resultados es que el mtodo de
Lucena et al. (1996) era capaz de distinguir los ismeros de estas molculas, por lo
que finalmente la UE adopt el mtodo de Lucena et al. (1996) como mtodo oficial
de anlisis, aunque con unas pequeas modificaciones realizadas con el fin de
aumentar su robustez (lvarez-Fernndez et al., 2006).

Evaluacin agronmica
La evaluacin agronmica de un quelato puede realizarse administrndolo por
diferentes vas:
1. Aplicacin foliar. La efectividad de esta aplicacin depender de la
formulacin y el procedimiento utilizados (Orera, I., 2010). Para que la
absorcin del Fe en hoja mejore, se adiciona conjuntamente con agentes
tensioactivos que mejoran la capacidad de penetracin del Fe en la hoja
(Fernndez et al., 2009). Aun as, la respuesta a esta aplicacin depender
de factores relacionados con la planta (especie, variedad, etc.), el medio
ambiente en que se encuentre (luz, temperatura, etc.) y factores fsico-
qumicos (Fernndez y Ebert, 2005).
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En cuanto a las aplicaciones foliares, algunos autores recomiendan
disoluciones cidas de quelatos para corregir la deficiencia de Fe (Chen y
Barak, 1982; Wallace, 1988). Otros, en cambio, comprobaron que son ms
eficaces aquellos tratamientos que contienen sales inorgnicas de Fe
(FeSO4) que los de quelatos (lvarez-Fernndez et al., 2004; Fernndez et
al., 2006). Se ha comparado, adems, la eficacia de rociados foliares con
diferentes quelatos y complejos naturales, obtenindose mejores
reverdecimientos para los quelatos sintticos y complejos de aminocidos,
mientras que la movilizacin del Fe hacia las races slo ocurri con los
lignosulfonatos de Fe (Rodrguez-Lucena et al., 2010).
2. Inyeccin al tronco. Este tipo de aplicacin slo se puede realizar en
rboles. La inyeccin de quelatos frricos se lleva a cabo en forma lquida,
pero otro tipo de fertilizantes de Fe (FeSO4 y citrato frrico) se pueden
aplicar en forma slida (Orera, I. 2010). Los estudios realizados muestran
que los implantes slidos de sales inorgnicas (FeSO4) en el tronco tuvieron
un efecto de hasta un ao en peral en la correccin de la clorosis frrica
(Abada et al., 2004; Larbi et al., 2002). Otros estudios compararon el efecto
de inyecciones lquidas de quelatos frricos de Fe-EDDHA y Fe-EDDHMA en
olivo y melocotonero, corrigiendo la clorosis en ambas especies, aunque el
efecto ms prolongado se produjo en el caso del Fe-EDDHMA (Fernndez-
Escobar et al., 1993).
3. Aplicacin al suelo o sustrato. Este mtodo de aplicacin, junto con el de
la fertirrigacin, es el ms utilizado y donde la aplicacin de quelatos
frricos resulta ms eficaz que otros productos como las sales de Fe,
acidificantes y humatos (Lucena, 2003).
Los quelatos ms eficaces para suelos calizos son el Fe-EDDHA y
derivados, ya que el Fe-EDTA y el Fe-DTPA son inestables a pH alcalino
(Orera, I., 2010). Los resultados para quelatos frricos con grupos fenlicos
en su estructura son contradictorios, ya que algunos autores obtuvieron un
efecto ms duradero con un producto de Fe-EDDHMA frente a uno de Fe-
EDDHA en plantas de tomate crecidas en sustrato calizo
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(lvarez-Fernndez et al., 1996), y otros consiguieron un efecto ms
duradero en tratamientos con Fe-EDDHA que con Fe-EDDHMA en girasol,
melocotonero y peral (lvarez-Fernndez et al., 2005).
En solucin nutritiva, se ha comparado la eficacia de cinco quelatos
sintticos (Fe-EDDS, Fe-IDHA y tres formulaciones comerciales de Fe-
EDTA) y diez complejos (humatos, lignosulfonatos, aminocidos,
glicoprotenas, polipptidos, citrato y gluconato) aplicados a plantas de soja
clorticas, obtenindose como resultado que los quelatos sintticos
favorecan el crecimiento de las plantas en mayor medida que los
complejos, as como el incremento en la concentracin de Fe y en el ndice
SPAD (Rodrguez-Lucena et al., 2010).
4. Adicin a las aguas de riego: fertirrigacin. Con este tipo de regado, la
clorosis suele agravarse ya que, adems del uso de aguas y sustratos calizos,
las races de la planta se desarrollan poco, lo que conlleva una menor
superficie de contacto con el sustrato; este hecho hace necesaria la
aplicacin regular de Fe en forma soluble en cultivos fertirrigados (Orera,I.
2010). Las sales inorgnicas no pueden usarse en fertirrigacin porque
precipitan como xidos o fosfatos de Fe, lo que obturara los goteros. Es por
esto que los quelatos sintticos son los fertilizantes frricos ms utilizados
(Lucena, 2003).

Mecanismo de accin de los quelatos frricos sintticos
Estos quelatos se aplican principalmente a plantas de Estrategia I, ya que las de
Estrategia II no suelen padecer deficiencia de Fe (Orera, I. 2010).
El mecanismo de accin propuesto para los quelatos frricos sintticos se
compone de las siguientes etapas (Shenker y Chen, 2005):

1. Adsorcin del Fe (III)-quelato en la raz.
2. Reduccin del Fe (III)-quelato a Fe (II)-quelato mediante una enzima
radicular especfica denominada Hierro Quelato Reductasa (FCR).
3. Disociacin del quelato y liberacin del Fe (II).
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4. Transporte del Fe (II) al interior de la clula a travs del transportador de
membrana IRT1.
La reduccin de los Fe (III)-quelatos fue descrita por primera vez en plantas de
soja, utilizando la formacin del complejo de Fe (II) con cido
batofenantrolindisulfnico (BPDS; Chaney et al., 1972). El agente reductor que se
ha propuesto como donor de electrones a la enzima FCR es el NAD(P)H, siendo el
Fe (III)-quelato el aceptor de electrones (Harrington y Crumbliss, 2009; Shenker y
Chen, 2005).
Tras la disociacin del quelato, el agente quelante queda libre en la solucin del
suelo, pudiendo disolver el Fe nativo del suelo y transportarlo hacia la rizosfera.
Este proceso es conocido como efecto shuttle (Lucena, 2006). Segn este
mecanismo, el agente quelante queda fuera de la planta, y slo el Fe (II) es
incorporado al interior. Adems, el Fe (II) producido por la FCR y no absorbido por
la planta tiene que ser re-oxidado. Se ha propuesto que los propios agentes
quelantes puedan actuar como catalizadores de la reaccin de re-oxidacin,
favoreciendo la formacin, de nuevo, del quelato frrico (Lucena, 2006).
Las caractersticas que idealmente debe tener un quelato para que su uso con
fines agrcolas sea viable son las siguientes (Brown, 1969; Shenker y Chen, 2005):
- El metal quelado no debe ser sustituido fcilmente por otro metal.
- Debe ser estable frente a la hidrlisis.
- No debe descomponerse por la accin de los microorganismos del suelo.
- Debe ser soluble en agua.
- No debe fijarse fcilmente a la superficie de las partculas del suelo.
- Debe estar en forma accesible para la planta.
- No debe ser txico en dosis adecuadas.
- Debe estar en forma fcilmente aplicable al suelo y a la planta.
- Debe ser barato.

2012

20

Marco legal de los fertilizantes

La regulacin del uso de estas sustancias se realiz por primera vez en la Unin
Europea en el ao 1976, pero debido a la aparicin de nuevos quelatos sintticos,
en el ao 2003 se elabor el Reglamento 2003/2003 de la Comunidad Europea,
traspuesta al derecho espaol en el Real Decreto 824/2005, en el que se
incluyeron estos nuevos quelatos. En la Tabla 1.1 se muestran los diferentes
agentes quelantes permitidos por dicha normativa, estando sealados en color
negro aqullos que eran ya aceptados en la norma anterior a la vigente.

Tabla 1.1: Lista de agentes orgnicos autorizados y complejantes para micronutrientes.
Fuente DOUE 2003.

cido etilendiaminotetraactico EDTA
cido etilentriaminopentaactico DTPA
[o,o]: cido etilendiamino-di(o-hidroxifenilactico) EDDHA
[o,p] cido etilendiamino-N-(o-hidroxifenilactico)-N-(p-
hidroxifenilactico)
EDDHA
cido 2-hidroxietilendiaminotriactico HEEDTA
[o,o]: cido etilendiamino-di (o-hidroxi o-metilfenilactico) EDDHMA
[o,p] cido etilendiamino-di (o-hidroxi-p-metilfenilactico) EDDHMA
[p,o] cido etilendiamino-di (p-hidroxi-o-metilfenilactico) EDDHMA
[2,4]: cido etilendiamino-di (2-hidroxi-4carboxifenilactico) EDDCHA
[2,5]: cido etilendiamino-di(2-carboxi-5 hidroxifenilactico) EDDCHA
[5,2]: cido etilendiamino-di (5-carboxi-2-hidroxifenilactico) EDDCHA
cido etilendiamin bis (2-hidroxi-5-sulfonatoetil) actico EDDHSA
cido N,N-di(2-hidroxibenzil)etilendiamino-N,N-diactico (*) HBED (*)
(*) Este agente quelante queda regulado en la Orden PRE/630/2011, y podr ser
utilizado siempre y cuando cumpla los requisitos del Reglamento CE n
o
1907/2006,
del Parlamento Europeo y del Consejo, relativo al registro, evaluacin, autorizacin y
restriccin de las sustancias y preparados qumicos (REACH).

En el Reglamento 2003/2003 CE, se indica que un fertilizante a base de quelato
de hierro debe contener un mnimo del 5% de hierro soluble en agua, del cual la
fraccin de hierro quelado debe ser de, al menos, un 80% (Diario Oficial de la
Unin Europea, DOUE 2003). Adems, en la etiqueta debe detallarse el contenido
de hierro quelado por cualquiera de los agentes quelantes presentes en la
formulacin en una concentracin superior al 2%, as como el intervalo de pH que
garantiza una buena estabilidad de la fraccin de hierro quelada (DOUE 2003).

2012

21

Desde el ao 1995 hasta la actualidad, se han realizado diversos estudios sobre
la calidad de las formulaciones comerciales de los quelatos de hierro. As, en 1996
se desarroll un mtodo que permita determinar la cantidad de hierro unido a la
molcula de agente quelante (Lucena et al., 1996). Este mtodo de anlisis se
aplic a un gran nmero de formulaciones comerciales en Espaa entre los aos
1998 y 1999 que declaraban contener EDDHA como agente quelante en la etiqueta,
dando como resultado que todos los productos presentaban contenidos de Fe-
EDDHA inferiores al contenido requerido por la directiva europea en vigor
(Hernndez-Apaolaza et al., 1997; lvarez-Fernndez, 2000). Esta falta de calidad
de los productos se atribuy a la presencia de otros compuestos en la formulacin
comercial que se producan durante el proceso de sntesis de la parte orgnica de
la molcula, siendo identificadas aos despus las estructuras de algunos de estos
compuestos, resultando ser, en muchos casos, molculas muy parecidas a los
componentes activos de las formulaciones (Cremonini et al., 2001; lvarez-
Fernndez et al., 2002; Garca-Marco et al., 2006).
2. Objetivo del ensayo

En este ensayo, se ha aplicado la metodologa cientfica para evaluar la eficacia
de un nuevo agente quelante sinttico para corregir la clorosis frrica. Para ello, se
han realizado varios ensayos agronmicos aplicando el quelato de nueva sntesis,
elaborado con dos compuestos de Fe diferentes, siguiendo las normas de
utilizacin habituales con este tipo de compuestos, aplicacin directa en el suelo
(como el caso del o,o-EDDHA/Fe) y rociado va foliar (como el caso del EDTA). Se
ha realizado una aplicacin edfica sobre un suelo agronmico, donde se
cultivaron plantas de soja (Glycine max L. Klaxon), y una aplicacin foliar en vid
(Vitis Vinifera L. cv. Tempranillo sobre el portainjerto R-110). Adems, para el
ensayo en aplicacin foliar, se realizaron lavados de la materia vegetal con dos
disolventes orgnicos diferentes, Tween 80
(lvarez Fernndez et al., 2001) y

Triclorometano (CHCl3) (Jetter et al., 2000) con el fin de evaluar el efecto del
mtodo de lavado sobre la valoracin del contenido total de micronutriente en la
2012

22

hoja, mediante la comparacin de la concentracin potencialmente absorbida de
un micronutriente, que en este caso fue el Fe (Martin et al., 2012).

3. Materiales y mtodos

3.1. Aplicacin edfica sobre un suelo agronmico.
Se realiz un cultivo con plantas de soja (Glycine max L. Klaxon), por ser una
variedad ineficiente en la captacin de hierro, y susceptible a desarrollar clorosis
frrica (Lucena et al., 2009). El ensayo vegetal se realiz en cmara de cultivo
durante 56 das a partir de la germinacin de las semillas y sobre un suelo calizo.
Se realizaron 3 muestreos vegetales a partir de la aplicacin de los
correspondientes tratamientos (10/05/2011). La cmara de cultivo de
investigacin dispone de funcin fotoperiodo modelo CCKF 0/16985. Durante la
realizacin del ensayo, el ciclo de cultivo utilizado fue: 16 horas de da a 28 C y
40% de humedad, y 8 horas de noche, a 20 C y 60 % de humedad. La intensidad
de luz fue 10872 lum m
-2
.

Preparacin y anlisis del suelo y la arena
Para el presente ensayo se utiliz un suelo agronmico con alto contenido en
caliza activa sobre el que se cultivan frutales para produccin, y sobre el que se
aplican, de forma anual, correctores frricos, debido a la presencia sistemtica de
clorosis frrica. Se eligi un suelo calizo procedente de Valencia (vase Tabla
3.1.2). Se prepar inicialmente el suelo secndolo, destruyendo los agregados y
tamizndolo a travs de un tamiz de 2 mm de luz de malla.
Dicho suelo agronmico se mezcl con arena caliza para mejorar la estructura
del suelo con el fin de poder muestrear las races al final del ensayo biolgico, y
para acentuar las condiciones alcalinas de dicho ensayo y as evaluar la eficacia de
los productos ensayados (vanse Tablas 3.1.1 y 3.1.2).

2012

23

Tabla 3.1.1: Composicin qumicas de la arena utilizada.

Tabla 3.1.2: Propiedades fsico-qumicas del suelo agronmico.

Macronutrientes
(NH4Ac)
cmolc /Kg
Ca 5,13
Mg 2,92
K 0,51
Na 0,14
Micronutrientes (Soltanpour) cmolc/Kg
Fe 5,26
Mn 4,52
Cu 1,07
Zn 3,00

Propiedad Contenido
CaCO3 (g/Kg) 975
SiO2 (g/Kg) 11,0
Al2O3 (g/Kg) 1,8
MgCO3 (g/Kg) 11,5
Fe2O3 (g/Kg) 0,55
Densidad (Kg/L) 2,60
CaO (g/Kg) 548
Propiedad Contenido
Arena (g/Kg) 435
Limo (g/Kg) 80
Arcilla (g/Kg) 485
Textura Arena arcillosa
pH(H2O) 7,92
pH (KCl) 7,66
C.E. (extracto 1:5) (dS/m) 0,270
M.O (oxidada) (g/Kg) 9,2
N Kjeldahl (g/Kg) 0,3
C/N 30,7
CaCO
3
Total (g/Kg) 380
Caliza activa (g/Kg) 89
2012

24

Cultivo de las plantas de soja

Se pusieron a germinar 400 semillas de soja (Glycine max L. cv Klaxon).
Previamente se lavaron con agua destilada durante 30 minutos (para hidratarlas y
eliminar posibles residuos), cambiando esta agua cada 10 minutos. La germinacin
se realiz poniendo las semillas en bandejas de plstico, cubrindolas con papel de
celulosa saturado con agua destilada. Se dejaron germinar durante 72 horas en
oscuridad y en estufa a 30
o
C y 60 % de humedad relativa.

Pasado este tiempo, se seleccionaron 120 semillas con un estado de
germinacin homogneo. Se colocaron en bandejas de hidropona pura durante 7
das para favorecer el desarrollo de la plntula con una disolucin nutritiva
estndar 5 veces diluida (Tabla 3.1.3).

Tabla 3.1.3: Composicin de la disolucin nutritiva utilizada en el cultivo hidropnico.

Sal
Inorgnica
Concentracin
Ca(NO3)2 0,2 mM
KNO3 0,18 mM
K2SO4 0,04 mM
MgSO4 0,02 mM
KH2PO4 0,02 mM
NaCl 7 M
H3BO3 2 M
Na2MoO4 0,01 M
EDTA/Na2 23,1 M
CuSO4 0,2 M
MnSO4 0,5 M
CoSO4 0,2 M
ZnSO4 2 M
NiCl2 0,2 M
HEPES 0,02 mM
KOH 0,01 mM
EDTA/Fe 5 M
Zn 0,04 mM

2012

25

Se trata de una disolucin nutritiva tamponada en micronutrientes en
donde se aade una concentracin de agente quelante (EDTA) mayor que la
suma de todos los micronutrientes para, de esta forma, asegurar que todos
ellos se encuentran formando el quelato correspondiente y, as, se evita la
precipitacin de alguno de ellos en la disolucin nutritiva, evitando la
interferencia sobre el contenido en raz. Esta disolucin se prepar, por
dilucin, a partir de disoluciones concentradas de las sales inorgnicas
correspondientes enrasando su volumen a 10 L. La concentracin final de
hierro fue 5 M, y el pH final de la disolucin se ajust a 7.5.
Transcurridos 4 das en hidropona, se indujo la clorosis frrica. Para ello se
elimin cualquier fuente de Fe de la disolucin nutritiva, dejando el resto de
nutrientes en la misma concentracin.
Despus de 10 das de la germinacin, se trasplantaron 70 semillas a tiestos.
Cada tiesto se dise para contener 600 g de una mezcla compuesta por 70%
del suelo anteriormente descrito y un 30% de arena caliza (p/p). Se saturaron
con agua destilada tras su preparacin, y se mantuvieron al 80 % de la
capacidad de campo antes del trasplante, restituyendo la cantidad de agua
perdida cada da, por pesada. Se cubrieron con papel de aluminio para evitar el
paso de la luz al suelo y que as no se desarrollaran algas ni se produjera una
fotodegradacin de los quelatos de hierro (Hill-Cottingham, 1955; Gmez-
Gallego et. al., 2005).
A partir de ese da, y hasta el da en que se realiz el tercer y ltimo
muestreo, las plantas se regaron con una disolucin nutritiva de
macronutrientes, cuya composicin figura en la Tabla 3.1.4.

Tabla 3.1.4.: Composicin de la disolucin nutritiva de riego.

Ca(NO3)2 0,2 mM
KNO3 0,18 mM
K2SO4 0,04 mM
MgSO4 0,02 mM
KH2PO4 0,02 mM

2012

26

Adems, se prepar otra disolucin nutritiva de igual composicin en
macronutrientes que la anterior, aunque contena Zn-EDTA en una concentracin
de 0,04 mM con el fin de cubrir las necesidades de la planta respecto a este
micronutriente. sta se aada 2 veces por semana, y el resto de das de la semana
se regaba diariamente con la disolucin de macronutrientes, manteniendo la
capacidad de campo de los tiestos al 80%. A ambas disoluciones se les aada 0.1
g/L de CaCO3 y de NaHCO3, y se ajustaba el pH a 7.5.

Inicialmente se colocaron 70 tiestos y, antes de la aplicacin de los
tratamientos se retiraron los 10 tiestos cuyas plantas presentaban un desarrollo
fenolgico no homogneo.

Durante todo el ensayo biolgico, se estim la concentracin de clorofila en
hoja mediante el ndice SPAD con un equipo Minolta SPAD 502 tres veces por
semana. Esta medida se registr separando entre los diferentes desarrollos foliares
de las plantas, segn los pisos de hojas emergentes.

Aplicacin de los tratamientos

Tras 4 das del trasplante a tiestos (14 das desde la germinacin) de cada una
de las 70 plntulas, se aplicaron los diferentes tratamientos (10/05/2011),
considerndose este da como el inicio del experimento. Los tratamientos fueron:
Control sin Fe, Quelato Sinttico 1 con hierro (QS1/Fe), Quelato Sinttico 2 con
hierro (QS2/Fe) y cido Etilendiamino-N,N-di[(orto-hidroxifenil)actico] con
hierro (o,o-EDDHA/Fe). Se prepararon para que todos ellos tuvieran una
concentracin de 840 M. Se dise un experimento con cinco repeticiones
(tiestos) por tratamiento, y tres muestreos. En cada muestreo, se coga una planta
entera de tal forma que en cada muestreo se quitaban 20 plantas (vase Esquema
1).

2012

27

Las nuevas formulaciones a ensayar tienen una relacin ligando:metal de 2:1,
siendo determinado el porcentaje de hierro quelado mediante resonancia
magntica nuclear de slido (
13
C-RMN).
La formacin de los correspondientes quelatos de Fe a partir de los agentes
quelantes o,o-EDDHA/Fe, QS1/Fe y QS2/Fe se realiz siguiendo el procedimiento
descrito por lvarez-Fernndez et al. (2002), en el que sobre una disolucin del
agente quelante se aadi el volumen necesario de una disolucin concentrada de
Fe (III) manteniendo el pH durante dicho proceso entre 5 y 7 para evitar la
precipitacin del Fe aadido y/o la ruptura del quelato durante dicho proceso. El
pH del quelato de Fe (III) resultante se ajust a 7,0 0,2 con HCl o NaOH.

Esquema 1. Diseo del experimento biolgico para estudiar la eficacia de un nuevo quelato frrico.

Se aplicaron 5 mL de disolucin 840 M de Fe quelado en cada tiesto (QS1/Fe,
QS2/Fe y o,o -EDDHA/Fe (vase figura 3.1.1.).
Figura 3.1.1: Disposicin de los tiestos en la cmara de cultivo
4 Tratamientos

(15 plantas por tratamiento)

Total: 60 plantas
3 Muestreos eliminatorios.

5 plantas por tratamiento en
cada muestreo.
2012

28

Muestreos de material vegetal y sustrato de cultivo

1. Material vegetal

Se realizaron tres muestreos a los 7, 21 y 42 das tras la aplicacin de
tratamientos, respectivamente.
Antes de retirar las plantas de soja de los tiestos, se fotografiaron, para
poder evaluar posibles sntomas visuales.
En la realizacin del muestreo, se separaron las diferentes partes de las
plantas (hojas sin pecolo, tallos con pecolo y races), y se procedi a su
pesado, con el fin de obtener el peso fresco de los mismos. Una vez pesados,
se lavaron con Tween 80
al 0.1% en solucin 0.1 M HCl (lvarez-

Fernndez et. al., 2003), para eliminar las impurezas inorgnicas que
pudieran existir en los tejidos vegetales, y despus en agua y agua destilada,
respectivamente. Seguidamente, se llevaron a la estufa, separadamente, y se
mantuvieron durante 3 das a 65
o
C, tras los cuales se volvieron a pesar,
obteniendo as el peso seco, y, por diferencia, el contenido en humedad.

Una vez secas, todas las muestras correspondientes a las diferentes
partes de la planta, se molieron. Una vez molidas, se procedi a su
mineralizacin, esto es, la destruccin de la materia orgnica por
incineracin en horno de mufla a 480
o
C para el anlisis de Fe total de la
planta (MAPA, 1994).

Atendiendo a la cantidad de muestra vegetal obtenida, se pesaron 0,10,
0,25 0,50 g en balanza analtica, en crisoles de porcelana. En cada tanda se
incluyeron dos crisoles como blanco de muestra.

2012

29

Se introdujeron los crisoles con las muestras vegetales en la mufla fra,
procediendo a la incineracin, siguiendo la siguiente rampa de
temperaturas:

- Subida a 180
o
C, 45 minutos.
- Subida a 280
o
C, 45 minutos.
- Subida a 380
o
C, 45 minutos.
- Subida a 480
o
C, 2 horas.

Una vez finalizada la incineracin, se dejaron enfriar las muestras en el
horno durante 24 horas.
A continuacin, se redisolvieron las cenizas, se humedecieron las
muestras contenidas en los crisoles con agua MilliQ y, seguidamente, se les
aadi 6 gotas de agua MilliQ, y HCl suprapur (volumen aadido en funcin
del peso de la muestra). Se taparon los crisoles con vidrio de reloj y se
calentaron sobre placa a 80
o
C durante 30 minutos. Al terminar este proceso,
y una vez enfriadas las muestras, se filtraron las mismas con un filtro exento
de cenizas y se enrasaron con agua milliQ (el enrase depender del peso de
muestra vegetal que se tenga, enrasndose a 10 mL las muestras que
pesaban 0,10 g, a 25 mL las muestras que pesaban 0,25 g y a 50 mL aqullas
que pesaban 0,50 g, respectivamente). La determinacin del Fe total se
realiz mediante AAS.
Aplicacin de la metodologa cientfica para evaluar la eficacia de un quelato frrico de nueva
sntesis en su uso como fertilizante de micronutrientes.
2012

30

A modo de resumen, en la Figura 3.1.2., se adjunta un cronograma del ensayo vegetal, realizado en el ao 2011.

Figura 3.1.2: Cronograma del ensayo vegetal.
Aplicacin de la metodologa cientfica para evaluar la eficacia
de un quelato frrico de nueva sntesis en su uso como
fertilizante de micronutrientes.
2012

31

3.2. Aplicacin foliar del agente quelante en hojas de vid

Para la realizacin de este estudio, se utilizaron 30 vides (Vitis vinfera L. cv.
Tempranillo sobre el portainjerto R-110) en sombrculo durante diez das (6-
15 junio de 2011). El diseo experimental fue de 5 tratamientos con 5
repeticiones por tratamiento, siendo la unidad experimental una cepa en su
segundo ao en un tiesto de 25 dm
3
(Martin et al., 2012). Cada tiesto se rellen
con una mezcla de un sustrato comercial (Universal de PONS
) y grava caliza,
en relacin sustrato:grava 2:1, para alcanzar un pH final de la mezcla de 7,20
(tabla 3.2.1.) (Martin et al., 2012).

Tabla 3.2.1: Propiedades fisicoqumicas del sustrato, de la grava caliza y de la mezcla.

Propiedad Suelo
Densidad (Kg/L) 0,35
pH (H2O, pasta saturada) 5,60
C.E. (extracto 1:5) (dS m
-1
) 0,362

Grava caliza (NH4Ac, cmolc Kg
-1
)

Densidad (kg/L) 1,38
CaCO3 total (g Kg
-1
) 975
Calibre (mm) 2-4

Mezcla sustrato:grava caliza (2:1 v:v)

pH (H2O, extracto 1:5) 7,20
C.E. (extracto 1:5) (dS m
-1
) 0,186

Las cepas se regaron con agua y, ocasionalmente, con una disolucin
nutritiva Hoagland de micronutrientes, a excepcin del in Fe, diluida y con
una disolucin de 0,1g CaCO3/ L y 0,1 g NaHCO3/L, con el fin de mantener
condiciones alcalinas para inducir la clorosis frrica (pH del agua del riego
alrededor de 8,4). (Martin et al., 2012).

2012

32

De estas 30 vides, se seleccionaron aquellas 25 que presentaban
homogeneidad en el crecimiento, y en las que se viera claramente el
crecimiento apical.
El esquema del diseo experimental y la disposicin de las cepas lo
observamos en las figuras 3.2.1. y 3.2.2., respectivamente.

Figura 3.2.1: Esquema del diseo experimental. Disposicin de los tiestos en el sombrculo y
los tratamientos aplicados en cada uno de ellos.

2012

33

Figura 3.2.2: Disposicin de los tiestos en el sombrculo.

Aplicacin de los tratamientos

Se aplicaron los 5 tratamientos con 5 repeticiones/tratamiento. Se prepararon
500 mL de todos los tratamientos, aadindoles un surfactante en concentracin
0,1 % (v/v), concretamente Tween 80
. Este surfactante, como habitualmente se

encuentra en los fertilizantes que se aplican va foliar, se aadi para que el
tratamiento se adhiriese a la superficie de las hojas. Todos ellos, excepto el Control,
se prepararon con una concentracin de 5 mM de Fe. El pH de todos estos
tratamientos se ajust a un valor de 5.0.

Control-Fe: Este tratamiento no contiene Fe, es decir, no administramos
ninguna fuente de Fe exgena.
EDTA/Fe: Este tratamiento se elabor a partir de EDTA-Na2 (Titriplex

III) y Fe (NO3)3, con una concentracin de 0.1371 M.
FeSO4/Fe: Se prepar directamente a partir de la sal de Fe (II) en
condiciones atmosfricas inertes para evitar la oxidacin del Fe (II).
LS/Fe: Se prepar a partir del agente complejante LS (Lignorit

AM),
con una capacidad de complejacin de Fe (III) de 8.6 % de Fe
complejado. En este caso, se le aadi un exceso de Fe del 5% de agente
complejante para evitar la floculacin con el exceso de Fe.
2012

34

QS/Fe: Se prepar a partir del agente quelante QS con riqueza del
18.07%, determinada por mtodo espectrofotomtrico.

Una vez preparados los tratamientos y realizado el diseo del ensayo mediante
la asignacin de los tiestos segn los tratamientos, se procedi a la eleccin de las
hojas utilizadas para el ensayo de la siguiente manera:

- Hoja Tratada. Se eligi de cada uno de los tiestos la hoja sobre la que se
aplic posteriormente el rociado foliar. Para ello, se eligi la tercera hoja
a partir del extremo superior de la parte area. Se verific que dicha
hoja no presentase deformaciones, alteraciones nutricionales o
enfermedad. Si as hubiera ocurrido, o bien se descartara el tiesto y se
seleccionara otro en su lugar, o se elegira, en su caso, la cuarta hoja.
Antes de tratar la hoja, se limpi con agua destilada con ayuda de un
algodn para retirar cualquier depsito que pudiera interferir en la
medida final. Esta hoja se marc con una cinta azul. (Figura 3.2.3.).
- Hoja no Tratada. Se eligi la hoja inmediatamente superior a la hoja
tratada, es decir, la segunda hoja desde la parte superior del pice. Esta
hoja se marc con una cinta roja. (Figura 3.2.3.).

Figura 3.2.3: Disposicin de hojas tratadas y no tratadas.
2012

35

Una vez elegidas las hojas a utilizar para la realizacin del ensayo, y antes de la
aplicacin de los tratamientos, se midi el ndice SPAD en las 25 plantas, tanto en
las hojas tratadas como en las no tratadas, para poder llevar un control de la
evolucin de la clorosis frrica y su correccin mediante la aplicacin de los
tratamientos.

Hecho todo esto, se realiz la aplicacin de los tratamientos de la siguiente
manera:
o La hoja tratada se sumergi completamente en la disolucin de cada
uno de los tratamientos, permaneciendo sumergida durante 30
segundos.
o Se realiz una nica aplicacin de los tratamientos a lo largo del ensayo.

Seguimiento del ensayo

Durante el perodo de duracin del ensayo (10 das) se realizaron las siguientes
determinaciones:

- Sntomas visuales. Se hizo un seguimiento visual cada dos das para
identificar posibles alteraciones visuales y, sobre todo, para controlar el
riego de las plantas. Se reg antes de la aplicacin de los tratamientos y
no volvi a regarse. El riego inicial se llev a cabo aadiendo 2 L de agua
destilada por tiesto, y se midi el pH en el lixiviado de cada tiesto.

- Medida de SPAD. Se estim la concentracin de clorofila en hoja
mediante la medida del ndice SPAD con un equipo Minolta SPAD 502 en
das intermitentes durante los 10 das de duracin del tratamiento,
haciendo la medida tanto en hojas tratadas como en las no tratadas. El
nmero total de das en que se midi el ndice SPAD fue de 5 das.

2012

36

Muestreo final

Pasados los 10 das desde la aplicacin de los tratamientos, se finaliz el ensayo
vegetal. Para ello, se realizaron las siguientes determinaciones:

- Medida del SPAD tal y como se realiz durante el ensayo vegetal.
- Se recogieron las hojas tratadas y no tratadas de cada uno de los tiestos
y se metieron en bolsas de plstico separadas.
- En el laboratorio, se procedi de la siguiente manera:

Se pesaron las hojas tratadas y no tratadas enteras para obtener el
dato de peso fresco.
La hoja no tratada se lav con 90 mL de la disolucin que contena
Tween 80
con HCl 0.01 M durante 10 segundos, otros 10 segundos

en agua de grifo y otros 10 en agua destilada, segn el mtodo de
lvarez-Fernndez et al. (2003). Se pesaron y se metieron en la
estufa durante 72 horas. La hoja tratada se dividi por la mitad y
cada una de las mitades volvi a pesarse, y se denominaron:

Mitad Tween 80
: esta mitad se lav igual que la hoja no

tratada, y se sigui el mismo procedimiento para medir el
Fe en AAS que el seguido para la hoja no tratada. Esta
parte de la hoja se meti en la estufa.

Mitad Triclorometano. La hoja se sumergi en Tween
80

con HCl 0,01 M, al igual que la otra mitad. A
continuacin, se sumergi la hoja en 90 mL de
Triclorometano durante 30 segundos, y posteriores
aclarados de 10 segundos con agua corriente y agua
destilada, respectivamente.
Despus, se meti la hoja igualmente en la estufa.

Se pesaron las hojas despus de tres das en la estufa, para obtener el
dato del peso seco.
2012

37

Se procedi a la digestin de cada una de las hojas de cada uno de los
tratamientos mediante digestin cida microondas con H2O2, y HNO3.
En la solucin resultante, se midi Fe y Mn total en AAS.

Los resultados fueron analizados estadsticamente mediante pruebas t-Student
para muestras relacionadas (p0,05) con el paquete informtico SPSS 18.0. Se
aplic la regla-4D de descarte de rplicas (Harris, D.C., 2004).

2012

38

4. Resultados y discusin

4.1. Ensayo en suelo agronmico.

Observaciones visuales

En las figuras 4.1.1 a 4.1.6 se muestran los sntomas visuales de las diferentes
plantas a lo largo de los diferentes muestreos.

Figura 4.1.1: Vista de las plantas correspondientes al primer muestreo (tras 7 das de
aplicacin de tratamientos) antes del muestreo destructivo.
2012

39

Figura 4.1.2: Vista de las plantas correspondientes al segundo muestreo (tras 21 das de
aplicacin de tratamientos) antes de la realizacin del muestreo destructivo.

2012

40

Figura 4.1.3: Vista de las plantas correspondientes al tercer muestreo (tras 42 das de
aplicacin de tratamientos) antes de la realizacin del muestreo destructivo.

2012

41

Figura 4.1.4.: Vista de las plantas correspondientes al primer muestreo (tras 7 das de
aplicacin de tratamientos) tras la realizacin del muestreo destructivo.

Figura 4.1.5: Vista de las plantas correspondientes al segundo muestreo (tras 21 das de
2012

42

Figura 4.1.6: Vista de las plantas correspondientes al tercer muestreo (tras 42 das de

Atendiendo a las observaciones visuales (Figuras 4.1.1 a 4.1.6.) el
comportamiento de los diferentes tratamientos por muestreo es el que sigue:

- Control: se puede observar cmo la clorosis se acenta con el transcurso
del tiempo. Si se comparan las plantas Control de los diferentes
muestreos, se aprecia ese aumento paulatino de la clorosis.
- QS1/Fe y QS2/Fe: Con respecto a estos tratamientos, se advierte que
existe una ligera mejora en la correccin de la clorosis, aunque no llega a
ser tan eficaz como el o,o-EDDHA/Fe, como se confirmar con los
resultados analticos.

2012

43

- o,o- EDDHA/Fe: Se observa el intenso verdor de las hojas en el primer
muestreo al aplicarse este tratamiento. A medida que transcurre el
tiempo, sigue habiendo una mejora de la clorosis, aunque sta
disminuye con el paso del tiempo. Se advierte que las hojas jvenes
permanecen verdes, siendo las ms viejas las que presentan un
amarilleamiento no debido a la clorosis frrica, sino a senescencia. Esta
observacin es importante a la hora de interpretar los resultados
analticos para ser capaces de diferenciar entre sntomas directamente
imputables a la deficiencia de hierro (y, por lo tanto, objetivo del
presente experimento), de sntomas fisiolgicos no imputables a dicha
deficiencia (y, por lo tanto, fuera del objetivo del presente proyecto).
Por otra parte, el alargamiento de los entrenudos y el reducido nmero de
hojas que presentaban las plantas, hace pensar que stas hayan podido sufrir un
efecto avoidance por falta de luz (Asencio et al., 2009).

Seguimiento de la evolucin de la clorosis mediante el ndice SPAD

Desde el da de aplicacin de los diferentes tratamientos, y con una frecuencia
de 3 veces por semana, se midi el ndice SPAD sobre cada uno de los pisos de cada
planta de cada tratamiento, lo que suponen quince medidas de SPAD por
tratamiento.
Durante la medida del ndice SPAD a lo largo del experimento y para cada uno
de los pisos, se fue observando que, en los primeros pisos de hojas (pisos 2 y 3), se
podan identificar dos procesos totalmente diferenciados (vase figura 4.1.7.). En
los primeros das, puede identificarse el efecto de la aplicacin de tratamientos de
Fe sobre la clorosis frrica; en cambio, en la segunda mitad del experimento, se
observa un amarilleamiento general en dichas hojas, no imputable a una
deficiencia de hierro, sino a un desorden nutricional o un problema fisiolgico de
la planta. Este efecto es muy importante, ya que nos centraremos en comentar
aquellos datos de SPAD que se puedan relacionar directamente con la clorosis
frrica y no con otros desrdenes adicionales. As, los pisos 4 y 5 sern aquellos
que proporcionen una mayor informacin de la evolucin del ndice SPAD a lo
2012

44

largo de todo el experimento ya que, a medida que se va subiendo en los pisos, al
tratarse de hojas nuevas, los datos que se obtienen corresponden ms a la segunda
parte del ensayo y, por lo tanto, no se evala el efecto de los tratamientos de Fe al
inicio del experimento.
En la figura 4.1.7 puede observarse la evolucin de este ndice durante el
transcurso del ensayo en los pisos de hojas 2 a 7 de cada planta. Debido a la
disparidad entre las medias, se ha aplicado la regla estadstica 4D como criterio de
descarte de rplicas (Harris, D.C., 2004).
El o,o-EDDHA/Fe presenta unos valores de SPAD significativamente superiores
a las hojas no tratadas para todos los pisos en estudio. As, para el piso 2, se
observa que dicha diferencia es superior y significativa durante, aproximadamente,
los primeros 12 das desde la aplicacin de tratamientos. Para los pisos 4, 5, 6 y 7,
el tratamiento o,o-EDDHA/Fe presenta valores de SPAD superiores al Control en
los primeros 19, 26, 33 y 35 das, respectivamente. El comportamiento del quelato
de nueva sntesis, independientemente de la formulacin utilizada, indica que, si
bien no existen diferencias con los valores del SPAD del tratamiento Control,
parece que la formulacin QS2/Fe tiende a presentar valores similares al o,o-
EDDHA/Fe para todos los pisos que se evalan. As, los valores de SPAD de las
hojas tratadas con QS2/Fe presentan valores similares al o,o-EDDHA/Fe durante
los primeros 19 das para el piso 4, durante 26 das para el piso 5 y durante 33 das
para el piso 6, mientras que la formulacin QS1/Fe muestra valores de SPAD
significativamente menores a los del o,o-EDDHA/Fe. Estos resultados estn en
lnea con los ya publicados por Lucena, 2009, donde qued demostrada la eficacia
del o,o-EDDHA/Fe para corregir la clorosis frrica.

2012

45

Figura 4.1.7: Evolucin del ndice SPAD en los pisos 2, 3, 4, 5, 6 y 7 desde la aplicacin de tratamientos, y durante todo el ensayo.
2012

46

Otro dato importante que se ha obtenido de los resultados es que todos los
tratamientos donde se ha aplicado Fe (o,o-EDDHA/Fe, QS1/Fe y QS2/Fe)
poseen el piso 11 de hojas, pudiendo haberse realizado la medida de SPAD en
todos ellos hasta el piso 12. En el tratamiento o,o-EDDHA/Fe, concretamente,
pudo medirse este ndice hasta el piso 14, y QS1/Fe y QS2/Fe hasta el piso 13,
mostrando as un mayor desarrollo vegetativo con respecto a las plantas no
tratadas (Control), donde el desarrollo vegetativo se alcanz hasta el piso 10.
Dicha observacin debera reflejarse en el peso seco de las hojas aunque,
debido al pequeo tamao de las mismas puede, dicha diferencia, no
observarse por la variabilidad intratratamientos.

Parmetros biomtricos de las plantas por muestreo

En cada muestro se tom el dato de peso fresco y peso seco de hojas, tallos y
races de cada planta por tratamiento (vanse figuras 4.1.8, 4.1.9 y 4.1.10. para
muestreo 1, muestreo 2 y muestreo 3, respectivamente)

Figura 4.1.8.: Histograma del peso seco de cada uno de los diferentes tejidos vegetales en el primer
muestreo segn el tratamiento aplicado. Diferentes letras indican diferencias significativas cuando se
aplica el test de Duncan con un nivel de significacin de = 0.10.
2012

47

Figura 4.1.9: Histograma del peso seco de cada uno de los diferentes tejidos vegetales en el
segundo muestreo segn el tratamiento aplicado. . Diferentes letras indican diferencias significativas
cuando se aplica el test de Duncan con un nivel de significacin de = 0.10.

Figura 4.1.10: Histograma del peso seco de cada uno de los diferentes tejidos vegetales en el
tercer muestreo segn el tratamiento aplicado Diferentes letras indican diferencias significativas
cuando se aplica el test de Duncan con un nivel de significacin de = 0.10.

En el primer muestreo, puede observarse que existen diferencias
estadsticamente significativas en el valor de peso seco de las hojas
dependiendo del tratamiento, siendo el tratamiento Control el que presenta un
mayor valor de peso seco, principalmente en races. Esto podra explicarse
2012

48

debido a que transcurri poco tiempo entre la aplicacin de tratamientos y el
primer muestreo (7 das tras la aplicacin de los mismos), y los agentes
quelantes no han actuado an en este punto del ensayo. En este primer
muestreo, adems, la planta todava utiliza las reservas de nutrientes de las
semillas, y no puede analizarse el efecto de los tratamientos.
Observando el valor de peso en raz en el primer muestreo, se observan
diferencias estadsticamente significativas entre el Control y el resto de
tratamientos, presentando aqul un mayor valor de peso seco en raz. Esto
podra explicarse debido a que se hubiera producido un engrosamiento de las
zonas subapicales y la aparicin de pelos radicales para aumentar la superficie
de adsorcin (Welkie y Miller, 1993), aumentando as el peso del tejido. Aun
as, el error en el muestreo de races cultivadas sobre suelo agronmico puede
alterar el valor del peso seco de las mismas.
En el segundo muestreo, el tratamiento Control posee valores medios
menores que los del resto de los tratamientos en todos los tejidos, no siendo
significativas en las races. Puede observarse que, entre muestreos, es claro que
el peso seco de las races para el tratamiento Control se ha mantenido, mientras
que para el resto de tratamientos ha aumentado. Posiblemente, si se
compararan los datos poniendo el muestreo como factor en estudio, se
observaran diferencias significativas.
En el caso concreto de las hojas, observamos que los tratamientos QS1/Fe,
QS2/Fe y o,o-EDDHA/Fe presentan diferencias estadsticamente significativas con
respecto al tratamiento Control, lo que indica que, en este segundo muestreo, los
tratamientos estn haciendo efecto, proporcionando un mayor crecimiento
vegetativo de las hojas. Este dato est en lnea con el mayor crecimiento observado
en el apartado de parmetros biomtricos.
En el tercer muestreo, se observa que no existen diferencias estadsticamente
significativas en los valores de peso seco de las hojas y los tallos. Con respecto a las
races, existen diferencias estadsticamente significativas en el tratamiento o,o-
EDDHA/Fe, obtenindose para este tratamiento un valor ms elevado de peso
seco.

2012

49

Toma de hierro por las plantas

Tras la mineralizacin de los tejidos vegetales, se obtuvieron datos de
concentracin de hierro total en planta (Figuras 4.1.11 a 4.1.16). Se han obtenido,
adems, datos de la relacin Fe/Mn (Figura 4.1.17.) como ndice nutricional
(Lucena et al., 1990).

Hierro en hoja

Figura 4.1.11: Concentracin de Fe (mg/Kg de materia seca) media total por tratamientos y por
muestreo en hoja. Diferentes letras indican diferencias significativas cuando se aplica el test de
Duncan con un nivel de significacin de = 0.10.

Atendiendo a estos datos, puede observarse que la concentracin media de Fe
en hoja habiendo aplicado el tratamiento o,o-EDDHA/Fe es significativamente
superior en el muestreo 1 a la del resto de tratamientos. En los siguientes
muestreos, esta concentracin de Fe en hoja disminuye debido, posiblemente a
que, al aumentar la biomasa, el contenido total de Fe aumente (Lucena, 2005).
Respecto a los quelatos QS1/Fe y QS2/Fe se observa que, aunque el contenido
en Fe en el muestreo 2 es significativamente menor para el QS1/Fe respecto al
2012

50

resto de tratamientos, no hay diferencias con respecto al tratamiento Control,
existiendo diferencias con ste, no obstante, al comparar el tratamiento QS2/Fe.

Como se mencion anteriormente, debe tenerse en cuenta el desarrollo
vegetativo de las plantas, y es por eso que resulta interesante observar la cantidad
de hierro por planta en cada tejido vegetal. En la figura 4.1.12, se observa la
cantidad de hierro (mg Fe/planta) en hoja en los diferentes muestreos.

Figura 4.1.12.: Histograma representando los mg de Fe en hoja/ planta.

Se ha visto anteriormente, que utilizando nicamente los datos de mg Fe/kg en
hoja, haba una tendencia generalizada a una disminucin de este micronutriente
en este tejido vegetal. Examinando los datos representados en la figura anterior se
aprecia que, realmente, la concentracin de Fe en este tejido aumenta con el paso
del tiempo (exceptuando el tratamiento Control, que sufre una disminucin en el
tercer muestreo). Esto ocurre as porque que debe tenerse en cuenta que no slo
es importante la concentracin en la hoja, sino que el nmero de hojas (en este
caso representadas mediante el peso seco de las mismas) es tambin importante,
ya que el hierro se reparte por todos los tejidos de la planta y, aunque en principio
pueda pensarse que la concentracin de este micronutriente desciende, lo que
2012

51

realmente ocurre es que est repartido entre todas las hojas que tiene la planta. Se
observa que los valores ms altos corresponden al tratamiento o,o-EDDHA/Fe,
como era de esperar segn otros estudios realizados con este agente quelante
(Lucena, 2009), sobre todo en el muestreo 1.

Hierro en tallo

Figura 4.1.13: Concentracin de Fe (mg/Kg de materia seca) media total por tratamientos y
por muestreo en tallo. Diferentes letras indican diferencias significativas cuando se aplica el test de

Cuando se compara la concentracin de Fe en tallo de los diferentes
tratamientos, se observa que, nuevamente, la mayor concentracin de Fe en este
tejido procede del tratamiento de o,o-EDDHA/Fe durante el primer muestreo,
disminuyendo paulatinamente con el paso del tiempo, al igual que ocurre con el
tratamiento Control. Es posible que la menor presencia de Fe en tallo para el
tratamiento o,o-EDDHA/Fe en el muestreo 2 sea debida a un mayor transporte
hacia las hojas, ya que as lo muestran los datos de SPAD con valores mayores para
dicho tratamiento.
2012

52

Los quelatos evaluados, QS1/Fe y QS2/Fe, no presentan diferencias
estadsticamente significativas con respecto al tratamiento Control en la
concentracin de Fe en tallo.

Figura 4.1.14: Histograma representando los mg de Fe tallo/ planta.

Al igual que ha ocurrido con las hojas, al evaluar los datos de mg de Fe/planta
en el tallo se observa que, realmente, la concentracin de Fe va en aumento
debido al desarrollo vegetativo de la planta, destacando el dato del QS2/Fe, que
en el tercer muestreo la tendencia es a mostrar un valor superior al resto de
tratamientos, incluso mayor que el dato del tratamiento o,o-EDDHA/Fe, aunque
no se ha realizado tratamiento estadstico de estos datos.

2012

53

Hierro en raz

Figura 4.1.15: Concentracin de Fe (mg/Kg de materia seca) media total por tratamientos y por
muestreo en raz. Diferentes letras indican diferencias significativas cuando se aplica el test de

Figura 4.1.16: Histograma representando los mg de Fe raz/ planta.
2012

54

En la raz, la mayor concentracin de Fe se observa en el tratamiento Control,
producindose un descenso en el segundo muestreo y un nuevo ascenso en el
tercero.
En lo que al resto de tratamientos se refiere, hay un aumento de concentracin
de este nutriente en el tercer muestreo en este tejido, exceptuando el QS1/Fe, que
se estabiliza con respecto al segundo muestreo. Pueden haberse producido
problemas de precipitacin de Fe en la raz, alterndose el anlisis de resultados.
Existen diferencias estadsticamente significativas entre todos los tratamientos
con Fe y el Control en el primer muestreo, y entre QS2/Fe y Control en el segundo.
En cuanto al tercer muestreo, se observan diferencias estadsticamente
significativas entre el tratamiento de nueva sntesis QS1/Fe y el tratamiento
Control.
Atendiendo a los datos de mg de Fe en raz/ planta, se aprecia que hay un
aumento generalizado en todos los tratamientos de este nutriente en la raz a lo
largo del experimento, exceptuando el tratamiento QS1/Fe, que sufre una
estabilizacin en el segundo muestreo.

Relacin Fe/Mn

La relacin Fe/Mn constituye un ndice de la adecuada nutricin frrica de
diversos cultivos (Lucena et al., 1990). En este ensayo, se observa que el
tratamiento o,o-EDDHA/Fe presenta una mayor relacin Fe/Mn que el resto de los
tratamientos (ver Figura 4.1.17), excepto en el tercer muestreo, donde los valores
son similares. Esto implica que el tratamiento o,o-EDDHA/Fe es ms efectivo a la
hora de nutrir a la planta con este microelemento, y que acta principalmente
durante la primera etapa del ensayo.
2012

55

Los tratamientos de nueva sntesis evaluados, QS1/Fe y QS2/Fe, presentan
valores similares a los del tratamiento Control. Este resultado muestra que, como
se ha visto en el ndice SPAD, estas nuevas formulaciones de Fe a base de un nuevo
agente quelante sinttico muestran una nutricin frrica inferior a la mostrada al
aplicar el Fe utilizando el tratamiento o,o-EDDHA/Fe. Deben realizarse ms
ensayos vegetales para confirmar dicha tendencia, y ver su eficacia como
correctores de la clorosis frrica.

Figura 4.1.17: Relacin Fe/Mn en hoja (mg/Kg materia seca) por tratamiento y muestreo.
Diferentes letras indican diferencias significativas cuando se aplica el test de Duncan con un
nivel de significacin de = 0.10.

2012

56

4.2. Ensayo de aplicacin foliar.

Seguimiento del ndice SPAD

La evolucin del SPAD (en promedio) en la hoja tratada podemos observarla en
la Figura 4.2.1, y la de la hoja no tratada en la figura 4.2.2:

Figura 4.2.1: Evolucin del ndice SPAD en Hoja Tratada durante los 10 das de duracin del
ensayo desde la aplicacin de tratamientos.

Figura 4.2.2: Evolucin del ndice SPAD en Hoja no Tratada durante los 10 das de duracin del
ensayo desde la aplicacin de tratamientos.
2012

57

En vista de los resultados de SPAD obtenidos, no se observan diferencias
significativas cuando se comparan los valores para cada tratamiento entre
hojas tratadas y no tratadas. De la misma forma, tampoco se han observado
diferencias entre los tratamientos en hoja tratada y no tratada. Debido al
diseo del experimento (con una duracin de 10 das), y teniendo en cuenta
que las cepas no presentaban sntomas visuales de estar afectadas por una
clorosis frrica grave, el hecho de que no existan diferencias resulta esperado.
Parmetros biomtricos de las hojas por tratamiento

Se tomaron, adems, datos de peso fresco y peso seco de las hojas por
tratamiento. Los resultados se presentan en las figuras 4.2.3. y 4.2.4.

Figura 4.2.3: Pesos fresco y seco (g) en la hoja tratada, distinguiendo entre el tratamiento
aplicado y el mtodo de lavado utilizado. Diferentes letras indican diferencias significativas cuando
se aplica el test de Duncan con un nivel de significacin de = 0.10.
2012

58

Figura 4.2.4: Pesos fresco y seco (g) de la hoja no tratada. Diferentes letras indican diferencias
significativas cuando se aplica el test de Duncan con un nivel de significacin de = 0.10.

Atendiendo a los datos estadsticos y a las grficas anteriormente expuestas, se
aprecia que no hay diferencias estadsticamente significativas entre el peso de las
hojas, tanto tratadas como no tratadas. Igualmente, tampoco existen diferencias en
el contenido de humedad de ambas hojas (datos no mostrados).

Concentracin de Fe en hoja

Se han comparado las medias relacionadas para cada uno de los
tratamientos entre la hoja lavada con Tween 80
y la hoja lavada con CHCl3.

Igualmente, se han comparado las medias relacionadas entre la hoja no tratada
(HNT) y la hoja lavada solamente con Tween80
, ya que ambas se lavaron con

el mismo procedimiento.
Se puede concluir que, tal y como se observa en la figura adjunta (Figura 4.2.5.),
cuando se comparan los valores de Fe obtenidos para cada una de las mitades de la
hoja siguiendo un protocolo diferente de lavado:

2012

59

- La concentracin de Fe en las hojas en el tratamiento Control no ha
experimentado diferencias significativas, independientemente del mtodo
de lavado aplicado.
- La concentracin de Fe en la media hoja lavada con Tween 80
tiene una
mayor concentracin de Fe que la media hoja lavada con CHCl3 para los
tratamientos EDTA/Fe, Sulfato/Fe y QS/Fe.
- La concentracin de Fe en la media hoja lavada con Tween 80
tiene una
menor concentracin de Fe que la media hoja lavada con CHCl3 para el
tratamiento LS/Fe.
Cuando se compara la concentracin de Fe entre la hoja no tratada y la media
hoja lavada con Tween se observa que:
- Existe una menor concentracin de Fe en la hoja no tratada que en la media
hoja tratada y lavada con Tween 80
para los tratamientos Control,

EDTA/Fe, Sulfato/Fe y QS/Fe.
- Las hojas no tratadas con LS presentan una concentracin superior que las
hojas tratadas. El comportamiento del tratamiento LS/Fe es dispar e
incoherente con los otros resultados, por lo que queda pendiente realizar
un estudio ms pormenorizado.

Figura 4.2.5.: Concentracin de Fe (mg/Kg materia seca) en las hojas, distinguiendo entre
tratamiento y mtodo de lavado, aplicando un nivel de significacin de = 0.10.
2012

60

Figura 4.2.5: Concentracin de Fe (mg/Kg materia seca) en las hojas, distinguiendo entre tratamiento y mtodo de lavado, aplicando un nivel de significacin de =
0.10.
2012

61

Diferencias entre tratamientos

En este ensayo interesa conocer las diferencias entre los tratamientos a la hora
de proporcionar Fe a la planta. La siguiente figura (Figura 4.2.6) expresa las
medias de cada tratamiento, dependiendo del tipo de lavado utilizado, en mg/Kg
de materia seca.

Figura 4.2.6: Diferencias entre Hoja Tratada y No Tratada, lavadas con Tween80
, en las
plantas Control y en las tratadas con EDTA, Sulfato y QS, as como las diferencias entre Hojas
Tratadas lavadas con Tween80
o con Triclorometano (p0,05). (Fuente: Martin et al., 2012).

Analizando los resultados expuestos en la figura 4.2.6, en trminos de
diferencias entre la concentracin de Fe (mg/kg m.s) en las Hojas Tratadas y Hojas
No Tratadas, se observa que, en prcticamente todos los tratamientos, la
concentracin de Fe en la Hoja no Tratada es significativamente menor que en la
Hoja Tratada, ambas lavadas con Tween 80
, lo que confirma la baja movilidad de

Fe desde tejidos de mayor edad hacia tejidos jvenes (Yunta et al., 2012).
En cuanto a las diferencias entre los tratamientos, se aprecia que los
resultados de concentracin de este micronutriente en hoja dependen del
mtodo de lavado utilizado. As, exceptuando el tratamiento LS/Fe, todas las
hojas que fueron lavadas solamente con Tween 80
presentan ms
Control
0,008**
NS
0
50
100
150
200
250
300
m
g

F
e

/
K
g

m
s
NT-Tween T-Tween T-HCCl3
EDTA
0,003**
0,002**
0
50
100
150
200
250
300
350
m
g

F
e

/
K
g

m
s
S ulfato
0,002** 0,003**
0
500
1000
1500
2000
m
g

F
e

/
K
g

m
s
QS
0,000*** 0,045*
0
100
200
300
400
500
m
g

F
e

/
K
g

m
s
2012

62

concentracin de Fe que aqullas lavadas con Triclorometano, lo que indicara
que hay una acumulacin de Fe inactivo para la planta en la superficie de la
hoja que este agente surfactante no ha podido retirar, y que se considera como
contenido activo de Fe en hoja si se lleva a cabo el procedimiento analtico tras
el lavado con este producto (ver figuras 4.2.6. y 4.2.7.) (Martin et al., 2012). En
cambio, los resultados de concentracin de Fe en hoja al lavar la materia
vegetal con Triclorometano, son significativamente menores debido a que este
compuesto retira mayor cantidad de Fe adsorbido en la superficie foliar o en las
partes creas de la hoja, por lo que la estimacin del contenido foliar de Fe
activo ser ms real (Martin et al., 2012). Se aprecia, adems, que el
tratamiento QS/Fe es el que presenta una menor diferencia en el contenido de
Fe cuando se comparan los dos mtodos de lavado (figura 4.2.6.), lo que
implicara que la tasa de penetracin de Fe hacia las partes activas es mayor
cuando se utiliza este producto, incluso si se compara con el tratamiento
EDTA/Fe, que es uno de los ms utilizados en fertilizacin foliar (Martin et al.,
2012). Este quelato de nueva formulacin presenta mayor concentracin de Fe
en hoja que el EDTA/Fe al lavar nicamente con Tween 80
, lo que podra
deberse tanto a una mayor eficacia del quelato como a una mayor dificultad del
agente surfactante para eliminar los restos del quelato en la superficie foliar
(Martin et al., 2012). Sin embargo, con el lavado con Triclorometano en este
tratamiento muestra que este tipo de lavado retira el 35% del Fe presente en la
Hoja Tratada con QS/Fe, lo que significara que un tercio del Fe total tras el
lavado con Triclorometano correspondera a Fe retenido en la capa crea
superficial de la hoja y, por tanto, a Fe no activo. Aun as, la mitad lavada con
Triclorometano es superior a la que presenta el tratamiento Control, lo que
implica que una parte del Fe aplicado ha sido absorbido eficazmente este
tratamiento, habiendo superado la primera capa crea de la hoja (Martin et al.,
2012). Este resultado est en lnea con el observado por otros autores, donde
parece que algunos quelatos sintticos son capaces de ser absorbidos cuando
se aplican va foliar (Yunta et al., 2012).

2012

63

En lo que al tratamiento Control se refiere, los datos muestran que el tipo de
lavado no afect al contenido de Fe en materia seca, lo que indica que, al no
realizarse un aporte de Fe exgeno en forma foliar, el mtodo de lavado de la hoja
no afecta sobre la distribucin del Fe dentro de la hoja (Martin et al., 2012).
Observando los resultados obtenidos para el Fe-Sulfato, puede apreciarse que
el lavado con Tween80
no se ha realizado correctamente, ya que tan elevada

concentracin (1727 mg Fe/kg m.s), slo podra justificarse mediante la
incapacidad de este agente surfactante para retirar la totalidad de los depsitos de
la sal en la superficie foliar (Figura 3.2.8.). Por otro lado, el posterior lavado con
Triclorometano elimina, aproximadamente, el 80% del Fe-Sulfato presente tras el
lavado con Tween80
(313 mg Fe/kg m.s), pero la naturaleza orgnica de este

agente de limpieza, aunque con cierta polaridad, hace dudar que las diferencias de
contenido en Fe respecto al Control sean realmente debidas nicamente a la
absorcin eficaz de Fe en dicho tratamiento.
Con respecto al tratamiento con Lignosulfonato (LS/Fe), la fertilizacin foliar
presenta un comportamiento diferente al resto de tratamientos. Los resultados
indican que las hojas tratadas con LS/Fe presentaban un menor contenido en Fe
que la Hoja no Tratada, adems de mostrar ambas hojas concentraciones
superiores de Fe a las observadas para el tratamiento Control (figuras 4.2.6.. y
4.2.7.). Este comportamiento solamente podra ser explicado si este tratamiento
fuese capaz de penetrar hasta fracciones fisiolgicamente ms activas,
favoreciendo una mayor tasa de traslocacin de Fe hacia las hojas ms jvenes. Sin
embargo, el hecho de que la fraccin lavada con Triclorometano presente una
concentracin de Fe significativamente mayor que la fraccin lavada slo con
Tween80
muestra la necesidad de llevar a cabo estudios con mayor detenimiento

de la efectividad real de productos fertilizantes (Figuras 4.2.6. y 4.2.7.).

2012

64

Figura 4.2.7: Diferencias entre la hoja Tratada y No Tratada con Fe-LS, lavadas con Tween80
, as
como las diferencias entre Hojas Tratadas lavadas con Tween80
o con Triclorometano (p0,05).

(Fuente: Martin et al., 2012).

Relacin Fe/Mn

Figura 4.2.8: Relacin Fe/Mn en hoja, distinguiendo entre el tipo de lavado utilizado y el
tratamiento aplicado. Diferentes letras indican diferencias significativas cuando se aplica el test
de Duncan con un nivel de significacin de = 0.10.

L S
0,047*
0,006**
0
100
200
300
400
500
600
700
m
g

F
e

/
K
g

m
s
b

2012

65

Atendiendo a los datos estadsticos, destaca la elevada relacin Fe/Mn del
tratamiento sulfato al realizar el lavado con Tween 80 . Esto es debido a, como ya
se ha mencionado anteriormente, la incapacidad de este agente surfactante de
eliminar los residuos de sal que quedan en la hoja.
Las hojas lavadas con Triclorometano no presentan diferencias
estadsticamente significativas con respecto al tratamiento Control en trminos de
relacin Fe/Mn.

5. Conclusiones

5.1. Ensayo en suelo agronmico

- La metodologa cientfica utilizada es adecuada para evaluar la
eficacia agronmica de un fertilizante de micronutrientes a base de
un quelato sinttico de hierro de nueva sntesis, ya que se ha
probado la eficacia de un quelato de nueva sntesis en dos vas de
aplicacin que se utilizan de forma rutinaria.
- Los resultados obtenidos para el tratamiento o,o-EDDHA/Fe estn en
lnea con los ya publicados por otros autores (Lucena, 2009), ya que
su aplicacin produce un aumento de clorofilas en hoja estimado
mediante la medida del ndice SPAD en aquellas hojas no
senescentes, y una mayor concentracin de Fe en todos los tejidos
vegetales.
- Las plantas tratadas con fertilizantes frricos (o,o-EDDHA/Fe,
QS1/Fe y QS2/Fe) han mostrado un mayor desarrollo vegetativo que
las plantas no tratadas (Control), ya que se pudo medir ndice SPAD
hasta el piso 14 en el tratamiento o,o-EDDHA/Fe, y hasta el piso 13
en las plantas tratadas con las nuevas formulaciones (QS1/Fe y
QS2/Fe), mientras que en el tratamiento Control slo pudo realizarse
esta medida hasta el piso 10.
2012

66

- Las nuevas formulaciones no parecen aportar el suficiente Fe a la
planta como para corregir la clorosis frrica a niveles del tratamiento
o,o-EDDHA/Fe. Aunque la formulacin QS2/Fe parece mostrar
valores de SPAD similares a los del o,o-EDDHA/Fe, sin ser diferentes
de los de la otra formulacin ni del tratamiento Control, no parece
afectar sobre la concentracin de Fe en los diferentes rganos de la
planta. Este dato se confirma cundo se analiza la relacin Fe/Mn
como ndice nutricional.
- Con los resultados obtenidos en este trabajo, parece necesario
realizar estudios de interaccin de las nuevas formulaciones con los
diferentes materiales del suelo (minerales de la arcilla, xidos de Fe,
materia orgnica) para evaluar la supuesta reactividad observada
durante este proyecto. Igualmente, sera conveniente comprobar la
eficacia de estos compuestos en condiciones de hidropona, donde
los mecanismos de adsorcin/precipitacin y competencia de un
suelo se encuentran mucho menos pronunciados. Sera til, adems,
comprobar el comportamiento de dichas formulaciones mediante el
uso de modelos tericos con programas de computacin (VMinteq,
PHREEQC, etc.).

5.2. Ensayo en aplicacin foliar

- Los resultados obtenidos para el quelato sinttico de nueva formulacin,
al ser comparados con los obtenidos para el tratamiento Control,
muestran que este tratamiento podra ser utilizado como fertilizante en
aplicacin foliar, puesto que presenta valores superiores al Control.
- La concentracin de Fe en hoja depender del mtodo de lavado
utilizado, puesto que al aplicar un fertilizante va foliar dicha
concentracin se ve afectada. El lavado con Triclorometano retira, en
general, mayor cantidad de Fe no activo de la superficie de la hoja
(Martin et al., 2012).
2012

67

- En cuanto a las diferencias del mtodo de lavado para cada tratamiento,
se aprecia que la mayor diferencia segn el mtodo de lavado se observa
para el tratamiento de Fe-sulfato, donde aproximadamente el 80% del
Fe total en hoja desaparece al lavar las hojas con Tween80 y luego con
Triclorometano, al retirar la primera capa crea de la hoja (Martin et al.,
2012).
- Es necesario realizar estudios que aclaren la idoneidad del mtodo
de lavado en funcin del tipo de fertilizante micronutriente utilizado
y del tipo de cultivo al que se aplican, ya que el mtodo de lavado
afectar de forma significativa al contenido final del micronutriente
en la hoja (Martin et al., 2012).

2012

68

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1

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE MADRID

(lvarez Fernndez et al., 2001) y

al 0.1% en solucin 0.1 M HCl (lvarez-

. Este surfactante, como habitualmente se

con HCl 0.01 M durante 10 segundos, otros 10 segundos

: esta mitad se lav igual que la hoja no

y la hoja lavada con CHCl3.

, ya que ambas se lavaron con

para los tratamientos Control,

o con Triclorometano (p0,05). (Fuente: Martin et al., 2012).

, lo que confirma la baja movilidad de

no se ha realizado correctamente, ya que tan elevada

(313 mg Fe/kg m.s), pero la naturaleza orgnica de este

muestra la necesidad de llevar a cabo estudios con mayor detenimiento

o con Triclorometano (p0,05).

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