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Mtodos para el estudio de hormonas
Eva Siles Rivas
Universidad de Jan
Departamento de Biologa y Experimental
(2007)
Extrado el 03 Marzo, 2014 del Sitio Web: http://
www4.ujaen.es/~esiles/ENDOCRTema6.pdf
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Tema 6: MTODOS PARA EL ESTUDIO DE HORMONAS
6.1. Radioinmunoanlisis.
6.2. Enzimoinmunoanlisis.
6.3. Fluoroenzimoinmunoanlisis.
6.4. Quimioluminoinmunoanlisis.

INTRODUCCIN

Para la determinacin de hormonas y sus metabolitos pueden utilizarse diversos
mtodos: qumicos, espectrofotomtricos, cromatogrficos.
Los ms utilizados son las tcnicas inmunoqumicas: radioinmunoanlisis (RIA),
enzimoinmunoanlisis (EIA), fluoroinmunoanlisis (FIA) y
quimioluminoinmunoanlisis.

6.1. RADIOINMUNOANLISIS

Es una tcnica inmunolgica propuesta en 1959 por Yallow y Berson, que tiene una
gran aplicacin en clnica.
Permite la cuantificacin exacta de compuestos biolgicos presentes en el organismo
en concentraciones tan bajas como ng/ml (nanogramo=10
-9
g) o incluso de pg/ml
(picogramo=10
-12
g), incluso hacerlo en mezclas con enormes cantidades y
diversidad de materiales extraos, por lo que no es necesario purificar previamente
la muestra.

Fundamento:

El radioinmunoanlisis se basa en una reaccin antgeno-anticuerpo.
Los anticuerpos deben ser especficos contra la substancia que queremos
determinar, y tener una gran afinidad.
La cantidad de anticuerpo aadida al anlisis es limitada, e inferior a la cantidad de
antgeno total. Por lo que va a quedar saturado con l.
El antgeno es la hormona (de la muestra) que queremos determinar, (antgeno
fro).
Adems del antgeno (hormona) presente en la muestra problema, se va a aadir
una cantidad constante y conocida de antgeno pero marcado (antgeno caliente).
Los antgenos marcados se forman sustituyendo algunos de los tomos normales del
antgeno por los correspondientes istopos radiactivos (H
3
=tritio, P
32
), o
introduciendo radioistopos extraos en la molcula (yodo=I
125
unido a un resto de
TYR).
Los dos tipos de antgenos, fro y caliente, van a competir, en igualdad de
condiciones, por unirse con el anticuerpo disponible.
Las concentraciones del antgeno marcado y del anticuerpo son constantes, la nica
variable del sistema es la concentracin de antgeno no marcado (muestra
problema).
Cuanto mayor sea la cantidad de antgeno fro en la muestra problema, este
desplazar al antgeno caliente y por tanto se fijarn al anticuerpo cantidades
menores de antgeno marcado.
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As pues, la formacin de complejos radiactivos (Ag*-Ac) vara en funcin de la
concentracin del antgeno no marcado: a mayor concentracin de antgeno no
marcado, mayor formacin de complejos antgeno-anticuerpo no marcados, y menor
formacin de complejos radiactivos, y viceversa.

Separacin de las fases ligada y no ligada
Tras la reaccin antgeno-anticuerpo, en el tubo de reaccin encontraremos:

las fracciones libres, constituidas por antgeno fro y antgeno marcado
las fracciones ligadas formadas por complejos antgeno-anticuerpo y antgeno
marcado-anticuerpo.

Sin embargo, la radiactividad total en el tubo permanece constante antes y despus
de la reaccin, por lo que hay que separar la fase ligada de la no ligada y contar la
radiactividad en una de ellas, sin interferencia de la otra.

Hay diferentes mtodos de separacin estn basados en las distintas propiedades del
antgeno libre y del complejo antgeno-anticuerpo:

Adsorcin: Con carbn activo, dextrano o resinas. Adsorben (se unen)
especficamente la fase libre (antgenos fro y caliente) pero no se unen a los
complejos antgeno-anticuerpo que quedaran en solucin. Tras centrifugacin,
el carbn sedimenta en el fondo del tubo con la fase no ligada mientras que la
fase ligada queda en el sobrenadante, que se aspira o decanta. Este mtodo
se utiliza cada vez menos.
Precipitacin qumica: Hay substancias como el etanol, el propilenglicol o el
sulfato amnico que alteran la solubilidad de las protenas provocando su
precipitacin. Precipitan los complejos ligados. Tras centrifugacin, quedan
los complejos ligados en el sedimento y la fraccin libre en el sobrenadante,
que se elimina por aspiracin o decantacin.

Precipitacin inmunolgica: Se utiliza un segundo anticuerpo contra el
anticuerpo del sistema. La unin del segundo anticuerpo al complejo antgeno-
anticuerpo da lugar a un complejo de gran tamao, en general insoluble y
fcilmente precipitable. Tras incubacin y centrifugacin, la fase libre queda en
el sobrenadante y se separa por aspiracin o decantacin. Este mtodo es
muy utilizado en RIA.

Fase slida: Consiste en inmovilizar al anticuerpo a un soporte slido, que
puede ser la propia pared del tubo, bolitas de vidrio, partculas de Sephadex

(polmero). La separacin se consigue simplemente aspirando el medio de
incubacin. Este mtodo tiende cada vez ms a utilizarse por ser sencillo,
prctico, ms corto y requiere menos manipulacin, e incluso permite su
automatizacin.

Una vez separadas las fases, normalmente, se lee la radiactividad de la fase ligada
utilizando un contador gamma (), si el istopo utilizado para el marcaje es I
125
, o un
contador beta () en el caso de haber marcado con tritio (
3
H). Un contador de
centelleo no detecta directamente la presencia de un radioistopo sino que la
muestra radiactiva se halla dispersa en el centelleador. El centelleador es un lquido
(lquido de centelleo) con propiedades fluorescentes. Como consecuencia de las
desintegraciones radiactivas se excitan las molculas del lquido de centelleo y
emiten fluorescencia que es detectada en el contador.
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Construccin de la curva patrn
Para poder relacionar los valores de radiactividad obtenidos con la concentracin de
hormonas, hay con construir una curva patrn que relacione estos parmetros.

La curva patrn se prepara al mismo tiempo que el anlisis de las muestras
problema, aplicando la tcnica a una serie de tubos que contienen cantidades
conocidas de la hormona a determinar (antgeno no marcado patrn) y las mismas
cantidades de antgeno marcado y de anticuerpo que se usan en el anlisis:

En el primer tubo no hay antgeno no marcado, por lo que todos los centros de
unin del anticuerpo sern ocupados por el antgeno marcado. A este punto de
mxima unin del antgeno marcado se llama B
0
o B
mx
, que representa la
radiactividad mxima que se puede unir.
Los siguientes tubos tienen concentraciones conocidas cada vez mayores de
hormona, a mayor concentracin de antgeno no marcado menor formacin de
complejos antgeno marcado-anticuerpo, ya que ambos antgenos compiten
por unirse al anticuerpo.

Los resultados obtenidos nos permiten construir una curva patrn representando
grficamente la radioactividad obtenida ( el % sobre Bo) en estos tubos (eje de
ordenadas, eje Y).frente a las concentraciones conocidas de antgeno no marcado
contenida en cada uno de los tubos (eje de abscisas, eje X).

Ejemplo de curva patrn: (100 de Ag*)

Ag frio %Ac-
Ag*
25 80 %
50 67 %
100 50 %
200 33 %
400 20 %
700 13 %
900 10 %
1900 5 %




La concentracin de hormona en las muestras problema se calcula interpolando en
esta curva patrn la medida de radiactividad obtenida para cada tubo problema. La
curva patrn se puede representar grficamente como una recta utilizando un papel
semilogartmico, lo que facilita la lectura de los resultados.

Como en cualquier mtodo analtico, hay una variabilidad experimental debida a
numerosos factores (reactivos, aparatos, operador, etc.) por lo que es frecuente que
todas las determinaciones se hagan por duplicado. Si los resultados obtenidos son
similares, el resultado final se calcular como la media aritmtica de los dos valores.
Tanto los contadores beta como gamma, en la actualidad, disponen de programas
informticos para cada una de las determinaciones hormonales, por lo que son
capaces de hacer todos los clculos de forma automtica, representar la curva
% Ac-Ag*
Ag fro
100%
50%
1000 500 2000 1500
% Ac-Ag*
Ag fro
100%
50%
1000 500 2000 1500
4
patrn, y leer en ella los problemas, mostrando directamente los resultados finales
del anlisis.


ENZIMOINMUNOANLISIS (EIA)

Son tcnicas inmunoqumicas cuantitativas basadas en reacciones antgeno-
anticuerpo como en el RIA, y siguiendo un protocolo experimental similar. La
diferencia consiste en que, en este caso, el marcaje se hace con un enzima en
vez de con un istopo radiactivo.

Se puede marcar tanto el antgeno como el anticuerpo (hay distintas estrategias).

La cuantificacin se hace, por tanto, basndose en la medida de la actividad del
enzima marcador.

Tras la formacin del complejo antgeno-anticuerpo, en el momento adecuado, se
aade un sustrato que es catalizado por el enzima transformndose en un
compuesto coloreado lo que permite la medida de la actividad enzimtica con ayuda
de un espectrofotmetro. Esta medida de la actividad nos servir para calcular la
concentracin de la molcula problema.

Al igual que en el cado del radioinmunoanlisis es necesario elaborar una curva
patrn.

Con objeto de aumentar la sensibilidad de este anlisis es frecuente utilizar el
sistema biotina-streptavidina, que acta como mecanismo multiplicador. As, por
ejemplo, el anticuerpo est unido a varias molculas de biotina (vitamina). Cada
molcula de biotina se une especficamente a varias molculas de estreptavidina
(similar a la avidina de huevo, pero de origen bacteriano y mayor afinidad). El
enzima est unido a la streptavidina. De esta forma se consigue un efecto
multiplicador de la seal. (Ej. 3 molculas de biotina por anticuerpo x 4 molculas de
streptavidina, cada una con un enzima, se unen a cada molcula de biotina= 12-
enzima en vez de una).

Las tcnicas enzimticas presentan numerosas ventajas respecto al
radioinmunoanlisis (RIA):
no utilizan compuestos radiactivos lo que facilita la manipulacin y evita la
necesidad de instalaciones y licencias especficas)
reactivos de larga duracin
posibilidades de automatizacin (estaciones automticas ELISA)
gran sensibilidad

Los EIA pueden ser de dos tipos: homogneos y heterogneos.
Los ensayos homogneos no requieren lavado o separacin fsica de las
sustancias reaccionantes antes de medir la actividad enzimtica.
Los ensayos heterogneos s necesitan la separacin fsica de los
reaccionantes en las fracciones libre y ligada antes de la determinacin de la
actividad del enzima marcador.

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EIA homogneo
No requiere la separacin de las fracciones ligada y libre resultantes de la reaccin
inmunolgica. Los reactivos necesarios son el anticuerpo y el antgeno marcado con
el enzima.
Fundamento: Se basa en la competencia por el anticuerpo entre la sustancia
problema y la marcada con el enzima.
Cuando el antgeno marcado se une al anticuerpo, este impide el acceso del
sustrato al centro activo del enzima, por lo que anula su actividad.
A mayor concentracin de la molcula problema, menor cantidad de antgeno
marcado se unir al anticuerpo, quedando mayor cantidad de antgeno
marcado libre con el enzima activo dando una mayor actividad. En resumen, a
mayor concentracin mayor actividad, sin necesidad de separar las fracciones.

EIA heterogneo
Requiere la separacin de las fracciones ligada y libre resultantes de la reaccin
inmunolgica. En esta modalidad, los reactivos son el anticuerpo y el antgeno
marcado con el enzima.
Fundamento: El antgeno de la muestra problema y el marcado compiten por el
anticuerpo, de forma que cuanto mayor sea la cantidad de antgeno presente en la
muestra problema, mayor cantidad de antgeno marcado con el enzima quedar sin
unirse al anticuerpo. En este caso la actividad del enzima no se anula por la unin
antgeno-anticuerpo.
Se separan los complejos antgeno (marcado y no marcado)-anticuerpo, se aade el
sustrato del enzima para que se produzca la reaccin enzimtica y se mide su
actividad. La actividad ser inversamente proporcional a la cantidad de antgeno en
la muestra.

ELISA
Hay una variedad del EIA en la que se utiliza una fase slida como mtodo de
separacin, lo que es lo ms habitual, recibe el nombre de ELISA (enzyme linked
immunosorbent assay).

ELI SA tipo sndwich de antgeno
Es la variedad de ELISA ms utilizada y que da mejores resultados.
Reactivos: Anticuerpo monoclonal ligado a la fase slida, anticuerpo monoclonal
marcado con el enzima.
Se usan dos anticuerpos monoclonales diferentes contra determinantes distintos del
mismo antgeno, lo que permite que los dos se puedan unir al antgeno al mismo
tiempo, pero por sitios diferentes.
Los anticuerpos especficos se
encuentran en exceso unidos a la fase
slida (V.g. la pared del tubo de
anlisis), de forma que toda la
hormona presente en la muestra
problema reacciona con ellos quedando
inmovilizada.
A continuacin se lava el tubo para
eliminar el resto de molculas sin
inters (no unidas).
Se aade un exceso de anticuerpos
marcados con el enzima. Estos
anticuerpos tambin se unen al
antgeno del complejo inmovilizado,
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pero por otro determinante antignico diferente.
Tras otro lavado que elimina el exceso de anticuerpo marcado no unido, se aade el
sustrato y se cuantifica la reaccin. La formacin de producto ser directamente
proporcional a la concentracin de antgeno en la muestra.


FLUOROINMUNOANLISIS (FIA)
Esta tcnica sigue un protocolo bsicamente igual al descrito para EIA, con la
diferencia de utilizar como marcador una molcula fluorescente o un sustrato que
por la accin de un enzima se transforma en una molcula fluorescente. La lectura
de fluorescencia es utilizada para el clculo de los resultados en la misma forma que
en RIA.

NOTA: Las molculas fluorescentes son aquellas que al ser excitadas por una radiacin con una longitud
de onda determinada, inmediatamente emiten una radiacin con una longitud de onda mayor que es
medida por un espectrofluormetro. (fluorescencia es distinto que fosforescencia)

QUIMIOLUMINOINMUNOANLISIS

Esta tcnica sigue un protocolo bsicamente igual al descrito para EIA, con la nica
diferencia de utilizar como enzima ligada un enzima (ej. peroxidasa) que cataliza la
oxidacin de un sustrato adecuado (ej. luminol + perxido de hidrgeno). Este
sustrato, al oxidarse, alcanza un estado de excitacin electrnica, y al volver
posteriormente los electrones a sus rbitas primitivas de menor energa, emiten la
diferencia en forma de energa luminosa (=luminiscencia).Esta energa luminosa es
medida en un luminmetro. La lectura de luminiscencia es utilizada para el clculo de
los resultados en la misma forma que en RIA.

Preguntas de revisin
1. Qu reactivos se utilizan para hacer un radioinmunoanlisis?
2. Al realizar un radioinmunoanlisis, por qu es necesario separar las fases
libre y ligada?
3. Cmo realizara una curva patrn?
4. Imagine que est evaluando la concentracin de una hormona por
radioinmunoanlisis y considerando que est detectando nicamente la
radiactividad debida a la fase ligada esperara obtener ms seal en una
muestra con ms o con menos cocentracin de hormona? Justifique su
respuesta.
5. En qu consiste un enzimoinmunoanlisis?
6. Cul es la diferencia entre el enzimoinmunoanlisis homogneo y el
heterogneo?
7. Cul es el fundamento de dicha diferencia?
8. Cuando se realiza un enzimoinmunoanlisis tipo sndwich de antgeno, el
anticuerpo que se utiliza debe estar en exceso o en defecto frente a la
concentracin de antgeno? por qu?
9. Cul es la molcula marcadora en el fluorinmunoanlisis? con qu aparato
se detecta dicha seal?
10. En el quimioluninoinmunoanlisis es muy frecuente utilizar luminol, perxido
de hidrgeno y peroxidasa. Comente el papel que desempea cada uno estos
reactivos.