UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA

FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFIA

DEPARTAMENTO BIOQUIMICA, BIOLOGIA MOLECULAR & FARMACOLOGIA
SECCION BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR
PRACTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA
ENZIMOLOGIA: INHIBIDORES Y EFECTO DE pH
I. OBJETIVOS:
Medir el efecto de los cambios de pH sobre la actividad enzimtica utilizando la
enzima pirazinamidasa
Ver el efecto de dos inhibidores sobre la actividad enzimtica de la pirazinamidasa
II. FUNDAMENTOS
Recordar lo visto en la prctica anterior: la importancia de una enzima como la
pirazinamida en el metabolismo de bacterias como Mycobacterium tuberculosis
Diversas protenas forman complejos con metales, en particular con metales
divalentes como Ca
!
, M"
!
, Co
!
, o #n
!
$ %a presencia de estos metales es
fundamental para su actividad enzimtica &a 'ue les permite ad'uirir su conformaci(n
activa, o forma complejos con sus sustratos para facilitar la catlisis$
)*isten compuestos 'ue pueden +secuestrar, iones divalentes, los as llamados
compuestos 'uelantes$ -n ejemplo de estos es el )D./ 0/cido etilen diamino
tetrac1tico2 el cual se une a los metales divalentes e impidiendo 'ue ellos se unan a la
enzima$
3tros compuestos pueden tener una estructura 'umica semejante al sustrato natural
de la enzima & de este modo pueden entrar en el centro activo o sitio de uni(n del
li"ando, desplazando al sustrato e inhibiendo la reacci(n$
III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA EFECTO DEL pH
4ara medir el efecto del pH sobre la actividad de la pirazinamidasa
emplearemos buffer fosfato en un ran"o de pH de 5 a 6$7 a fin de hallar a'uel pHen
conde la enzima ten"a su valor de actividad ms alto8 es decir, se encuentre a su pH
(ptimo$
M/.)R9/%)::
;uffer fosfato 7$< M, pH 5$78 5$58 =$78 =$58 >$78 >$58 6$78 6$5
)nzima: pirazinamidasa: concentraci(n !57 M
:ustrato: soluci(n de trabajo: <77 mM pirazinamida
:ulfato de amonio ferroso: !7? 4@V en a"ua 0preparado fresco2
;uffer "licina 7$<M, pH A$B
Prcticas de Laboratorio de Bioqumica-2006 Bioqumica y Biologa Molecular-FCF-UPCH
<
4ara c! pH del buffer fosfato preparar dos tubos:
B"##$% H&O E'()* PZA SAF G+,
;lanco 57 l B7 l 7 <7 l 9ncubar !
min a .Camb
<7 l 6D7 l
Muestra 57 l A7 l <7 l <7 l <7 l 6D7 l
E.odos los volFmenes estn dados en microlitros
<$ Cul es la concentraci(n final de enzima & sustrato 'ue e*iste en cada tubo
!$ %eer la absorbancia de los tubos vs$ a"ua a B57 nm$
A$ Calcular la actividad enzimtica de cada tubo de la misma manera 'ue lo hizo en la
prctica de cin1tica enzimtica
MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA EFECTO DE EDTA y NAD
M/.)R9/%)::
<$ ;uffer fosfato 7$< M, pH =$5
!$ :ustrato: soluci(n de trabajo: <77 mM pirazinamida
A$ )nzima: pirazinamidasa: concentraci(n !57 M
B$ )nzima: pirazinamidasa preGincubada con )D./8 concentraci(n de enzima !57
mM8H)D./I J B7 mM 0toda la noche2
5$ K/D: <77 mM en buffer fosfato pH =$5
=$ :ulfato de amonio ferroso: !7? 4@V en a"ua 0preparado fresco2
>$ ;uffer "licina 7$<M, pH A$B
4repara los si"uientes tubos:
B"##$% H&O E'()*
#%$-c
E'()* p%$.
)'c"/!
NAD
011 *M
PZA SAF G+,
< 57 l B7 l 7 7 <7 l 9ncubar !
min a
.Camb
<7 l 6D7 l
! 57 l A7 l <7 <7 l <7 l 6D7 l
A 57 l A7 7 <7 <7 l <7 l 6D7 l
<7 l 6D7 l
B 57 l <7 7 5 l <7 l <7 l 6D7 l
5 57 l <7 <5 l <7 l <7 l 6D7 l
E.odos los volFmenes estn dados en microlitros
<$ Cul es la concentraci(n final de K/D 'ue e*iste en los tubos B & 5
!$ %eer la absorbancia de los tubos vs$ a"ua a B57 nm$
A$ Calcular la actividad enzimtica de cada tubo de la misma manera 'ue lo hizo en la
prctica de cin1tica enzimtica
%levar a cabo clculos semejantes a los 'ue realiz( en la prctica de cin1tica
enzimtica a fin de convertir sus valores de absorbancia en velocidad o actividad :
mM@min
Prcticas de Laboratorio de Bioqumica-2006 Bioqumica y Biologa Molecular-FCF-UPCH
!
Recordar 'ue necesita el valor del coeficiente de e*tinci(n molar para el producto de la
reacci(n enzimtica 0cido pirazinoico2
Discutir sobre el efecto del pH sobre la actividad enzimtica8 cul es el pH (ptimo para
la enzima 'ue ha estudiado
Lu1 compuesto produce una ma&or inhibici(n en la enzima$
4re"untas para el informe:
<$ )*iste al"una semejanza estructural entre los inhibidores utilizados & el
sustrato de la enzimaM :i as fuera, podra usted especular 'u1 tipo de
inhibici(n es la 'ue se ha dado a cabo en, al menos, uno de los casosM
!$ Muestre usted ejemplo de dos enzimas cu&a actividad vara con el pH$ Mostrar
"rficas de actividad vs$ pH para estas protenas 0buscar p$ ej$ en 4ubMed:
http:@@NNN$ncbi$nlm$nih$"ov2 e indicar el ori"en de la informaci(n 0referencia
biblio"rfica2$
A$ Lu1 tipo de inhibidor es el )D./ & el K/DM :e puede saber esto a partir de los
resultados obtenidosM :i no es as, 'u1 tipo de ensa&o llevara usted a cabo$
B$ Cul es la especificidad del )D./, 'u1 iones metlicos 'uela preferentemente$
;us'ue otros dos a"entes 'uelantes 'ue se usen en el laboratorio & mencione
su especificidad
Prcticas de Laboratorio de Bioqumica-2006 Bioqumica y Biologa Molecular-FCF-UPCH
A