Cromatografia

La cromatografa puede definirse como una tcnica que separa una mezcla de
solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se
establece al ser arrastrados por una fase mvil (lquida o gaseosa) a travs de un lecho
cromatogrfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser lquida o slida Las
propiedades de los componentes de una mezcla determinan su movilidad entre s ! con
respecto a la fase mvil La base de la separacin cromatogrfica ser, por tanto, la
diferencia en la migracin de los mismos
Clasificacin de la Cromatografa
"#isten muchas maneras de clasificar los mtodos cromatogrficos, seg$n su fase
mvil se clasifica en Cromatografa de gases que puede ser a travs de dos sistemas,
gas% lquido ! gas%slido ! Cromatografa lquida donde el eluente es un lquido ! puede
ser lquido%liquido, liquido%slido &or el mecanismo de retencin%separacin, es decir el
tipo de equilibrio implicado en la transferencia de los solutos entre las fases se
encuentra la Cromatografa de reparto, de adsorcin ! de e#clusin 'eg$n la forma de
contacto entre las fases se denomina de columna o superficie plana (ambin se puede
clasificar teniendo en cuenta la fase estacionaria, la dimensionalidad, escala fsica !
gradientes
Cromatografa en capa fina
&or este mtodo se pueden analizar mezclas de aminocidos La muestra para
anlisis se aplica por medio de un tubo capilar en la superficie de una capa fina
adsorbente en forma de banda, punto o mancha ! es adsorbida en la superficie por la
accin de fuerzas electrostticas ()uerzas de *an der +aals, puentes de hidrogeno,
efectos inductivos, etc) Los adsorbentes ms utilizados son gel de silica, alumina,
tierra silcea, celulosa ! poliamidas Como soportes del adsorbente se utilizan laminas o
placas de vidrio, plsticas o metlicas, algunas placas tienen indicador de
fluorescencia , f-./ f011
La placa seca se coloca en el tanque cromatogrfico o cmara, en el cual debe
encontrarse saturado el eluente ()ase 2vil lquida)"l eluente ascender o desplazara
por capilaridad en la placa ! arrastrar los componentes a lo largo de sta produciendo
3manchas4 que representan a los componentes, la separacin se da por migracin
diferencial, es decir que la fase mvil arrastra a las substancias apolares ! aquellas ms
polares son retenidas por la fase estacionaria dando lugar a la separacin
&osteriormente se evapora el eluente ! la placa se analiza por medio de mtodos
qumicos en el que por inmersin o rociado se obtienen derivados coloreados o
fluorescentes (5dicin de 6inhidrina a aminas, 7cido sulf$rico para carbonizar
compuestos orgnicos, etc), o por medio de mtodos fsicos pticos utilizando radiacin
8* o luz visible
Cromatografa en papel
"l proceso es bsicamente el mismo, solo que se usan tiras de papel cromatogrfico
en el tanque cromatogrfico
Cromatografa en Columna
'e utilizan columnas de vidrio rellenas de 5l$mina (5l-90), 'lica u 9#ido de
2agnesio La fase estacionaria esta constituida por un slido poroso, el cual queda
soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en plstico o vidrio La
fase mvil se encuentra formada por la solucin que lentamente va atravesando la fase
estacionaria La solucin que sale al final de la columna se reemplaza constantemente
por nueva solucin que se suministra desde un contenedor por la parte superior de la
columna
Cromatografa de gases
'e utiliza para la separacin de sustancias gaseosas La )ase 2vil es un :as
(llamado :as &ortador) ! la )ase "stacionaria puede ser un slido (Cromatografa :as%
'lido) o una &elcula de lquido de alto punto de ebullicin (:eneralmente &olietiln%
:licol o 'ilicn) recubriendo un slido inerte (Cromatografa :as%Lquido) "l
cromatgrafo de gases esta constituido normalmente por un suministro ! una entrada
del gas portador, un puerto de in!eccin, una columna normalmente localizada en el
interior de una cmara termostatizada (horno), un detector ! un sistema computarizado
para analizar, registrar e imprimir el cromatgrama
La muestra se introduce a travs del sistema de in!eccin dentro de la columna que
es el sitio donde ocurre la separacin La columna de aluminio, acero ino#idable, vidrio
o tefln contiene la fase estacionaria slida o lquida ! esta su;eta a la superficie por un
soporte que es generalmente de slice La fase mvil o gas portador transporta los
componentes de la muestra a travs de la columna, por esta razn debe ser inerte para
evitar interacciones con la muestra o la fase estacionaria, ! ser capaz de minimizar la
difusin gaseosa 5l final de la columna e#iste el detector que permite la deteccin !
cuantificacin de las sustancias, midiendo conductividad trmica ! electronegatividad
de las sustancias eludas
Cromatografa Liquida de alta eficiencia o rendimiento (<&LC)
"s una Cromatografa de alta presin es decir se aplica el flu;o a presin (entre =.>>
a -->> psi) "l tama?o de partcula es entre 0 ! => micras, la longitud de la columna es
entre . ! -. cm ! requiere de equipo sofisticado 'e pueden analizar muestras
proteicas La reduccin del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la
columna, limita el ensanchamiento por difusin de las bandas, aumentando por tanto la
resolucin
"l sistema <&LC requiere una mezcladora de solventes, un in!ector, ! una bomba
que in!ecte el lquido a la columna :eneralmente las columnas de slica requieren alta
presin para que el flu;o de lquido sea adecuado, la mezcladora se requiere para variar
la proporcin de solvente en la fase mvil ! el in!ector permite la aplicacin de la
muestra 5 la salida de la columna se coloca un detector generalmente de absorcin
ultravioleta o de fluorescencia ! si se desea recuperar las molculas que elu!en de la
columna, se requiere un colector
Cromatografa por &ermeabilidad en :el
"s $til para la separacin de protenas La Cromatografa de e#clusin molecular,
tambin llamada de filtracin en gel, separa en funcin de su tama?o La matriz de la
columna esta formada por un polmero entrecruzado con poros de tama?os
determinados Las protenas de ma!or tama?o migran ms deprisa a lo largo de la
columna que las de peque?o tama?o, debido a que son demasiado grandes para
introducirse en los poros de las bolas de polmero ! por tanto siguen una ruta ms corta
! directa a lo largo de la longitud de la columna Las protenas de menor tama?o, entran
en los poros ! su marcha a lo largo de la columna es ms lenta
Cromatografa de 5finidad
La Cromatografa de 5finidad permite la separacin de mezclas proteicas por su
afinidad o capacidad de unin a un determinado ligando "n este caso, las protenas
que se retienen en la columna son aquellas que se unen especficamente a un ligando
que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna @espus de
que las protenas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a travs de la
columna, la protena de inters que ha quedado retenida en la columna se elu!e o libera
mediante el empleo de una solucin que contiene bien ligando libre u otro compuesto
que rompa la interaccin entre el ligando ! la protena