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Lacase
/ L de 6
mg/mL
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3
9
5
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A/t V
0
[4MC]
0
/
M
G
r
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p
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I
4.0 950 20 50
5.0 950 20 50
5.5 950 20 50
6.0 950 20 50
7.0 950 20 50
G
r
u
p
o
I
I
950 2 50
950 5 50
950 7 50
950 10 50
950 15 50
950 20 50
G
r
u
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I
I
I
950 2 5 50
950 5 5 50
950 7 5 50
950 10 5 50
4
950 15 5 50
950 20 5 50
G
r
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p
o
I
V
950 2 10 50
950 5 10 50
950 7 10 50
950 10 10 50
950 15 10 50
950 20 10 50
G
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u
p
o
V
950 2 5 50
950 5 5 50
950 7 5 50
950 10 5 50
950 15 5 50
950 20 5 50
G
r
u
p
o
V
I
950 2 10 50
950 5 10 50
950 7 10 50
950 10 10 50
950 15 10 50
950 20 10 50
1. No laboratrio, pipetar para uma cuvette de espectrofotmetro de 1mL, 950L do tampo
respectivo. Repetir para tantas cuvettes quanto for indicado.
2. Adicionar o volume indicado na tabela de 4MC, c. saliclico e/ou c. benzico.
3. Tapar com Parafilm e homogeneizar por inverso. Retirar o Parafilm.
4. Levar o suporte com as cuvettes para junto do Espectrofotmetro.
5. Uma a uma, executar as cinticas. Colocar cada cuvette no espectrofotmetro e iniciar a cintica
adicionando, o mais rapidamente possvel, 50L de soluo de enzima. Agitar e iniciar a reaco.
Deixar correr durante 30 segundos. Anotar o valor de A/t.
Tratamento de resultados:
1. Transformar todos os valores de A/t em v
0
e terminar de preencher a tabela.
2. Construir os grficos em papel milimtrico:
3. v
0
vs pH
4. v
0
vs [4MC]
0
, sem inibidores
5. v
0
vs [4MC]
0
, com cido saliclico
6. v
0
vs [4MC]
0
, com cido benzico
7. Construir tabela com 1/v
0
e 1/[4MC]
0
, nas condies todas exceto os diferentes pH
8. Construir os grficos de Lineweaver Burk (9, 10, 11) em papel milimtrico. Determinar V
max
e K
M
. Determinar k
cat
.
9. 1/v
0
vs 1/[4MC]
0
, sem inibidores
5
10. 1/v
0
vs 1/[4MC]
0
, com cido saliclico
11. 1/v
0
vs 1/[4MC]
0
, com cido benzico
Anlise de resultados
Qual o melhor pH
Que tipo de inibidores se trata?
Qual o melhor inibidor?
BIBLIOGRAFIA
Goncalves M.L.S. (1983). Mtodos instrumentais para anlise de solues- Anlise
Quantitativa. Fundao Calouste Gulbenkian. Lisboa.
Mayer AM (1987). Polyphenoloxidases in plants - Recent progress. Phytochem. 26, 11-20.
Mayer AM e Harel E (1979). Polyphenoloxidases in plants. Phytochem. 18, 193-211.
Pombeiro, A.J.L.O. (1980). Tcnicas e Operaes Unitrias em Qumica Laboratorial.
Fundao Calouste Gulbenkian. Lisboa.
Reinhammar B e Malmstrom BG (1981). Blue copper-containing oxidases In Copper
proteins. pp 109-147. Spiro TG (ed), Wiley Interscience, New York.