Lineamientos Tosferina 2012

Prolongacin de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegacin Miguel Hidalgo, C.P.
11340, Mxico, D.F.

Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx

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EPIDEMIOLOGA
InDRE

LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR
LABORATORIO DE
TOS FERINA Y SINDROME COQUELUCHOIDE

InDRE RNLSP
2012

Mxico, DF.

Prolongacin de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegacin Miguel Hidalgo, C.P. 11340, Mxico, D.F.

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EPIDEMIOLOGA
InDRE
SECRETARIA DE SALUD

SALOMN CHERTORIVSKI WOLDENBERG
SECRETARIO DE SALUD

DR. PABLO KURI MORALES
SUBSECRETARIO DE PREVENCIN Y PROMOCIN DE LA SALUD

DR. JESS FELIPE GONZLEZ ROLDN
DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGA

INSTITUTO DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLGICOS

DR. JOS ALBERTO DAZ QUIONEZ
DIRECTOR GENERAL ADJUNTO

DRA. MA. DEL CARMEN GUZMN BRACHO
DIRECTORA DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA

QFB. LUCA HERNNDEZ RIVAS
DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TCNICO

LIC. JESS OMAR CASTILLO HERNNDEZ
SUBDIRECTOR DE OPERACIN

QBP. IRMA HERNNDEZ MONROY
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGA

M EN C IRMA LPEZ MARTNEZ
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGA

QFB. ROBERTO VZQUEZ CAMPUZANO
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIA

QC. ISRAEL PARRA ORTEGA
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGA

DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGA

M EN C JUDITH ESTVEZ RAMREZ
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS

DR. ERNESTO RAMREZ GONZLEZ
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGA MOLECULAR Y
VALIDACIN DE PRUEBAS

Q.B.P. MONICA GUADALUPE VIVEROS TERRAZAS
JEFE DEL LABORATORIO DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS BACTERIANAS
Y PERTUSSIS

Q.B.P. GUADALUPE ADRIANA GALICIA
JEFE DE LABORATORIO DE BACTERIOLOGA MOLECULAR

M EN C. ILIANA ALEJANDRA CORTS ORTIZ
JEFA DEL LABORATORIO DE DIAGNSTICO Y TIPIFICACIN MOLECULAR


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EPIDEMIOLOGA
InDRE

Contenido

1. Introduccin
2. Objetivo General
3. Vigilancia de la Tos ferina y Sndrome coqueluchoide por el laboratorio
4. Situacin Actual y organizacin de la RNLSP para el Diagnstico de la tos ferina
5. Consideraciones generales para el diagnstico por laboratorio de la tos ferina
6. Diagnstico por laboratorio de la tos ferina
7. Uso de la reaccin en cadena de la polimerasa para detectar B. pertussis a partir de muestras
clnicas.
8. Nuevo Algoritmo para el Diagnstico de tos ferina por PCR
9. Anlisis de la informacin
10. Recursos
11. Evaluacin del desempeo
12. Coleccin de cepas
13. Sistema de informacin
14. Referencias
15. Anexos

1. Introduccin


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EPIDEMIOLOGA
InDRE

La tos ferina es una enfermedad con tasas de morbilidad del 90 al 100% en contactos domsticos
que no han sido vacunados, se presenta en cualquier poca del ao especialmente en nios, donde
los lactantes menores de un ao de edad ocupan el 41% de los casos declarados de tos ferina y el
78% de los fallecimientos debido a esta enfermedad. Entre adolescentes y adultos cercanos a casos
de tos ferina el 40 al 80% de los miembros de la familia desarrollan anticuerpos contra B. pertussis y
estos solo el 50% presentan signos y sntomas compatibles con esta enfermedad. En la actualidad se
acepta que adolescentes y adultos sintomticos no diagnosticados, representan una fuente de
transmisin a lactantes y nios, as como un mecanismo de perpetuacin de la enfermedad en la
poblacin en general.

Por otra parte, en estudios realizados en brotes de tos ferina, sugieren que la inmunidad protectora
inducida por la vacuna tiene una duracin determinada, de tal forma que el biolgico elaborado con
la bacteria completa solo ofrece proteccin, aproximadamente durante 12 aos, esto hace necesario
que en las zonas endmicas se mantenga una vigilancia epidemiolgica permanente.
En Mxico, como producto de la aplicacin de la vacuna anti-pertussis, la morbilidad de la tos ferina
ha tenido una baja significativa, as en 1950 la tasa de morbilidad era de 130 por 100,000
habitantes, a 1980 disminuy a menos de 10 por 100,000 habitantes, sin embargo a partir del ao
2008 se ha presentado un notable incremento en el nmero de casos y en este ao se presentaron
162 casos de este padecimiento a nivel nacional con una incidencia global de 0,15 por 100,000
habitantes. Durante el 2009 se confirmaron por laboratorio 185 casos (21%) de 879 estudiados y se
estudiaron un total de 2060 contactos y en 76 (3.8%) se detect la presencia de Bordetella pertussis
y en 2010 se estudiaron un total de 722 casos de los cuales 46 (6.37%) fueron confirmados por el
laboratorio como positivos, de ah la importancia de la bsqueda de portadores que son los que
favorecen la transmisin de esta enfermedad, a pesar de existir, la prevencin a travs de la
vacunacin.

2. Objetivo general


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EPIDEMIOLOGA
InDRE
Establecer las directrices para realizar el diagnstico por laboratorio de la tos ferina y el Sndrome
coqueluchoide a travs de la RNLESP de forma estandarizada, estableciendo los flujos de
informacin adecuados de los datos generados por el laboratorio en apoyo a la vigilancia
epidemiolgica.

3. Vigilancia de la Tos ferina.

La Vigilancia Epidemiolgica de la tos ferina y el Sndrome coqueluchoide consiste en producir y
difundir la informacin generada en el laboratorio, que contribuya a la prevencin y control de estos
padecimientos; mediante el estudio y confirmacin de casos probables o sospechosos as como el
de sus contactos intradomiciliarios,

El principal objetivo es caracterizar la etiologa del sndrome coqueluchoide bacteriana y determinar
la frecuencia con que se presenta Bordetella pertussis y B. parapertusis, como agentes etiolgicos
de este sndrome, y que al encontrar la presencia de estas bacterias deja de llamarse como tal y se
confirma como Tos ferina.

Las actividades a realizar para esta vigilancia son las siguientes:

Anlisis de las muestras de exudado nasofarngeo para la bsqueda de Bordetella
pertussis y B. parapertussis.
( anexo 1).

Envo del 100% de los aislamientos de Bordetella pertussis , B. parapertussis, u otras
especies de Bordetella spp, que se aslen de los casos y sus contactos, al Instituto de
Diagnstico y Referencia Epidemiolgicos que provienen de los diferentes niveles de salud
y de todas las Instituciones que forman parte del sistema Nacional de salud.

Envo del 100% de muestras positivas a Bordetella pertussis, B. parapertussis u otras
especies de Bordetella spp por PCR Tiempo Real (TR) o PCR Punto final (PF) de casos
de Tos ferina y sus contactos para control de calidad al Laboratorio de IRAs bacterianas
del InDRE

Envo del 10% de muestras negativas a Bordetella pertussis, B. parapertussis u otras
especies de Bordetella spp, por PCR TR o PCR PF de casos con Sx coqueluchoide para
control de calidad al Laboratorio de IRAs bacterianas del InDRE.


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EPIDEMIOLOGA
InDRE

Informe de los resultados al epidemilogo de la unidad solicitante del estudio
(dependiendo del nivel).

4. Situacin Actual y organizacin de la RNLSP para el Diagnstico de Tos ferina

La Red para el diagnstico de tos ferina est formada por 26 laboratorios: Aguascalientes, Baja
California, Baja California sur, Chiapas, Chihuahua, Coahuila, Colima, Edo de Mxico, Guanajuato,
Guerrero, Hidalgo, Jalisco, Michoacn, Morelos, Nayarit, Nuevo len, Oaxaca, Puebla, Quertaro,
Quintana roo, San Luis Potos, Sinaloa, Sonora, Tabasco, Tlaxcala, Veracruz, y Zacatecas, los
cuales declaran en su marco analtico que realizan el cultivo para Bordetella pertussis y otras
especies, la mayora de los LESP (83.8%) ya realizan este diagnstico sin embargo, es necesario que
el 100% de los laboratorios participen en esta Red para fortalecer la vigilancia epidemiolgica
continua de la tos ferina a nivel Nacional.
Los 26 laboratorios que pertenecen a la Red de Tos ferina realizan solamente la tcnica de
aislamiento por cultivo e identificacin bioqumica.
Los LESP de los estados de Campeche, Colima, Durango, Tamaulipas y Yucatn no estn
incorporados a la Red.
Analizando la participacin de estos 26 LESP, en el Programa Caminando a la Excelencia, que nos
permite evaluar el desempeo de los estados en relacin a los programas prioritarios en salud; en los
ltimos tres aos tenemos que, de los 26 laboratorios que realizan el diagnstico de Tos ferina,
especficamente en el indicador de Concordancia del Boletn Caminando a la Excelencia solo 10 de
26 laboratorios (38.46%) envan cepas para control de calidad de Bordetella pertussis y desde esta
perspectiva es difcil comparar la concordancia obtenida en las cepas enviadas para confirmar al
InDRE (control de calidad indirecto) y la concordancia obtenida en el panel de eficiencia, dado que la
mayora de los participantes a pesar de tener muy buena correlacin en el panel de eficiencia, no
envan cepas para el control de calidad, esto habla de que los laboratorios si tienen la infraestructura
suficiente, tanto en recursos humanos y materiales para llevar a cabo con calidad este diagnstico,
sin embargo por la complejidad en el manejo de estos microorganismos fastidiosos y por el costo
que esto representa, aunado a la baja demanda de ste diagnstico en los estados, se dificulta an
ms su implementacin.


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EPIDEMIOLOGA
InDRE
Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica (RNLSP)
para el Diagnstico de tos ferina

La red la integran 26
Laboratorios

Faltan de integrarse
a la red de tos ferina


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EPIDEMIOLOGA
InDRE
5. Consideraciones generales para el diagnstico por laboratorio de la tos ferina

El diagnstico en el laboratorio se basa en mtodos directos e indirectos. El diagnstico directo
consiste en identificar a B. pertussis, B. parapertussis, u otras especies de Bordetella spp por cultivo
o por la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
El diagnstico indirecto esencialmente es por serologa y consiste en detectar anticuerpos especficos
contra los componentes de la bacteria de un paciente infectado.
El cultivo es considerado por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) como el estndar de oro
para la confirmacin de casos por laboratorio. Sin embargo este mtodo es poco sensible desde el
punto de vista de recuperacin del microorganismo que no va ms all del 60%. Se ha reportado que
la mayor recuperacin se da en infantes y nios no vacunados. El xito del cultivo que es un
diagnstico ms especfico se basa en la oportunidad de la toma de la muestra, que debe ser dentro
de las dos a tres primeras semanas de iniciada la tos. La PCR es ms sensible que el cultivo
bacteriano y ofrece resultados en menor tiempo, sin embargo es importante seguir realizando el
cultivo, para analizar la evolucin de este patgeno y vigilar eventuales variantes que puedan ser
antignicamente diferentes a las cepas vacunales. Las tinciones de inmunofluorescencia directa con
anticuerpos especficos a partir de secreciones nasofarngeas no es recomendada por la alta
frecuencia de resultados falsos positivos y negativos.
El diagnstico indirecto (serologa) consiste en la deteccin de anticuerpos especficos en el suero de
individuos infectados y por mucho tiempo se haba requerido de una muestra inicial en la fase aguda
de la enfermedad y de una segunda muestra en la fase de convalecencia. Sin embargo hoy en da
existen diferentes inmuno ensayos dirigidos contra diferentes factores de virulencia de B. pertussis
entre ellos estn la Hemagluitinina filamentosa, la pertactina, y la toxina Pertussis, este ltimo
antgeno ,ha demostrado en diferentes investigaciones realizadas por el CDC de Atlanta, ser el
inmungeno ms sensible y especfico comparado con los otros factores de virulencia de B. pertussis
La presencia de altos niveles de anticuerpos IgG anti-toxina pertussis en el suero de pacientes no
vacunados indica infeccin.
Inicialmente las pruebas serolgicas para la tos ferina fueron diseadas para la evaluacin de la
respuesta de anticuerpos contra diferentes componentes de las vacunas, pero actualmente estos
inmunoenyayos son de gran utilidad para confirmar el diagnstico de tos ferina, especialmente
cuando los resultados de PCR y /o cultivos no son determinantes para el diagnstico, sobre todo
cuando se da tratamiento con antibiticos previo a la toma de la muestra situacin que impacta
directamente la recuperacin de B. pertussis por cultivo , por esta razn la serologa puede ser
empleada como una herramienta diagnstica en individuos incluso que tienen como antecedente
haber recibido vacunacin reciente, un ao previo, debido a que la cantidad de IgG en contra de la
toxina pertussis tiene un patrn nico alcanzando su mximo nivel rpidamente justo a las dos


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EPIDEMIOLOGA
InDRE
semanas de iniciada la tos y luego decae, por lo tanto se puede dar un diagnstico de una infeccin
reciente siempre y cuando la toma de la muestra se realice en el momento oportuno.

Sin embargo existen grupos de edad ms vulnerables menores de dos meses en donde la serologa
no es ampliamente recomendable por su sensibilidad en infantes, debido a que su sistema inmune
es inmaduro y existe la interferencia de anticuerpos maternos adquiridos va transplacentaria..

El criterio para la eleccin de la tcnica diagnstica depender la evolucin de la enfermedad, de la
edad del paciente y de su estado inmunolgico: de tal forma que en
menores de 2 meses: Se recomienda ms el cultivo y el PCR .
En nios de 2 meses: Se debe hacer Cultivo y/o PCR en nios con o sin vacunacin reciente, pero
la toma debe ser dentro los primeros das de iniciada la tos.
Adultos: el cultivo se recomienda si la muestra es tomada en la fase catarral o hasta la primera
semana de la fase paroxstica; el PCR y la Serologa se recomienda para aquellos pacientes que se
encuentran ya en fases tardas de la enfermedad.

6. Diagnstico por laboratorio de la tos ferina


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EPIDEMIOLOGA
InDRE
Para la toma de muestras es importante considerar las definiciones operacionales de caso
probable, caso sospechoso y portador asintomtico ( Anexo 4 ),
La obtencin de las muestras se har en todos aquellos pacientes con evidencia clnica de Tos
ferina en el laboratorio de la unidad hospitalaria, centro de salud o jurisdiccin correspondiente. Las
muestras deben ser tomadas durante el episodio agudo de la enfermedad a fin de tener la mayor
posibilidad de aislamiento del agente etiolgico.

El laboratorio del hospital, del centro de salud o jurisdiccional procesar las muestras clnicas y todos
los aislamientos presuntivos de Bordetella spp y los remitir al Laboratorio Estatal de Salud Pblica.
Solo en caso de que el hospital no cuente con laboratorio o recursos para procesar las muestras
clnicas, deber tomar las muestras y enviarlas al Laboratorio Estatal de Salud Pblica.

Los Laboratorios Estatales de Salud Pblica (LESP) recibirn las muestras clnicas o los aislamientos
sugestivos de Bordetella pertussis o Bordetella spp procedentes de las unidades hospitalarias a fin
de que se realice el diagnstico o se confirmen las cepas. Los LESP se encargaran de transportar las
cepas confirmadas como positivas (en medio de transporte de AMIES con carbn) al Instituto de
Diagnstico y Referencia Epidemiolgicos (InDRE) con la informacin solicitada (formato nico de
envo de muestras con los resultados obtenidos y formato acional de estudio Epidemiolgico de
caso). Los LESP debern apoyar a los laboratorios de las unidades hospitalarias y jurisdiccionales en
aquellas situaciones en que se requiera y de acuerdo a los recursos disponibles a fin de realizar los
estudios de las muestras y enviar los resultados al laboratorio correspondiente.
El InDRE ser el laboratorio responsable de recibir las muestras para diagnstico de los hospitales
del rea metropolitana las cepas de Bordetella pertussis o Bordetella spp. procedentes de los
LESP.
En el InDRE se llevar a cabo el estudio de confirmacin y enviar los resultados por RED a los
LESP y a la Direccin General Adjunta de Epidemiologa.

6.1 Cultivo


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EPIDEMIOLOGA
InDRE
El aislamiento de Bordetella pertussis por cultivo bacteriano, es la prueba ms especfica para
confirmar un caso de tos ferina. Todos los pacientes con cultivo positivo a B. pertussis, que
presentan tos con ms de 14 das de evolucin o inclusive menos, deben reportarse como casos
confirmados.

6.1.2. Recoleccin y transporte de muestras clnicas.

La recoleccin y transporte de muestras clnicas es muy importante para el diagnstico de los
agentes bacterianos causantes de la tos ferina.

Bordetella pertussis y B. parapertussis se adhieren a los cilios del epitelio que recubre la nasofaringe
y estas bacterias pueden aislarse a partir de exudados nasofarngeos o aspirados nasofarngeos.
Por la dificultad y el tipo de material para la toma del aspirado nasofarngeo, en la mayora de los
casos se prefiere la toma del exudado nasofarngeo (ExNF).

6.1.3. Toma de exudado nasofarngeo para cultivo y PCR

Exudado Nasofarngeo (ExNF)
Esta es la muestra de eleccin para el estudio de casos probables y sospechosos de tos ferina, as
como de sus contactos para la bsqueda de Bordetella en portadores asntomticos; debido a que
esta bacteria se adhiere a los cilios del epitelio del tracto respiratorio superior del hombre.
Se utiliza un hisopo rayn o dacrn con mango flexible (alambre de aluminio o plstico) para no
lastimar al paciente. Si el estudio solicitado es cultivo la toma de la muestra puede ser con hispo de
alginato de calcio, rayn o dacrn.
Para el estudio de PCR la muestra debe ser tomada con hisopo de rayn o dacrn, nunca de
alginato de calcio ya que este inhibe la actividad de la Taq polimerasa y se pueden obtener
resultados falsos negativos.
Si se van a solicitar cultivo y PCR se deben tomar dos muestras, la muestra destinada para cultivo
debe ser depositada en el medio de transporte Regan Lowe y la muestra para PCR en el medio de
transporte solucin salina con cefalexina a una concentracin final de 40g/mL, cada tubo debe ser
perfectamente etiquetado con la solicitud del estudio Para cultivo, para PCR y las dos muestras
deben transportarse en red fra.

6.1.4. Condiciones para la toma de las muestras


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EPIDEMIOLOGA
InDRE
La toma se hace con el paciente sentado, la cabeza ligeramente hacia atrs y se introduce el hisopo
de mango flexible por cada una de las fosas nasales perpendicularmente a la nariz hasta
aproximadamente 10cm, cuidando tocar slo el extremo posterior del mango y evitar tocar los
cornetes. Una vez tocado el fondo de la nasofaringe se frota suavemente el hisopo, se pide al
paciente que tosa y se retira con cuidado para que no se contamine. (Figura 1)
Depositar la muestra cultivo en el medio de transporte Regan Lowe y cortar con tijeras el excedente
del mango de aluminio que queda fuera del tubo, el mango de aluminio no debe enrrollarse dentro del
tubo para evitar contaminacin de la muestra; si la muestra se va a procesar de inmediato dejar los
hisopos en el medio de transporte durante 15 a 30 minutos para inhibir la flora asociada y despus
sembrar la muestra por duplicado en Agar Bordet Gengou (ABG) y en Agar Bordet Gengou con
cefalexina o tambin puede utilizarse Agar charcoal con sangre de carnero al 15% o sangre de
caballo al 10% (Agar Regan Lowe) (ARL) y tambin se utilizan dos placas una sin antibitico y otra
con antibitico e incubar en aerobiosis y en bolsas plsticas las placas sembradas, (para evitar la
desecacin del medio de cultivo) a 37C. Realizando una primera lectura a las 72 horas de
incubacin. En caso de que no se pueda inocular inmediatamente la muestra, en los medios de
cultivo para el primoaislamiento; depositarla en el en medio de transporte y trasladarla lo ms
pronto posible al laboratorio, en red fra, para que se procese la muestra. Anexo 1
Las muestra destinadas para el PCR debe introducirse en el medio de transporte de solucin salina
con cefalexina y transportarse en red fra. El rea donde se toman las muestras para el cultivo en el
caso de los centros de salud u hospitales debe ser un rea independiente del rea en donde se
aplican las vacunas contra la Tos ferina (DPT o la vacuna acelular contra Pertussis)

Figura 1.- Toma de Exudado nasofarngeo
Fuente: Centers for Disease Control and Prevention. Manual for the surveillance of vaccine-
preventable diseases. Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, 2008.
http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/surv-manual/
7. Uso de la reaccin en cadena de la polimerasa para detectar B. pertussis a partir de
muestras clnicas.


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EPIDEMIOLOGA
InDRE
La deteccin especfica de los cidos nucleicos de B. pertussis y B. parapertussis presentes en
muestras clnicas se describi desde 1985, desde entonces se han empleado diferentes iniciadores
para esta deteccin, hoy en da se emplean diferentes oligoncletidos para la deteccin de este
patgeno que derivan de cuatro regiones cromosmicas del genoma de B. pertussis, ests incluyen
1) la regin promotora que codifica para la toxina pertussis (PT), 2) una regin upstream del gen
porina, 3) las secuencias de insercin repetitiva IS481 para B.pertussis e IS1001 para B.
parapertussis y 4) la regin que codifica para la produccin de la toxina adinilato ciclasa (ACT), con
excepcin del gen ACT estas sondas son especficas de especie, algunas pruebas de PCR son
especficas para B. pertussis, otras permiten la deteccin de B. pertussis y B. parapertussis y otras la
deteccin de estas ltimas dos adems de B. bronchisptica, a pesar de esta gran diversidad de
iniciadores disponibles, la sensibilidad reportada para cada una de ellas es similar.

La tcnica de la PCR a partir de exudados y aspirados nasofarngeos es un mtodo alternativo ms
sensible y rpido que el cultivo para el diagnstico de la tos ferina por el laboratorio.
Otras consideraciones importantes son:
a) La PCR ofrece mayor posibilidad que el cultivo y la serologa en la deteccin de infeccin en
pacientes con sintomatologa no definida o en los asintomticos, incluyendo aquellos individuos
previamente inmunizados, lo que permitir definir con ms claridad la epidemiologa de la tos ferina.
b) La PCR permite detectar la infeccin por B. pertussis inclusive en aquellos individuos que ya
tienen tratamiento antimicrobiano previo.
Diferentes organismos internacionales como la OMS y el CDC recomiendan el empleo de esta
tcnica, sin dejar de realizar el cultivo, por qu un aislamiento representa la posibilidad de realizar
pruebas de sensibilidad y la tipificacin molecular.
La recomendacin internacional es que la PCR no se realice a partir del mismo hisopo, con el que se
realiza el cultivo, esta prctica puede generar resultados falsos positivos, debido a que el hisopo
puede estar expuesto a una contaminacin ambiental con el ADN de B. pertussis, que se produce
en la inoculacin de los medios de cultivo empleados para el primo aislamiento.

8. Nuevo Algoritmo para el Diagnstico de tos ferina por PCR en la RNLSP

Numerosos estudios a nivel internacional, han demostrado el gran potencial de sta tcnica molecular
para mejorar la sensibilidad del diagnstico de la tos ferina, por esta razn, la propuesta de incluir la


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EPIDEMIOLOGA
InDRE
PCR PF y PCRTR para el diagnstico de Tos ferina dentro del marco analtico de la RNLESP, est
fundamentada en dos aspectos importantes:
1) Mejorar el porcentaje de casos confirmados por laboratorio con respecto a los casos probables
2) La necesidad de mejorar el estndar de servicio, disminuyendo el tiempo en la emisin de
resultados, para mejorar la vigilancia epidemiolgica basada en la evidencia generada por el
laboratorio, la cual apoyar en la mejor toma de decisiones para el manejo y control de esta
enfermedad.
Actualmente el InDRE cuenta con dos tcnicas moleculares las cuales estarn a disposicin de la
Red de acuerdo a la disponibilidad de su infraestructura y recursos.

1.- La PCR TR o la PCR PF se debe realizar en todos los casos clnicos que cumplen con la
definicin operacional de casos probables o sospechosos de tos ferina y en sus contactos.

La PCR PF utilizada en el InDRE detecta la presencia de un elemento repetidor de 424 pares de
bases (pb) ste, es una regin especfica repetitiva del genoma de Bordetella pertussis, y se utilizan
los siguientes iniciadores:

Bp168 5 GACTTCGTCTTCGTGGCCAT- 3
Bp169 , 5 TCGTCCAGGTTGAGTCTGGA- 3

El producto esperado es una banda de aproximadamente 424 pares de bases, y solo en las muestras
en la que se detecta esta banda se les realiza el anlisis de restriccin con la enzima Alu 1.
Esperando la amplificacin de dos bandas de 200 y 224 pb.

Las muestras aceptadas para realizar la PCR TR y PF son exudado o aspirado nasofarngeo, el
medio de transporte debe ser solucin salina con cefalexina a una concentracin final de 40g/mL., y
la muestra debe ser tomada con hisopo de rayn o dacrn. (No emplear hisopos de alginato de
calcio debido a que se inhibe la accin de la DNA polimerasa y se pueden obtener resultados
falsos negativos).

2.- El tiempo de transporte no debe exceder ms de 3 das.

3.-Las muestras deben ser tomadas de la misma forma en la que se realiza para el cultivo y deben
ser transportadas en red fra. La muestra de exudado nasofarngeo puede ser almacenada en:
refrigeracin por 0 7 das, ms de 7 das en congelacin a -20C.


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EPIDEMIOLOGA
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Negativo a:
B. pertussis
* Muestra clnica (ExNF para el diagnstico
*molecular de Bordetella pertussis
Extraccin de ADN
( QiaAmp)
Secuencia de insercin repetitiva de
Bordetella pertussis.
(primers Bp 168 y Bp 169) producto
esperado de aproximdamente 400 pb
Amplificacin
positiva
Reportar Positivo
a B.
pertussis
Anlisis de restriccin con Enzima Alu1
producto esperado: dos bandas
de aproximadamente 200 y 224 pb
Dx . difer encial con
virus respiratorios:
Reportar positivo
Positivo Negativo
Reportar negativo
Reportar negativo
Amplificacin del producto esperado

4.- En el laboratorio de IRAs bacterianas se reciben las dos muestras, se les asigna el nmero
de identificacin PR correspondiente, y una se lleva al rea de proceso de cultivos y la otra al rea de
extraccin de DNA.

6.- La extraccin se realiza empleando las columnas de QIAamp DNA Mini and Blood Kit de la
marca QIAGEN.

7.- Una vez realizada la extraccin del DNA, es canalizada al laboratorio de Bacteriologa molecular,
en donde se hace el corrimiento de la PCR PF y el anlisis de restriccin correspondiente.
Las muestras que no amplifican se reportan como negativo a Bordetella pertussis.

8.- Las muestras que amplifican un producto de aproximadamente 400pb, son tratadas con la enzima
de restriccin Alu 1 y aquellas que amplifican dos bandas de 200 y 224 pb se reportan como
positivas a Bordetella pertussis (Anexo 6)

Las muestras que no amplifican se reportan como negativas a Bordetella pertussis y se sugiere
hacer diagnstico diferencial para determinar si la etiologa es viral.

Algoritmo para el diagnstico de Tos ferina por PCR punto final


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EPIDEMIOLOGA
InDRE

Existen otras pruebas moleculares como la PCR TR que ofrecen mayores ventajas sobre las pruebas
moleculares convencionales. En cuanto sensibilidad, rapidez y seguridad para el operador.

La PCR TR utilizada en el InDRE es una PCR TR mltiple multi-target en donde se utilizan
iniciadores y sondas especficos, trazable al CDC de Atlanta. En esta se emplean dos targets:
IS481 y ptX1 que son positivos para B. pertussis. La secuencia IS481 es una secuencia de insercin
que se encuentra en mltiples copias (50 a 238) por cada clula de B. pertussis. El amplicon


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EPIDEMIOLOGA
InDRE
generado es de 66 pares de bases. El ensayo de ptx1 es especfico para una regin de
aproximadamente 400 pares de bases que codifica para la subunidad 1 de la toxina pertussis,
conocida como el gen ptxA y genera un amplicn de 55 pares de bases y solo se encuentra una copia
por cada clula de B. pertussis, estas dos targets nos permiten detectar a B. parapertussis como se
muestra en la siguiente tabla:

Criterios de interpretacin:


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EPIDEMIOLOGA
InDRE

*ptxS1 PCR:CT<40 ciclos es considerado como una reaccin positiva.
** Requiere confirmacin por otras pruebas (cultivo, serologa o vinculacin epidemiolgica)

Algoritmo para el diagnstico de Tos ferina por PCR TR


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EPIDEMIOLOGA
InDRE

9. Anlisis de la informacin

Todos los casos se deben de notificar inmediatamente a la DGE (dentro de las primeras 24 horas de
conocido el caso incluso antes de tener resultados de laboratorio), de acuerdo con la NOM-017-
SSA2-1994 y la Ley General de Salud a travs del correo electrnico epv@dgepi.salud.gob.mx.

-El correcto y oportuno intercambio de informacin, es la base de la interaccin interna de la RNLSP
y a la que debe tener con sus respectivos niveles tcnico-administrativos.

-Los resultados de laboratorio del InDRE se envan directamente al LESP de la entidad federativa de
la que proviene la muestra, la que a su vez es el responsable de hacer llegar el resultado al
destinatario final y a la jurisdiccin correspondiente. Este mismo procedimiento es aplicable a los
resultados de los estudios que realiza cada LESP o laboratorio local.

Muestra clnica
Extraccin de ADN,
manual o automatizada
PCR en tiempo real
multiplex
Resultado
Reportar negativo
Diagnstico diferencial
con virus respiratorios
Reportar
PCR en tiempo real para
toxina ptx1
Reportar de acuerdo al
criterio de interpretacin
Negativo
Positivo


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EPIDEMIOLOGA
InDRE
-Los resultados producidos a nivel nacional o estatal deben ser enviados por este nivel a su
homnimo de las otras instituciones del sector salud.

-En el nivel central la notificacin de resultados de laboratorio la realiza el InDRE por va electrnica
al Centro Nacional de Vigilancia Epidemiolgica, a la Direccin General de Epidemiologa y a la
mxima autoridad de salud en cada entidad federativa con la frecuencia establecida para cada
padecimiento de las vas respiratorias ya mencionados.

-Si las circunstancias lo ameritan, el informe de los resultados de los estudios realizados para el
diagnstico del Sndrome coqueluchoide y la tos ferina en cualquiera de los tres niveles de
laboratorios deben ser enviados en forma inmediata y directa al responsable de la solicitud del
examen, con el objeto de administrar el tratamiento oportuno y adecuado, llevando a cabo el
seguimiento de los contactos y convivientes para evitar la posible aparicin de brotes.

Con la caracterizacin de la etiologa de la Tos ferina y el Sx. coqueluchoide se podr conocer su
distribucin por grupo de edad, rea geogrfica, en el tiempo y de esta manera poder ofrecer
informacin til a los servicios de salud para la eleccin de las mejores medidas de prevencin y el
tratamiento adecuado de los casos.

10. Recursos

10.1 Infraestructura

Dependiendo del nivel, la unidad debe contar con las siguientes reas: Toma o recepcin de
muestras, rea de bacteriologa, rea de pruebas moleculares que est separada del rea de
cultivos bacterianos, rea de lavado y acondicionamiento de material de laboratorio, rea de
preparacin de medios de cultivo, rea de almacenamiento temporal de residuos peligrosos
biolgico infecciosos (RPBI), entre otras.

10.2 Funciones de los diferentes niveles

Nivel Local: Este nivel incluye los laboratorios de centro de salud, jurisdiccionales y algunos
laboratorios de hospitales de primer nivel.
Estos laboratorios debern realizar la toma y manejo y transporte de muestras

-Los laboratorios locales tienen las siguientes funciones:


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EPIDEMIOLOGA
InDRE
-Realizar las pruebas mnimas para el diagnstico en muestras humanas que requieren
nicamente equipo bsico de laboratorio.

-Referir muestras al LESP de su entidad para el control de calidad y para la realizacin de pruebas
generales y especializadas o de referencia que no realicen.

-Llevar a cabo la toma de muestras de los contactos de un caso probable o sospechoso de tos
ferina.

-Notificar al rgano normativo jurisdiccional correspondiente los casos confirmados de tos ferina.

-Mantener el flujo de informacin a los niveles estatal y nacional (LESP e InDRE).

PROCEDIMIENTOS DE MANEJO Y ANALISIS DE MUESTRAS EN LA RNLSP.

-El envo de cada muestra, junto con el formato correspondiente, debe ser directamente del
responsable de la toma al laboratorio que la va a procesar, debe mandar copia del formato al
responsable de la unidad de vigilancia epidemiolgica y debe notificar al nivel inmediato superior
de acuerdo a los procedimientos especificados en la Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-1994,
para la vigilancia epidemiolgica.

-La toma, el manejo, el envo de muestras y los procedimientos de laboratorio para el estudio de los
casos de tos ferina sujetos a vigilancia epidemiolgica deben cumplir los requisitos mnimos de
definicin operacional y las condiciones de calidad (temperatura, esterilidad, cantidad, etc.)
descritas en estos lineamientos.
-La clasificacin de las pruebas que se realizan en apoyo a la vigilancia epidemiolgica las define
el InDRE segn su nivel de complejidad en pruebas mnimas, generales y especializadas o de
referencia.

-Las muestras que no cumplan con los requisitos anteriores tcnicos y administrativos
correspondientes no se procesarn y se dar aviso a las instancias correspondientes, para que
anexen los requisitos faltantes o enven nuevamente la muestra adecuada, en los condiciones
solicitadas.

-Los LESP y laboratorios locales que no tengan capacidad tcnica para el aislamiento y
caracterizacin de los microorganismos causantes de los casos de tos ferina y S{indrome
coqueluchoide, pueden solicitar el apoyo total o parcial en cualquiera de las fases de un estudio al
InDRE, especialmente en lo que se refiere a la confirmacin de el microorganismo involucrado en el
proceso infeccioso estudiado.

Nivel Estatal


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EPIDEMIOLOGA
InDRE
Constituido por los LESP y son sus funciones:

-Participar en actividades de vigilancia epidemiolgica mediante la realizacin de pruebas mnimas
y generales en el diagnstico de la tos ferina

-Centro de referencia de la Red Estatal de Laboratorios Locales de Salud Pblica.

-Coordinar, asesorar y supervisar las actividades de la red estatal de laboratorios de diagnstico.

-Participar en el diseo de programas de vigilancia epidemiolgicas y de diagnstico por el
laboratorio a nivel estatal.

-Realizar investigaciones seroepidemilgicas y bacteriolgicas sobre la prevalencia de la tos ferina
a nivel estatal.

-Colaborar en el seguimiento y control de casos y contactos de pacientes con infecciones
respiratorias sujetas a vigilancia epidemiolgica.

-Promover la utilizacin adecuada de las pruebas diagnsticas ya estandarizadas , as como la
interpretacin de los resultados obtenidos en apoyo a las actividades de vigilancia epidemiolgicas
de la tos ferina y la aplicacin de medidas de prevencin y control correspondientes al mbito
estatal.

-Disear programas de capacitacin al personal de la red de laboratorios locales para lel manejo
de muestras, as como en el aislamiento y caracterizacin de Bordetella pertussis y B.
parapertussis.

-Promover y apoyar programas de control de calidad para el mejoramiento integral de los
laboratorios locales.

-Participar en la elaboracin y actualizacin de los manuales de procedimientos referente al
diagnstico y temas especializados (bioseguridad, manejo de residuos peligrosos biolgico-
infecciosos, etc.).

-Notificar al rgano normativo correspondiente los casos confirmados de Tos ferina
-Coordinar el flujo de informacin de la red estatal al nivel nacional

Nivel Nacional


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EPIDEMIOLOGA
InDRE
El InDRE, para el estudio de la tos ferina, es la institucin de referencia a nivel nacional y
desempea las siguientes funciones:

-Llevar a cabo actividades de diagnstico y anlisis diversos en muestras de seres humanos en
apoyo a la vigilancia epidemiolgica.

-Participar en el desarrollo, estandarizacin, adaptacin y validacin de tcnicas y procedimientos
de laboratorio para pruebas mnimas, generales y especializadas.

-A nivel nacional realizar estudios de referencia y control de calidad de los LESP.

-Participar en el diseo de programas de vigilancia epidemiolgica y diagnstico de la tos ferina a
nivel nacional.

-Realizar investigaciones seroepidemiolgicas y bacteriolgicas que permitan conocer directa o
indirectamente la prevalencia de la tos ferina en poblaciones que viven en zonas endmicas del
pas.

-Establecer la utilizacin de las pruebas estandarizadas y validadas por el InDRE , en apoyo a la
vigilancia epidemiolgica de la tos ferina.

-Capacitar al personal de los LESP (Qumicos y tcnicos) en las tcnicas y procedimientos para el
diagnstico de la tos ferina en las instalaciones del InDRE.

-Establecer programas de supervisin continua a las actividades de la red

-Orientar a los LESP en la preparacin, compra de reactivos y de patrones de referencia para el
aislamiento de los agentes etiolgicos del sndrome coqueluchoide y la tos ferina.

-Elaborar y mantener actualizados los manuales de procedimientos y tcnicas de laboratorio para el
diagnstico de estas enfermedades.

-Organizar y participar en reuniones cientficas donde se aborden temas relacionados con procesos
infecciosos de las vas respiratorias.

-Coordinar el flujo de informacin de la RNLSP y notificar al rgano normativo de vigilancia
epidemiolgica correspondiente los casos confirmados de los padecimientos ya sealados que se
presenten.

11. Evaluacin del desempeo


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EPIDEMIOLOGA
InDRE
La evaluacin del desempeo se har dos veces al ao a travs de paneles de cepas o muestras. El
InDRE enviar paneles al LESP y ste a su vez a los laboratorios de hospital. Cuando sea necesario
se realizar la supervisin en cascada.

A partir de la introduccin del Programa de Evaluacin Externa del Desempeo en la RNLSP , el
Laboratorio de IRAs bacterianas y Pertussis a enviado ocho paneles de eficiencia; de 2005 a 2010,
inicialmente se envi un panel por ao y en 2008 considerando los resultados obtenidos por la red de
laboratorios para el diagnstico de IRAS Bacterianas en este periodo, se propuso hacer una
modificacin de este esquema (un panel por ao) y privilegiar el envo de paneles de eficiencia como
una mejor herramienta para la evaluacin del desempeo.

Para evaluar el desempeo de la RNLESP se propuso comparar la concordancia de los resultados
obtenidos en la identificacin bacteriana obtenida por los laboratorios participantes con los
resultados del Laboratorio coordinador considerando los siguientes criterios a partir del 2010:

a) Aquellos laboratorios que hayan obtenido de manera constante en los dos aos de evaluacin
entre 9.0 y 10.0 en el PEED, se clasifican como SOBRESALIENTES
b) Aquellos laboratorios que hayan obtenido de manera constante en los dos aos de evaluacin
entre 8.0 y 8.9 en el PEED, se clasifican como SATISFACTORIOS
c) Aquellos laboratorios que hayan obtenido de manera constante en los dos aos de evaluacin
entre 6.0 de 7.9 en el PEED, se clasifican como MINIMOS
d) Aquellos laboratorios que hayan obtenido de manera constante en los dos aos de evaluacin
menos 5.9 en el PEED, se clasifican como PRECARIOS

Es importante mencionar que los criterios empleados durante los aos 2005 al 2009 que se
emplearon para evaluar el desempeo de los paneles del primero al sptimo, fueron modificados a
partir del 2010 con el fin de mejorar el desempeo de los LESP participantes
La clasificacin del desempeo se realiz empleando los criterios que se especifican en la siguiente
tabla:

CONCORDANCIA
(%) 2005-2009
CONCORDANCIA
(%) 2010
CLASIFICACIN
DEL


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EPIDEMIOLOGA
InDRE
DESEMPEO
90-100 90-100 SOBRESALIENTE
70-89 80-89 SATISFACTORIO
50-69 60-79 MINIMO
< 50 < 59 PRECARIO

Atendiendo a estos criterios de clasificacin, de los 26 laboratorios que integran esta red para el
diagnstico de Tos ferina conforme a los resultados del PEED 2010, 17 fueron clasificados como
sobresalientes, cuatro como mnimo y como 5 como precarios.

Estados que envan cepas de B. pertussis y B. parapertussis para control de calidad 7/26 que
integran la red


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EPIDEMIOLOGA
InDRE

12. Coleccin de cepas

Una vez caracterizadas las cepas aisladas y enviadas al InDRE, y despus de la emisin del
informe correspondiente; se conservarn a mediano y a largo plazo el 100% de las cepas de B.
pertussis y B. parapertussis o alguna otra especie aislada de casos probables de tos ferina, con el
objetivo de crear un banco biolgico para:
El monitoreo de cambios fenotpicos o genotpicos de cepas circulantes a nivel Nacional, en
apoyo a la Vigilancia epidemiolgica de este padecimiento
Evaluar impacto de las vacunas disponibles en el pas.
Desarrollar proyectos de investigacin en colaboracin con instituciones que permita un
fortalecimiento de los participantes de la RNLESP, manteniendo cada Estado la propiedad de
sus colecciones.
Todas las cepas sern conservadas, a excepcin de las que no cumplan los criterios de inclusin
para ingresar a la coleccin de cepas del InDRE.
Criterios de inclusin:
Cepas caracterizadas que han sido aisladas y relacionadas con la aparicin de brotes
Cepas resistentes a los antibiticos primera eleccin (mcrolidos) que se emplean para el
tratamiento de la tos ferina


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EPIDEMIOLOGA
InDRE
REFERENCIAS

1.-Koneman, E.W.; Allen, S.D.; Janda, W.M.; Schreckenberger, P.C.; Winn, W.C. Diagnstico Microbiolgico,
Texto y Atlas color. 5a ed. Ed Panamericana . 2003 pp. 416-424
2.-Harrison. Principios de Medicina Interna. 14. Ed. Mc Graw-Hill. Interamericana de Espaa. SAU.1998. pp.
1066-1070.
3.- Nennig M.E. Prevalence and Incidence of Adult Pertussis in an urban Population. JAMA.1996. 275:1672
4.-NOM-024-SS2-1994. Para la Prevencin y Control de las Infecciones Respiratorias Agudas en la Atencin
primaria a la Salud. Diario Oficial de la Federacin. 11 de Abril de 1996.
5.-NOM-017-SSA2.1994. Para la Vigilancia Epidemiolgica. Diario Oficial de la Federacin. 11 de Octubre de
1999.
6. Gilligan,P.H. Importance of culture in Laboratory Diagnosis of Bordetella pertussis infections.J of clinical
Microbiol.vol 20 no 5,1984 . pp 891-893.
7. -Manual para el control de enfermedades transmisibles. Publicacin cientfica No. 564. Organizacin Mundial
de la Salud. Abram S. Benenson.
Editor, Decimosexta edicin. Washington, D. C. 1997. pp. 90, 307, 312, 335, 446.

8. - Publicacin Tcnica del InDRE No. 5 Bordetella pertussis.
Microbiologa y Diagnstico. InDRE/SSA. 1991.

9. - Manual de Tcnicas de Laboratorio. Vol. I Virologa y Bacteriologa. InDRE/SSA. 1995. pp. 49-78.
10. -Infecciones Respiratorias Agudas 2008. Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiolgica. Epidemiologa.
No. 52, Vol. 17, Semana 52. 200.

10.- Kristin Brown, MPH; Pam Cassiday, MS; Maria Lucia Tondella, PhD; Amanda Cohn, MD; Kris Bisgard,
DVM, MPH. Pertussis: Chapter 10-1 in VPD Surveillance Manual, 4th Edition, 2008.

11.-Hallander HO, Reizenstein E, Renemar B, Rasmuson G, Mardin L, Olin P. Comparison of nasopharyngeal
aspirates with swabs for culture of Bordetella pertussis. J Clin Microbiol 1993;31:502.

12.- Halperin SA, Bortolussi R, Wort AJ. Evaluation of culture, immunofluorescence, and 13. serology for the
diagnosis of pertussis. J Clin Microbiol 1989; 7:7527.

13.- Morrill WE, Barbaree JM, Fields BS, et al. Effects of transport temperature andmedium on recovery of
Bordetella pertussis from nasopharyngeal swabs. J Clin. Microbiol 26:1814-7.

14.- Meade BD, Bollen A. Recommendations for use of the polymerase chain reaction in the diagnosis of
Bordetella pertussis infections. J Med Microbiol 1994;41:51-5.


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EPIDEMIOLOGA
InDRE

15.- Preston NW. Technical problems in the laboratory diagnosis and prevention of
whooping-cough. Lab Pract 1970;19:482-6.

16.- Trudy Murphy, MD, Kris Bisgard, DVM, MPH, and Gary Sanden, MS, PhD Revised June 2000 Chapter 2
Diagnosis and Laboratory Methods in Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Guidelines for the
Control of Pertussis Outbreaks. CDC, 2000.

17.- Hewlett EL: Bordetella species. En: Mandel GL, Bennett JE, Dolin R, eds.
Principles and Practice of Infectious Diseases (5 edicin). Philadelphia.
Churchill Linvinsgtone. 2000: 2414-2422).

18.- Benenson AS. Manual para el control de las enfermedades transmisibles. AS
Benenson Ed. 16 . Ed. Washington DC.: OPS, 1997.

19.- Centers for Disease Control and Prevention. Manual for the surveillance of vaccine-preventable diseases.
Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, 2008. http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/surv-manual/

20.- World Health Organization , Department of immunization, Vaccins and Biologicals. Laboratory Manual for
Diagnosis of Whooping cough caused by Bordetella pertussis /Bordetella parapertussis. WHO/IVB/04.14. CH-
1211 Geneva 27, Switzerland.March 2007

21.- World Health Organization , Department of Vaccins and Biologicals. Generic protocol for estimating the
burden of pertussis in young children. WHO/IVB/05.15. CH-1211 Geneva 27, Switzerland.March 2005.

22.- McLaffferty M, Harcus D, Hewlett E. Nucleotide Sequence and Characterization of a Repetitive DNA
Element from the Genome of Bordetella pertussis with Characteristics of an Insertion Sequence. J Gen Micro
1988; 134:2297-2306.

23.- Baughman, A. L., K. M. Bisgard, K. M. Edwards, D. Guris, M. D. Decker, K. Holland, B. D. Meade, and F.
Lynn. 2004. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin,
filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol
11:1045-53.

24.- Marchant, C. D., A. M. Loughlin, S. M. Lett, C. W. Todd, L. H. Wetterlow, R. Bicchieri, S. Higham, P. Etkind,
E. Silva, and G. R. Siber. 1994. Pertussis in Massachusetts, 1981-1991: incidence, serologic diagnosis, and
vaccine effectiveness. J Infect Dis 169:1297-305.
25.- Meade, B. D., A. Deforest, K. M. Edwards, T. A. Romani, F. Lynn, C. H. O'Brien, C. B. Swartz, G. F. Reed,
and M. A. Deloria. 1995. Description and evaluation of serologic assays used in a multicenter trial of acellular
pertussis vaccines. Pediatrics 96:570-5.

26.- Tondella, M. L., G. M. Carlone, N. Messonnier, C. P. Quinn, B. D. Meade, D. L. Burns, J. D. Cherry, N.
Guiso, E. L. Hewlett, K. M. Edwards, D. Xing, A. Giammanco, C. H. Wirsing von Konig, L. Han, L. Hueston, J. B.
Robbins, M. Powell, C. M. Mink, J. T. Poolman, S. W. Hildreth, F. Lynn, and A. Morris. 2009. International
Bordetella pertussis assay standardization and harmonization meeting report. Centers for Disease Control and
Prevention, Atlanta, Georgia, United States, 19-20 July 2007. Vaccine 27:803-14.


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EPIDEMIOLOGA
InDRE

ANEXO 1
CONDICIONES DE CONSERVACIN DE LAS MUESTRAS PARA SU ENVO AL LABORATORIO.
Exudado Nasofarngeo
Muestras de Exudado nasofarngeo para la bsqueda de Bordetella pertussis Estas muestras se
procesarn de acuerdo al algoritmo del Anexo 3. Este tipo de muestra se recomienda para el
diagnstico de Tos ferina y la bsqueda de contactos intradomiciliarios..

Condiciones para la toma del exudado nasofarngeo:
Se utiliza un hisopo de rayn o dacrn (para cultivo y/o PCR) con mango flexible (alambre de aluminio
pero de preferencia de plstico) para no lastimar al paciente y evitar interferencia con la PCR.
La toma se hace con el paciente sentado, la cabeza ligeramente hacia atrs y se introduce el hisopo
de mango flexible por cada una de las fosas nasales perpendicularmente a la nariz hasta
aproximadamente 10 cm, cuidando tocar slo el extremo posterior del mango y evitar tocar los
cornetes. Una vez tocando el fondo de la nasofaringe se frota suavemente el hisopo y se retira con
cuidado para que no se contamine.
Volumen: Se recomienda que el volumen del medio de transporte no sea mayor de 1 ml para evitar
la dilucin de los microorganismos presentes en la muestra.
Transporte: Depositar el hisopo con la muestra en medio de transporte de solucin salina con
cefalexina a una concentracin de 40 g/ml y trasladarlo lo ms pronto posible al laboratorio en red
f`ra sin congenlar
Nota: El tiempo de viabilidad de este microorganismo en la muestra en red fra es de 48 a 72 hrs.

Informacin requerida: La muestra debe de venir perfectamente bien etiquetada, con el nombre del
paciente, edad, fecha de toma, tipo de muestra, si es primera o segunda toma y diagnstico
solicitado.
Las muestras deben ser enviadas con el oficio de solicitud del estudio, acompaada de l formato
nico de envo de muestras biolgicas del InDRE, formato de laboratorio de estudio de caso de tos
ferina y contactos intradomiciliarios (IRAB-F-89), o copia del Formato del Sistema Nacional de Salud
de estudio epidemiolgico de caso de tos ferina.
La falta de alguno de estos documentos o las condiciones inadecuadas de la muestra, causa el
rechazo definitivo. sin embargo si el rechazo es de ndole administrativo e notificar al usuario y
contar con un periodo de 2 das, para enviar la documentacin complementaria, pero si el rechazo


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EPIDEMIOLOGA
InDRE
es debido a la calidad de la muestra se solicitar la nueva muestra en las condiciones adecuadas, de
no ocurrir as, se rechazar definitivamente y se notificar al usuario responsable del envo.
Las muestras de suero y exudados nasofarngeos, de casos y contactos sern resguardadas durante
un periodo de dos meses como mximo, para efectos de cualquier repeticin que sea requerida y
con el fin de crear un banco de muestras positivas para la creacin de paneles.

Suero

Condiciones:

Volumen: Se requiere de 1 a 3 ml para la prueba, el suero, no debe estar hemolizado,
lipmico contaminado.
Transporte: Estas muestras deben ser recolectadas en un tubo estril, sin anticuagulante y
deben transportarse en red fra.

Informacin requerida: La muestra debe de venir perfectamente bien etiquetada, con el
nombre del paciente, edad, sexo, fecha de toma, tipo de muestra, y con la fecha de inicio de
tos, es muy importante que la muestra serolgica sea tomada a partir de las dos semanas o
ms de iniciada la tos , pero no antes.
Las muestras deben ser enviadas con la solicitud de estudio.
La falta de alguno de estos documentos o las condiciones inadecuadas de la muestra, causa
el rechazo. Se notificar al usuario y contar con un periodo de ocho das, para enviar la
documentacin complementaria, de no ocurrir as, se rechazar definitivamente y se
notificar al usuario responsable del envo.


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EPIDEMIOLOGA
InDRE

ANEXO 2
Criterios para aceptacin y Rechazo de muestras o cepas para el diagnstico, control de
calidad y Referencia de Tos ferina
CRITERIOS PARA LA ACEPTACIN DE MUESTRAS EXUDADO NOSOFARNGEO
1. Se aceptarn las muestras que cumplan con las definiciones operacionales caso para el
diagnstico de tos ferina ( caso probable, caso sospechoso, caso atpico y contacto)
2. Muestras registradas en el InDRE
3. Muestras con volumen suficiente 1 ml de solucin salina con cefalexina para PCR y medio de
transporte Regan Lowe con 5 mL y perfectamente etiquetadas
4. Muestras de casos que hayan sido tomadas dentro de las primeras 4 semanas de iniciados
los sntomas en pacientes.
5. Muestras de contactos para bsqueda de portadores tomadas dentro de los 10 das primeros
das de iniciado el estudio de caso probable o sospechoso.
6. Muestras que no excedan las 72 horas de transporte.
7. Muestras almacenadas a 4 -8 C
8. Muestras que cumplan los lineamientos del manual de toma y envo de muestras editado por
el InDRE
CRITERIOS DE RECHAZO
1. Se rechazaran las muestras que no cumplan con las definiciones operacionales caso para
el diagnstico de tos ferina (caso probable, caso sospechoso, caso atpico y contacto)
2. Muestras sin oficio o sin alguno de los siguientes formatos (formato nico de envo de
muestras biolgicas del InDRE, formato de laboratorio de estudio de caso de tos ferina y
contactos intradomiciliarios (F-IRAB- 89), copia del Formato del Sistema Nacional de Salud
de estudio epidemiolgico de caso de tos ferina).
3. Muestras de referencia y control de calidad que no tengan resultado en formato
4. Muestras con volmen insuficiente (menos de 1 mL) y que no estn etiquetadas
adecuadamente.
5. Muestras que sean tomadas con hisopo de algodn
6. Muestras que excedan los 2 das de trnsito en reas locales y 3 das en reas forneas.
7. Muestras derramadas
8. Muestras no etiquetadas.
9. Muestras que no sean enviadas con refrigerantes
10. Muestras de referencia o control de calidad que no cuenten con formatos de envo
11. Muestras de referencia o control de calidad con datos incompletos en formatos de e


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EPIDEMIOLOGA
InDRE
ANEXO 3
DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGIA
ALGORITMO MAESTRO 2011 PARA EL DIAGNSTICO, REFERENCIA Y CONTROL DE
CALIDAD DE Bordetella pertussis y OTRAS ESPECIES
Las muestras se reciben en la seccin de Recepcin de Muestras y son recogidas por el Laboratorio
de IRAs Bacterianas en dnde se les asigna el nmero de registro correspondiente

Siembra en placas con medio selectivo
Positivo
Identificacin por coaglutinacin
con antisuero especfico
MUESTRAS RECIBIDAS
Exudado nasofarngeo y/o cepas para
Diagnstico, Referencia o control de
calidad
Caracterizacin
bioqumica
Negativo
Conservacin de cepas de
Bordetella en congelacin
Captura de resultados en INFOLAB, revisin e impresin de resultado para entrega en la seccin de Recepcin
de Muestras, mnimo 7 das por cultivo posterior a la recepcin de la misma, 2 das para PCR PF y1 da para
PCR TR
Sin desarrollo bacteriano Con desarrollo
presuntivo
muestras de exudado
nasofarngeo o cepas
para extraccin de
DNA) para PCR PF y
PCR TR, ver
algoritmos


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EPIDEMIOLOGA
InDRE
ANEXO 4

DEFINICIONES OPERACIONALES DE CASO
PARA EL DIAGNOSTICO DE TOS FERINA

a. CASO SOSPECHOSO DE TOS FERINA: persona de cualquier edad con tos, sin importar los
das de duracin y con asociacin con otros casos probables o confirmados. Esta definicin se usa
para la bsqueda activa de casos adicionales ante la presencia de casos probables, confirmados o
atpicos, portadores, defunciones y en brotes.
b. CASO PROBABLE DE TOS FERINA: persona de cualquier edad, con tos de 14 o ms das
de evolucin y dos o ms de las siguientes caractersticas; tos paroxstica, en accesos, espasmdica
o estridor larngeo inspiratorio y uno o ms de los siguientes datos: tos cianosante, hemorragia
(conjuntival, petequias, epistaxis), leucocitosis con predominio de linfocitos; o historia de contacto con
casos similares en las ltimas 2 a 4 semanas previas al inicio del padecimiento. Nota: En esta
definicin se incluyen a los MENORES DE 3 MESES que pueden manifestar slo episodios de apnea
o cianosis con o sin tos.
c. CASO CONFIRMADO DE TOS FERINA: todo caso probable que tenga aislamiento de
Bordetella pertussis por cultivo o PCR en el caso o cualquiera de sus contactos, convivientes o
personas con asociacin epidemiolgica.
d. CASO DE TOS FERINA CLNICA: todo caso probable que no cuenta con muestra,
independientemente de sus cinco contactos.
e. CASO DE TOS FERINA ATPICO: todo caso sospechoso que tenga aislamiento de Bordetella
pertussis.
f. PORTADOR DE Bordetella pertussis: toda persona sin signos o sntomas de enfermedad
respiratoria a quien se tom muestras por tener asociacin epidemiolgica con un caso probable o
confirmado y cuyos resultados de cultivo o PCR son positivos a Bordetella pertussis.

Prolongacin de Carpio 470, Col. Casco de Santo Toms, Del. Miguel Hidalgo, Mxico, DF, 11340
t. +52 ( 55) 5342 7550 | f. +52 ( 55) 5341 3264 | www.cenavece.salud.gob.mx/ indre/ interior/ intd_index.html

ANEXO 5
FORMATO PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE LA TOS FERINA

-
HOSPITAL NOTIFICANTE DEL CASO:_______________________________________________________________ JURISDICCIN CORRESPONDIENTE:________________________________ F-IRAB-89
TOS
PRODUCTIVA/
TOS SECA
RINORREA ACCESOS DISNEA EMETIZANTE CIANOSIS FIEBRE
PERDIDADE
CONOCIMIENTO
FECHADE
TRATAMIENTO
CON
ERITROMICINA
1a. 2a. 3a. SIN VACUNA
EXUDADO
NASOFARINGEO
SANGRE O
SUERO
LEUCOCITOS
LINFOCITOS
(%)
FECHA DEVACUNACINCONDPT OPENTAVALENTE OBSERVACIONES
TOS
PRODUCTIVA /
TOS SECA
RINORREA ACCESOS DISNEA EMETIZANTE CIANOSIS FIEBRE
PERDIDA DE
CONOCIMIENTO
FECHA DE
TRATAMIENTO
CON
ERITROMICINA
1a. 2a. 3a. SIN VACUNA
EXUDADO
NASOFARINGEO
SANGRE O
SUERO
No DE EXPEDIENTE CLINICO DEL CASO:____________________________________________________
DOMICILIO DEL CASO:___________________________________________________________ ________________________________________________________________ TELEFONO: ___________________
____________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________
______________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________
______________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________
RESPONSABLE DE LA TOMA DE MUESTRAS DEL CASO:________________________________________________________________________ TELEFONO: ___________________
RESPONSABLE DE LA TOMA DE MUESTRAS DE LOS CONTACTOS:__________________________________________________ TELEFONO: ___________________
FECHA DE INICIO DE SINTOMAS
FECHA DE
NACIMIENTO
FECHA DE
NACIMIENTO
EDAD
EDAD
FECHA DE INICIO DE SINTOMAS
BIOMETRAHEMTICA FECHA DEVACUNACINCONDPT OPENTAVALENTE
ESTUDIO DE CASO DE TOS FERINA Y CONTACTOS INTRADOMICILIARIOS
NOMBRE DEL CASO
CONTACTOS FAMILIARES
NOMBRE Y PARENTESCO
FECHADE TOMADE MUESTRAS
FECHA DETOMA DEMUESTRAS
DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGA
LABORATORIO DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS BACTERIANAS Y
PERTUSSIS
EPIDEMIOLOGA
InDRE
Instituto de Diagnstico y Referencia Epidemiolgicos

ANEXO 6

DESARROLLO DE PCR PUNTO FINAL PARA LA DETECCIN
DE
DE Bordetella perutussis,
EN MUESTRAS CLNICAS Y CEPAS
1. PRINCIPIO

La amplificacin de una secuencia de insecin presente en varias copias exclusivamente
en el genoma de Bordetella pertussis por la tcnica de reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) en cido desoxirribonuclico (DNA) extrado de muestras de exudado
nasofarngeo o cultivo puro. La especificidad de la amplificacin se confirma usando la
enzima de restriccin Alu I.

2. OBJETIVOS
Deteccin de Bordetella pertussis en casos de tosferina y sus contactos utilizando la
Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR).

3. MATERIALES Y EQUIPO

EQUIPO

Termociclador
Gabinete de bioseguridad tipo II clase 2A
Cabina para PCR
Cmara de electroforesis horizontal
Fotodocumentador
Fuente de poder
Congelador vertical
Refrigerador vertical
Termoagitador
Sistema de purificacin de agua

Balanza analtica
Aire acondicionado
Horno de microondas

MATERIALES

Micropipeta 1-10 L
Micropipeta 2-20 L
Micropipeta 20-200 L
Micropipeta 100-1000 L
Guantes desechables
Tubos tipo eppendorf de 0.2 ml, 0.5 ml y 1.5 ml
Puntas para micropipeta 10, 200 y 1000 L
Tubos para centrifuga de 50 ml
Pipetas desechables 5 y 10 ml
Marcadores indelebles
Gradillas para tubos eppendorf
Bolsas de polipropileno
Contenedores para desecho de puntas
Gasas

REACTIVOS Y MATERIALES BIOLGICOS

Reactivos y Materiales biolgicos Marca
dNTPs (A, T, C, G) 100M Roche
Taq polimerasa 5U/L Roche
Bp168 5'-GAC TTC GTC TTC GTG GCC AT-3'
(1)
Applied biosystems
Bp169 5'- TCG TCC AGG TTG AGT CTG GA -3'
(1)
Applied biosystems
Endonucleasa de restriccin Alu I Roche
MgCl
2
, 25mM Applied biosystems
Regulador 10 X Applied biosystems
Solucin amortiguadora TBE
Agarosa Sigma
Bromuro de etidio
Agua destilada y desionizada MILLIPORE
Marcador de peso molecular
Naranja G
Alcohol etlico al 70%

1) Ewanowich CA, Linda W. Chui, Paranchych, Pepler, Marusyk G, Albrition W, Major
Outbreak of Pertussis in Northern Alberta, Canada: Analysis of Discrepant Direct
Fluorescent-Antibody and Culture Results by Using Polymerase Chain Reaction
Methodology. Journal of Clinical Microbioly, 1993, 31: 1715-1725

4. METODOLOGA

1. El DNA de las muestras llegar al laboratorio en tubo para microcentrifuga de 1.5mL
tipo eppendorf a temperatura ambiente cuando se ha extrado recientemente y
congelado cuando tenga ms de 2h de haberse extrado.
2. El almacenamiento de la muestra de DNA debe ser a -20C

CONSIDERACIONES ANTES DE INICIAR LA PCR.
1. Antes de empezar a trabajar descontaminar el gabinete de bioseguridad utilizando
el sanitizante asignado.
2. Colocarse el equipo de seguridad. (Ver punto 6).
3. Mantener las muestras en hielo listas para la PCR.
4. Descongelar previamente los reactivos para la PCR.
5. Rotular los tubos de acuerdo al nmero y tipo de muestra a trabajar.

PREPARACIN DE LA MEZCLA DE REACCIN.
1. Esta se har en el rea Blanca del laboratorio.
2. El volumen de los reactivos se calcular de acuerdo al nmero de muestras a
diagnosticar, siguiendo el formato de trabajo para PCR. Una vez preparada la
mezcla de reaccin homogenizar suavemente con pipeta aproximadamente 30
veces, finalmente adicionar 20 L de esta mezcla en el fondo de cada tubo.
3. En el rea de templados, adicionar 5 L del DNA extrado de cada muestra en el
tubo correspondiente.

FORMATO DE TRABAJO PARA PCR

FECHA: ANALISTA:

NUMERO
DE TUBO
CLAVE DE LA
MUESTRA
COMENTARIOS

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA MOLECULAR

HOJA DE TRABAJO DE PCR PARA Bordetella pertussis
FECHA:___________________ ANALISTA:_________________
NUMERO
DE TUBO
CLAVE DE LA MUESTRA OBSERVACIONES
1

2

3

4

5

6

7

8

SOLUCIN MADRE I
FECHA:___________________ ANALISTA:_________________
uientes cantidades de
reactivos y solucion s tampn:
REACTIVOS [ Stock ] [ final ]
Volumen
por
muestra (

Volumen total (

dH
2
O estril 7.25
Buffer 10 X 1 X 2.5
MgCl
2
25 mM 3 mM 4.0
Bp 168 1:50 1.0
Bp 169 1:50 1.0
dNTPs 4.0
Taq polimerasa 0.25 0.5
Vaselina ---- 10 ---- --------
DNA 5 50

Multiplicar las cantidades sealadas por el nmero de muestras a procesar ms una, para
qu los volmene no queden excesivamente ajustados.
n + 1 = _____ n = nmero de muestras
Digestin:


FECHA:___________________ ANALISTA:

Enzima de restriccin:______________ Temperatura de incubacin:

Muestras a digerir

Inicio a:__________________ Termino a:
Comentarios:

ANALISTA:

Electroforesis en gel de agarosa al 2%:
FECHA: ANALISTA:


Correr el gel a 80 volts durante 1hora y 30 minutos
Inicio: Termino:
Peine I

Peine II

N
Pozo
N de
tubo
Clave Resultado Comentario

N
Pozo
N de
tubo
Clave Resultado Comentario
1

1

2

2

3

3

4

4

5

5

6

6

7

7

8

8

9

9

10

10

11

11

12

12

13

13

POSITIVO= Positivo a Bordetella pertussis

NEGATIVO= Negativo a Bordetella pertussis.

Marcador de Peso Molecular (PM):_______________________________

CONTROLES

En el rea de controles. Adicionar 5 L de control positivo y negativo respectivamente.
Control negativo: Colocar una muestra de DNA confirmada como Bordetella
bronchiseptica.

Control negativo: Colocar una muestra de DNA confirmada como Bordetella
parapertussis.
Control positivo: Colocar una muestra de DNA confirmada como Bordetella pertussis.
Control de reactivos: Utilizar 5 L de agua inyectable o milliQ.

NOTA. Asegurarse de que todos los tubos queden bien tapados, para evitar que el
contenido se evapore.

Colocar los tubos en el Termociclador, seleccionar el programa para Bordetella
pertussis y dar inicio a la corrida
Los productos de DNA obtenidos se someten a 120V por 30 minutos a electroforesis en
un gel de agarosa al 2% en regulador Tris-EDTA-cido actico. (Ver punto 7)
Finalizada la electroforesis evidenciar la presencia de las bandas (productos) con luz UV
Las muestras amplificadas que presenten una banda fluorescente correspondiente al
tamao esperado de aproximadamente 424pb comparando con el marcador de peso
molecular, debern digerirse con la enzima de restriccin Alu I por 2 horas a 37C para
confirmar la presencia de DNA de Bordetella pertussis. (Ver punto 8)
Al terminar el tiempo de restriccin del DNA se analizar por electroforesis en gel de
agarosa al 2.5%, en el rea de electroforesis se tomaran 6L de cada muestra y controles
y se mezclaran con 2L de Naranja G y se correra a 120V/40min.
Finalizada la electroforesis evidenciar la presencia de las bandas (productos) con luz UV

5. INTERPRETACIN POR EL LABORATORIO

Positivo: Presencia de la secuencia de insercin existente en varias copias exclusivas
del genoma de Bordetella pertussis digeridos con la enzima Alu I muestra bandas de 224
y 200pb
Negativo: Ausencia de DNA de Bordetella pertussis

Ausencia de bandas de 224 y 200pb despus de la restriccin.

6. MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

a. Todas las muestras y controles deben manejarse como potencialmente infecciosos. Y
trabajarse en un Laboratorio de Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2) dentro de un gabinete de
bioseguridad tipo II 2A.
b. El analista debe vestirse con su equipo de proteccin personal, bata (una para cada
rea del proceso), guantes desechables (un par para cada proceso) y lentes de
seguridad.
c. Disponer de los contenedores y bolsas correspondientes para los desechos RPBI en
cada rea.
d. Descontaminar las micropipetas, gabinetes y cabinas antes y despus de trabajar con
etanol al 70% benzal-metanol 1:1 v/v.
e. Todo el material a utilizar deber estar esterilizado.
f. El personal que realice la electroforesis no podr hacer mezcla para PCR en la misma
jornada.
g. El rea limpia rea blanca est libre de toda contaminacin por DNA por lo que solo
podrn manejarse reactivos.
h. El rea de templados ser la nica donde se podrn abrir los tubos que contienen el
DNA de las muestras.
i. El rea de controles ser la nica permitida para la colocacin de el DNA control.
j. Solo en el rea sucia o de electroforesis se podrn abrir los tubos con cDNA y
cargarse en los geles.
k. Cada rea deber estar separada fsicamente para evitar contaminaciones.
l. Es muy importante que cada rea cuente con su material propio (puntas, guantes,
agua, etc), y ste no deber compartirse entre reas.
m. Los equipos debern descontaminarse antes de una reparacin, mantenimiento o
antes de ser removidos del laboratorio.

n. El analista debe lavar sus manos antes y despus de trabajar.

7. ELECTROFORESIS EN GEL

PREPARACION DEL GEL DE AGAROSA AL 2.0% EN CHAROLA DE 15 X 25 cm
2

FUNDAMENTO:

La electroforesis en gel se encuentra entre los mtodos ms resolutivos y convenientes
empleados en la separacin macromolecular, los geles ms ampliamente utilizados son
los de poliacrilamida y agarosa los cuales se utilizan para separar, identificar y purificar
fragmentos

de ARN o ADN; estos tienen las caractersticas de formar poros de dimensiones
moleculares una vez que han polimerizado, en la electroforesis en gel, los cidos
nuclicos que tienen carga negativa debido a su esqueleto de grupo fosfato se aleja del
polo negativo (ctodo) y se dirigen hacia el polo positivo (nodo), los fragmentos
pequeos de ADN se mueven ms rpido que los grandes, las bandas resultantes de la
separacin por electroforesis necesitan teirse para visualizarse, el reactivo ampliamente
utilizado es el colorante de bromuro de etidio el cual se incorpora en la solucin de
agarosa.
Para lograr la separacin adecuada de los fragmentos de ADN se toma en cuenta la
composicin porcentual de acrilamida o agarosa para determinar que tan fcil migrarn en
el gel el ADN de diferentes tamaos, por lo tanto, la composicin porcentual del gel
determinar el nivel de resolucin (capacidad de separar uno del otro) de los fragmentos
de ADN.

REACTIVOS


TBE 10X (Sol. Stock)
TBE 1 X
Bromuro de Etidio
Buffer de colorante de corrida.
Marcador de peso molecular X174
Agarosa en polvo
Naranja G

MATERIAL Y EQUIPO

Matraz Erlenmeyer de 500 ml
Cmara de electroforesis
Balanza analtica
Fotodocumentador
Micropipeta 0.5 - 10 L.
Puntas 1- 200 L.

PROCEDIMIENTO

1. Pesar en la balanza analtica, previamente calibrada, 2g. de agarosa. y mezcle en
100 mL. de TBE 1X en un matraz de Erlenmeyer con tapn de rosca.
2. Calentar el matraz en horno de microondas en ciclos de 20 segundos y agitar
hasta la completa dilucin de la agarosa, (utilice guantes de carnaza para evitar
quemaduras), deje ligeramente flojo el tapn del matraz.
3. Permita enfriar por varios minutos.
4. Agregar a la agarosa 3.0 L de bromuro de etidio.
5. Agitar el matraz suavemente con el tapn sellado, y vace la agarosa lentamente
para evitar la formacin de burbujas en la charola previamente nivelada, con el
peine colocado en el lugar correspondiente.

6. Deje solidificar el gel a temperatura ambiente por espacio de 30 minutos.
7. Ya solidificado el gel retire el peine y coloque el gel en la cmara de electroforesis
con los pozos orientados al lado izquierdo de la cmara.
8. Llene la cmara de electroforesis con 1.800 mL de TBE 1X hasta cubrir el gel.
9. Prepare el X174 en un pozo de una placa falcn flexible colocando 5 l de
X174.
10. En una superficie plstica y plana (parafilm) mezcle 8L de muestra ms 2 mL de
colorante de buffer, homogenice y deposite en el pozo correspondiente del gel, as
procesar todas sus muestras de acuerdo a la capacidad del No. de pozos de su
gel.
11. Coloque la tapa de la cmara ajustando los electrodos, el color negro polo (+) del
lado derecho y el color rojo polo (-) lado izquierdo.
12. Los pozos del gel deben estar orientados hacia el polo (-) el gel correr a 120
voltios por espacio de 30 minutos.
13. Coloque su gel en un fotodocumentador de luz UV y observe sus bandas de
acuerdo a su marcador y compare sus resultados para un anlisis posterior.

Nota. Durante la manipulacin del gel siempre deber usar guantes ya que el bromuro de
etidio es altamente cancergeno.

8. ANLISIS DE RESTRICCIN.
1) Pipetear 10L de muestra proveniente de cada tubo de producto de PCR en tubos
de 500L rotulados.
2) Adicionar 2.5L de buffer 10X y 2.5L de enzima Alu I (10U/ L) a cada tubo y
10L de agua grado PCR.
3) Asegurarse de tapar bien los tubos y mezclar.
4) Incubar a 37C por 2 horas.

5) Almacenar las muestras digeridas a 4C hasta corrimiento en gel de agarosa al
2.5%.

FORMULACIN DE REACTIVOS PARA EL ANLISIS MOLECULAR

TBE 10X

Tris base 108.0g
cido brico 27.5g
EDTA 6.8g EDTA = Etilen-Diamino-Tetra-Acetato
Aforar a 1L pH = 8.3

Disolver los reactivos en 950mL de agua destilada y ajustar el volumen a
1000mL

TBE 1X

Diluir 100mL de TBE 10X a 1000mL con agua destilada.

Colorante de carga (electroforesis)

Buffer de muestra 10X (listo para su uso)
Naranja G 0.25%
Bromuro de etidio (EtBr) 10mg/mL

Pesar 50mg de bromuro de etidio y disolver en 5mL de agua destilada. Almacenar en un
frasco ambar para protegerlo de la luz.

PRECAUCIN: El bromuro de etidio es mutagnico y cancergeno. Usar guantes cuando
maneje el polvo o la solucin.

9. FUENTES DE VARIABILIDAD

La prueba se realizar en un laboratorio entre 18-25C. Las diferentes reas debern
estar separadas y selladas para evitar el paso de aire con polvo y evitar as la
contaminacin. Ninguna otra condicin ambiental afecta la PCR, puesto que toda la
reaccin se realiza en el Termociclador.


ALGORITMO PARA LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) PARA
LA IDENTIFICACIN DE CEPAS DE Bordetella pertussis.
Negativo
Ausencia de banda
caracterstica
Positivo
Presencia de una
banda de 424pb
Digestin con enzima AluI
37C/2 horas
Negativo
Ausencia de bandas
carctersticas

confirmacin
Positivo
Presencia de secuencia de insercin evidenciada por 2 bandas caractersticas en cepas de Bordetella
pertussis
INSTITUTO DE DIAGNOSTICO Y
REFERENCIA EPIDEMIOLOGICOS
DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGIA
LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA
MOLECULAR
NOM-017-SSA2-
1994: Para la
vigilancia
epidemiolgica.
NOM-024-SSA2-
1998, para la
prevencin y control
de las Infecciones
Respiratorias Agudas
en la atencin
primaria a la Salud

Electroforesis en gel de
agarosa
RESULTADO
Fotodocumentar
Amplificacin de
secuencia con
iniciadores
correspondientes de
insercin exclusiva de
Bordetella pertussis

Preparar el gel de agarosa
al porcentaje requerido
Revelar bajo luz
UV

10.ALGORITMO


Lineamientos Tosferina 2012

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