REA DE BIOLOGA CELULAR

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA AMBIENTAL Y SALUD PBLICA

FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES
UNIVERSIDAD DE HUELVA
Los metales como contaminantes.
1. Conceptos bsicos.
2. Efectos de los metales sobre los seres vivos.
3. Tcnicas citohistolgicas de anlisis de
metales.
4. Factores que afectan a la biodisponiblidad
de los metales.
5. Mecanismos de defensa frente a la
contaminacin por metales.
LOS METALES COMO CONTAMINANTES
EJ EMPLO 1
Ro Guadiamar (marzo, 1999)
Niveles de arsnico
LOS METALES COMO CONTAMINANTES
EJ EMPLO 2
Moluscos que acumulan metales
EJ EMPLO 3
Erica andevalensis
DEFINICIONES PREVIAS
METAL - Elemento qumico caracterizado por una fuerte conductividad
trmica y elctrica, brillo peculiar (metlico), aptitud para ladeformacin
y una marcada tendencia a formar cationes.
METALES PESADOS - grupo de elementos de P.M. 63,5 a 200,6 con
una distribucin electrnica similar en su capa externa (Rainbow, 1993)
Presentes en cantidades pequeas o trazas en el ambiente
Esenciales(activacin de metaloenzimas, protenas de estrs,
transporte de oxgeno, actividades redox, etc.) y no esenciales
Presentes en tejidos biolgicos, tpicamente como cationes
divalentes, libres o ligados a residuos sulfhidrilo, hidroxilo,
carboxilo, imidazol, etc. de protenas, cidos nucleicos, etc.
METALES ESENCIALES Y NO ESENCIALES
Crculos: Elementos biolgicos ms importantes. Cuadrados: Elementos
traza esenciales. Cuadrados punteados: Posibles elementos traza esenciales.
Relacin entre la concentracin de un elemento y
sus efectos fisiolgicos.
EFECTO CONTAMINANTE DE LOS METALES
1. Los metales y metaloides pueden generar
estrs oxidativo
El metal interacta con H
2
O
2
produciendo HO
mediante la reaccin de Fenton. El HO provoca:
8Daos en lpidos de membrana
8Daos en protenas
8Daos en cidos nucleicos
8En general: daos metablicos en el
organismo, que pueden conducirle a la
muerte.
8Estos efectos pueden ser premutagnicos
2. Los metales y metaloides contaminantes
compiten con metales esenciales
8Compiten por los sistemas de transporte,
disminuyendo la concentracin efectiva del
metal esencial
8Activan receptores de membrana
desencadenando reacciones en cadena
8Reemplazan a metales esenciales en
biomolculas, alterando su funcionamiento
8Reaccionan con grupos funcionales de
biomolculas, alterando su funcionamiento
METALES Y EXPRESIN GNICA (1)
Los metales interaccionan con la cromatina
Los metales deben alcanzar el ncleo
En el ncleo, los metales se unen al ADN, a protenas
histnicaso a protenas no histnicas.
Metal
1. Los metales provocan daos en el ADN
El metal interacta con H
2
O
2
produciendo HO mediante la
reaccin de Fenton. El HO provoca:
8Oxidacin de bases o de la desoxirribosa
8Prdida de bases
Formacin de hlices sencillas
Roturas de hlices dobles
Formacin de puentes ADN-protena
Formacin de puentes ADN-ADN
Estos efectos pueden ser premutagnicos
BASES
NITROGENADAS
RADICALES
DE BASES
BASES
NITROGENADAS
ALTERADAS
METALES Y EXPRESIN GNICA (2)
Los metales afectan a la fidelidad de la replicacin
Inhibicin de enzimas requeridas para la replicacin
Inhibicin de la sntesis de nucletidos
Alteracin de los procesos de metilacin del ADN
Alteracin de los componentes del complejo de replicacin del ADN
Los cambios en la secuencia de nucletidos del ADN
pueden modificar la expresin gnica
La expresin gnica tambin puede alterarse mediante
cambios epigenticos (sin cambios en la secuencia del ADN):
METALES Y ESTRS OXIDATIVO
METALES Y CARCINOGNESIS
EFECTO DE METALES: EJEMPLOS (1)
EFECTO DE METALES: EJEMPLOS (2)
EFECTO DE METALES: EJEMPLOS (3)
EFECTO DE METALES: EJEMPLOS (4)
TCNICAS DE DETERMINACIN DE LOS METALES
PROCEDIMIENTOS QUMICOS
Espectrofotometra
Espectrofotometra de absorcin atmica (AAS)
Espectrofotometra de emisin atmica (AES)
Plasma por corriente directa (DCP)
Plasma inductivamente acoplado (ICP)
Plasma inducido por microondas (MIP)
Fluorometraatmica (AF)
Potenciometra
PROCEDIMIENTOS BIOLGICOS
Tejido no fijado
Secciones congeladas
Histoqumica
Autometalografa
Microanlisis por rayos X
Secciones incluidas en resinas hidroflicas
Histoqumica
Autometalografa
Tejido fijado
Secciones incluidas en parafina
Histoqumica
Autometalografa
Secciones incluidas en resinas
Autometalografa
Microanlisis por rayos X
AUTOMETALOGRAFA
DISPONIBILIDAD DE LOS METALES (1)
Disponibilidad de los metales en el ambiente celular
en soluciones acuosas o en sistemas biolgicos
los metales tienden a donar electrones
forman iones cargados o complejos con ligandos
Metales (segn Nieboer y Richardson, 1980)
Clase A
Alta tendencia a formar
compuestos inicos
Cs, K, Na, Li
Ba, Sr, Ca, Mg, Be
La, Gd, Y, Lu, Sc, Al
Borderline
Propiedades intermedias
Cd, Sn, Pb(II), Ti(II), Mn, Fe, V
Cu(II), Co, Zn, Ni
Cr, In, Fe, Ga
Sb, As, Sn
Clase B
Forman complejos con
ligandos
Au, Ag, Ti(I), Cu(I)
Hg, Pd, Pt
Bi, Tl
Pb(IV)
La actividad de un metal depende de
su concentracin y de su especiacin
a
Me
+
= C
Me
+

Me
+
Ejemplo: especiacindel sulfato
de cobre en agua dulce
(Chakoumakoset al., 1979)
CuSO
4
Cu
2
+
+SO
4
2-
DISPONIBILIDAD DE LOS METALES (2)
Factores que afectan a la disponibilidad de un metal
Hidrofobicidad: compuestos organometlicos (eg. Pb, Hg, As)
Potencial redox.
Ejemplo, el Cr
3+
se oxida a Cr
6+
(100-1000 veces ms
txico que el Cr
3+
) en suelos con xidos de manganeso.
pH
Ejemplo, la solubilidad del CuCl
2
y CoCl
2
en suelos se incrementa
rpidamente al disminuir el pH de 8 a 7.
Temperatura
Aumenta la biodisponibilidad y afecta a la fluidez (y por
consiguiente a la permeabilidad) de la membrana
Interacciones inicas
Ejemplo, el CdCl
2
es muy txico en agua salada, ya que el exceso
de Cl
-
desplaza el equilibrio hacia la forma no disociada
Materia orgnica
Generalmente reduce la biodisponibilidad de los metales.
Procesos de solubilizacin
Para aquellos metales con carcter lipoflico, su
biodisponibilidad aumenta en presencia de detergentes (al
formarse micelas).
Mecanismos de incorporacin de los metales en las clulas
Difusin
Difusin facilitada
Transporte activo
Endocitosis y fagocitosis
Destino de los metales en las clulas
Eliminacin
Inertizacinpor unin a ligandos
Acumulacin en compartimentos intracelulares
CONTAMINACIN POR METALES EN PLANTAS (1)
Mecanismos fisiolgicos de tolerancia a los metales en plantas
CONTAMINACIN POR METALES EN PLANTAS (2)
Mecanismos fisiolgicos de tolerancia a los metales en plantas
Fitoquelatinas (FQ):
Las FQ son pptidosde bajo p.m. ricos en cistena.
Las FQ fijan los metales formando enlaces tiol con los residuos
de cistena.
Las FQ no estn codificadas por genes estructurales.
La FQ-sintasa se activa en presencia de metales pesados y se
inactiva en su ausencia.
CONTAMINACIN POR METALES EN ANIMALES (1)
Sistemas implicados en la detoxificacinde metales
1. Sistema de grnulos
2. Metalotionenas
Grnulos:
- Depsitos inorgnicos con membrana.
- Prcticamente universales en el Reino Animal.
- Intra- y extracelulares.
- Clase a: esfricos ( 0,2-3 m), metales asociados con oxgeno de carbonato,
oxalato, fosfato y sulfato. Incorporan metales de clase a y borderline (Mn, Fe, Co,
Zn).
- Clase b, forma irregular (0,2-2 m), metales asociados con ligandos de azufre o
nitrgeno. Incorporan metales de clase b (Cu, Cd, Hg) y algn borderline (Zn).
- Funciones: equilibrios cido-base, almacn de iones, detoxificacinintracelular.
Grnulos del hepatopncreas
del caracol Helix aspersa
Interpretacin de experimentos de doble istopo:
- algunos metales se acumulan en citoplasma
(metalotionenas).
- algunos metales se acumulan en grnulos.
- algunos metales se expulsan de la clula.
CONTAMINACIN POR METALES EN ANIMALES (2)
Metalotionenas (MT): protenas que ligan metales.
Clase I: protenas ricas en cistena, similares a MT de rin
de caballo.
Clase II: protenas ricas en cistena, poco similares a MT de
rin de caballo.
Clase III: pptidosde bajo peso molecular, ricos en cistena,
de plantas y algas
INVESTIGACIN:
ESTRS OXIDATIVO CAUSADO POR
METALES EN Spartina densiflora
0
5
10
15
20
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

i
n

n
m
o
l
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s
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W
P
O
D

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U
/
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F
.
W
.
0
1
2
3
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e
n
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(

g

/

m
g

F
W
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
3.0
3.5
4.0
4.5
Chlorophyl a
Chlorophyl b
Total chorophyls
Carotens
Ratiochol. a/b
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

i
n

n
m
o
l
e
s
/
m
g

o
f

F
W
0
5
10
15
20
25
30
35
Acclimatisation Acclimatisation
Period Period
A A
B B
D D
C C
A
S
C

r
e
d
u
c
e
d
D
H
A
Total Asc Total Asc
Concentration Concentration
POD POD
Activity Activity
Photopigment Photopigment
Concentration Concentration
Spartina densiflora (1)
Aclimatacin de Spartina densiflora
Spartina densiflora (2)
0
5
10
15
20
25
Control
9g/l Fe
18g/l Fe
0 5 10 15 20 25
20
40
60
80
0 5 10 15 20 25
20
40
60
80
0
5
10
15
20
25
Control
25g/l salt
40g/l salt
Treatmentperiod
Total Asc Total Asc
concentration concentration
% % of ofreduced reducedAsc Asc
SaltTreatments Irontreatments
Days Daysof oftreatment treatment
A A
C C
D D
B B
Estrs salino o frrico en Spartina densiflora (1)
0 5 10 15 20 25
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
control
25 g/l salt
40 g/l salt
0 5 10 15 20 25
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
control
9 g/l Fe
18 g/l Fe
Salttreatments Irontreatments
Days Daysof oftreatment treatment
0 5 10 15 20 25
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Control
25g/l salt
40g/l salt
0 5 10 15 20 25
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Control
9g/l Fe
18g/l Fe
Concentration Concentrationof of
chlorophyll chlorophyll
Iron
treatments
Salt
treatments
POD POD activity activity
Spartina densiflora (3)
Estrs salino o frrico en Spartina densiflora (2)
CONCLUSIONES DE LOS ESTUDIOS EN
Spartina densiflora (Martnez D., De las Heras M.A.,
Navarro F., Torronteras R. y Crdoba F. 2004)
El medio donde se desarrolla S.densiflora es
estresante, por contener concentraciones excesivas
y variables de sal, metales, etc.
Su aclimatacin a condiciones controladas de
laboratorio, en ausencia de agentes contaminantes,
disminuye el estrs, lo que se manifiesta por la
disminucin de la sntesis de cido ascrbico, el
aumento del ascorbato reducido, la disminucin de
actividad peroxidasa, y el incremento en la sntesis
de clorofilas.
Cuando la planta se somete en condiciones
controladas de laboratorio a exceso de sal o de
hierro (agentes estresantes), la planta responde
rpidamente, activando su sistema defensivo
antioxidante, aunque se observan daos como, por
ejemplo, una disminucin de la concentracin de
clorofilas.
INVESTIGACIN:
CADMIO EN EL CARACOL
COMN (Helix pomatia) y LA TRUCHA
ALPINA (Salvelinus alpinus)
Helix pomatia (1)
Estudios de acumulacin de cadmio en el caracol (Helix pomatia)
Acumulacin de Cd en diferentes
rganos de H.pomatia.
Se aadi Cddurante 32 das (hasta
la flecha).
Fraccionamiento de
MT que ligan Cd en la
glndula digestiva.
Arriba: absorbancia
254 nm(protenas).
Abajo: contenido de
Cd.
Helix pomatia (2)
Inducibilidad de la Mt-
Cd en H.pomatia.
La barra negra en abcisas
indica el periodo de dieta
rica en Cd.
Arriba: concentracin de
MT.
Abajo: Porcentaje de
saturacin de Mt por Cd.
Salvelinus alpinus (1)
Estudios de acumulacin de cadmio en la trucha alpina
(Salvelinus alpinus)
Fraccionamiento de MT
Patrn estacional de Mt-Cd en
hgado. Se compara una zona
contaminada (Schwarzsee) y una
no contaminada (Thaur)
Correlacin negativa entre la
concentracin de Mt y la
alcalinidad de los lagos alpinos.
Arriba: Mt y saturacin por Cd.
Abajo: nivel de alcalinidad.
Salvelinus alpinus (2)
Fraccionamiento de Mt en hgado (izquierda) y rin (derecha) de
trucha alpina.
Arriba: protena. Abajo: concentracin de Cdy Cu.
Correlacin lineal entre la
edad de la trucha y la
concentracin de Cd en
rin de truchas
contaminadas.
METALOTIONENAS. CONCLUSIONES DE
LOS ESTUDIOS EN CARACOL Y TRUCHA
ALPINA (Dallinger, 1995).
En el caracol...
Existe una Mt especfica responsable de la
acumulacin de Cd en la glndula digestiva.
Es un mecanismo a largo plazo de detoxificacin
de Cd.
Existen otras protenas que ligan Cu o Zn. Esto
permite a los animales acumular mucho Cd sin
afectar a la regulacin de elementos esenciales.
En la trucha alpina...
Existen varias Mt que acumulan Cd, aunque
inespecficamente porque tambin acumulan Cu o
Zn.
La acumulacin de Cd interfiere con la regulacin
de elementos esenciales.
La solucin al problema anterior se logra
aumentando la concentracin de Mt en hgado o
incrementando la carga de Cd en isorformas de Mt
en rin.
El rin es el lugar de almacenamiento a largo
plazo de Cd; el hgado o las branquias son
almacenamientos temporales.
La acumulacin en rin produce daos a largo
plazo, por lo que la acumulacin de Cd no es un
mecanismo verdadero de detoxificacin.