PRACTICA #11

CULTIVO DE PROTOZOARIOS
I. Parte


OBJETIVO DE LA PRACTICA
Conocer algunas tcnicas de cultivo de protozoarios que permitan su
multiplicacin, cuyas poblaciones pueden ser utilizadas en estudios diferentes
al diagnstico.

INTRODUCCCION
En el diagnstico clnico, el cultivo de los protozoarios parsitos no juega un
papel importante, y la microscopa sigue siendo la tcnica de eleccin para la
identificacin de la mayora de ellos. Aunque no es posible el cultivo in vitro de
todos los protozoarios parsitos, algunos de ellos se pueden aislar y cultivar en
medio de cultivo. En algunos casos hay reactivos comerciales disponibles para
inmunodagnstico, y por otro lado, las tcnicas de PCR constituirn el mtodo
de eleccin en el futuro.
La importancia del cultivo de protozoarios es principalmente por motivos de
investigacin de las especies de dichos organismos. Actualmente, las tcnicas
de cultivo son utilizadas para el estudio in vitro de los parsitos, desde diferentes
puntos de vista. El cultivo es un prerrequisito para estudios que requieren un
gran nmero de clulas, por ejemplo en pruebas de antiparasitarios, estudios
antignicos o de biologa molecular, etc.
Hay tres tipos bsicos de sistemas de cultivo:
a) xnico, en el cual el parsito es cultivado en presencia de una flora
indefinida.
b) monoxnico, en el cual el parasito es cultivado en presencia de una sola
especie adicional
c) axnico, en el cual el parasito es cultivado en ausencia de cualquier
organismo.
d) El trmino "polixnico" algunas veces es usado errneamente como un
sinnimo de xnico. Este trmino polixnico debe referirse solamente a
cultivos en los cuales es conocida la identidad de todas las especies
presentes.
Sin la posibilidad de cultivar un determinado parsito, se recurre al cultivo en
tejidos de clulas o a la inoculacin en animales, mtodos ms laboriosos y
antieconmicos.







MATERIALES Y METODOS

I. Aislamiento de Entamoeba histolytica de materia fecal, en
Medio Difasico LE.

Solucin de Locke:
Disuelva los reactivos en el siguiente orden:
1000 ml de agua destilada
8.0 g de cloruro de sodio
0.2 g de cloruro de calcio
0.2 g de cloruro de potasio
0.01 g de cloruro de magnesio
2.0 g de fosfato de sodio dibsico
0.4 g de bicarbonato de sodio
0.3 g de fosfato de potasio monobsico.
Esterilice en autoclave durante 15 min a 121C y 15lb/in
2
de presin. Enfre a
temperatura ambiente. Si hay cualquier precipitado, separe por filtracin, en
papel Whatman no. 1. Vuelva a esterilizar en autoclave.

Preparacin de la fase slida con huevo:
Se esteriliza la superficie de huevos frescos de gallina, mediante flameado con
etanol de 70% y enseguida se rompe y se deja caer en una probeta graduada
estril. Se aaden 12.5 ml de sol. de Locke por cada 45 ml de huevo. Se
emulsifica en una licuadora y se filtra a travs de una gasa, utilizando vaco
hasta eliminar todas las burbujas de aire. Se adicionan cantidades de 5 ml de
huevo emulsificado a tubos de cultivo de 16 x 125 mm con tapn de rosca
aflojado, y se autoclavean a 100C durante 10 min., colocando los tubos
inclinados, en un ngulo que produzca 12 a 15 mm de huevo en el fondo del
tubo. El medio inclinado resultante debe quedar libre de burbujas. Se enfran a
temperatura ambiente y el huevo solidificado se cubre con 6 ml de solucin de
Locke. Se esteriliza a 121C durante 15 min a una presin de 15 lb/in
2
.
Despus de enfriar los medios inclinados a temperatura ambiente, se aprietan
los tapones y se pueden refrigerar hasta seis meses.

Inoculacin de los medios :
Las muestras de heces se emulsifican en solucin salina fisiolgica y se filtran
por una gasa para eliminar las partculas gruesas antes de inocular el medio.
Sin embargo puede aadirse directamente al medio una cantidad de heces del
tamao de un chcharo.
Es bueno incluir porciones de heces con sangre y moco. Tambin puede usarse
un concentrado obtenido del mtodo de flotacin con sulfato de zinc o con
sacarosa, lo que reduce la cantidad de debris mientras se concentran los
quistes en la muestra. Sin embargo el sulfato de zinc puede daar los quistes.
Los tubos del cultivo conteniendo medio e inculados con las heces, se incuban
verticalmente a 35.5C

durante 48 hs y se examinan. Puede extraerse una gota
de sedimento del tubo de cultivo y se examina al microscopio entre porta y
cubre.

Alternativamente, los tubos de cultivo pueden examinarse con un microscopio
invertido. Las amibas se observan adheridas a la pared de vidrio del tubo. Si no
hay crecimiento a las 48 hs, se hace una resiembra. La mayor parte del liquido
se descarta y se deja menos de 1 ml en el tubo. El sedimento se resuspende en
el poco liquido que qued y se transfiere a un tubo con medio nuevo y se incuba
otras 48 hs y se vuelve a examinar . Si a este plazo no hay amibas se da por
negativo.

I I . Cultivo de Giardia lamblia

Preparacin del medio TYI-S-33
Se disuelven los reactivos en el orden descrito a continuacin:
600 ml de agua desionizada o destilada
1.0 g de fosfato de potasio dibsico
0.6 g de fosfato de potasio monobsico
2.0 g de cloruro de sodio
20.0 g de peptona digerido de casena
10.0 g de extracto de levadura
10.0 g de glucosa
2.0 g de cloruro de L-cystena
0.2 g de cido ascrbico
1.0 ml de citrato de amonio frrico, forma caf (22.8 mg/ml)
Aada 500 mg de bilis bovina deshidratada por litro.
Lleve a un volumen final de 880 ml y ajuste a pH 7.0 usando una solucin de
hidrxido de sodio 1 N
Esterilice por filtracin a travs de un filtro con poro de 0.22 m. No se
autoclavea. Se reparte en cantidades de 13 ml en tubos de 16 x 150 mm.
El medio estril TYI-base puede ser almacenado a 20C durante varios
meses.

2.1. Los cultivos pueden iniciarse a partir de trofozotos de biopsia duodenal,
pero mas comnmente a partir de heces.
2.2. En primer lugar se procede a la purificacion de los quistes de las heces.
La muestra de heces se diluye 1:12 (vol/vol) en agua destilada. Se toman
20 ml y se colocan en un vasito con unas perlas de vidrio, homogenizando
en un vortex por 5 min., filtrando despus el material a travs de una gasa.
2.4. En un recipiente con hielo se colocan 5 ml del filtrado en un tubo de
centrfuga de 50-ml conteniendo 10 ml de sacarosa 1M. Se centrifuga a
450 x g durante 5 min.
2.5. Se separa el sobrenadante con una pipeta y se diluye a 50 ml con agua.
Centrifugue a 450 x g durante 5 min. Decante y descarte el lquido.
2.6. Se resuspende el sedimento en un tubo de centrfuga de 15 ml
conteniendo 2.5 ml de agua destilada, colocado sobre hielo, y coloque
en la superficie con mucho cuidado, una capa de 10 ml de sacarosa 0.5 M
Centrifugue a 450 x g durante 5 min. Con una pipeta Pasteur, separe
1ml del lquido del fondo y colquelo en un tubo de centrifuga de 15 ml.
2.7. Examine este material y busque quistes de Giardia.

2.8. Diluya a 10 ml con agua distilada y centrifugue a 450 x g durante 5 min.
Decante y elimine el sobrenadante . Resuspenda el sedimento y selo
para inocular los medios de cultivo
2.9 Los Cultivos se inician en tubos de 16 x 125 mm, conteniendo 13 ml de
medio TYI-S-33

o en otro tipo de tubos llenados a

80% de su capacidad.
2.10. El medio TYI-S-33 debe contener antibiticos y antimicticos.


Una combinacin adecuada incluye lo siguiente, por mililitro:

1 g de
anfotericina B (solucin patrn 1-mg/ml), 1 mg de moxolactamo

(solucin
patrn 300-mg/ml ), 1 mg de ticarcillina (solucin patrn 400-mg/ml),
40

g de gentamicina (solucin patrn 40-mg/ml), y 200 U de penicillina


(solucin patron 100,000-U/ml).
2.11. Los tubos de cultivo se incuban verticalmente a 35.5 C y se examinan
diariamente en el microscopio invertido. El medio debe decantarse (o
extraerse con una pipeta) y reemplazarse con medio fresco y antibiticos
diariamente durante la primera semana y despues cada dos dias dos
semanas. Si no se observan trofozotos a este tiempo, el cultivo se
considera negativo. La mayora de los trofozotos se adhieren a la pared
de vidrio.

I I I . Cultivo de Trichomonas vaginalis en

Medio TYM:

Agua destilada 600 ml
20.0 g de peptona digerido de casena (Trypticase)
10.0 g de extracto de levadura
5.0 g de maltosa
1.0 g de cloruro de L-cystena
0.2 g de acido ascorbico
0.8 g de fosfato de potasio dibasico
0.8 g de fosfato de potasio monobasico
Ajuste a pH 6.0.
Se lleva a 900 ml con agua destilada y se reparten cantidades de 90-ml en
frascos. Esterilice en autoclave 15 min a 121C y 15 lb/in
2
de presin. Puede
almacenarse por varios meses a 20C . Para completer el medio adicione al
medio 10 ml de suero bovino inactivado con calor, en condiciones de esterilidad.
Deben adicionarse al medio antibiticos y

antifngicos. Es efectiva una
combinacin de penicillina, estreptomycina y kanamycina, ms mycostatina o
nystatina en concentracin de 100 g/ml

Nota: No utilizar el medio despus de 1 semana de su preparacin.

Inoculacin de los medios:
Para el cultivo de Trichomonas se inoculan tubos del medio con un exudado
vaginal sospechoso del parsito. Los tubos de cultivo se incuban verticalmente
a 35.5 C y se examinan diariamente durante 4 dias., en un microscopio
invertido. Despus de ese tiempo si no se observa crecimiento se considera
negativo.


Bibliografa:
C. Graham Clark
1*
and Louis S. Diamond
2
Methods for Cultivation of Luminal Parasitic Protists of Clinical Importance
Clin Microbiol Rev. 2002 July; 15(3): 329341.

Proveedores:
American Laboratories, Inc., Omaha, Nebr., gastric mucin (catalog no. 014); Becton
Dickinson Co., Cockeysville, Md., BBL casein digest peptone (catalog no. 211921) and
yeast extract (catalog no. 288620); Biofluids, Inc., Rockville, Md., vitamin mixture 18
(catalog no. 318) and adult bovine serum (catalog no. 203); VWR International, Poole,
United Kingdom, starch rice powder (catalog no. 21150294); Sigma Aldrich, St. Louis,
Mo., adult bovine serum (catalog no. B-2771) and yeast extract (catalog no. Y-1625);
Oxoid Ltd., Basingstoke, United Kingdom, liver digest neutralized (LP027).