UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DEMEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
9
DESARROLLO Y ESTANDARIZACIN
DEUN BANCO DE SANGRE DE
CORDN UMBILICAL
TESIS DOCTORAL
Rafael Bornstein Snchez
Madrid, 1999
P23152
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
II l i i i U N U i i i 1 1 1 1 1 1 1 M M ID
* 530988690 X
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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
6 I~4 2~.4Z
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DESARROLLO Y ESTANDARIZACIN DE UNBANCO
DE SANGRE DE CORDN UMBILICAL
Memoria que para optar al Grado de Doctor en
Medicina presenta el
Lcdo. Rafael Rornstein Snchez.
Directora: Dra. Florinda GIsanz Rodrguez
Profesora Titular de la U.C.M.
Facultad de Medicina.
Madrid, Diciembre de 1999
ISIt3IJOTECA
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido realizado gracias a la colaboracin de los Servicios de Hematologa
y Hemoterapia, Obstetricia y Ginecologa, Inmunologa y Microbiologa del Hospital 12 de
Octubre de Madrid, as coma del Laboratorio de Citometra de Flujo del Servicio de
Hematologa y Hemoterapia del Hospital de Getafe. Adems, el respaldo institucional y la
confianza depositada en nuestro centro han permitido generar las infraestructuras necesarias
para la creacin del Banco de Sangre de Cordn Umbilical del IINSALUD, con sede en el
Hospital 12 de Octubre, cuyo desarrollo ha dado lugar a esta tesis doctoral.
Agradezco a la Prof. Florinda Gilsanz haber aceptado dirigir esta tesis, los estmulos para
iniciar el trabajo y desarrollar las diferentes etapas del mismo, as como todo el apoyo prestado.
Ala Dra. Claude Auray agradezco su contribucin en muchos de los anlisis realizados y
la dedicacin constante en la recogida y procesamiento de la numerosa informacin manejada.
Asimismo, debo agradecer el apoyo de todos los miembros del Servicio de Hematologa, siendo
destacable el esfuerzo de las enfermeras y tcnicos de laboratorio que han posibilitado la
ejecucin de este estudio. Quiero mencionar entre ellos a Paloma Garca por su vinculacin ms
directa al mismo.
Agradezco al Prof. Pedro de la Fuente, al Dr. Jess Grande, al Dr. Alberto Galindo, y a
todas las enfermeras del Departamento de Obstetricia y Ginecologa que han participado en la
obtencin de las unidades de sangre de cordn umbilical, en especial a Teresa Cabrera y Elosa
Muoz, la ilusin que han demostrado tener en este proyecto desde su inicio y la constante
dedicacin al mismo.
Al Prof. Antonio Arnaiz y al Dr. Jorge Martnez-Laso agradezco la valiosa contribucin
de los estudios de tipaje liLAy las sugerencias aportadas por ambos en este ampo.
Al Prof. Antonio Noriega y al Dr. Antonio Fuertes tengo que agradecer los estudios
microbiolgicos que han tenido que llevarse a cabo para la validacin final de las unidades de
sangre de cordn umbilical.
Mi agradecimiento al Dr. Jos Garca Vela por su inestimable colaboracin en los
estudios con citometra de flujo que han resultado en la caracterizacin fenotpica del sistema
linfohematopoytico de sangre de cordn umbilical. Deseo dejar aqu constancia de su
disposicin permanente a prestar la ayuda necesaria y de su gran profesionalidad.
Agradezco la generosidad de los padres que han aceptado donar de manera altruista la
sangre de cordn durante el nacimiento de sus hijos. Sin su especial e imprescindible
contribucin, esta tesis y el Banco de Sangre de Cordn Umbilical establecido hubieran sido
imposibles.
En ltimo lugar, al tratarse de las personas de mayor importancia para m, quiero sealar
con especial cario y el reconocimiento ms profundo la ayuda que mi familia y amigos no han
dudado en proporcionarme a lo largo de todo el tiempo que he necesitado para escribir esta tesis.
Al haber contado siempre con su comprensin y nimo, haber podido afrontar un reto como es
ste gracias a su apoyo incondicional y aprendido de ellos tantas cosas que van ms all de la
propia tcnica y, en defmitiva, haber trabajado en cercana de quienes me son tan queridos, creo
que no exagero al afirmar que esta tesis es igualmente tan suya como ana.
NDICE
ndice
ABREVIATURAS 1
INTRODUCCIN 3
1.- LA SANGRE DE CORDN UMBILICAL COMO FUENTE DE CLULAS
PROGENITORAS HEMATOPOYTICAS 4
1.1.-Antecedentes histricos 6
1.2.- Resultados clnicos del trasplante no relacionado de SCU 7
1.3.- Caractersticas biolgicas de la SCU 10
1.3. 1.- Propiedades inmunolgicas de las clulas de SCU 11
1.3.2.- Frecuencia de clulas progenitoras hematopoyticas en SCU 12
1.3.3.- Fenotipo de las clulas progenitoras hematopoyticas en SCU 13
1.3.4.- Diferencias funcionales in vitro e in vivo entre clulas progenitoras
hematopoyticas de SCU y MO adulta 14
1.3.5.- Expansin ex vivo de SCU 16
2.- PROGRAMAS DEBANCOS DE SANGRE DE CORDN UMBILICAL 19
2.1.- Procesamiento de SCU y su influencia en los resultados clnicos de
trasplante de SCU 20
2.2.- Implicaciones sobre la actividad de los Bancos de SCU derivadas de la
experiencia en trasplante de SCU 21
2.2.1.- Contenido celular de las unidades de SCU 23
2.2.2.- Tipaje HLAde clase 1 y clase II de alta resolucin 24
2.2.3.- Actividad injerto contra leucemia (ICL) de la SCU 25
OBJETIVOS 27
MATERIALES Y MTODOS 29
1.- MATERIALES 30
1.1.-Impresos para la donacin de SCU 30
1.2.- Material para la obtencin de SCU 30
1.3.- Material para el procesamiento y caracterizacin de SCU 30
ndice
1.4.- Reactivos para el procesamiento y caracterizacin de SCU 30
1.5.- Muestras 32
2.- MTODOS 33
2.1.-Seleccin de donantes de SCU 33
2.2.- Obtencin de SCU 33
2.2.1.- Placenta pura utero (Fraccin 1~ ) 34
2.2.2.- Placenta ex utero (Fraccin 2~ ) 34
2.2.3.- Conservacin de las unidades de SCU hasta el procesamiento 34
2.3.- Procesamiento de las unidades de SCU 35
2.3.1.-Identificacin 35
2.3.2.- Muestra de suero materno 35
2.3.3.- Sangre de cordn umbilical 35
2.3.3.1.- Separacin celular con gradientes de densidad 36
2.3.3.2.- Sedimentacin de hemates con metilcelulosa 1% 36
2.3.3.3.- Sedimentacin de hemates con gelatina 3.5% 37
2.3.3.4.- Sedimentacin de hemates con hidroxietil almidn 6% 37
2.3.3.5.- Criopreservacin 37
2.3.3.6.- Descongelacin 39
2.4.- Recuento y viabilidad celular 39
2.5.- Anlisis por citometra de flujo 39
2.5.1.- Anlisis de antgenos de superficie 39
2.5.2.- Anlisis de citocinas intracelulares 40
2.6.- Cultivos de progenitores hematopoyticos 41
2.7.- Determinacin de antgenos HLA 41
2.7.1.- Antgenos HLA de clase 1 42
2.7.2.- Antgenos HLA de clase 11 43
2.8.- Anlisis estadstico 43
2.8.1.- Comparacin de muestras independientes
(prueba U de Mann-Whitney) 43
2.8.2.- Comparacin de variables categricas
(prueba de Chi-cuadrado) 44
2.8.3.- Comparacin de medias (prueba r ) 44
2.8.4.- Anlisis de correlacin bivariante 44
2.8.5.- Regresin lineal 44
ndice
RESULTADOS 46
1.- CARACTERSTICAS HEMATOPOYETICAS E INMUNOLGICAS DELA
SANGRE DECORDN UMBILICAL. AN LISIS DELAMUESTRA DEESTUDIO 47
1.1.- Clulas nucleadas totales en SCU 48
1.2.- Clulas primitivas y progenitoras hematopoyticas de SCU. Comparacin
con mdula sea y sangre perifrica movilizada del adulto 50
1.2.1.- Anlisis fenotpico de clulas CD34# 51
1 2 11.- Clulas primitivas 52
1.2.1.2.- Clulas progenitoras granulocito-macrofgicas 53
1.2.1.3.- Clulas progenitoras megacariocticas 54
1.2.1.4.- Clulas progenitoras linfoides B 55
1.2.2.-Clulas formadoras de colonias 56
1.2.2.1.- CFU-GEMM, CFU-GM y BFU-E 56
1.2.2.2.- CFU-Mk 58
1.3.- Clulas linfocitarias de SCU. Comparacin con sangre perifrica de adulto 59
1.3. 1.- Anlisis fenotpico de poblaciones linfocitarias 59
1 . 3 . 1 . 1 . - L i n f o c i t o s T 60
1 . 3 . 1 . 2 . - L i n f o c i t o s B 64
1 . 3 . 1 . 3 . - C l u l a s NK 65
1.3.2.- Produccin de citocinas por linfocitos T 66
2.- CRITERIOS DESELECCION DE DONANTES DE SCU 70
2.1.- Exclusiones predonacin 71
2.2.- Exclusiones en el periodo inmediato postparto 73
2 . 2 . 1 .- I n f e c c i o n e s b a c t e r i a n a s 7 3
2 . 2 . 2 . - I n f e c c i o n e s v r i c a s y parasitarias 74
2.2.3.- Enfermedades hereditarias 76
2.3.- Control a los 90 das del parto 76
2.3.1.- Tasa de cumplimentacin 76
2.3.2.- Infecciones vfricas y parasitarias 76
2 . 3 . 3 . - En f e r me da de s h e r e di t a r i a s 7 7
2 . 3 . 4. - C o n f i r ma c i n de l tipaje HL A mediante el haplotipo materno 78
3 . - ESTANDARI ZAC I N DE L OS MTODOS DE OBTENC I N Y
PROC ESAMI ENTO DE L A SC U 7 9
3 . 1 . - Op t i mi z a c i n de l procedimiento de obtencin de SCU 79
3.1.1.- Volumen y celularidad total de las unidades de SCU 80
ndice
3.1.2.- Recogida de SCU mediante puncin de la vena umbilical 82
3.1.3.- Obtencin complementaria de SCUmediante perfusin de
la placenta 82
3.2.- Efecto de distintas medidas de asepsia preventivas de contaminacin
bacteriana durante la recogida de SCU 85
3.3.- Re p e r c u s i n de l i n t e r v a l o e n t r e l a o b t e n c i n y e l p r o c e s a mi e n t o de
l a SC U sobre la viabilidad celular 86
3.3.1.- Clulas nucleadas 88
3.3.2.- Clulas progenitoras hematopoyticas 90
3 . 4. - F a c t o r e s p r e di c t i v o s de v o l u me n y c e l u l a r i da d de las unidades de SCU 94
3.4.1.- Variables dependientes 95
3 . 4. 2 . - V a r i a b l e s p r e di c t o r a s 96
3 . 4. 3 . - Mo de l o s de r e g r e s i n m l t i p l e 97
3 . 5 . - Se p a r a c i n c e l u l a r y r e du c c i n de volumen. Recuperacin obtenida con
l o s di f e r e n t e s m t o do s de f r a c c i o n a mi e n t o 100
3 . 5 . 1 . - G r a di e n t e s de de n s i da d 1 02
3 . 5 . 2 . - Ag e n t e s de s e di me n t a c i n 104
3.6.- Criopreservacin 106
3.6.1.- Optimizacin de los programas de congelacin segn formato
y volumen 108
3.6.2.- Viabilidad de SCU criopreservada en diferente formato y volumen 108
3.6.3.- Efecto del almacenamiento transitorio a - 80
0C previo al
definitivo en nitrgeno lquido a - 1960C 111
3.7.- Descongelacin 113
4.- VALIDACION DELAS UNIDADES PROCESADAS DESCU 115
4.1.- Tipaje 1-LA. Frecuencias allicas y de haplotipos en las unidades de SCU
p r o c e s a da s 1 1 6
4. 2 . - C r i t e r i o s f i n a l e s de e l e g i b i l i da d 1 1 9
4.2.1.-Consentimiento informado 119
4.2.2.- Obtencin/Procesamiento/Congelacin 120
4.2.3.- Historia materna y familiar 121
4.2.4.- Revisin de los resultados analticos 122
4.3.- Envio de unidades de SCU validadas al Registro Espaol de Donantes
de Mdula sea (REDMO)
122
ndice
ANEXOS
Anexo 1 Hoja de informacin sobre la donacin de sangre de
cordn umbilical.
Anexo U Consentimiento informado para la donacin voluntaria de
sangre de cordn umbilical.
Anexo III Protocolo de obtencin de sangre de cordn umbilical
Recogida de datos de la madre
Recogida de datos de paritorio
Recogida de datos del recin nacido
Recogida de datos de serologa y lactante
Recogida de datos del fraccionamiento y criopreservacin
Solicitud de bsqueda de unidades de SCU compatibles
Informe preliminar de compatibilidad
Informe definitivo de unidades compatibles
Anexo IV
Anexo V
Anexo VI
Anexo VII
DISCUSIN
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFA
124
153
155
180
181
184
187
192
195
197
199
ABREVIATURAS
Abreviaturas
ABREVIATURAS
B FU-E
CFU-GEMM
CFU-GM
CFU-Mk
CMV
DMSO
EICH
HBsAg
HES
HLA
ICL
IFN-y
IL-2
IL-4
MO
PMA
REDMO
SC I D/NOD
SCU
SPA
SPM
TPH
VHC
VIIi
Clula formadora de bursts eritroides
Clula formadora de colonias mixtas
macrfago-megacariocito)
Clula formadora de colonias granulocito-macrofgicas
Clula formadora de colonias megacariocticas
Citomegalovirus
Dimetilsulfxido
Enfermedad injerto contra husped
Antgeno de superficie del vims de la hepatitis 8
Hidroxietil almidn
Sistema mayor de histocompatibilidad (uman-Leucocyre-wztigens)
Actividad injerto contra leucemia
Interfern-y
Interleucina-2
Interleucina-4
Mdula sea
forbol- 1 2-miristato- 13-acetato
Registro Espaol de Donantes de Mdula sea
Cepa murina con inmunodeficiencia severa combinada diabetes
sin obesidad
Sangre de cordn umbilical
Sangre perifrica de adulto
Sangre perifrica movilizada
Trasplante alognico de clulas progenitoras hematopoyricas
Virus de la hepatitis C
Virus de la inmunodeficiencia humana
(granulocito-eritroblasto-
2
INTRODUCCIN
Introduccin
1.- LA SANGRE DE CORDN UMBILICAL COMO FUENTE DE CELULAS
PROGENITORAS HEMATOPOYTICAS.
El trasplante alognico de clulas progenitoras hematopoyticas (TPH) de mdula sea
(MO) y sangre perifrica movilizada (SPM) constituye un tratamiento estndar en determinadas
enfermedades malignas, anemia aplsica severa adquirida, anemia aplsica constitucional,
inmunodeficiencias congnitas y enfermedades metablicas hereditarias (Gratwohl y cols.,
1996). Sin embargo, y a pesar del progreso mantenido en este campo desde los aos 70, cuando
se consiguieron llevar a cabo con xito los primeros trasplantes de MO, no se han podido
solventar las importantes limitaciones de las que todava adolece esta terapia. Entre ellas, caben
citarse la carencia de donantes compatibles en los antgenos del sistema HLA en cerca del 50%
de los pacientes, an cuando los registros internacionales cuentan en la actualidad con ms de
1.5 millones de donantes de mdula sea HLA-A, -B y -DR tipados (Confer, 1997), y la elevada
toxicidad inherente al procedimiento. Esta ltima se relaciona con: i) complicaciones precoces
producidas principalmente por dao endotelial, representado en su ms dramtica expresin por
la enfermedad heptica veno-oclusiva (Bearman, 1995; Carreras y cols., 1998), neumonitis
intersiticial idioptica (Kantrow y cols., 1997) y microangiopata trombtica/sndrome urmico
hemoltico (Schriber y Herzig, 1997); u) la alta incidencia y severidad de enfermedad injerto
contra husped (EICH) aguda y crnica, aunque, por otro lado, puede ofrecer como
contrapartida proteccin inmune frente a la recidiva tumoral (Weisdorf y cols., 1990; Keman y
cols., 1993; Ochs, 1994); iii) el riesgo de infecciones en el periodo de aplasia, durante la fase de
EICH aguda y en periodos ms tardos (Wingard, 1990; Zaia, 1990); y iv) complicaciones
diferidas que afectan a diferentes rganos y sistemas (Borgstrom y Bolme, 1994; Cohen y cols.,
1995; Apperley y Reddy, 1995; Deeg y Soci, 1998)
El descubrimiento en la sangre de cordn umbilical (SCU) de un nmero elevado de
clulas progenitoras hematopoyticas (Nakahata y Ogawa, 1982; Broxmeyer y cols., 1989) y el
xito del primer trasplante realizado en 1988 en un paciente con Anemia de Fanconi (Gluckinan
y cols., 1989), impulsaron el desarrollo de programas de bancos de SCU en New York,
Dtisseldorf y Miln en 1993, y posteriormente en otras ciudades de Norteamrica, Europa, Japn
4
Introduccin
y Australia durante 1993-1998. Con el establecimiento de estos bancos se pretendi, por una
parte, aliviar la falta de donantes de MO, por otra, acortar el proceso de bsqueda de los
mismos. En el momento presente, diferentes bancos de SCU tienen disponibles, para su
utilizacin clnica por cualquier centro de trasplante en todo el mundo, cerca de 20.000 unidades
HLA tipadas y almacenadas en nitrgeno liquido, evaluadas en cuanto al riesgo de
enfennedades infecciosas y hereditarias potencialmente transmisibles, y caracterizadas en su
capacidad hematopoytica. La experiencia recogida en aproximadamente 1.000 trasplantes de
SCU realizados hasta la fecha (Kurtzberg y cols., 1996; Gluckman y cols., 1997; Rubinstein y
cols., 1998; Gluckman y cols., 1998) ha pennitido poner en contexto las perspectivas de este
tipo de trasplante y definir cada vez mejor el lugar que ocupa la SCU en comparacin con otras
fuentes de clulas progenitoras hematopoyticas. Del mismo modo, el conocimiento adquirido
sobre el potencial hematopoytico y los requerimientos mnimos de la SCU para su
consideracin como producto de trasplante, estn siendo elementos bsicos para definir los
criterios de estandarizacin y control de calidad de los bancos de SCU, imprescindibles para que
las unidades procedentes de distintos bancos sean suficientemente homogneas y garanticen la
mxima seguridad en los eventuales receptores de trasplante. Esta optimizacin metodolgica
resulta, por tanto, esencial para mejorar los programas de bancos de SCU ya existentes y servir
de referencia obligada para los que se prevean desarrollar en el futuro.
Los resultados clnicos preliminares sobre el trasplante no relacionado de SCU
(Kurtzberg y cols., 1996; Wagner y cols., 1996) sugirieron que la SCU de donantes no
emparentados, procesada y almacenada en bancos de SCU, contena un nmero de clulas stem
y clulas progenitoras suficiente para reconstituir el sistema hematopoytico en nios y adultos
jvenes, con un riesgo de EICH aguda inferior al anticipado. Estas observaciones propiciaron el
inicio de una serie de estudios por parte de numerosos grupos interesados en conocer en
profundidad las caractersticas biolgicas de los progenitores hematopoyticos primitivos de
SCU, as como tambin del sistema inmune neonatal. Ontognicamente, la hematopoyesis se
inicia durante los primeros estadios del desarrollo embrionario en la pared ventral de la aorta
dorsal y en el saco vitelino (Tavian y cols., 1996). Tras una breve fase heptica, las clulas
primitivas hematopoyticas migran hacia los espacios de la mdula sea al final del segundo
trimestre de la gestacin, en donde pennanecen casi de manera exclusiva durante la vida adulta
5
Introduccin
(Moore y Metcalf, 1970). No obstante, y en contraste con esta restriccin medular de la
hematopoyesis en los individuos adultos, es bien sabido desde hace aos que la SCU y la sangre
neonatal contienen clulas progenitoras hematopoyticas en una proporcin elevada. Por
ejemplo, la frecuencia de clulas progenitoras de estirpe granulocito-macrofgica (CFU-GM) es
igual o superior a la de MO adulta (Knudtzon, 1974; Gabutti y cols., 1975; Broxmeyer y cols.,
1989; Broxmeyer y cols., 1992). Estos progenitores, sin embargo, abandonan abruptamente la
circulacin neonatal a las pocas horas del nacimiento (Broxmeyer y cols., 1989), reducindose la
frecuencia de los mismos en este corto intervalo hasta los niveles difcilmente detectables en
condiciones basales en sangre perifrica de individuos adultos.
A continuacin se describe el estado actual del conocimiento sobre las propiedades
hematopoyticas de las clulas de sangre de cordn umbilical y las caractersticas del sistema
inmune neonatal, as como los resultados obtenidos en las series ms recientes de trasplante de
SCU. Finalmente, se discuten cuestiones relacionadas con la estandarizacin metodolgica y las
tcnicas de procesamiento dentro de los programas de bancos de SCU, cuestiones que en
conjunto han dado lugar al planteamiento y realizacin del estudio que se propone en esta tesis
doctoral.
1.1.- Antecedentes histricos.
Hasta mediados de los aos 80, la SCU se consideraba generalmente como un material
de desecho despus de tomar las muestras pertinentes para la realizacin de las pruebas
rutinarias en el recin nacido. El primer trasplante de SCU se realiz en octubre de 1988
(Gluckman y cols., 1989), realizndose en los dos aos siguientes un nmero muy escaso de
trasplantes. Cuatro de los cinco primeros trasplantes de SCU se llevaron a cabo en pacientes con
Anemia de Fanconi (Gluckman y cols., 1989; Broxmeyer y cols., 1990; Broxmeyer y cols.,
1991; Kohli-Kumar y cols., 1993), mientras uno fue realizado para el tratamiento de una
leucemia mielomonoctica crnica juvenil (Wagner y cols., 1992). La racionalidad de estos
t r a s p l a n t e s de SC U p r o c e de n t e de h e r ma n o s HL A idnticos fue sustentada en estudios de
laboratorio que sugeran que la SCU era una fuente potencial de clulas progenitoras
hematopoyticas trasplantables (Broxmeyer y cols., 1989; Broxmeyer y cols., 1992).
6
Introduccin
Desde los primeros trasplantes realizados con material obtenido de un hermano HLA
compatible o con una disparidad antignica (Gluckman y cols., 1989; Wagner y cois., 1992;
Vilmer y cols., 1992; Bogdanic y cols., 1993; Kohli-Kumar y cols., 1993; Vowels y cols., 1993;
Pahwa y cols., 1994; Brichard y cols., 1995; Issaragrisil y cols., 1995; Wagner y cols., 1995;
Brichard y cols., 1996; Stary y cols., 1996; Zix-Kieffer y cols., 1996), el campo ha avanzado
r p i da me n t e h a s t a l a u t i l i z a c i n de clulas con ms de una disparidad HLA (Kurtzberg y cols.,
1994). Por su parte, los trasplantes de donantes no relacionados han llegado a un punto en el que
superan en nmero a los trasplantes de donantes familiares (Kurtzberg y cols., 1996; Laporte y
cols., 1996; Wagner y cols., 1996; Gluckman y cols., 1997; Rubinstein y cols., 1998). La
celeridad con la que se ha adquirido esta experiencia clnica en trasplante no relacionado de
SCU se debe al establecimiento de los bancos de SCU mencionados (Gluckman, 1994;
Rubinstein y cols., 1993), siendo el de mayor entidad el banco ubicadoen el New York Blood
Center bajo la direccin del Dr. Pablo Rubinstein. La gran mayora de trasplantes no
relacionados de SCU realizados hasta la fecha han utilizado clulas de donaciones obtenidas en
este banco (Kurtzberg y cols., 1996; Laporte y cols., 1996; Wagner y cols., 1996; Gluckman y
cols., 1997; Rubinstein y cols., 1998;).
1.2.- Resultados clnicos del trasplante no relacionado de SCU.
Las dos series ms numerosas analizadas en detalle han sido recopiladas por el Banco de
SCU de New York (562 pacientes) (Rubinstein y cols., 1998) y el registro Eurocord-Cord Blood
Transplant Group (318 pacientes) (Gluckman y cols., 1998). En ambos grupos, ms del 80% de
los trasplantes fueron realizados en nios. Aproximadamente dos terceras partes de los
receptores padecan leucemia o linfoma, y un tercio de los pacientes leucmicos fueron
trasplantados en fases avanzadas de la enfermedad. En ambas series, los trasplantes de SCU
fueron realizados en un nmero muy amplio de hospitales de distintos pases. Por esta razn, no
es posible comparar el efecto de diferentes regmenes preparativos y profilcticos sobre el
resultado del trasplante. En cuanto a los bancos de SCU que proporcionaron las unidades, en el
primer estudio todas procedan de un nico banco, mientras que en el segundo las unidades
procedan de ocho bancos diferentes. En el 94% de los casos de Eurocord, las unidades fueron
proporcionadas por los bancos de New York, Dtisseldorf, Miln y Barcelona. Por ltimo,
7
Introduccin
mientras los 562 receptores del estudio del Banco de New York fueron trasplantados con
unidades de donantes no relacionados, los 318 pacientes de la serie Eurocord incluan 102 casos
trasplantados con SCU de donantes familiares.
Los datos clnicos del estudio de New York han mostrado una relacin significativa entre
el tiempo de implante de granulocitos y plaquetas y la dosis celular infundida. A este respecto,
cabe sealar una observacin interesante en cuanto a la recuperacin de plaquetas, que fue
especialmente tarda en comparacin con las series publicadas de trasplante de MO o SPM
(Kernan y cols., 1993). Por otra parte, la frecuencia de eventos relacionados con el trasplante,
definidos como muerte, reconstitucin autloga o segundo trasplante, mostr una correlacin
significativa con la dosis celular y con la edad y el diagnstico del paciente, siendo mnima en
receptores de hasta 2 aos de edad y mxima en receptores con anemia aplsica severa. La
incidencia de EICH aguda grado 1 1 1 -1 V y EICH crnica fue 23% y 25%, respectivamente.
Finalmente, la frecuencia de recidiva, que fue de un 26% al ao del trasplante en pacientes con
leucemia aguda, estaba significativamente relacionada con el estadio de la enfermedad. La
estimacin mediante curvas de Kaplan-Meier de la supervivencia libre de eventos a los 100 das
fue del 49%.
Los 102 nios (72 con neoplasias malignas) de la serie Eurocord sometidos a trasplante
no relacionado mostraron, de forma similar, tiempos prolongados de implante plaquetar. La
incidencia de EICH aguda grado 11-1V fue 37%. La supervivencia a los 2 aos fue 32% en
pacientes con neoplasias malignas y 70% en aquellos con inmunodeficiencias/enfermedades
metablicas. Cuando los pacientes fueron estratificados por diagnsticos, la supervivencia a un
ao fue 70%, 35% y 10% en receptores con enores innatos del metabolismo, neoplasias
malignas, y anemia aplsica constitucional/adquirida, respectivamente. Los factores asociados
con una mejor supervivencia fueron la serologa negativa para citomegalovirus (CMV) antes del
trasplante y la compatibilidad de grupo sanguneo ARO. Estos datos pueden compararse con los
obtenidos en 42 receptores adultos de trasplante no relacionado con neoplasias malignas,
comunicados tambin por Eurocord, 67% de los cuales pertenecan a grupos de alto riesgo
(definidos como una fase ms avanzada que segunda remisin completa en pacientes con
leucemia aguda, o primera fase crnica en leucemia nteloide crnica). Estos pacientes tuvieron
8
Introduccin
una probabilidad y velocidad de implante de neutrfilos y plaquetas similares a los receptores
peditricos. Sin embargo, presentaron una mayor incidencia de EICH y una menor
supervivencia. En particular, la supervivencia a un ao en pacientes adultos fue 36% y 7% en
subgrupos de bajo y alto riesgo, respectivamente. Los factores favorables de supervivencia en
pacientes adultos con neoplasias malignas en la serie Eurocord fueron el nmero de clulas
nucleadas infundidas superior a 1x10
7/kg de peso corporal y un estadio precoz de la enfermedad
en el momento del trasplante.
El trasplante no relacionado de SCU en nios con leucemia aguda ha sido
especficamente investigado por Locatelli y cols. (1999), quienes examinaron 40 pacientes con
leucemia linfoblstica y 20 pacientes con leucemia mieloblstica registrados entre abril de 1990
y diciembre de 1997 en Eurocord. Este grupo de pacientes inclua 42 y 18 pacientes
trasplantados en condiciones de bajo y alto riesgo, definidas como primera o segunda remisin
c o mp l e t a y e n f e r me da d m s a v a n z a da . La superivencia libre de eventos a los 2 aos estimada
con curvas de Kaplan-Meier en estos dos grupos pronsticos fue 40% y 7%, respectivamente.
En r e s u me n , los datos descritos por los investigadores del Banco de New York y del
r e g i s t r o Eurocord-Cord Blood Transplant Group indican que los resultados del trasplante
a l o g n i c o no relacionado de SCU estn fuertemente condicionados por la dosis celular
infundida, siendo ms eficaz en nios que en adultos, adems de ser muy dependientes del
e s t a di o de l a e n f e r me da d e n el momento del trasplante. Ambos estudios han mostrado una
menor frecuencia e intensidad de EICH, y un mayor tiempo de implante plaquetario en
comparacin con receptores de MO y SPM. Globalmente, la tasa de recidiva y la probabilidad
de implante hematopoytico no han sido diferentes de las que cabra esperar en un grupo
comparable de pacientes trasplantados con MO o SPM. Aunque los datos del Programa de New
York parecen apoyar un efecto negativo de la incompatibilidad HLA entre donante y receptor,
sta no demostr tener ninguna asociacin significativa con la supervivencia en la serie
comunicada por Eurocord. Se necesitan, por tanto, estudios ms amplios para poder obtener
evidencias conclusivas en este aspecto concreto.
9
Introduccin
Si bien estos resultados preliminares muestran la potencialidad de la SCU en el
tratamiento de diversas enfermedades, la informacin disponible no es an suficiente para sentar
indicaciones firmes del trasplante no relacionado de SCU como alternativa a otras fuentes de
clulas progenitoras hematopoyticas. En general, algunos datos publicados o presentados en
foros cientficos relevantes indican que el resultado del trasplante de SCU no es favorable en
pacientes trasplantados en condiciones de alto riesgo, particularmente cuando la dosis de clulas
nucleadas por kg de peso es inferior a 2x10
7. Hasta que no se disponga de informacin ms
precisa, la recomendacin ms extendida es solicitar una bsqueda simultnea en los registros de
do n a n t e s v o l u n t a r i o s de MO y e n l o s b a n c o s de SCU, adoptando la decisin final en funcin del
grado de compatibilidad HLA, la disponibilidad del donante, la urgencia del trasplante, el
nmero de clulas presentes en la SCU, la edad, sexo y nmero de embarazos del donante y el
estado serolgico para CMV (Gluckman y cols., 1998). Sin embargo, a medida que los
trasplantes de SCU no solo aumenten en nmero, sino que adems se efecten en una fase
evolutiva ms temprana de la enfermedad y se pueda comparar as la eficacia de las distintas
fuentes de trasplante, cabe esperar que termine evidencindose la superioridad clnica que, con
respecto a MO y SPM, previsiblemente demostrar la SCU dadas las peculiares caractersticas
hematopoyticas e inmunolgicas que poseen las clulas sanguneas neonatales.
1.3.- Caractersticas biolgicas de la SCU.
La SCU tiene muchas ventajas tericas sobre las clulas de MO y 5PM debido a la
relativa inmadurez que presentan los sistemas hematopoytico e inmunitario durante el periodo
perinatal. En comparacin con las clulas hematopoyticas adultas, los progenitores
hematopoyticos de SCU tienen una mayor proporcin de clulas stem ms primitivas con
capacidad de repoblacin in vivo a largo plazo. Estas propiedades confieren una ventaja
proliferativa a las clulas hematopoyticas de SCU que debera compensar la limitacin en el
nmero de clulas trasplantadas y, en consecuencia, ser suficiente para reconstituir la
hematopoyesis despus de un tratamiento mieloablativo en nios y tambin en adultos.
Por otro lado, dada la relativa inmadurez de los linfocitos de SCU, es razonable predecir
una menor frecuencia e intensidad de EICH en los trasplantes de SCU que en los de clulas stem
o
Introduccin
hematopoyticas de donantes adultos, los cuales contienen un mayor nmero de clulas T
activadas. Estas caractersticas inmunolgicas deberan conducir al establecimiento de criterios
menos estrictos de compatibilidad HLA entre donante y receptor en los trasplantes de SCU.
1.3.1.- Propiedades inmunolgicas de las clulas de SCU.
La enfermedad injerto contra husped es una consecuencia de la activacin de clulas T
derivadas del donante que reconocen aloantgenos especficos del receptor. El sndrome clnico
es la culminacin de una serie compleja de eventos que implican no solo la estimulacin
linfocitaria va receptor de la clula T y diversas molculas coestimuladoras, sino tambin la
liberacin de citocinas proinfiamatorias. La proliferacin clonal de clulas T del donante, la
activacin de otras clulas efectoras (clulas T citotxicas, clulas natural killer [NK]) y la
secrecin de diversas citocinas conduce al dao tisular y, subsecuentemente, a las
manifestaciones de la enfermedad. La observacin clnica de que la EICHes menos frecuente y
menos severa, y qu e l o s r e qu e r i mi e n t o s de compatibilidad HLA pueden ser menores en los
receptores de SCU que en los receptores de otras frentes de clulas progenitoras
hematopoyticas, ha propiciado numerosos estudios con un objetivo comn: intentar explicar los
mecanismos por los que el sistema inmunitario neonatal no es capaz de generar una respuesta de
la magnitud con la que responden normalmente las clulas adultas.
La principal conclusin de estos estudios indica que los linfocitos de SCU tienen un
fenotipo naive (Madrigal y cols., 1997; Cohen y cols., 1998), y que funcionalmente estos
linfocitos T inmaduros son muy susceptibles a la induccin de tolerancia inmunolgica
(Roncarolo y cols., 1996). Segn describen estos investigadores, la activacin repetida in vitro
de clulas Tde SCU con aloantgenos da lugr a la incapacidad de proliferacin o de produccin
de citocinas cuando estas clulas son estimuladas de nuevo con el mismo antgeno. Apesar de
estos hallazgos de laboratorio, an no ha podido determinarse positivamente que estas
propiedades sean responsables de la menor capacidad de las clulas de SCU para generar EICH.
Un mecanismo que resulta especialmente atractivo para explicar la menor frecuencia y severidad
de EICH podra consistir en la expresin y produccin disminuida de interleucina-12 (IL-12),
11
Introduccin
una citocina crtica en la regulacin de las funciones T y NK, en clulas activadas de SCU en
comparacin con sangre perifrica del adulto (SPA) (Lee y cols., 1996).
No obstante las diferencias encontradas entre clulas fetales y adultas, existen dos
lagunas importantes que impiden extraer conclusiones firmes a partir de estos datos. En primer
lugar, el hecho de que la mayora de los trasplantes de SCU hayan sido realizados en nios,
cuando es bien conocido que los pacientes jvenes pueden tolerar mayor grado de
incompatibilidad HLA que los adultos. Adems, los estudios que revelan una funcin alterada
de los linfocitos de SCU han sido realizados comparando clulas mononucleadas de SCU y SPA
(Cohen y cols., 1998), cuando hubiese sido probablemente ms relevante un anlisis
comparativo entre SCU y MO al tratarse de las dos fuentes de trasplante ms habituales. En este
sentido, existen algunos estudios de inters que describen una capacidad citotxica aumentada
en SCU en comparacin con MO (Gardiner y cols., 1998). Este aspecto puede tener un impacto
significativo en el resultado del TPH, al sugerir que la SCUpodra pseer un mayor potencial de
actividad injerto contra leucemia (ICL).
1.3.2.- Frecuencia de clulas progenitoras hematopoyticas en SCU.
En comparacin con MO de individuos adultos, la SCU contiene una mayor proporcin
de progenitores clonognicos primitivos (Hows y cols., 1992) y una frecuencia ocho veces
mayor de progenitores clonognicos de alto potencial proliferativo (CFU-HPP), que son clulas
progenitoras capaces de dar lugar a colonias de gran tamao (Lu y cols., 1993). Ambas fuentes
de clulas stem hematopoyticas muestran frecuencias similares de clulas iniciadoras de
cultivos a largo plazo (LTC-IC), una poblacin de progenitores muy precoces incapaces de
formar colonias en cultivos semislidos, pero capaces de dar lugar a clulas fonnadoras de
colonias despus de varias semanas en cultivos a largo plazo tipo Dexter (Pettengell y cols.,
1994).
12
Introduccin
1.3.3.- Fenotipo de las clulas progenitoras hematopoyticas en SCU.
El antgeno CD34, una glicoproteina de membrana, es considerado desde hace ya varios
anos como un marcador bien definido de clulas progenitoras hematopoyticas (Civin y cols.,
1984); de hecho, sigue siendo aceptado como tal en la actualidad, si bien datos recientes
s u g i e r e n que una pequea subpoblacin de clulas que no lo expresan puede comprender
precursores an ms precoces (Huss, 1998). La frecuencia de clulas CD34~ es 0.2-1% y 1-3%
de las clulas nucleadas en SCU y MO adulta, respectivamente (Kinniburgh y Russell, 1993).
Dentro de l&poblacin CD34~ , las clulas sin el antgeno CD38 (CD34~ /CD3W) representan un
subgrupo de clulas ms primitivas cuya proporcin, por el contrario, es superior en SCU que en
MO adulta (aproximadamente 4% vs 1%, respectivamente) (Hao y cols., 1995).
Estas clulas primitivas muestran en SCU y en MO un fenotipo similar (CD34~ , CD3W,
low lo
CD45RA , CD71 W) Adems, la mayora de ellas expresan Thy- (CD9O, un antgeno
inhibidor de l a p r o l i f e r a c i n c e l u l a r ) , c - k i t (C D1 1 7 , e l r e c e p t o r p a r a stem ccli factor, SCF9, y
FLT3 (CD135, el receptor del factor de crecimiento de clulas primitivas FLT3-ligand).
Tambin se caracterizan por una mayor expresin de p-glicoprotena respecto a clulas ms
diferenciadas, como refleja la menor retencin citoplasmtica de rodamina (Rho). La expresin
de HLA-DR en LTC-IC es diferente en SCU respecto a MO adulta, siendo detectable solo en los
progenitores primitivos de SCU (Traycoff y cols., 1994a).
En resumen, la evidencia actual indica que las clulas progenitoras hematopoyticas ms
primitivas presentes en SCU y MO adulta comparten un mismo fenotipo: CD34~ 3W 45RAow
low
71 Thy-~ c~ kitOW Rho . La frecuencia de clulas con este fenotipo en SCU es
aproximadamente 1 en 30.000 clulas nucleadas. Globalmente, la proporcin de clulas
p r o g e n i t o r a s i n ma du r a s de f i n i da s de e s t a f o r ma p a r e c e ser mayor en SCU que en MO adulta
(Mayani y Lansdorp, 1998).
13
Introduccin
1.3.4.- Diferencias funcionales in vitro e in vivo entre clulas progenitoras bematopoyticas
de SCUyMO adulta.
Una peculiaridad importante que muestran las clulas progenitoras hematopoyticas de
SCU es el mayor potencial de proliferacin/expansin in vitro en comparacin con MO adulta.
Esta caracterstica, que puede ser relevante para los programas de expansin ex vivo, cuya
finalidad es aumentar las posibilidades de trasplante de la SCU en pacientes adultos o con gran
tamao corporal (ver ms adelante), se ha relacionado con una serie de diferencias biolgicas: i)
t r n s i t o r p i do e n f a s e GdG~ del ciclo celular y produccin autocrina de citocinas (Traycoff y
c o l s . , 1 994b ) ; u) presencia de telmeros ms largos (Vaziri y cols., 1994); y iii) menor
sensibilidad a algunos inhibidores hematopoyticos, tales como el factor de crecimiento
transformante-fi (TGF-j3), factor de necrosis tumoral-c (TNF-ct), protena inflamatoria
macrofgica-la (Mm-la) e interfern-a (IFN-a) (Hahn y cols., 1994).
Las diferencias funcionales in vivo d las clulas progenitoras hematopoyticas de SCU
versus MO adulta han sido analizadas princibalmente en modelos animales, incluyendo el ratn
SCIDINOD y la oveja fetal, y tambin en procedimientos de trasplante/transferencia gentica.
En comparacin con MOadulta, las clulas ~ rogenitoras de SCU muestran un potencial superior
de implante y repoblacin hematopoytica. Este mayor potencial se refleja en la capacidad de
injertar y repoblar el tejido hematopoytic de ratn sin necesidad de administrar citocinas
postrasplante (Vormoor y cols., 1994), las uales, sin embargo, son necesarias para mejorar
sustancialmente el implante hematopoytico~ cuando se trasplanta MO adulta (Lapidot y cols.,
1992). Por otro lado, estudios comparativos han demostrado que la SCU contiene
aproximadamente una clula repobladora de SCD (CRS, clulas capaces de injertar la mdula
sea de ratones SCD) por milln de clulas ~ ucleadas, comparada con 1 en 3 millones y 1 en 6
millones en MO y SPM, respectivamente ~ Wang y cols., 1997). Una observacin de gran
relevancia para la reconstitucin hematopoytica a largo plazo, es la capacidad que tienen las
clulas de MO de receptores murinos primaiios de SCU de injertar en receptores secundarios
(Hogan y cols., 1997).
14
Introduccin
A pesar de su utilidad, el modelo murino SCID/NOD adolece de algunas limitaciones
qu e i mp i de n r e a l i z a r o b s e r v a c i o n e s p r o l o n g a da s o e s t u di a r l a r e c o n s t i t u c i n c o mp l e t a
hematopoytica e inmunolgica postrasplante, ya que la proliferacin y diferenciacin de las
clulas del donante pueden verse restringidas en animales genticamente deficientes (Greiner y
cols., 1998). Algunas de estas limitaciones podran superarse con el modelo de oveja fetal
desarrollado por Zanjani y cols. (1992), quienes lo utilizaron para demostrar la capacidad de
i mp l a n t e y repoblacin a largo plazo de clulas CD34~ purificadas de SCU. Segn estos autores,
en el xenotrasplante humano/ovino las clulas stem hematopoyticas colonizan y persisten en
mdula sea durante vahos aos, son capaces de diferenciarse en mltiple linajes, mantienen su
capacidad de respuesta a citocinas humanas y retienen la capacidad de implante/diferenciacin
en receptores secundarios (Zanjani y cols., 1996). Adems, un aspecto del modelo de oveja que
lo hace nico es su gran tamao, lo cual permite evaluar de forma repetida la actividad
hematopoytica en el mismo animal quimrico durante un periodo de tiempo prolongado.
Desgraciadamente, este hecho constituye el mayor impedimento para que este sistema de
hematopoyesis iii vivo pueda ser utilizado de una forma ms extendida.
En lo que se refiere a manipulacin gentica, algunos datos sugieren que las clulas de
SCU pueden ser ms apropiadas para realizar ensayos de transferencia gentica que las clulas
de MO. Estudios realizados por Moritz y cols. (1993) demostraron que la eficiencia de
transferencia de los genes adenosina deaminasa y resistencia a neomicina fue aproximadamente
el doble en clulas progenitoras primitivas de SCU que en clulas de MO. Aunque la
experiencia clnica basada en estos procedimientos es todava muy preliminar, de momento se
ha podido comprobar la capacidad de estas clulas de SCU genticamente modificadas de
injertar en neonatos con deficiencia de adenosina deaminasa (Kohn y cols., 1995).
En resumen, los datos actualmente disponibles muestran que la SCU contiene no solo
una mayor proporcin de clulas progenitoras hematopoyticas primitivas sino que, adems,
stas tienen un mayor potencial de proliferacin y expansin en comparacin con la MO de
adulto. La evidencia actual indica que las clulas progenitoras de SCU poseen una mayor
capacidad para injertar y mantener la hematopoyesis in vivo y son ms adecuadas para
manipulacin y terapia genticaque las clulas hematopoyticas procedentes de otras fuentes.
15
Introduccin
1.3.5.- Expansin ex vivo de SCU.
Debido a las limitaciones derivadas del escaso nmero de clulas presentes en una
unidad de SCU, se han desarrollado un nmero de protocolos de expansin ex vivo de clulas
progenitoras hematopoyticas de SCU (Denning-Kendall y cols., 1998). Algunos protocolos han
sido diseados no solo para aumentar el nmero de clulas stem primitivas, sino tambin para
promover algn grado de compromiso hacia linaje megacarioctico, con la esperanza de poder
as acortar el tiempo de prendimiento de las plaquetas.
Kohler y cols. (1999) han investigado las condiciones ptimas para la expansin ex vivo
de SCU en lo que se refiere a la influencia del enriquecimiento de clulas progenitoras, al papel
de las capas alimentadoras (feeder-layers), a las combinaciones de citocinas y al modo de
agitacin del frasco de cultivo. Estos autores describieron que los resultados ptimos fueron
obtenidos con una combinacin de SCF, FLT3-ligand e IL-3 y que la adicin de trombopoyetina
(TPO) mejoraba los resultados de la expansin. Adems, encontraron que una rotacin continua
de los frascos de cultivo no disminua la tasa de expansin. Collins y cols. (1998) han descrito
expansiones ptimas de clulas mononucleadas de SCU cutivadas en frascos giratorios en medio
libre de suero, condiciones diseadas en perspectiva de una aplicacin clnica futura. Un sistema
parecido al anterior, consistente en un cultivo a gran escala basado tambin en el empleo de
frascos giratorios, ha sido puesto a punto por Kogler y cols. (1998a), quienes describieron una
expansin ex vivo de LTC-IC de 8 veces tras 7-14 das de cultivo en presencia de FLT3-ligand,
SCF e IL-3. Finalmente, los efectos sobre subpoblaciones celulares definidas de SCU de una
exposicin de 7 das a IL-3, IL-6, CSF-G, SCF y FLT3-ligand, en la presencia de 10% de suero
bovino fetal, fueron estudiados por Rice y cols. (1999). Basndose en los resultados de este
estudio, estos autores concluyeron que las clulas ms primitivas CD34~ CD38B CD34~ Thy-~ y
CD34~ Rhl2Y tienen una respuesta proliferativa limitada y que su actividad de clula stemno se
ve incrementada por accin de las citocinas, siendo las poblaciones celulares de precursores
comprometidos las que dieron lugar a la expansin celular observada al final del cultivo.
Piacibello y cols. (1999) investigaron la expansin de SCU durante intervalos muy
prolongados, siendo capaces de obtener amplificaciones extensas e inducir autorenovacin de
16
Introduccin
clulas stem primitivas en un sistema in vitro apropiado para expandir ms de 200.000 veces
LTC-IC de SCU tras 20 semanas de cultivo lquido en presencia de TPO y FLT3-ligand. El
efecto sinrgico de IL-6 e IL- 11, citocinas que intervienen en la maduracin del linaje
megacarioctico, fue igualmente investigado en cultivos prolongados de SCU por Lazzari y cols.
(1998), quienes identificaron como condiciones ptimas para la expansin de clulas CD34~
purificadas de SCU la incubacin en medio libre de suero y de estroma, y la presencia en el
c u l t i v o de TPO, F L T3 - l i g a n d, I L - 6 e IL-1 1.
La disparidad de resultados observada en estos estudios indica que no existe por el
momento un consenso universal sobre el sistema ms conveniente y adecuado para la expansin
ex vivo de clulas progenitoras hematopoyticas de SCU, y que la investigacin en este campo
est todava en una fase muy preliminar. Del mismo modo, en lo que respecta al potencial de
repoblacin iii vivo de estas clulas, junto a una serie de estudios preclicos que demuestran la
capacidad de prendimiento de SCU expandida en animales inmunodeficientes como el
SCID/NOD(Lazzari y cols., 1998; Stevenson y cols., 1998; Piacibello y cols., 1999), existe una
cierta preocupacin a raz de los hallazgos recientes de Gilenechea y cols. (1999), quienes
describen un retraso en la repoblacin a cono plazo de ratones SCIDNOD trasplantados con
SCU expandida ex vivo durante 6 das en presencia de IL-3, IL-6 y SCF, en comparacin con la
repoblacin obtenida con SCU fresca. Esposible que las conclusiones divergentes de algunos
estudios se deriven bsicamente de la utilizacin de diferentes condiciones de cultivo y
combinaciones de citocinas en las expansiones de SCU.
Algunos productos expandidos ya han sido utilizados clnicamente, aunque solo en
protocolos investigacionales (Jaroscak y cols., 1998; Shpall y cols., 1998; Stiff y cols., 1998).
En algunos casos, las clulas infundidas han sido cultivadas en un sistema cerrado y
automatizado, cuyo diseo responde a normas de buena prctica de manufacturacin (GMP) que
facilitan la utilizacin clnica de los productos expandidos (Koller y cols., 1998). Estos estudios
fueron planteados inicialmente para evaluar la seguridad y tolerancia de la administracin de
clulas expandidas, que en general no se acompaa de incidencias relevantes. Sin embargo, a
pesar de que los resultados preliminares son alentadores, se requieren evaluaciones a ms largo
17
Introduccin
plazo de los receptores de SCU sometida a expansin ex vivo antes de que puedan extraerse
conclusiones firmes sobre el impacto de esta nueva forma de trasplante.
18
Introduccin
2.- PROGRAMAS DE BANCOS DESANGRE DE CORDN UMBILICAL.
Como consecuencia de la experiencia clnica en trasplantes de SCU, claramente positiva
desde un primer momento, se han desarrollado en diferentes pases un nmero relativamente
amplio de bancos de SCU distribuidos por todo el mundo, y otros muchos estn siendo
contemplados en la actualidad. La actividad de un banco de SCU comprende la seleccin de los
donantes, la recogida, caracterizacin y criopreservacin de la SCU, su almacenamiento en
condiciones apropiadas para mantener la viabilidad celular de forma duradera, y la bsqueda y
envio de unidades compatibles para trasplante. La localizacin de posibles unidades de SCU
requiere que los equipos de trasplante sean capaces de acceder fcilmente a grandes inventarios,
sin tener que multiplicar la bsqueda en distintos centros. Al mismo tiempo, las unidades de
SCU trasplantadas deberan cumplir con niveles ptimos de calidad prestablecidos,
independientemente de la ubicacin del banco proveedor. Estos criterios de accesibilidad y
seguridad, objeto de una demanda cada vez mayor por parte de los centros de trasplante, y el
nmero creciente de bancos operativos de SCU, determinan ltimamente la necesidad de
implementar, en estos ltimos, estndares y sistemas bien defmidos que aseguren su calidad,
preferiblemente bajo la regulacin de agencias sanitarias y/o sociedades cientficas
internacionales. Los elementos claves de este sistema de calidad consisten en el empleo de
normas GMP en el procesamiento de la SCU, la deteccin eficiente de enfermedades
potencialmente transmisibles y, especialmente, el desarrollo de estndares especficos.
Aunque est claro que la SCU es una frente alternativa de clulas srem hematopoyticas
para trasplante, todava nos encontramos en una fase de aprendizaje. Del mismo modo que las
caractersticas de la SCU pueden influir en la prctica clnica, los resultados de los trasplantes
pueden influir en los mtodos de procesamiento de la SCU y en la caracterizacin del potencial
de trasplante. Por eso, el desarrollo de estndares para el procesamiento de SCU y la
determinacin del rango de aplicaciones potenciales de esta fuente de clulas progenitoras
hematopoyticas exigen la definicin previa de una serie de aspectos relevantes para el
funcionamiento ptimo de los Bancos de SCU, entre los que deben incluirse: i) las estrategias
para una donacin consentida, confidencial, sin riesgo para la madre o el recin nacido, y segura
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Introduccin
para los eventuales receptores; u) la elaboracin y validacin de procedimientos operativos para
la obtencin, caracterizacin hematopoytica, procesamiento, criopreservacin y descongelacin
de SCU, as como tambin para la determinacin a partir de DNA del tipaje HLA de clase 1 y
clase II mediante tcnicas moleculares de alta resolucin; y iii) los criterios de validacin de las
unidades procesadas de acuerdo a una serie de parmetros bsicos de celularidad y esterilidad.
El objetivo de este esfuerzo de estandarizacin, al estar todas las unidades de SCU
procesadas bajo una unifonnidad de criterio, y estar suficientemente caracterizadas en cuanto al
contenido de progenitores hematopoyticos (clulas y subpoblaciones CD34~ , ensayos
clonognicos) y al tipaje HLA (determinacin de los antgenos de clase 1 y clase II por alta
resolucin), es poder evaluar de forma ms precisa el efecto de la dosis celular y de la disparidad
HLA sobre el resultado del trasplante de SCU. En ltima instancia, se persigue constatar si la
SCU es una fuente suficiente de clulas stem hematopoyticas en todos los pacientes o si, por el
contrario, tiene que limitarse su aplicacin a cienos subgrupos.
2.1.- Procesamiento de SCU y su influencia en los resultados clnicos de trasplante de SCU.
Los diferentes mtodos de obtencin de SCU que han sido propuestos para optimizar el
volumen de recogida y reducir los riesgos de contaminacin microbiana, consiguen de manera
irregular estos objetivos (Turner y cols., 1992; Traineau y cols., 1993; Hanis y cols., 1994).
Aunque ninguno de ellos ha demostrado ser sustancialmente mejor que otro, la recogida de SCU
en un frasco abierto mediante la seccin del cordn umbilical prcticamente se ha abandonado
debido al elevado potencial de contaminacin bacteriana. Por el contrario, los sistemas cerrados
que utilizan catteres y agujas de venopuncin, si bien tcnicamente ms complejos, se asocian
con menores indices de contaminacin, una vez que el personal responsable de la recogida
adquiere el entrenamiento necesario.
Respecto a los procedimientos de separacin celular, diferentes mtodos han sido
optimizados recientemente con objeto de disminuir la toxicidad asociada con la reinfusin de
dimetilsulfxido (DMSO) o la incompatibilidad ARO, as como para reducir el volumen de las
unidades de SCU y, por tanto, el espacio requerido en los bancos de SCU para su
20
Introduccin
almacenamiento (Broxmeyer y cols., 1989; Harris y cols., 1994; Bertolini y cols., 1995;
Rubinstein y cols., 1995). Mientras que los primeros estudios mostraron una prdida
significativa de clulas progenitoras durante la separacin de SCU, una serie de estudios
realizados con posterioridad han descrito tasas de recuperacin celular en tomo al 90%. En la
actualidad existe la confirmacin de que la separacin de SCU es clinicamente aplicable, sin
haberse notado efectos deletreos en la recuperacin hematopoytica ni en la probabilidad de
prendimiento (Pahwa y cls., 1994; Rubinstein y cols., 1998).
El procedimiento de descongelacin de SCU tambin ha sido recientemente modificado
en base a las sugerencias de Rubinstein y cols. (1995). Con el mtodo propuesto por estos
autores, se consigue recuperar mayor cantidad de progenitores hematopoyticos en las unidades
as procesadas. Adems, la utilizacin de este procedimiento en pacientes sometidos a trasplante
de SCU se sigue de una recuperacin hematolgica ms rpida que en aquellos en los que la
SCU reinfundida fue descongelada por mtodos convencionales (Kurtzbergy cols., 1996).
2.2.- Implicaciones sobre la actividad de los Bancos de SCU derivadas de la experiencia en
trasplante de SCU.
La consideracin de la SCU como una fuente apropiada de clulas stem hematopoyticas
debe estar fundamentada en lo que se conoce y se desconoce de sta y otras fuentes de
trasplante. En base a los datos actualmente disponibles sobre la SCU, se pueden realizar las
siguientes afirmaciones:
1. La SCU contiene un nmero suficiente de clulas stem y clulas progenitoras para asegurar
el implante hematopoytico en la mayora de pacientes con menos de 50 kg de peso.
2. La obtencin de SCU no supone ningn riesgo para la madre ni para el recin nacido.
3. El almacenamiento en bancos de SCU elimina la atricin observada en todos los registros de
donantes voluntarios de mdula sea.
4. La contaminacin por citomegalovirus o por virus de Epstein-Ban es muy infrecuente.
5. La SCU puede producir EICH severa.
21
Introduccin
Adems, los datos clnicos existentes permiten sugerir ciertas caractersticas adicionales,
si bien se requieren estudios ms extensos que confirmen definitivamente estas propiedades de
la SCU:
1. El trasplante de SCU parece asociarse con una tasa de EICH aguda inferior a la del
trasplante de MO.
2. La disponibilidad en bancos de unidades criopreservadas de SCU permite acortar el intervalo
entre el inicio de la bsqueda y la recepcin del producto de trasplante en cerca de un mes,
eliminndose los retrasos e incertidumbres que complican la obtencin de MO.
3. La donacin dirigida debera reducir el desequilibrio de representacin de las minoras
tnicas y raciales en los bancos de SCU.
Por ltimo, la carencia de informacin clnica pertinente impide todava dar respuesta a
cuestiones tan importantes como las planteadas en los puntos siguientes:
1. Es suficiente el contenido de clulas stem de l a SC U p a r a r e c o n s t i t u i r l a h e ma t o p o y e s i s e n
receptores adultos de gran tamao corporal?
2. Se asocia el trasplante de SCU con un riesgo de recidiva igualmente reducido como se
o b s e r v a e n e l t r a s p l a n t e n o r e l a c i o n a do de MO adulta?
3. Se producir un aumento del nmero de trasplantes en pacientes de minoras tnicas o
r a c i a l e s ?
Todas estas consideraciones sern de gran ayuda para precisar cada vez mejor el espacio
que la SCU ocupa respecto a MO y SPM como fuente de clulas stem hematopoyticas. Pero
adems, desde un punto de vista prctico, constituyen las bases para indicar a los bancos de SCU
un conjunto de recomendaciones que han de mejorar previsiblemente los resultados clnicos del
trasplante de SCU.
22
Introduccin
2.2.1.- Contenido celular de las unidades de SCU.
As, una de las cuestiones clave acerca del uso general de SCU en el trasplante alognico
de clulas stem hematopoyticas ha sido la preocupacin constante respecto al potencial de
implante de una nica unidad de SCU en pacientes de todas las condiciones hematopoyticas y
de todos los pesos. Los resultados hasta ahora publicados demuestran que un nmero elevado de
clulas nucleadas (CN) infundidas es un buen factor pronstico de implante hematopoytico y
de supervivencia. En la serie Eurocord (Gluckman y cols., 1998), la media de CN en las
unidades de SCU utilizadas para trasplante relacionado y no relacionado fue 1 1x10
8 (extremos:
0.13-58). En los trasplantes no relacionados, los pacientes que recibieron menos de 3.7x107
CN/kg tuvieron un tiempo medio hasta =500411neutrfilos de 34 das (extremos: 18 a 48 das) y
hasta =20.000411plaquetas de 134 das (extremos: 30 a 180 das), mientras que en los pacientes
que recibieron un dosis celular superior el tiempo de recuperacin fue respectivamente 25 das
(extremos: 10 a 56 das) y 47 das (extremos: 9 a 85 das). En adultos, ninguno de los pacientes
que recibieron menos de l>d0~ CN/kg sobrevivieron. Los pacientes que recibieron menos de
2x107 CNIkg tuvieron una probabilidad del 69% y 49% para alcanzar =500/.11neutrfilos y
>20.000/jil plaquetas a da 60, respectivamente.
Estos resultados muestran que la dosis celular infundida determina tanto la probabilidad
de implante como la velocidad de recuperacin hematolgica. Es interesante destacar que el
nmero de clulas infundidas es un orden de magnitud inferior al de un trasplante alognico
estndar de MO y 50-loo veces inferior al de un trasplante estndar de SPM. En consecuencia,
el nmero de clulas infundidas es considerablemente menor que la dosis recomendada para
trasplante no relacionado de MO (Sierra y cols., 1997), lo cual apoyara la hiptesis de que las
clulas de SCU tienen una ventaja proliferativa selectiva en comparacin con MO adulta.
Con el fin de incrementar la probabilidad y velocidad de implante hematopoytico en los
trasplantes de SCU se han propuesto diferentes alternativas, siendo una de ellas el uso de
factores de crecimiento tales como CSF-G, SCF o TPO. En este momento, an no se ha
demostrado ningn beneficio derivado de la administracin de estos factores, necesitndose
23
Introduccin
claramente mayor investigacin en este campo. Otra aproximacin, ya discutida en el apartado
anterior, podra consistir en la expansin ex vivo de progenitores de SCU para mejorar el
implante a. corto plazo. Una tercera lnea de investigacin contempla la posibilidad de emplear
varias unidades de SCU para aumentar el nmero de clulas stem infundidas. Esto implica
cuestiones bsicas sobre la reactividad inmunolgica de clulas de SCU trasplantadas
provenientes de fuentes HLA no idnticas, y su capacidad de reaccionar con el husped. A la
espera de que todas estas propuestas demuestren su verdadero alcance teraputico, la
importancia de la dosis celular es ya un dato suficiente para recomendar a los bancos de SCU la
obtencin del mayor nmero de clulas mediante procedimientos ptimos de recogida de SCU,
y la seleccin del mejor mtodo de separacin celular y reduccin de volmen, de forma que las
unidades disponibles de SCU sean de la mxima riqueza celular.
2.2.2.- Tipaje HLA de clase 1 y clase II de alta resolucin.
La inmadurez inmunolgica de las clulas de SCU podra ser responsable de la menor
incidencia y severidad de EICH aguda, incluso en situaciones de incompatibilidad HLA. Por el
momento, no hay ningn estudio de casos y controles que compare la incidencia de EICH de
acuerdo con la naturaleza de las clulas stem trasplantadas; no obstante, algunas evidencias
sugieren que dicha incidencia puede estar reducida tras el trasplante de SCU. En las series
publicadas, la EICH fue menos severa y la incidencia de EICH crnica fue menor que en el
trasplante de MO. Estos hallazgos merecen ser destacados, teniendo en cuenta que se trata de
trasplantes altamente incompatibles sin deplecin de clulas T. En un estudio cooperativo
JBMRT-Eurocord, se compar la incidencia de EICH aguda y crnica en nios que recibieron
bien un trasplante de SCU, bien un trasplante de MO de un hermano HLA idntico. En anlisis
univariante y multivariante, la incidencia tanto de EICH aguda como de EICH crnica fue
s i g n i f i c a t i v a me n t e i n f e r i o r e n e l t r a s p l a n t e de SCU: 15% vs. 24%, y 6% vs. 16%,
r e s p e c t i v a me n t e (G l u c k ma n y cols., 1998).
El anlisis de los trasplantes no relacionados de SCU es ms complicado, debido a la
presencia en la mayora de los casos de una o ms disparidades HLA, as como a la
heterogeneidad en las tcnicas de tipaje HLA empleadas. En trasplantes no relacionados de MO,
24
ntroduccin
se ha demostrado que las incompatibilidades detectadas por tipaje HLA de alta resolucin de
clase 1 y clase II son predictivas de EICH y tambin de supervivencia (Scott y cols., 1998). Por
ejemplo, en un estudio de trasplante no relacionado de MO sin deplecin de clulas T en
leucemia mieloide crnica, la incidencia global de EICH grado 11-1V fue del 73%, con una
estimacin de EICH severa grado 111-1V de un 21% en pacientes que recibieron un trasplante
HLAidntico, y de un 47% en los que recibieron un trasplante de MO incompatible (Hansen y
cols., 1998). Estas cifras deben ser comparadas con la incidencia del 21% de EICH aguda grado
11-1V, y un nmero reducido de EICH grado 111-1V, observada en trasplante no relacionado de
SCU incompatible.
Mientras que la incompatibilidad HLA en los trasplantes relacionados de SCU se asocia
con un mayor riesgo de EICH aguda, no se ha encontrado ninguna correlacin entre el nmero
de disparidades HLA y la aparicin de EICH en los trasplantes no relacionados. Esto podra
deberse al hecho de que el tipaje de alta resolucin solo se ha aplicado en la determinacin de
HLA-DRB 1, lo que hace difcil la interpretacin de los resultados. Tambin podran jugar algn
papel diferencias menores en el sistema de histocompatibilidad. En consecuencia, ser muy
importante en el futuro estudiar todos los antgenos HLA de clase 1 y clase II utilizando tcnicas
moleculares de alta resolucin, consideradas en la actualidad como los mejores mtodos
disponibles. El objetivo es adquirir el mximo de informacin para poder evaluar la
trascendencia clnica de los diversos niveles de incompatibilidad HLA en los trasplantes no
relacionados de SCU. El almacenamiento de clulas viables y de DNAde donantes y receptores
para futuras pruebas es, asimismo, muy til para este propsito.
2.2.3.- Actividad injerto contra leucemia (ICL) de la SCU.
Es bien sabido que las clulas Tjuegan un papel importante en la erradicacin de clulas
leucmicas, fundamentalmente en leucemia mieloide crnica. La constatacin de este hecho
proviene de dos observaciones clnicas bsicas: el riesgo aumentado de recidiva tras un
trasplante de MO deplecionada de clulas T, y la eficacia de las infusiones de linfocitos del
donante para tratar recidivas postrasplante de MO. Dado que los linfocitos de SCU estn
disminuidos en nmero y son inmunolgicamente inmaduros, cabe la posibilidad de que no
2 5
Introduccin
ejerzan una funcin ICL como los linfocitos de MO adulta. De hecho, datos experimentales
s u g i e r e n e n r e a l i da d u n c i e r t o g r a do de i mp e di me n t o f u n c i o n a l , si bien las clulas NK y T de
SCU pueden ser inducidas mediante estimulacin antignica (Harris, 1 995 ). En el contexto
c l n i c o de l o s t r a s p l a n t e s de SC U, e n a u s e n c i a de estudios comparativos con otras fuentes de
clulas stem, la actividad ICL es difcil de evaluar, puesto que el nmero de pacientes es an
limitado y el seguimiento demasiado corto. Sin embargo, una observacin interesante la
constituye el efecto ICL sin EICH de las infusiones de linfocitos del donante tras recidiva en
receptores de trasplante familiar de SCU. Basndose en ste y otros datos adicionales que
indican que la probabilidad de recidiva no est aumentada a pesar de un menor potencial de
EICH, puede sugerirse que la SCU es capaz de generar una respuesta ICL eficaz. El estudio de
los mecanismos responsables de este posible efecto inmune antitumoral en SCU ser esencial
para la identificacin de las clulas efectoras con actividad ICL y, a su vez, comprobar si esta
a c t i v i da d e s t s e g r e g a da r e s p e c t o de l a s c l u l a s e f e c t o r a s c o n a c t i v i da d EI C H.
A la vista de toda la informacin acumulada hasta el momento, y que se ha descrito en
los prrafos precedentes, se puede concluir que la sangre de cordn umbilical constituye una
fuente alternativa de clulas progenitoras hematopoyticas con algunas caractersticas distintivas
que suponen, o ms importantemente, pueden suponer en el futuro, una mejora de gran
relevancia en el tratamiento de enfermedades malignas y no malignas cuya terapia estndar
todava descansa en el trasplante de progenitores hematopoyticos de MO o SPM.
26
OBJETIVOS
Objetivos
OBJETIVOS
A partir de lo expuesto en la introduccin, resulta evidente la proyeccin que puede tener
e l Ba n c o de SCU en el desarrollo de nuevas alternativas teraputicas. No obstante, tambin se
advierte de la complejidad de dicha tarea, puesto que para ello es estrictamente necesario, no
solo optimizar los procedimientos ms adecuados para procesar las unidades de SCU conforme
a estndares de calidad aceptados a nivel nacional e internacional, sino tambin conocer en
profundidad las caractersticas biolgicas de la SCU y, en consecuencia, disponer de las tcnicas
a p r o p i da s p a r a s u a n l i s i s .
El objetivo principal de esta tesis doctoral ha sido la evaluacin y estandarizacin de
protocolos para la creacin de un Banco de Sangre de Cordn Umbilical en el Hospital 12 de
Octubre, donde el Doctorando lleva a cabo su labor asistencial como Mdico Especialista en
Hematologa y Hemoterapia. Para ello, se plantearon dos objetivos concretos:
1. Caracterizacin de la SCU mediante estudio experimental de las propiedades
h e ma t o p o y t i c a s e i n mu n o l g i c a s de l a mi s ma .
2. Puesta a punto de los procedimientos tcnicos de obtencin, fraccionamiento,
c r i o p r e s e r v a c i n , a l ma c e n a mi e n t o y de s c o n g e l a c i n de l a s mu e s t r a s de SC U p a r a s u
v a l i da c i n c o mo u n i da de s t r a s p l a n t a b l e s .
28
MATERIALES Y MTODOS
Materiales y Mtodos
1.- MATERIALES.
1.1.- Impresos para la donacin de SCU.
L a h o j a de i n f o r ma c i n s o b r e l a do n a c i n de s a n g r e de cordn umbilical, el
c o n s e n t i mi e n t o i n f o r ma do p a r a l a donacin voluntaria de sangre de cordn umbilical, el
protocolo de obtencin de sangre de cordn umbilical y la hoja de recogida de datos de
fraccionamiento y criopreservacin quedan recogidos en los Anexos 1 a IV, respectivamente.
1.2.- Material para la obtencin de SCU.
Para la recoleccin de la SCU se utilizaron los sistemas de donacin de sangre de bolsa
doble de Terumo, con 63 ml de citrato-fosfato-dextrosa-adenina (CPD-A) como solucin
anticoagulante, cloruro sdico 0.9% de Baxter, sistemas de infusin de Sendal, heparmna sin
conservantes 1000 U/ml de Rovi, pinzas de Kocher, alcohol 70%, povidona yodada, gasas y
guantes estriles.
1.3.- Material para el procesamiento y caracterizacin de SCU.
Las bolsas de transferencia de 400 ml, los adaptadores para toma de muestras y las
bolsas de congelacin de 750 ml y 50 ml fueron suministrados por Baxter; los frascos de cultivo
aerobios y anaerobios por Organon; los tubos cnicos de polipropileno de 50 ml, los criotubos
de 4.5 y 1.8 ml y las placas multidishes de 24 pocillos por Nunc.
1.4.- Reactivos para el procesamiento y caracterizacin de SCU.
Para el fraccionamiento de SCU se utilizaron los siguientes medios de separacin
celular: Ficoll-Paque densidad 1.077 g/ml de Pharmacia, Histopaque densidad 1.083 g/ml y
metilcelulosa de Sigma, gelatina al 3.5% (Hemoce) de Behring y hidroxietil almidn al 6%
(HES) de Grifols. La solucin de metilcelulosa al 1% se prepar en medio Iscoves y se
suplement con L-glutamina, ambos de GIBCO BRL, y a-monotioglicerol de Sigma.
30
Materiales y Mtodos
Los reactivos empleados para la congelacin y descongelacin de SCU fueron: medio
199 de GIBCO BRL, dimetilsulfxido (DMSO) de Carlo Erba, suero bovino fetal (SBF) de
Sera-Lab, dextrano 10% de Antibiticos Farma y albmina humana 20% de Behring.
En la caracterizacin de la SCU por citometra de flujo, se emplearon anticuerpos
monoclonales (AcMo) para el anlisis de clulas progenitoras hematopoyticas, clulas
linfocitarias y deteccin intracelular de citocinas. Todos los AcMo fueron adquiridos de la casa
comercial Becton Dickinson, excepto anti-CD7 y anti-CD69 que fueron adquiridos de CALTAG
y Dako, respectivamente. La relacin de AcMo utilizados en los distintos ensayos fenotpicos se
detalla en la siguiente tabla:
Designacin
CD3
CD4
COS
CD7
CDS
CD1O
CDI la (LFA-1)
CD1 3
CD15
CD16
CD19
CD25
C D3 3
CD34
CD38
CD4 1
CD44 (HCAM)
Clon
Leu-4
Leu-3a
[Bu- 1
6B-7
Leu-2a
CALLA
la
Leu-M7
Leu-M1
[Bu-lic
Leu-12/S125-C1
IL-2R
[Bu-M9
HPC A- 2
[Bu- 17
Gp-Ib
[Bu-44
Designacin
CD45
C D45 RA
CD45RO
CD54 (ICAM-1)
CD56
CD57
CD5S (LFA-3)
CD6 1
C D1 1 7
HLA-DR
lCRaJB
TCRyS
CD69
IL-2
IL-4
FN-y
Clon
G APS. 3
[Bu - l S
L e u - 45 R0
[Bu-54
L e u - 1 9
L e u - 7
LFA-3
Gp-fija
c-kit
HLA-DR
WT3 1
TCR-yS- 1
FNSO
IL-2
IL-4
FN-y
31
Materiales y Mtodos
Otros reactivos empleados en los estudios de citometra de flujo fueron: solucin de lisis
FACS y solucin de permeabilizacin FACS de Becton Dickinson; tampn PBS y medio RPMI
de GJBCO BRL; forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), ionomicina, brefeldina y albmina
srica bovina (BSA) de Sigma.
Para el anlisis de viabilidad celular se utiliz azul tripn al 0.5 % de Seromed. Por su
parte, los ensayos clonognicos fueron realizados en medio de cultivo MethoCult H443 1 de
Stem Cel Technologies, compuesto por lscoves, metilcelulosa al 0.9%, SBF al 30%, BSA al
1%, 2-mercaptoethanol a My L-glutamina a 2 mM, suplementado con medio condicionado
de leucocitos-agar al 10% y eritropoyetina humana recombinante a 3 U/ml.
1.5.- Muestras.
Las muestras de SCU se obtuvieron segn el procedimiento que se describe ms
adelante. Las muestras de MO y SPA fueron obtenidas en heparina a partir de donantes adultos
sanos. Las muestras de SPM se obtuvieron a partir de citafresis realizadas en pacientes adultos
que recibieron quimioterapia y CSF-G como tratamiento de movilizacin de clulas
progenitoras hematopoyticas.
32
Materia les y Mtodos
2.- METODOS.
2.1.- Seleccin de donantes de SCU.
La obtencin de SCU fue realizada en neonatos sanos a trmino, nacidos de parto
vaginal, siempre que no se apreciara ninguna de las siguientes circunstancias clnicas
consideradas causas de exclusin para la donacin: i) parto prematuro (menos de 32 semanas de
gestacin); u) rotura de bolsa de liquido amnitico de ms de 12 horas; iii) fiebre materna
(>38
0C); iv) presencia de meconio en liquido ammotico, y) sufrimiento fetal; vi) inmunizacin
materna eritrocitaria (anticuerpos irregulares en el suero de la madre); vii) anemia materna
(HbclO.5 g/dl); viii) enfermedad infecciosa transmisible (virus de la inmunodeficiencia humana
[VN], citomegalovirus [CMV], sfilis, hepatitis B, hepatitis C, toxoplasmosis, rubeola).
Una vez comprobado y anotado en las hojas de datos correspondientes (anexo III) que la
madre/donante reuna todos los requisitos, fue requerida la firma del consentimiento informado
para la donacin voluntaria de SCU (anexos 1 y II) antes de proceder a su obtencin. Toda la
documentacin relativa a la donacin se identific con etiquetas adhesivas en las que figuraban
el nombre y apellidos de la madre, el nmero de historia clnica, la edad y los datos de
domiciliacin.
2.2.- Obtencin de SCU.
Para preparar las bolsas de recogida a partir de los sistemas de donacin de sangre, se
transfiri una parte del contenido de CPD-A a la bolsa satlite dejando un volumen de 30 ml en
la bolsa principal, y sellando el tubo conector entre ambas (la bolsa satlite se desecha). En esta
operacin, la esterilidad del sistema fue siempre preservada. Una vez preparadas, las bolsas se
almacenaron en el paritorio a temperatura ambiente y protegidas de la luz.
En el momento de la donacin, se identificaron dos bolsas de recogida (rotuladas como
Fraccin a y Fraccin 2~ ) mediante etiquetas adhesivas con los datos de identificacin de la
33
Materiales y Mtodos
madre. Paralelamente, se prepar aspticamente una solucin de 50 ml de cloruro sdico 0.9%
con 5000 Ude heparmna (solucin heparinizada de CNa), y se conect a un sistema de infusin.
2.2.1.- Placenta intra tetero (Fraccin la).
Inmediatamente despus del nacimiento (en menos de 15 segundos), el cordn umbilical
fue pinzado a 5-7 cm del ombligo mediante dos pinzas de Kocher. Una vez seccionado, se
procedi a esterilizar el cordn: inicialmente solo se utiliz povidona yodada para este fin; en
una segunda fase, la esterilizacin se realiz con alcohol 70% y povidona yodada.
A continuacin, se canul la vena umbilical con la aguja de la bolsa de recogida rotulada
como Fraccin la, y se dej fluir la sangre por gravedad hasta que cesara el flujo. En ese
momento, se procedi a retirar la aguja de la vena, cubrirla con su proteccin, y anudar
fuertemente el sistema para evitar prdidas de sangre. Esta primera fase de recogida se complet
en menos de 5 minutos desde el momento del parto.
2.2.2.- Placenta extetero (Fraccin 2~ ).
Tras el alumbramiento, se esteriliz la placenta en la zona de insercin del cordn, y se
canalizaron la arteria y la vena umbilical con las agujas respectivas de los sistemas de la
solucin heparmnizada de CINa y de la bolsa rotulada como Fraccin Y. Se colocaron en alto y
en un plano inferior, respectivamente, con objeto de perfundir la placenta de forma
arteriovenosa y recoger por gravedad la sangre placentaria. Al finalizar, se protegi el sistema de
la segunda bolsa de recogida de igual forma a como se ha descrito para la primera,
completndose el procedimiento de obtencin en 15-20 minutos.
2.2.3.- Conservacin de las unidades de SCU basta el procesamiento.
Las bolsas de SCU fueron almacenadas a 4
0C hasta su procesamiento al da siguiente,
adjuntndose las hojas de recogida de datos y el consentimiento informado. El transporte al
laboratorio se realiz a temperatura ambiente en un periodo inferior a 10 minutos, dada la
34
~..Materialesy Mtodos
proximidad con la maternidad. Al ser recibidas en el Banco de SCU, las unidades fueron
procesadas inmediatamente o, en su defecto, volvieron a conservarse a 4
0C hasta el momento de
su procesamiento.
2.3.- Procesamiento de las unidades de SCU.
Alo largo del procesamiento de la SCU, todas las manipulaciones se realizaron en cabina
de flujo laminar y se adoptaron medidas bsicas de asepsia.
2.3.1.- Identificacin.
Todo el material biolgico y documental de cada unidad de SCU se identific de
manera especfica con la fecha, nmero de unidad de SCU (asignado consecutivamente) y
cdigo de unidad de SCU (compuesto por las tres primeras letras de los dos apellidos y las dos
primeras letras del nombre de la madre). Est identificacin sirve para relacionar cada unidad de
SCU con la madre y el recin nacido, las muestras testigo (ver ms adelante) y toda la
documentacin de recogida de datos y resultados analticos.
2.3.2.- Muestra de suero materno.
Cuando la unidad de SCU fue finalmente procesada para su almacenamiento en el Banco
(y no para fines investigacionales; ver anexo 1), se tom una muestra de sangre materna y se
remitieron al laboratorio de Microbiologa 2.5 ml de suero (800 xg, 10 mm) para realizar
serologa viral (VIII 1/2, VHC, HBsAg y CMV) y parasitaria (Sfilis y Toxoplasma) por
enzima-inmuno-anlisis (EIA) o test de hemaglutinacin; el resto fue congelado a 800C en un
criotubo de 1.8 ml debidamente identificado (muestra testigo- 1: Suero Materno).
2.3.3.- Sangre de cordn umbilical.
Las dos fracciones de SCU fueron combinadas en una bolsa estril de 400 ml utilizando
el sistema de transferencia. Una vez pesada la bolsa y calculado el volmen de SCU (peso de la
35
Materiales y Mtodos
bolsa llena menos peso de la bolsa vaca), se extrajeron las muestras necesarias para analizar el
contenido celular y el grupo ARORh de la unidad.
La SCU fue entonces cnopreservada o sometida antes a alguno de los procedimientos de
separacin celular que posterionnente se describen. Adems de tomar muestras para determinar
7
la eficiencia de la separacin, se remiti una muestra (4x10 clulas) para tipaje HA, y se
procesaron io~ clulas para la obtencin de DNA que, junto con una alcuota de plasma, se
conservaron a 8(YC en criotubos debidamente identificados (muestra testigo-2: DNAde SCU;
muestra testigo-3; Plasma de SCU). Por ltimo, el control de esterilidad se realiz directamente
en la unidad de SCU no fraccionada, o en la fraccin restante de hemates despus de la
separacin celular. Para ello, se obtuvieron 4 ml para cultivos bacterianos (2 ml en cada uno de
los frascos de cultivo para grmenes aerobios y anaerobios, repectivamente).
2.3.3.1.- Separacin celular con gradientes de densidad.
Para la separacin de clulas mononucleadas (CMN) en gradientes de densidad, la SCU
fue diluida con uno o dos volmenes de cloruro sdico 0.9% de manera que la concentracin
celular fuese igual o inferior a 4x10
9/1. Se prepararon tubos con 15 mi de Ficoll-Paque o
Histopaque, y se dispensaron 20 ml de SCU diluida con cuidado de no alterar las fases. Se
centrifugaron a 400 xg durante 25 minutos, y se recogieron el plasma sobrenadante, la interfase
de CMN y todo el gradiente inferior, dejando los glbulos rojos en el fondo del tubo. Las clulas
se lavaron dos veces con cloruro sdico 0.9% (400 xg, o mm), y se resuspendieron en 7 ml de
pas ma
2.3.3.2.- Sedimentacin de hemates con metilcelulosa 1%.
Se mezclaron 30 ml de SCU con 3.3 ml de metilcelulosa 1% (concentracin final 0.1%),
dejando sedimentar los hemates durante 30 minutos a temperatura ambiente (TA). Al cabo de
este tiempo, se recuperaron las clulas en suspensin, se lavaron dos veces y se resuspendieron
en 7 ml de plasma.
36
Materiales y Mtodos
Para la preparacin de metilcelulosa al 1%, 10 g de metilcelulosa se esterilizaron con luz
ultravioleta durante 24 horas en una placa de Petri estril, y se disolvieron en 1 litro de medio
Iscoves mediante ebullicin y posterior agitacin a 4
0C hasta que la solucin de metilcelulosa
quedase completamente translcida. Se alicuotaron fracciones de 25 ml y se conservaron a
200C. Antes de ser utilizadas, cada alcuota fue suplementada con 800 g de L-glutamina
200 mM y 42.5 gl de una dilucin 1:100 de a-monotioglicerol en medio Iscoves preparada en
el momento.
2.3.3.3.- Sedimentacin de hemates con gelatina 3.5%.
A travs de un adaptador para toma de muestras, se aadi un volumen de gelatina 3.5%
a la unidad de SCU (concentracin final 1.75%), dejando sedimentar los hemates durante 90
minutos a 40C. Las clulas en suspensin se recuperaron con un extractor de plasma por el
sistema de transferencia de la bolsa, se lavaron dos veces y se resuspendieron en 7 ml de plasma.
2.3.3.4.- Sedimentacin de hemates con hidroxietil almidn 6%.
La SCU fue mezclada con HES 6% en una proporcin 1:5 (concentracin final 1.2%),
dejando sedimentar los hemates durante 90 minutos a TA. Las clulas en suspensin fueron
transferidas a una bolsa estril y centrifugadas a 600 xg durante 10 minutos. El sedimento
celular se resuspendi en 7 o 12 ml de plasma-HES residual, segn el formato de
criopreservacin posteriormente utilizado.
2.3.3.5.- Criopreservacin.
Dependiendo de la unidad a procesar (fraccionada o no fraccionada) y del formato de
criopreservacin, las clulas de SCU fueron transferidas a una bolsa de congelacin (750 ml o
5 0 mi ) , o a u n t u b o e s t r i l (5 0 mi ) e n c a s o de c o n g e l a r l a SC U e n c r i o t u b o s . L o s v o l me n e s
t r a n s f e r i do s de SC U o de c l u l a s s e p a r a da s f u e r o n , r e s p e c t i v a me n t e , 80 mI , 1 2 mi y 7 ml . L a
s o l u c i n c r i o p r o t e c t o r a u t i l i z a da c o n s i s t i e n me di o 1 99 y DM5 0 2 0%. Pa r a l a s mu e s t r a s t e s t i g o
37
Materiales y Mtodos
de SCU criopreservada, se prepar una solucin con DMSO 10%, que fue repartida en tres
alcuotas de 1.5 ml en criotubos de 1.8 ml.
Una vez enfriadas en hielo la suspensin celular y la solucin crioprotectora, se aadi
lentamente un volumen de esta ltima sobre la suspensin celular con agitacin continua,
alcanzando una concentracin final de DM50 de 10%. El volumen final de congelacin fue 160
o 24 ml cuando la SCU se criopreserv en bolsas, y de 13 ml en el caso de congelar la SCU en
tres alcuotas en criotubos de 4.5 ml. Inmediatamente antes de iniciar el proceso de congelacin,
se dispensaron 0.3 ml de la suspensin celular en los tres criotubos preparados con medio 199 y
DM50 10% (muestras testigo-4: SCU criopreservada), y se realiz una dilucin 1:10 en medio
Iscoves con 20% de SBFpara anlisis de viabilidad celular y ensayos clonognicos.
El proceso de congelacin fue realizado en un equipo de congelacin programada de
Cryoson (Heidelberg, Alemania), utilizando programas especficamente diseados en funcin
del volumen y formato de criopreservacin. Al trmino de la congelacin, la unidad de SCU y
las tres muestras testigo de SCU se almacenaron en nitrgeno lquido ( 196
0C). Los programas
de congelacin fueron los siguientes (duracin en minutos; temperatura en grados Celsius):
Bolsa (160 mI) Bolsa (24 ml) Criotubo (4.5 mO
Segmento Duracin r final Duracin r final Duracin r final
1 0.0 +4.0 0.0 +4.0 0.0 +4.0
2 20.0 +4.0 20.0 + 4.0 20.0 + 4.0
3 0.0 +0.7 0.0 +03 0.0 +0.7
4 10.8 - 1 0. 0 1 0. 8 - 10.0 10.8 - 10.0
5 0. 7 - 60. 5 0. 5 - 40. 0 0. 6 - 5 5 . 0
6 1.6 - 2 0. 0 1 . 2 - 18.0 1.5 - 19.0
7 7 . 0 - 2 0. 0 5 . 3 - 1 8. 0 6. 3 - 19.0
8 2 0. 0 - 40. 0 2 2 . 0 - 40. 0 2 1 . 0 - 40.0
9 10.0 - 60. 0 1 0. 0 - 60.0 10.0 - 60.0
1 0 5 . 0 - 1 2 0. 0 5 . 0 - 1 2 0. 0 5 . 0 - 1 2 0. 0
38
Materiales y Mtodos
2.3.3.6.- Descongelacin.
La .SCU fue sumergida en un bao a 370(2, ayudando a deshacer el contenido de la
unidad congelada mediante presin y/o agitacin suave. Las clulas descongeladas fueron
procesadas de dos maneras distintas. Siguiendo el mtodo convencional, la unidad de SCU no se
someti a ninguna manipulacin adicional tras la descongelacin, preparndose una dilucin
1:10 de SCU descongelada en Iscoves/SBF 20% para control de viabilidad y ensayos
clonognicos. En el mtodo de dilucin 1:2 con dextrano/albntna, se aadi lentamente un
volumen de dextrano 10% y albmina humana 5%, se centrifug (400 xg, U) mm) para retirar el
sobrenadante, y se resuspendi el sedimento celular en un volumen igual de dextrano y
albmina. La viabilidad y los ensayos clonognicos fueron realizados en una alcuota de las
clulas lavadas y resuspendidas.
2.4.- Recuento y viabilidad celular.
La concentracin de clulas nucleadas se determin mediante un contador automtico
(H3, Technicon), cuyo correcto funcionamiento fue comprobado diariamente con controles
analticos comerciales. El nmero de clulas viables se determin por exclusin de azul tripn
en una cmara hemocitomtrica, despus de haber incubado las clulas con un volumen de azul
tripn 0.5 % durante 5 minutos a TA.
2.5.- Anlisis por citometra de flujo.
2.5.1.- Anlisis de antgenos de superficie.
El anlisis fenotipico se realiz en clulas de SCU separadas con HES, y en muestras no
fraccionadas de MO, SPM y SPA. La expresin antignica fue analizada sistemticamente
mediante combinaciones triples de AcMo directamente conjugados con fluorocromos, y
dirigidos frente a marcadores de clulas hematopoyticas primitivas y comprometidas, linfocitos
T, linfocitos B, clulas NK y molculas de adhesin. Las clulas se incubaron durante 15
minutos a TA y en oscuridad con 10 .11 de cada AcMo. Posteriormente, se aadieron 2 ml de
39
Materiales y Mtodos
solucin de lisis FACS, se incubaron 10 minutos en las mismas condiciones, se lavaron (600 xg,
5 mm) y se resuspendieron en 0.5 ml de PBS para anlisis por citometra de flujo. En todos los
casos, se utiliz un control negativo isotpico (Becton Dickinson) para detenninar la
fluorescencia inespecfica.
La adquisicin de datos se realiz mediante el programa Cellquest (Becton Dickinson)
en un citmetro de flujo FACScan (Becton Dickinson) equipado con un lser argn ajustado a
488 nm y 15 mW. En cada ensayo, se adquirieron como mnimo 10.000 eventos. Para el anlisis
de los datos, se emple el programa PAINT-A-GATE PRO (Becton Dickinson). Las clulas
progenitoras hematopoyticas se identificaron inicialmente por sus caractersticas de baja SSC
(side-scarter) y expresin intermedia de CD45, mientras que los linfocitos fueron reconocidos
por su baja 55(2 y reactividad intensa para CD45. En ambos casos, los resultados fueron
referidos a estas dos poblaciones: ventana de progenitores (baja SSC/CD45~ ) y ventana de
linfocitos (baja SSC/CD45~ ).
2.5.2.- Anlisis de citocinas intracelulares.
Para este anlisis, se analizaron muestras no fraccionadas de SCU y SPA diluidas en
medio RPMI. Las clulas se estimularon con PMA (25 ng/mi) e ionomicina (1 .tg/ml) durante
48 horas, en presencia de brefeldina (10 gg/ml), en un incubador a 370(2 y 5% de CO
2.
Posteriormente, se lavaron dos veces en PBS con 1% de BSA, y se marcaron con AcMo anti-
CD3, anti-CD4 o anti-CD8. Para ello, se incubaron durante 15 minutos a TAy en oscuridad con
20 gI de cada uno de los AcMo citados. Despus, se aadieron 2 ml de solucin de lisis FACS,
se incubaron 10 minutos en las mismas condiciones, y se centrifugaron a 600 xg durante 5
minutos. Tras aadir al sedimento celular solucin permeabilizante FACS para fijar y
permeabilizar las clulas, stas se incubaron con anti-CD69 (un marcador de activacin precoz)
y con AcMo frente a IL-2, IL-4 e FN-y
El anlisis de los datos fue similar al utilizado en el estudio de antgenos de superficie,
exceptuando la ventana de adquisicin, definida en este caso por SSC y expresin de CD3. En
40
Materiales y Mtodos
t o do s l o s e x p e r i me n t o s , s e r e a l i z u n c o n t r o l de a c t i v a c i n c o n s i s t e n t e e n u n a e s t i mu l a c i n
celular en condiciones idnticas, pero sin brefeldina. Las clulas se tieron con anti-CD69 y
anti-CD3, considerndose una activacin c e l u l a r a de c u a da c u a n do m s de l 90% de las clulas T
expresaban CD69.
2.6.- Cultivos de progenitores hematopoyticos.
Los ensayos clonognicos se realizaron empleando un medio de cultivo (MethoCult
H4431, Stem Cdl Technologies) que promueve la proliferacin de clulas progenitoras
hematopoyticas de estirpe granulo/monoctica y eritroctica. Las clulas fueron sembradas a
una concentracin de 5x10
4/ml, agitando la suspensin celular en un vrtex. Despus de
sedimentar el medio durante 15 minutos a TA para que las burbujas de aire atrapadas
ascendieran a la superficie, se dispensaron 0.3 ml por duplicado en una placa de 24 pocillos,
rellenando con agua estril el resto de pocillos no utilizados.
Las clulas se incubaron a 370(2 y 5% de (202 durante 14 das, al cabo de los cuales se
contaron las colonias en un microscopio de luz invertida. Se consideraron CFU-GM las
agrupaciones con =50 clulas granulo/monociticas, y BFU-E las agrupaciones con =50 clulas
eritrocticas (hemoglobiizadas) y/o =3 agrupaciones de 8 o ms clulas eritrocticas. Las
colonias compuestas por clulas pertenecientes a dos o ms linajes fueron identificadas como
CFU-GEMM. La eficiencia clonognica referida a s>o~ clulas se calcul realizando un
promedio del recuento de colonias en dos pocillos y multiplicando por un factor de 3.3.
2.7.- Determinacin de antgenos liLA.
Los protocolos para estos ensayos fueron los utilizados rutinariamente en el Servicio de
Inmunologa del Hospital 12 de Octubre. A continuacin se describen someramente los mtodos
empleados en cada una de las determinaciones.
4
Materiales y Mtodos
2.7.1.- Antgenos LA de clase 1
Las tcnicas se describen en orden de menor a mayor nivel de resolucin en la
determinacin de a l e l o s HL A:
i) Microlinfocitotoxicidad estndar, realizada s o b r e l i n f o c i t o s t o t a l e s e n c i n c o p l a c a s
diferentes: 2 placas con 58 anticuerpos policlonales cada una, incluyendo siempre en cada placa
un control negativo y uno positivo; 3 placas comerciales con 70 anticuerpos monoclonales por
p l a c a (On e l a mb da ) .
u) PCR-SSP (sequence-speciflc-primer), basada en la amplificacin especfica de alelos
o g r u p o s de a l e l o s e n l o s l o c i HL A- A, - B, - C de f i n i do s p o r s u s e c u e n c i a . Se u t i l i z a r o n k i t s
c o me r c i a l e s de l a s s i g u i e n t e s c a s a s : Dy n a l , Bo e h r i n g e r l n g e l h e i m y Bi o s y n t h e s i s .
iii) Oligotipaje con sondas especficas, basada en la amplificacin de los dos alelos de
c a da l o c u s (HL A- A, - B, -(2) a e s t u di a r . L o s p r o du c t o s a mp l i f i c a do s s e f i j a r o n e n u n a me mb r a n a
de nylon y se enfrentaron a una batera de sondas especficas, que comprendan regiones
exnicas e intrnicas de los alelos y grupos de alelos para cada locus: 30 sondas para HLA-A,
5 0 s o n da s p a r a HL A- B, y 3 0 s o n da s p a r a HL A- C . L a s s o n da s p o s i t i v a s s e e v i de n c i a r o n
mediante revelado por color.
iv) Secuenciacin despus de clonaje. Se realiz mediante una amplificacin conjunta de
los dos alelos de cada locus. Los productos resultantes se purificaron por mtodos comerciales
(QLkquick gel extraction kit, QIAgen), y se insertaron en un vector plasmdico (p-Mosblue-T
vector, Amershan). Los plsmidos recombinantes fueron introducidos en bacterias E. cok
competentes, despus de lo cual se sembraron en placas de agar con antibitico, IPTG y X-gal.
Se aisl el plsmido de las colonias recombinantes (resistentes al antibitico y carentes de
actividad 13-galactosidasa) y se procedi a su secuenciacin.
y) Secuenciacin directa, que proporciona una resolucin mxima en la determinacin de
alelos HLA. La amplificacin especfica de los dos alelos de cada loci se realiz por separado,
42
Materiales y Mtodos
debido al polimorfismo especfico que se encuentra en el intrn 1, permitiendo la secuenciacin
en un tiempo muy corto (1 da).
2.7.2.- Antgenos LA de clase II
La caracterizacin de los antgenos HLA de clase II fue realizada en todas las muestras
con tcnicas de genticamolecular: PCR-SSP (para HLA-DR, -DQ), secuenciacin directa (para
HLA-DRB) y secuenciacin despus de clonaje (para HLA-DRB, -DQA, -DQB), tal y como se
de s c r i b e p a r a l o s a n t g e n o s de c l a s e 1 . Ade m s , s e u t i l i z a r o n :
i) Dot-blot reverso con el sistema Amplicor (Roche) para el tipaje HLA-DR a una
resolucin media-baja. Tras una amplificacin gentica del exn 2 polimrfico, el producto
resultante se enfrent a una tira que llevaba fijados oligonucletidos especficos de alelos o
grupos de alelos. Mediante procesos de incubacin, lavado y revelado por color, se determinaron
l o s o l i g o n u c l e t i do s qu e di e r o n p o s i t i v o s p a r a l a mu e s t r a . F i n a l me n t e , e l t i p a j e f u e f a c i l i t a do p o r
un programa informtico.
u> Dot-blot reverso con el sistema Inolipa (Innogenetics), basado en las mismas premisas
que el anterior, que permiti determinar tanto antgenos HLA-DRB como DQB y DP con un
nivel alto de resolucin.
2 .8 .- Anlisis estadstico.
2.8.1.- Comparacin de muestras independientes (prueba U de Mann-Whitney).
Las diferencias en el contenido de clulas progenitoras hematopoyticas en SCU, MO y
SPM, en las subpoblaciones linfocitarias de SCU y SPA, la eficacia de los distintos mtodos de
s e p a r a c i n c e l u l a r y de l o s f o r ma t o s e mp l e a do s p a r a l a c r i o p r e s e r v a c i n de SC U s e a n a l i z a r o n
con el procedimiento de comparacin de dos muestras independientes respecto de la variable de
e s t u di o . Se a p l i c l a p r u e b a de Ma n n - Wh i t n e y p a r a c o mp r o b a r s i l a s o b s e r v a c i o n e s e n a mb o s
g r u p o s de da t o s e r a n e qu i v a l e n t e s .
43
Materiales y Mtodos
2.8.2.- Comparacin de variables categricas (prueba de Chi-cuadrado).
La efectividad de los procedimientos de asepsia durante la recogida de SCU fue
analizada con la prueba de Chi-cuadrado. Las variables se tabularon en categoras y se
compararon las frecuencias observadas y esperadas en cada una de ellas, con objeto de
comprobar si contenan la misma proporcin o, por el contrario, una proporcin especfica de
v a l o r e s .
2.8.3.- Comparacin de medias (prueba 1).
Los datos de viabilidad celular y de progenitores hematopoyticos en las distintas fases
del procesamiento, as como en el anlisis de los mtodos empleados para la descongelacin de
SCU, fueron obtenidos en las mismas muestras de SCU de forma longitudinal y paralela,
respectivamente. La comparacin de resultados en estos estudios se llev a cabo con la prueba 1
de muestras pareadas. Para el anlisis de la repercusin del intervalo entre la obtencin y el
procesamiento de SCU, los valores de viabilidad y clulas progenitoras segn el tiempo
transcurrido desde la recogida fueron comparados mediante la prueba r para muestras no
paredas.
2.8.4.- Anlisis de correlacin bivariante.
La determinacin de una asociacin lineal entre volumen y celularidad, y entre
viabilidad celular, nmero de progenitores hematopoyticos y tiempo entre la obtencin y el
procesamiento de SCU se realiz con el procedimiento de correlacin bivariante y el clculo del
coeficiente de correlacin de Pearson.
2.8.5.- Regresin lineal.
El impacto de factores obsttricos y matemos sobre la celularidad de SCU se analiz
mediante el procedimiento de regresin lineal. Las variables clnicas perinatales y los
parmetros biolgicos estudiados se obtuvieron en el momento de la donacin y durante el
44
Materiales y Mtodos
procesamiento de la SCU, respectivamente. Los datos fueron analizados mediante una regresin
paso a paso en sentido antergrado (fonvard) y retrgado (backward), habindose fijando el
nivel de significacin al 5%. Las ecuaciones de regresin para cada variable dependiente se
calcularon con el procedimiento REGRESSION del programa estadstico SPSS v.6. 1 (SPSS mc,
Chicago, It, USA). La regresin lineal estim los coeficientes de la ecuacin, referidos a una o
ms variables independientes, que mejor predijo el valor de la variable dependiente.
45
RESULTADOS
Resultados
1.- CARACTERSTICAS EMATOPOYTICAS E INMUNOLGICAS DE LA
SANGRE DE CORDN UMBILICAL. AN LISIS DE LA MUESTRA DEESTUDIO.
Un o de l o s o b j e t i v o s p r i mo r di a l e s de u n Ba n c o de Sa n g r e de C o r d n Umb i l i c a l c o n s i s t e
en ofrecer las mximas garantas de un injerto hematopoytico eficaz en los pacientes que
r e c i b e n u n t r a s p l a n t e de SC U. C o mo s e h a a p u n t a do a n t e r i o r me n t e , e l x i t o del trasplante de
SC U de p e n de de m l t i p l e s f a c t o r e s , u n o s r e l a c i o n a do s c o n e l r e c e p t o r (p o r e j e mp l o , n a t u r a l e z a
de l a e n f e r me da d de b a s e , e s t a do de l a e n f e r me da d r e mi s i n o r e c i di v a , i n t e n s i da d y du r a c i n
de los tratamientos previos de quimio/radioterapia), y otros relacionados con las caractersticas
biolgicas del injerto (por ejemplo, potencial de implante hematopoytico, capacidad
a l o r e a c t i v a , di s p a r i da d HL A) . Al p l a n t e a mo s e l de s a r r o l l o de u n Ba n c o de SC U e n e l Ho s p i t a l
12 de Octubre, y con la finalidad de establecer criterios mnimos para el procesamiento y
depsito de unidades de SCU ptimas para trasplante, consideramos que en primer lugar deban
ser analizadas las caractersticas hematopoyticas e inmunolgicas de la sangre de cordn
u mb i l i c a l . Po r t a n t o , de c i di mo s e s t u di a r u n a s e r i e de p a r me t r o s b i o l g i c o s qu e n o s p e r mi t i e r a n
definir genricamente estas caractersticas de la SCU, y evaluar individualmente cada una de las
u n i da de s i n c l u i da s e n e l Ba n c o .
El estudio que se describe en este primer apartado ha sido realizado sobre una muestra no
seleccionada de 300 unidades de SCU, obtenidas consecutivamente en un periodo de 30 meses.
Todas las unidades recogidas en este periodo han sido analizadas y criopreservadas sin
excepcin alguna, esto es, sin tener en cuenta el volumen, celularidad total, contenido de
progenitores hematopoyticos, distribucin de subpoblaciones linfocitarias o fenotipo HLA. Ya
que se trata del anlisis de un nmero suficientemente elevado de unidades de SCU, y
previsiblemente de una muestra sin desviaciones al no haberse introducido ninguna preseleccin
antes del procesamiento de las unidades, los resultados obtenidos en este anlisis constituyen
una descripcin tpica de la sangre de cordn umbilical como producto de trasplante
h e ma t o p o y t i c o .
Ya hemos reseado que el potencial de reconstitucin medular y la capacidad aloreactiva
s o n l o s do s a s p e c t o s de l i n j e r t o m s r e l e v a n t e s qu e c o n di c i o n a n e l x i t o de u n t r a s p l a n t e de
47
Resultados
clulas hematopoyticas, y que el trasplante de SCU presenta unas caractersticas distintivas
respecto a los trasplantes de mdula sea (MO) y sangre perifrica movilizada (5PM) de adultos,
de las cuals merecen ser destacadas la menor incidencia de enfermedad injerto contra husped
(EICH) y l a c a p a c i da d de r e p o b l a c i n me du l a r c o n u n n me r o me n o r de c l u l a s i n f u n di da s . C o n
e l f i n de r e v e l a r p o s i b l e s di f e r e n c i a s b i o l g i c a s qu e a y u de n a e x p l i c a r e s t a s di f e r e n c i a s c l n i c a s
tan notables entre ambos tipos de trasplantes, hemos llevado a cabo tambin un estudio
comparativo de los parmetros hematopoyticos e inmunolgicos de SCU respecto a MO, SPM
y/o SPA.
1.1.- Clulas nucleadas totales en SCU.
La experiencia acumulada hasta la actualidad demuestra que uno de los principales
f a c t o r e s qu e i n f l u y e n e n l a r e c u p e r a c i n de l a s c i f r a s de n e u t r f i l o s y p l a qu e t a s e n s a n g r e
perifrica tras un trasplante de SCU es el nmero de clulas nucleadas totales infundidas. As, la
probabilidad de implante es del 89% y 74% en pacientes trasplantados con una dosis celular
s u p e r i o r e i n f e r i o r , r e s p e c t i v a me n t e , a 3.7x o~ clulas nucleadas por kilo de peso (Gluckman y
cols., 1997; Locatelli y cols., 1999). Por esta razn, hemos querido realizar en primer lugar un
a n l i s i s de l a c e l u l a r i da d t o t a l c o n t e n i da e n l a s u n i da de s de SC U, s u b r a y a n do l a v a r i a b i l i da d e n
c u a n t o a r i qu e z a c e l u l a r y , de a c u e r do c o n e l l a , l a p r e v i s i n de u t i l i z a c i n p a r a t r a s p l a n t e de l a s
u n i da de s p r o c e s a da s e n p a c i e n t e s p e di t r i c o s y a du l t o s .
C o mo s e v e r m s a de l a n t e (a p a r t a do 3 . 1 . ) , h e mo s i n t r o du c i do u n p r o c e di mi e n t o de
o b t e n c i n de SC U qu e c o n s i s t e e n l a s u ma de do s f r a c c i o n e s r e c o g i da s me di a n t e p u n c i n de l a
v e n a u mb i l i c a l y p e r f u s i n a r t e r i o v e n o s a de l a p l a c e n t a , r e s p e c t i v a me n t e . L o s r e s u l t a do s
c o n s e g u i do s c o n e s t a me t o do l o g a qu e da n p o r me n o r i z a do s e n di c h o a p a r t a do 3 . 1 , a s c o mo
tambin la importancia de su utilizacin. Aqu se muestran la celularidad de las unidades
o b t e n i da s c o n di c h a t c n i c a de r e c o l e c c i n , y e l a n l i s i s r e a l i z a do s o b r e e l p o t e n c i a l de
t r a s p l a n t e de l a mu e s t r a de SC U e s t u di a da .
48
Resultados
1.2.- Clulas primitivas y progenitoras hematopoyticas de SCU. Comparacin con mdula
sea y sangre perifrica movilizada del adulto.
Si bien la detenninacin de la celularidad total permite establecer un criterio inicial para
definir la riqueza de una unidad de SCU, la capacidad de repoblacin hematopoytica reside en
ltima instancia en la presencia de clulas primitivas pluripotenciales viables que aseguren una
reconstitucin sostenida de todos los linajes celulares. El ensayo que mejor define esta
capacidad de autorrenovacin consiste en la reconstitucin hematopoytica in vivo en el modelo
murino SCID/NOD. Dentro de los ensayos in vitro, aquel en el que se determinan las clulas
progenitoras ms inmaduras es la cuantificacin de clulas iniciadoras de cultivos a largo plazo
(LTC-IC). Sin embargo, la complejidad, laboriosidad y el coste elevado de estos experimentos
impiden su aplicacin rutinaria en el anlisis de las unidades procesadas en un Banco de SCU.
Alternativamente, la deteccin y cuantificacin mediante ensayos clonognicos
(tcnicamente ms simples) de clulas progenitoras ms diferenciadas, comprometidas en la
diferenciacin nicamente de uno o hasta tres linajes celulares, permite inferir la presencia de un
nmero proporcional de clulas primitivas. Asimismo, la caracterizacin fenotpica por
citometra de flujo, aunque no informa de la funcionalidad de las clulas hematopoyticas,
constituye una herramienta rpida de anlisis tanto de clulas primitivas como de clulas
progenitoras en base a la expresin en la superficie celular de marcadores especficos que sirven
para su identificacin.
Hemos combinado estas dos ltimas metodologas para estudiar las distintas poblaciones
celulares hematopoyticas en SCU. Adems, hemos comparado el contenido en clulas
primitivas y progenitoras de sangre de cordn umbilical con el de mdula sea y/o sangre
perifrica movilizada del adulto, con objeto de cuantificar posibles diferencias relacionadas con
el potencial de implante hematopoytico de la SCU respecto al de las otras dos fuentes de
clulas progenitoras habitualmente empleadas en trasplante.
5 0
Resultados
1.2.1.- Anlisis fenotipico de clulas CD34~ .
El antgeno CD34 se expresa muy tempranamente en las clulas hematopoyticas
p r i mi t i v a s . Su e x p r e s i n s e ma n t i e n e e n l o s p r i me r o s e s t a di o s de di f e r e n c i a c i n de l a s c l u l a s
m s i n ma du r a s , c u a n do s t a s da n l u g a r a c l u l a s p r o g e n i t o r a s c o mp r o me t i da s a l o s di f e r e n t e s
l i n a j e s c e l u l a r e s h e ma t o p o y t i c o s . C o i n c i di e n do c o n l a a p a r i c i n de l a p r o g e n i e c e l u l a r m s
di f e r e n c i a da a p a r t i r de l a s clulas progenitoras, cesa la expresin de este antgeno, de manera
qu e t o da s l a s c l u l a s p o s t p r o g e n i t o r a s ma du r a s s o n C D3 4 n e g a t i v a s .
La expresin concomitante de otros antgenos de superficie ayuda a la caracterizacin y
distincin entre las clulas ms primitivas y las clulas progenitoras, as como entre los
p r o g e n i t o r e s p e r t e n e c i e n t e s a di s t i n t o s l i n a j e s h e ma t o p o y t i c o s . De e s t a f o r ma , u n a n l i s i s
c i t o f l u o r o m t r i c o b i - o t r i v a r i a n t e b a s a do e n l a de t e c c i n de l a n t g e n o C D3 4 j u n t o a
determinados antgenos especficos de linaje, permite la identificacin y enumeracin de los
di s t i n t o s p r o g e n i t o r e s h e ma t o p o y t i c o s s e g n s u e s t a di o y c o mp r o mi s o de di f e r e n c i a c i n .
En l a t a b l a 1 s e i n di c a el porcentaje y el nmero absoluto de clulas CD34~ totales en la
mu e s t r a de SC U e s t u di a da . De l a s 1 83 u n i da de s de SC U a n a l i z a da s , 1 3 3 (7 3 %) c o n t e n a n m s de
TABL A 1 . D e te r m i n a c i n p o r c i to m e tr a d e f l u j o d e c l u l a s C D3 4~ d e S C U
C l u l a s C D3 4~
F r e c u e n c i a (%) Total (x106)
4.664.28
me di a ds 0. 3 90. 2 6
me di a n a 0. 3 1 3 . 43
0.53 - 26.46 e x t r e mo s 0.06 - 1.41
Los resultados muestran el anlisis realizado sobre 183 unidades de SCU.
Abreviaturas: SCU, sangre de cordn umbilical; ds, desviacin estndar.
51
Resultados
2x10
6 clulas CD34~ , lo que equivaldra a infundir una dosis al menos superior a 0.3x105
clulas CD34~ por kg de peso en receptores de hasta 65 kg. Esta cifra es aproximadamente 100
v e c e s i n f e r i o r a l a c a n t i da d de c l u l a s C D3 44 qu e s e i n f u n de n c o n l o s t r a s p l a n t e s de MO y 5 PM.
1.2.1.1.- Clulas primitivas.
La poblacin CD34~ comprende las clulas ms primitivas y las clulas progenitoras ms
diferenciadas, pudiendo distinguirse ambas subpoblaciones en funcin de la expresin adicional
de a n t g e n o s c o mo C D3 8 y HL A de c l a s e I I (HLA-DR), cuya expresin se establece con el
grado de diferenciacin. Una vez definidos los porcentajes globales de clulas CD34t
determinamos las poblaciones de clulas ms primitivas CD34~ /CD3W y de clulas ms
diferenciadas CD34~ /CD38VHLA-DR~ , as como las correspondientes a clulas progenitoras
+ + +
CD34 /CD38 comprometidas a los linajes granulocito-macrofgico (CD33 /CD13~ ),
megacarioctico (CD61tCD41~ ) y linfoide B (CD10~ /CD19~ ).
El anlisis comparativo con MO y 5PM de adulto (Tabla 2) mostr porcentajes similares
al de SCU de clulas primitivas CD34~ /CD3W y clulas progenitoras CD34~ /CD38~ (3.3 vs
1.13 v s 2 . 48%, y 94. 9 v s 99. 3 8 v s 97 . 86%, r e s p e c t i v a me n t e ) . Si n e mb a r g o , a p a r e c i e r o n
diferencias a nivel de los progenitores ms inmaduros dentro de la subpoblacin CD34~ /CD3W
definidos como clulas CD344/CD38YHLA-DR, ya que en SCU ms del 60% de las clulas
CD34~ /CD3W eran HLA-DR7, mientras que en MO solo una tercera parte de las mismas eran
HLA-DRJ y en 5PM no se detect este subtipo de progenitores inmaduros (Tabla 2).
Podemos concluir, por tanto, que la SCU tiene en trminos absolutos (cuando se tiene en
cuenta el nmero total de clulas trasplantadas) un contenido de clulas CD344 unas 100 v e c e s
inferior al de MO o SPM, si bien el porcentaje de clulas ms. primitivas
CD344/CD38JHLA-DICes significativamente superior en SCU.
5 2
Resultados
TABLA 2. C l u l a s p r i m i ti v a s C D 34 ~ / C D 3B y c l u l a s
p r o g e n i to r a s CD 34 ~ ICD 38 ~ e n S C U . C o m p a r a c i n c o n M O y 5P M d e l a d u l to
Fenotipo SCU MO SPM
CD38JHLA-DR7 1.560.79 1.22.0 0
p _________________
<0.01
CD38JHLA-DR~ 0.920.76 2.1 3.3 1.131.73 NS
CD38~ /HLA-DR 6.763.49 16.918.5 5.95 2.46 NS
CD38/HLA-DR 78.019.8 93.43 3.12 NS
91.14.6
Su b p o b l a c i o n e s de c l u l a s C D3 Q de t e r mi n a da s p o r c i t o me t r a de f l u j o e n s a n g r e de c o r d n u mb i l i c a l
(n = l O) , m du l a s e a (n = 4) y s a n g r e p e r i f r i c a mo v i l i z a da (n = 4) , a n a l i z a n do l a c o e x p r e s i n de C D3 8
y HLA-DR. L o s r e s u l t a do s mu e s t r a n e l p o r c e n t a j e me di o ds de l a s di f e r e n t e s p o b l a c i o n e s s o b r e e l
t o t a l de c l u l a s C D3 4t
Abreviaturas: SCU, sangre de cordn umbilical; MO, mdula sea de adulto; 5PM, clulas progenitoras
mo v i l i z a da s de s a n g r e p e r i f r i c a de a du l t o ; p , p r u e b a de s i g n i f i c a c i n e s t a d s t i c a (U de Ma n n -
Wh i t n e y ) ; NS, di f e r e n c i a n o s i g n i f i c a t i v a .
Ade m s de l e s t u di o de l c o mp a r t i me n t o de c l u l a s h e ma t o p o y t i c a s p r i mi t i v a s , s e h a
analizado tambin la composicin de las poblaciones de clulas progenitoras ms diferenciadas,
comprometidas a los distintos linajes de diferenciacin. Consideramos importante analizar este
compartimento, ya que la determinacin del nmero de progenitores hematopoyticos
comprometidos permitira comprobar si la velocidad de recuperacin postrasplante en sangre
p e r i f r i c a de c l u l a s ma du r a s p e r t e n e c i e n t e s a l a s di s t i n t a s l n e a s de di f e r e n c i a c i n
(granulocitos, monocitos, plaquetas, linfocitos) guarda relacin con la cantidad infundida de sus
correspondientes progenitores. En consecuencia, hemos analizado la proporcin de progenitores
de lnea granulocito-macrofgica, megacarioctica y linfoide B, comparando los resultados
obtenidos en SCU con los de MO y SPM.
1.2.1.2.- Clulas progenitoras granulocito-macrofgicas.
Entre un 70 a 90%, aproximadamente, de las clulas CD34~ /HLA-DR~ expresaban
antgenos de diferenciacin granulocito-macrofgica CD33, CD13 y CDI 17. Por el contrario, la
53
Resultados
TABLA 3. C l u l a s p r o g e n i to r a s C D 34 ~ c o n d i f e r e n c i a c i n
g r a n u l o c i to -m a c r o f g i c a e n S C U . C o m p a r a c i n c o n M O d e l a d u l to
Fenotipo SCU MO p
CD33/HLA-DR~ 86.15.56 69.019.9 NS
CDIM/HLA-0R 89.52.91 74.031.0 NS
C D1 1 7 ~/HL A- DR 7 6. 7 7 . 8 51.823.9 NS
CDI5/HLA-DR 11.84.37 18.38.1 NS
Subpoblaciones de clulas CD34 determinadas por citometra de flujo en sangre de cordn umbilical
n=l0) y mdula sea (n=4), analizando la coexpresin de marcadores de diferenciacin mieloide
(CD33~ , CD13~ , CDI l7~ y CD15~ ). Los resultados muestran el porcentaje medio ds de las
di f e r e n t e s p o b l a c i o n e s s o b r e e l t o t a l de c l u l a s CD34t
Abreviaturas: SCU, s a n g r e de c o r d n u mb i l i c a l ; MO, m du l a s e a de a du l t o ; p , p r u e b a de s i g n i f i c a c i n
e s t a d s t i c a (Ude Ma n n - Wh i t n e y ) ; NS, di f e r e n c i a n o s i g n i f i c a t i v a .
e x p r e s i n de CD15, un marcador de diferenciacin granuloctica terminal, se detect en un
porcentaje inferior, en tomo al 10-20%. En ninguna de estas subpoblaciones granulocito-
macrofgicas se han evidenciado diferencias significativas entre SCU y MO (Tabla 3).
1.2.1.3.- Clulas progenitoras megacariocticas.
Tampoco se observaron diferencias significativas en la frecuencia de clulas CD34~ con
diferenciacin megacarioctica (CD1
4 y/o CD4l~ ) en SCU, MO y SPM, con porcentajes que
oscilaron entre el 16 y 28% de clulas CD34~ /CD6l~ , y entre el 12 y 22% de clulas
CD34tCD4I~ (Tabla 4>. El anlisis de la expresin HLA-DR en los progenitores
megacariocticos para discriminar aquellos que son ms inmaduros (HLA-DlC) de los ms
diferenciados (HLA-DR~ ), tampoco revel diferencias significativas en la distribucin de ambos
compartimentos entre las tres fuentes de clulas hematopoyticas (Tabla 4).
5 4
Resultados
TABLA4 . C l u l a s p r o g e n i to r a s C D 34 ~ c o n d i f e r e n c i a c i n
m e g a c a r i o c ti c a e n S C U . C o m p a r a c i n c o n M O y 5P M d e l a d u l to
Fenotipo SCU MO SPM p
CD6l/HLA-DR~ 18.87.83 15.312.1 24.83.67 NS
CD6l~ /HLA-DW 2.021.03 0.90.7 3.42.81 NS
CD4lVHLA-DR 10.45 4.9 20.65.98 NS
CD4l~ /HLA-DlC 2.032.38 2.051.35 NS
Su b p o b t a c i o n e s de c l u l a s C D3 4~ de t e r mi n a da s p o r c i t o me t r a de f l u j o e n s a n g r e de c o r d n u mb i l i c a l
(n=l0), mdula sea (n=4> y sangre perifrica movilizada (n = 4) , a n a l i z a n do l a c o e x p r e s i n de
ma r c a do r e s de di f e r e n c i a c i n me g a c a r i o c t i c a (C D6l ~ y C D41 ) . L o s r e s u l t a do s mu e s t r a n e l
p o r c e n t a j e me di o ds de l a s di f e r e n t e s p o b l a c i o n e s s o b r e e l t o t a l de c l u l a s C D3 4~.
Abreviaturas: SCU, sangre de cordn umbilical; MO, mdula sea de adulto; 5PM, clulas progenitoras
mo v i l i z a da s de s a n g r e p e r i f r i c a de a du l t o ; p , p r u e b a de s i g n i f i c a c i n e s t a d s t i c a (U de Ma n n -
Wh i t n e y ) ; NS, di f e r e n c i a n o s i g n i f i c a t i v a .
1.2.1.4.- Clulas progenitoras linfoides B.
En cuanto a los progenitores CD34~ pertenecientes al linaje linfoide B (CD10~ y /o
CD19
4), los resultados obtenidos (Tabla 5) confirman la ausencia de los mismos en SCU
TABLA 5.- C l u l a s p r o g e n i to r a s C D 34 ~ c o n
d i f e r e n c i a c i n l i n f o i d e B e n S C U . C o m p a r a c i n c o n M O d e l a d u l to
Fenotipo SCU MO p
CD10~ 0 18.611.8 <0.01
CD1r 0 12.313.2 <0.01
Su b p o b l a c i o n e s de c l u l a s C D3 4 de t e r mi n a da s p o r c i t o me t r a de f l u j o e n s a n g r e de c o r d n u mb i l i c a l
(n=l0) y mdula sea (n=4), analizando la coexpresin de marcadores de diferenciacin linfoide B
(CD1O, CDl9~ ). Los resultados muestran el porcentaje medio ds de las diferentes poblaciones
s o b r e e l t o t a l de c l u l a s C D3 4t
II
Abreviaturas: SCU, sangre de cordn umbilical; MO, mdula sea de adulto; p, prueba de significacin
estadstica (U de Mann-Whitney).
55
Resultados
Los resultados descritos muestran que la presencia de clulas progenitoras de diferentes
linajes, a excepcin de los progenitores linfoides B, parece ser similar en SCU, MO y 5PM. El
anlisis citomtrico de progenitores pertenecientes a distintos linajes, si bien indicativo de la
presencia de los mismos en SCU, debe necesariamente completarse con un estudio funcional
que demuestre la capacidad proliferativa de los mismos. Este estudio se ha realizado mediante
ensayos clonognicos, cuyos resultados se describen a continuacin.
1.2.2.- Clulas formadoras de colonias.
La determinacin de progenitores hematopoyticos mediante ensayos clonognicos est
sujeta a una gran variabilidad dependiente de las condiciones de cultivo, la actividad de los
factores de crecimiento empleados y la subjetividad en el recuento de las colonias. Por ello, los
datos numricos que se obtienen con estos ensayos no pasan de ofrecer una informacin
semicuantitativa del contenido de clulas progenitoras presentes en la muestra. Sin embargo,
ofrecen la posibilidad de comprobar la funcionalidad de las clulas clonognicas en cuanto a su
capacidad de proliferacin y diferenciacin in vitro y, por tanto, de la viabilidad de las mismas.
La combinacin de funcin hematopoytica y semicuantificacin de clulas progenitoras que
proporcionan los ensayos clonognicos determina su importancia en la evaluacin del potencial
hematopoytico de cualquiera de los productos utilizados para trasplante, y es por ello por lo que
deben constituir una herramienta de rutina en la caracterizacin de las unidades de SCU.
1.2.2.1.- CFU-GEMM, CFU-GMy BFU-E.
En la tabla 6 se exponen los valores obtenidos en la muestra de estudio referentes a la
eficiencia clonognica y al nmero absoluto de clulas formadoras de colonias granulocito-
macrofgicas (CFU-GM), eritroides (BFU-E) y mixtas (granulocito-eritroblasto-macrfago-
megacariocito, CFU-GEMM) en SCU. Como puede observarse, la muestra no segua una
distribucin normal en ninguno de los progenitores, al tiempo que la dispersin respecto al valor
me di o f u e mu y a mp l i a . En e s t e c a s o , l a me di a n a y e l r a n g o i n f o r ma n me j o r de l c o n t e n i do de
c l u l a s p r o g e n i t o r a s c l o n o g n i c a s de l a s u n i da de s de SC U. Ta n t o l a e f i c i e n c i a c l o n o g n i c a c o mo
5 6
Resultados
TABLA 6.- D e te r m i n a c i n d e p r o g e n i to r e s h e m a to p o y ti c o s c to n o g n i c o s e n S C U
CFU-GM BFU-E CFU-GEMM
EC Total EC Total EC Total
(> d0~) (>4q5) (40~)
me di a ds 1 7 . 5 81 1 . 6 4. 3 93 . 7 2 5 . 3 3 1 6 6.265.22 4.083.46 1.091.5
me di a n a 1 5 . 95 3 . 3 3 2 2 . 5 5 4. 66 3 0. 64
e x t r e mo s 0- 7 5 0- 2 4. 2 7 0- 1 04 0- 3 2 . 2 4 0- 1 9 0- 1 0. 2 9
Ef i c i e n c i a c l o n o g n i c a y n me r o a b s o l u t o de c l u l a s p r o g e n i t o r a s h e ma t o p o y c a s de t e r mi n a da s
me di a n t e e n s a y o s c l o n o g n i c o s . L o s r e s u l t a do s mu e s t r a n e l a n l i s i s r e a l i z a do s o b r e 3 00 u n i da de s de
SCU, excepto en CFU-OEMM donde se han analizado 75 unidades.
Abreviaturas: CFU-OM, clulas formadoras de colonias granulocito-macrofgicas; BFU-E, clulas
f o r ma do r a s de bursts e r i t r o i de s ; C F U- G EMM, c l u l a s f o r ma do r a s de c o l o n i a s mi x t a s (g r a n u l o c i t o -
e r i t r o b l a s t o - ma c r f a g o - me g a c a r i o c i t o ) ; EC , e f i c i e n c i a c l o n o g n i c a (n u me r o de c o l o n i a s e n 5 x l 0~
c l u l a s s e mb r a da s e n e l c u l t i v o ) .
e l n me r o t o t a l de BF U- E f u e 1 . 4 v e c e s s u p e r i o r a l o s v a l o r e s c o r r e s p o n di e n t e s de C F U- G M.
C o n r e s p e c t o a l c o n t e n i do de C F U- G EMM, l a p r o p o r c i n de C F U- G M y BF U- E f u e de l o r de n
de 5 a 7 v e c e s ma y o r .
TABL A 7 . - C l u l a s p r o g e n i to r a s m e g a c a r i o c ti c a s (C F U -M k > e n S C U . C o m p a r a c i n c o n 5P M d e l a du l t o
SCU SPM p
me di a 11.20 5.87 NS
ds 10.83 4.76
e x t r e mo s 4- 3 0 1 . 4- 1 5
Ef i c i e n c i a c l o n o g n i c a (n u me r o de c o l o n i a s e n lo
5 c l u l a s s e mb r a da s e n e l c u l t i v o ) de p r o g e n i t o r e s
me g a c a r i o c t i c o s de t e r mi n a do s me di a n t e e n s a y o s c l o n o g n i c o s e n s a n g r e de c o r d n u mb i l i c a l (n = 5 )
y s a n g r e p e r i f r i c a mo v i l i z a da (n = 8) .
Abreviaturas: C F U- Mk , c l u l a s f o r ma do r a s de c o l o n i a s me g a c a r i o c t i c a s ; SC U, s a n g r e de c o r d n
u mb i l i c a l ; 8PM, c l u l a s p r o g e n i t o r a s mo v i l i z a da s de s a n g r e p e r i f r i c a de a du l t o ; p , p r u e b a de
s i g n i f i c a c i n e s t a d s t i c a (U de Ma n n - Wh i t n e y ) . NS: di f e r e n c i a n o s i g n i f i c a t i v a ; ds , de s v i a c i n
e s t n da r .
57
Resultados
1.2.2.2.- CFU-Mk.
La determinacin de clulas formadoras de colonias megacariociticas (CFU-Mk) se
r e a l i z s o l o e n 5 mu e s t r a s de SC U (Ta b l a 7 ) , s i e n do l a e f i c i e n c i a c l o n o g n i c a de e s t o s
progenitores 3 y 5 veces menor que las de CFU-GMy BFU-E respectivamente.
En las tablas 7 y 8 se comparan la eficiencia clonognica de CFU-Mk y CFU-GM de
SCU, MO y SPM. La frecuencia de CFU-OM en SCU fue casi tres veces superior a la de MO y
s i mi l a r a l a qu e s e o b s e r v e n 5 PM. I g u a l me n t e , l a f r e c u e n c i a de C F U- Mk e n SC U f u e
practicamente el doble que en SPM.
En conjunto, de todos estos resultados puede concluirse que la SCU posee al menos una
proporcin similar, si no mayor, respecto a MO y SPM de clulas primitivas ms inmaduras
(CD34
4/CD3WfflLA-DW), y de clulas progenitoras granulocito-macrofgicas, eritroides y
me g a c a r i o c i t i c a s , e x i s t i e n do s i mu l t n e a me n t e u n a a u s e n c i a de p r o g e n i t o r e s c o mp r o me t i do s e n
l a di f e r e n c i a c i n l i n f o i de E.
TABLA 8. C l u l a s p r o g e n i to r a s g r a n u l o c i to -m a c r o f g i c a s
(C F U -G M ) e n S C U . C o m p a r a c i n c o n M O y 5P M d e l a d u l to
SCU MO SPM
44.20
p
me d a 46. 40 1 6. 80 < 0. 01
ds 2 2 . 2 2 1 2 . 5 0 2 8. 5 0
10-86 4-38 11-94 e x t r e mo s
Ef i c i e n c i a c l o n o g n i c a (n u me r o de c o l o n i a s e n io~ c l u l a s s e mb r a da s e n e l c u l t i v o ) de p r o g e n i t o r e s
g r a n u l o c i t o - ma c r o f g i c o s de t e r mi n a do s me di a n t e e n s a y o s c l o n o g n i c o s e n s a n g r e de c o r d n
u mb i l i c a l (n = 1 0) , m du l a s e a (n = 1 0) y s a n g r e p e r i f r i c a mo v i l i z a da (n = 1 0) .
Abreviaturas: C F U- G M, c l u l a s f o r ma do r a s de c o l o n i a s g r a n u l o c i t o - ma c r o f g i c a s ; SC U, s a n g r e de
c o r d n u mb i l i c a l ; MO, m du l a s e a de a du l t o ; 5 PM, c l u l a s p r o g e n i t o r a s mo v i l i z a da s de s a n g r e
p e r i f r i c a de a du l t o ; p : p me b a de s i g n i f i c a c i n e s t a d s t i c a (U de Ma n n - Wh i t n e y ) .
58
Resultados
1.3.- Clulas linfocitarias de SCU. Comparacin con sangre perifrica de adulto.
Uno de los aspectos de la SCU que ms entusiasmo ha generado es la menor incidencia y
severidad de enfermedad injerto contra husped (EICH) cuando se utiliza esta fuente de clulas
hematopoyticas, siendo posible la realizacin de trasplantes de SCU con un mayor grado de
incompatibilidad HLAque en los trasplantes de MO o SPM de donantes adultos.
Como se ha mencionado anteriormente, la EICH es una complicacin en la que linfocitos
T reactivos frente a antgenos del sistema HLA, y probablemente tambin clulas natural killer
(NK), juegan un papel relevante. Ambos tipos de clulas producen citocinas que son mediadores
importantes de este proceso. La secrecin de una variedad de citocinas prointiamatorias tales
como interleucina-2 (IL-2), factor de necrosis tumoral-a (TNF-cz) e interfern-y (IFN-y) por
linfocitos T aloreactivos inducen dao tisular bien directamente, o a travs de la activacin de
otras clulas efectoras como clulas Tcitotxicas, clulas B productoras de anticuerpos y clulas
NK.
C o n e l f i n de i n v e s t i g a r si existen diferencias en el sistema inmune neonatal que pudieran
justificar la menor ocurrencia y g r a v e da d de EI C H e n l o s t r a s p l a n t e s de SCU, hemos comparado
el inmunofenotipo y el perfil de produccin de citocinas de linfocitos de sangre de cordn
umbilical frente a los de sangre perifrica del adulto.
1.3.1.- Anlisis fenotpico de poblaciones linfocitarias.
El anlisis de las distintas poblaciones linfocitarias se llev a cabo por tipaje
citofluorimtrico, con anticuerpos especficos de clulas T (CD3~ ), clulas B (CDl9~ ) y clulas
NK (CD37CD7~ ). Las principales subpoblaciones linfocitarias (linfocitos T CD3
4, linfocitos B
CD194 y clulas NK CD37CD7~ ) se mostraron porcentualmente similares en sangre de cordn
umbilical y sangre perifrica del adulto (Tablas 9, 12 y 13).
59
Resultados
TABLA9. A n l i s i s f e n o t p i c o d e l i n f o c i to s T d e S C U . C o m p a r a c i n c o n s a n g r e p e r i f r i c a d e l a d u l to
Fenotipo SCU SPA p
CD3 72.09.7 73.53.8 NS
CD3~ /CD4~ 53.8 7.8 45.3 5.2 0.04
CD3/CD8 16.0 4.8 29.6 4.7 <0.001
ratio CD4/CD8 3.70.9 1.60.4 <0.001
CDM/TCRa~ 69.210.1 74.03.1 NS
CD3/TCRyS~ 1.81.1 2.21.9 NS
CD3~ /CD25~ 5.3 0.6 12.24.0 <0.001
CD3~ /CD38~ 70.7 10.3 39.45.1 <0.001
CD3VHLA-DR~ 0.8 0.5 6.61.6 <0.001
C03/CD56 0.3 0.6 4.02.0 <0.001
CD3~ /CD57~ 0 6.1 1.9 <0.001
Subpoblacones de linfocitos 1 CDY determinadas por citometra de flujo en sangre de cordn umbilical
(n=15) y sangre perifrica de adulto (n=10). Los resultados muestran el porcentaje medio ds de los
distintos subgrupos CD3 sobre el total de linfocitos, definidos como clulas de baja complejidad por
SSC (side-scatter ) y reactividad intensa para CD45.
Abreviaturas: SCU, sangre de cordn umbilical; SPA, sangre perifrica de adulto; p, prueba de
significacin estadstica (Ude Mann-Whitney); NS, diferencia no significativa.
1 . 3 . 1 . 1 . - L i n f o c i t o s T.
Se realiz un anlisis posterior de las subpoblaciones de linfocitos T colaboradores
+
(CD4
4) y citotxicos (CD8t. As, la frecuencia de linfocitos T CD4 fue superior en SCU que en
SPA, al tiempo que haba menos linfocitos TCD84, siendo la ratio CD4:CD8 mayor (Tabla 9).
60
Resultados
los linfocitos T CD4~ coexpresaban predominantemente el antgeno CD45RA (clulas naive),
mientras que solo se observ una proporcin muy pequea de clulas CD45RO~ (clulas de
memoria). La mayora de los linfocitos CD4
4/CD4SRO4 de SCU tambin expresaban CD45RA
(denominadas clulas T transicionales), lo que refleja clulas T recientemente estimuladas in
vivo. Por el contrario, el estudio en SPA mostr la presencia de un mayor nmero de clulas
CD4~ /CD45RO4. En la figura 2 se muestra el patrn tpico de expresin de las isoformas CD45
en linfocitos T CD4~ de SCU y SPA.
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Y .1&. 1I
FIGURA 3. Histogramas de fluorescencia de CD3 vs CD38, C025 y HLA-DR en
linfocitos T. SPA, s a n g r e p e r i f r i c a de l a du l t o ; SCU, s a n g r e de c o r d n u mb i l i c a l ;
Pu n t o s n e g r o s , c l u l a s CD3~ qu e e x p r e s a n CD3S, CD25 o HL A- DR.
2 ~ j
10 10 1 &
CD3
6
a
4
t
62
Resultados
TABLA 1 1 . E x p r e s i n d e m o l c u l a s d e a d h e s i n
e n l i n f o c i to s T d e S C U . C o m p a r a c i n c o n S P d e l a d u l to
SCU SPA
71.910.4 74.53.8
p
CD3~ /CD1 la~ (LFA-l) NS
CD3~/CD44 (HCAM) 73.1 11.2 74.74.8 NS
CD3~ /CD54~ (ICAM-l) 2.10.6 34.216.1 <0.001
CD3~ /CD58~ (LFA-3) O
42.2 14.0 <0.001
F r e c u e n c i a de l i n f o c i t o s T C D3 ~ de t e r mi n a da p o r c i t o me t r a de f l u j o e n s a n g r e de c o r d n u mb i l i c a l
(n=15) y sangre perifrica de adulto (n=l0) que expresan las molculas de adhesin LFA-l (CDI la),
HCAM (CD44), ICAM-1 (CDS4) y LFA-3 (CD58). Les resultados muestran el porcentaje medio
ds de l o s di f e r e n t e s s u b g r u p o s C D3 s o b r e e l t o t a l de l i n f o c i t o s de f i n i do s c o mo c l u l a s de b a j a
c o mp l e j i da d p o r SSC (side-scatter) y r e a c t i v i da d i n t e n s a p a r a C D4S.
Abreviaturas: SCU, sangre de cordn umbilical; SPA, s a n g r e p e r i f r i c a de a du l t o ; p , p r u e b a de
s i g n i f i c a c i n e s t a d s t i c a (U de Ma n n - Wh i t n e y ) ; NS, di f e r e n c i a n o s i g n i f i c a t i v a .
F i n a l me n t e , h e mo s r e a l i z a do u n e s t u di o de l a e x p r e s i n e n l i n f o c i t o s T de mo l c u l a s de
a dh e s i n qu e i n t e r v i e n e n e n l a i n t e r a c c i n c e l u l a r y qu e p u e de n s e r i mp o r t a n t e s e n l a c a p a c i da d
aloreactiva linfocitaria. Las molculas de adhesin LFA-3 (CD58) e ICAM-1 (CD54) estaban
s i g n i f i c a t i v a me n t e me n o s e x p r e s a da s e n l i n f o c i t o s C D3 + de SC U, mi e n t r a s qu e l a e x p r e s i n de
LFA-1 (CD1 la/CD18) y HC AM (C D44) e r a s i mi l a r e n SC U y SPA (Ta b l a 1 1 ) , a u n qu e s e
observ una densidad disminuida de LFA-1 en los linfocitos T de SCU en correlacin con el
fenotipo CD45RA.
1.3.1.2.- Linfocitos B.
En c u a n t o a l a n l i s i s de p o b l a c i o n e s de linfocitos B, no se constataron diferencias con
r e s p e c t o al porcentaje de clulas CD19~ entre SCU y SPA. Sin embargo, casi el 90% de los
linfocitos B de SCU expresaban el antgeno CD5, considerado como un marcador de inmadurez.
No h u b o t a mp o c o di f e r e n c i a s e n l a e x p r e s i n de HL A- DR n i de mo l c u l a s de a dh e s i n e n t r e
a mb a s f u e n t e s de clulas (Tabla 12).
64
Resultados
TABLA 1 2. A n l i s i s f e n o t p i c o d e l i n f o c i to s B e n S C U . C o m p a r a c i n c o n S P d e l a d u l to
Fenotipo SCU SPA p
CDI 9~ 12.063 11.12.8 NS
CD19~ /HLA-DR~ 12.1 5.9 11.02.8 NS
CDlr/CD5~ 10.96.7 5.32.1 0.002
CDL9VCDLl&(LFA-1) 11.86.7 11.1 2.8 NS
CD19~ /CD44 (HCAM) 11.16.4 11.02.8 NS
CD19/CD54~ (JCAM-1) 10.58.1 10.62.8 NS
CDl9~ /CD58~ (LFA-3) 3.1 4.9 3.21.8 NS
Su b p o b l a c i o n e s de l i n f o c i t o s B CDI9
t de t e r mi n a da s p o r c i t o me t r a de f l u j o e n s a n g r e de c o r d n
u mb i l i c a l (n = 1 5 ) y s a n g r e p e r i f r i c a de a du l t o (n = l 0> , a n a l i z a n do l a c o e x p r e s i n de HLA-DR, CD5 y
mo l c u l a s de a dh e s i n L F A- l (C Dl l a ) , HC AM (C044), ICAM-1 (CDS4) y LFA-3 (CD58). L e s
resultados muestran el porcentaje medio ds de los diferentes subgmpos CD19~ sobre el total de
l i n f o c i t o s de f i n i do s c o mo c l u l a s de b a j a c o mp l e j i da d p o r SSC (side-scatter) y r e a c t i v i da d i n t e n s a
p a r a C D45 .
Abreviaturas: SCU, sangre de cordn umbilical; SPA, sangre perifrica de adulto; p, prueba de
s i g n i f i c a c i n e s t a d s t i c a (U de Ma n n - Wh i t n e y ) ; NS, di f e r e n c i a n o s i g n i f i c a t i v a .
1.3.1.3.- Clulas NK.
El porcentaje de clulas NK en SCU y SPA fue similar (Tabla 13>. Como se ha
mencionado previamente, la expresin de antgenos CD56 y CD57 se asocia con una mayor
actividad citotxica celular. La subpoblacin de clulas NK CD164/CD56 encontrada en SCU
f u e s u p e r i o r a la de SPA. De forma similar a los hallazgos descritos en linfocitos T, las clulas
NK de SCU no expresaban CD57, y la expresin de CD56 era de menor densidad que la
observada en las clulas NK de SPA (Figura 4).
De los datos expuestos, se puede concluir que las poblaciones linfocitarias de SCU
muestran una relativa inmadurez y una menor expresin de marcadores de actividad citotxica,
siendo los linfocitos Ten SCU predominantemente clulas naive.
65
Resultados
TABLA 1 3. A n l i s i s f e n o t p i c o d e l i n f o c i to s N K e n S C U . C o m p a r a c i n c o n S P d e l a d u l to
SCU SPA
11.46.8
Fenotipo p
CD7~ /CDV 14.4 4.4 NS
CD7~ /CD3JCD16~ 13.24.4 11.94.7 NS
CD7~ /CD3YCD56 8.5 3.9 12.8 6.1 0.01
CD7~ ~ /CD16~ /CD5& (*) 4.5 3.8 0.70.3 0.001
CD7~ /CD3JCD57~ 0 8.7 5.0 <0.001
Su b p o b l a c i o n e s de l i n f o c i t o s n a t u r a l killer (NK) CD7~ /CDV de t e r mi n a da s p o r c i t o me t r a de f l u j o e n
s a n g r e de c o r d n u mb i l i c a l (n=1 5 ) y s a n g r e p e r i f r i c a de a du l t o (n = 1 0) , a n a l i z a n do l a c o e x p r e s i n de
CDI6, CD56 y CD57. * En e s t a c o mb i n a c i n l a s c l u l a s NK h a n s i do s e l e c c i o n a da s p o r l a e x p r e s i n
i n t e n s a de C D7 , a de m s de C DI . L e s r e s u l t a do s mu e s t r a n e l p o r c e n t a j e me di o ds de l o s di f e r e n t e s
subgrupos CD7~ /CDY sobre el total de linfocitos definidos como clulas de baja complejidad por
SSC (side-scatter) y r e a c t i v i da d i n t e n s a p a r a C D45 .
Abreviaturas: SCU, s a n g r e de cordn umbilical; SPA, sangre perifrica de adulto; p, prueba de
s i g n i f i c a c i n e s t a d s t i c a (U de Ma n n - Wh i t n e y ) ; NS, di f e r e n c i a n o s i g n i f i c a t i v a .
1.3.2.- Produccin de citocinas por linfocitos T.
Un ensayo itt vitro que reproduce el proceso de activacin de linfocitos T, es la
estimulacin con steres de forbol e ionomicina, que, de forma conjunta, estimulan la expresin
y s e c r e c i n de c i t o c i n a s me di a do r a s de r e s p u e s t a i n mu n e . En n u e s t r o c a s o , t r a s la incubacin
con estas dos sustancias activadoras de clulas T, ms del 90% de los linfocitos en SCU y SPA
expresaron en todos los experimentos realizados el marcador de activacin precoz CD69, lo cual
permite afirmar que la activacin indujo en la mayora de los linfocitos una estimulacin
e f i c i e n t e . Aa di e n do un agente inhibidor del trfico intracelular de protenas, como es la
brefeldina, las citocinas producidas tras la estimulacin se retienen en el interior de la clula, y
pueden as ser fcilmente detectadas por citometra de flujo.
En la figura 5 se compara la expresin intracelular de IL-2, IL-4 e IFN-y en dos muestras
de linfocitos Tde SCU y SPA. En este experimento representativo se comprueba una produccin
66
Resultados
TABLA 1 4. Expresin de citocinas en linfocitos T CD4~ y CD8~ de SCU. Comparacin con SP del adulto
SCU p
CD3~/CD4~/IL-2 ~ 2 .91 .1 30.97.3 <0.01
CD3~/CD8~/1L-2~ 0.50.3 5.91.7 <0.01
CD3~/CD4iIL-4 0.3 0.2 2.00.5 <0.01
CD3~ /CD8~ /IL-4 0.1 0.4 0.20.3 <0.01
CD3~ /CD4~ /IFN>< 2.01.5 8.22.3 <0.01
CD3VCD8~ /IFN-< 0.5 0.6 10.0 4.7 <0.01
C l u l a s T CD3 productoras de citocinas caracterizadas por citometra de flujo en sangre de cordn
umbilical (n=8) y sangre perifrica de adulto (n=l0), de acuerdo con la expresin de CD4 y CD8 y la
deteccin intracelular de JL-2, IL-4 e lEN-y tras estimulacin con steres de forbol e ionomicina. Les
resultados muestran el porcentaje medio ds de positividad sobre el total de linfocitos T definidos
como clulas de baja complejidad por SSC (side-scatter) y expresin de CD3.
Abreviaturas: SCU, sangre de cordn umbilical; SPA, sangre perifrica de adulto; p, prueba de
significacin estadstica (U de Mann-Whitney).
CD56 y CD57 y de la menor proporcin de linfocitos T que expresan molculas de adhesin
LFA-3 e ICAM-1. Igualmente, la deteccin de clulas NK CD16~ /CD56 en SCU,
prcticamente inexistentes en SPA, se corresponde con una menor actividad ltica NK de SCU,
r e p e t i da me n t e de mo s t r a da e n e s t u di o s f u n c i o n a l e s . Po r l t i mo , l a me n o r p r o p o r c i n de c l u l a s
capaces de producir citocinas implicadas en reacciones proinflamatorias (IL-2 e EN-y) est en
concordancia con la inmadurez (CD45RA) de los linfocitos T de SCU, los cuales no han sido
an activados hacia clulas tipo TH1 (secretoras de IL-2 e EN-y) o TH2 (secretoras de IL-4).
69
Resultados
2.- CRITERIOS DE SELECCINDE DONANTES DESCU.
Una de las prioridades ms importantes de un Banco de SCU es procurar la mxima
seguridad a las madres que aceptan donar la sangre de cordn de su hijo, y proteger a los
pacientes que eventualmente reciban un trasplante de SCU. Para ello, la seleccin de los
posibles donantes de SCU debe ser muy estricta, siendo necesario en primer lugar facilitar a la
madre/donante una informacin adecuada de los propsitos del programa y de los
requerimientos que su participacin en el mismo le supone, y asegurar su conformidad por
escrito mediante la firma del consentimiento informado para la donacin de SCU. Adems,
cuando existen complicaciones durante el parto, puede existir algn riesgo para el recin nacido
o la madre si se procede a la recogida de SCU, por lo que en estas circunstancias debe
desestimarse la donacin de SCU. En tercer lugar, debe descartarse toda posibilidad de
transmisin de enfermedades a los pacientes que reciben sangre de cordn, investigando los
antecedentes familiares del donante y detectando en la madre y en la SCU la presencia de
posibles infecciones o transtomos hereditarios transmisibles.
Este proceso de seleccin se inicia en el primer contacto con la madre a la que se propone
participar en el programa, comprobando si existe algn criterio de exclusin que impida la
donacin de SCU (ver Anexo III). Tiene en cuenta las caractersticas del parto y el estado del
feto, descartando situaciones obsttricas que contraindiquen el procedimiento de recogida de
SCU. Por ltimo, incluye sendas revisiones del estado del recin nacido y de la madre, la
primera inmediatamente despus del parto, y la segunda tres meses despus de la donacin. De
esta forma, se garantiza la idoneidad de las unidades que se obtienen y que finalmente son
inventariadas en el Banco de SCU, al tiempo que se preserva la seguridad de las madrs que
consienten voluntariamente en la donacin de SCU.
En los puntos siguientes se detallan las exclusiones que han sido aplicadas antes,
inmediatamente despus y en el control realizado a los tres meses de la donacin de SCU,
haciendo mencin de aquellas alteraciones que no hemos considerado motivo de exclusin. Se
describe tambin la experiencia propia con algunas de las pruebas realizadas en cuanto al valor
70
Resultados
de las mismas en proporcionar mayor seguridad a las unidades de SCU disponibles para
trasplante.
2.1.- Exclusiones predonacin.
El programa de Banco de SCU fue iniciado en octubre de 1995. Hasta marzo de 1998 se
entrevistaron en el momento inmediatamente anterior al parto 439 mujeres embarazadas,
candidatas potenciales para la donacin de SCU. Trescientas madres (68%) cumplan todos los
criterios de inclusin (ver apartado 2.1. de Materiales y Mtodos) y fueron aceptadas como
donantes de SCU. Ciento treinta y nueve (32%) fueron excluidas por los motivos expresados en
la tabla 15.
Los tres grupos de causas ms frecuentes que impidieron la donacin de SCU fueron
problemas de naturaleza obsttrica (27.3%), la infeccin potencial de SCU (18.7%) y el
sufrimiento fetal (12.2%). Dentro de las causas obsttricas, las ms frecuentes fueron cesrea,
parto instrumental y periodo expulsivo rpido. Se desestim la obtencin de SCU en las cesreas
y partos instrumentales fundamentalmente para no interferir con una maniobra adicional que
pudiera suponer una dificultad aadida a una situacin obsttrica ms compleja de lo habitual.
La posibilidad de infeccin de la SCU vino motivada principalmente por una rotura de bolsa
amnitica de ms de 12 horas de duracin y por la presencia de fiebre materna durante el parto,
circunstancias que se asocian con riesgo de sepsis neonatal. El sufrimiento fetal fue detectado
clnicamente (alteraciones en la frecuencia cardaca o en el pH arterial), o por la presencia de
meconio en el lquido amnitico. El resto de causas descritas fueron incidentalmente marginales,
incluyendo un 3% de enfermedades hereditarias en la familia, y hubo un porcentaje significativo
de madres en las que no se procedi a la recogida de SCU sin que se refiriera ningn motivo
concreto por parte del personal de obstetricia encargado de la recoleccin. Un 12% de las
exclusiones fueron debidas a denegacin del consentimiento infonnado.
71
Resultados
TABLA 15. S e l e c c i n d e d o n a n te s d e S C U . In c i d e n c i a y c a u s a s d e e x c l u s i n .
Exclusin Incidencia (% )
Denegacin de consentimiento 17 (12 .2 )
I n f e c c i n p o t e n c i a l de SCU 26(18.7)
Bolsa rota> 12horas 13
Fiebre materna 7
Serologa rubeola (IgM) positiva (madre) 1
Infeccin perineal 1
Herpes cervix uterino 1
Serologa VIH positiva (madre) 1
Embarazo no controlado 1
Hepatitis C crnica (padre) 1
S u f r i m i e n t o f e t a l 17 (12.2)
Sospecha clnica 7
Meconio en lquido amnitico 10
Causas obsttricas 38 (27.3)
Cesrea 16
Periodo expulsivo rpido 7
Parto instrumental 10
Vuelta de cordn 1
Embarazo gemelar 1
Hipertensin arterial 3
A n t e c e de n t e s de e n f e r m e da de s ge n ticas 4(2.9)
Traslocacin t(13; 14) 1
Fenilcetonuria 1
Trisoma 21(S. Down) 1
Trombocitopenia hereditaria 1
Motivos religiosos 1(0.7)
Exclusin errnea 4(2.9)
Causa no reportada 32 (23)
Total exclusiones 139(100)
Donaciones 300
De 439 mujeres embarazadas, 139 (32%) fueron excluidas para la donacin por los motivos indicados en
la tabla, procedindose a la obtencin de SCU en 300 (68%).
72
Resultados
2.2.- Exclusiones en el periodo inmediato postparto.
Una vez recogida la SCU, se realiz una investigacin dirigida a descartar posibles
enfermedades transmisibles de naturaleza infecciosa o hereditaria. Para ello se practicaron
controles microbiolgicos tanto en la unidad de SCU (cultivos bacterianos aerobios y
anaerobios) como en el suero materno (serologa vrica y parasitaria), adems de una revisin
del estado clnico del recin nacido y de la historia familiar para identificar transtornos genticos
no detectados previamente.
2.2.1.- Infecciones bacterianas.
Durante la obtencin de SCU es posible la contaminacin por grmenes habituales de la
regin perineal (flora recto-vaginal), originada bsicamente por la entrada de bacterias en el
sistema de recoleccin durante la puncin de la vena umbilical o la canalizacin de los vasos
placentarios. Apesar de las medidas preventivas de esterilizacin del lugar de puncin, existe un
cierto nmero de unidades recolectadas en las que se detectan cultivos positivos para bacterias
aerobias y/o anaerobias.
Aerobios
Estafilococo epidermidis
Estreptococo agalactiae
Escherichia Coli
Estreptococo viridans
Klehsiella pnewnoniae
Lactobacillus sp
Hora mixta gram negativa
TABLA 16. C o n ta m i n a c i n b a c te r i a n a e n S C U
N
0 Unidades
7
4
2
1
1
1
1
Anaerobios
Bacteroidesfragilis
Bacillus sp
Dfteroides
Enterococofaecalis
Pediococus
Fusobacterium
Peptoestreptococo
Micrococussp
N0 Unidades
4
2
1
1
1
1
1
1
Total 17(5.6%> Total 11(3.6%)
Los resultados indican el nmero de unidades de SCUpositivas para grmenes aeorobios o anaerobios.
Entre parntesis se indica el porcentaje de contaminacin bacteriana (n=300).
73
Resultados
La incidencia de contaminacin por bacterias aerobias y anaerobias en las 300 unidades
de SCU analizadas se muestra en la tabla 16. Un total de 28 unidades (9.2%) fueron positivas,
no existiendo una incidencia significativamente superior de contaminacin por grmenes
aerobios o anaerobios. La contaminacin por Estafilococo epiderinidis y Estreptococo
agalacriae fueron las ms frecuentes dentro del gmpo aerobio, y la originada por Bacteroides
fragilis fue la ms frecuente en el grupo anaerobio. Durante el proceso final de validacin, todas
estas unidades positivas fueron consideradas no elegibles para trasplante y, por tanto,
desechadas del inventario del Banco.
2.2.2.- Infecciones vricas y parasitarias.
Por otro lado, puede existir antes o durante el parto una transmisin materno-fetal de
infecciones activas de naturaleza vrica o parasitaria. Segn la legislacin vigente, es obligatorio
realizar estudios de serologa en el suero de la madre que descarten la existencia de anticuerpos
TABLA17. In c i d e n c i a d e a n ti c u e r p o s
v i r a l e s y p a r a s i ta r i o s e n l a s m a d r e s / d o n a n te s d e S C U
Test serolgico Incidencia (%)
HBsAg 1(0.3)
Anti-VHC 3 (1)
Anti-VIH 1/2 0
TPHA O
Anti-Toxoplasma (IgG) 62 (21 )
Anti-CMV (IgG) 2 5 5 (85 )
Los resultados (n=300) indican el nmero de sueros matemos positivos (entre parntesis,
porcentaje de positividad), analizados el da de la donacin de SCU (da 0).
Abreviaturas: HBsAg, test de enzima-inmuno-anlisis (EIA) para el antgeno de superficie
del virus de la hepatitis B; Anti-VHC, test de EIA para anticuemos anti-virus de la
hepatitis C; Anti-VIH 1/2, test de ELA para anticuerpos anti-virus de la
inmunodeficiencia humana 1 y 2; TPHA, test de hemaglutinacin para anticuemos anti-
Treponema pallidum; Anti-Toxoplasma (IgO), test de ELA para anticuerpos Ig O a n ti -
toxoplasma; Anti-CMV (Ig O ), test de EIA para anticuemos IgO anti-citomegalovirus.
74
Resultados
frente a virus de la hepatitis B y hepatitis C, virus de inmunodeficiencia humana adquirida
(VIH) y sfilis. De forma adicional, analizamos la presencia de anticuerpos frente a
citomegalovirus (CMV) y toxoplasma, dos de las infecciones congnitas ms frecuentes en
pases desarrollados.
Los resultados de la serologa realizada en el suero de la madre el da del parto se
> 1
muestran en la tabla 17. Aunque la muestra estudiada fue relativamente pequea, la incidencia
de positividad para el antgeno de superficie del virus de la hepatitis B y de anticuerpos frente al
virus de la hepatitis C fue superponible a la detectada en una poblacin normal de donantes de
sangre, y supone por tanto una prdida escasa de unidades de SCU procesadas que, por esta
razn, fueron desechadas del Banco. Ninguna madre/donante fue positiva para VIR ni
Treponema pallidum.
La positividad para CMV y toxoplasma fue documentada en el rango de incidencia
descrito en nuestro mbito poblacional (Prez-Rivilla y cols., 1996), detectndose en todos los
casos anticuerpos IgO y nunca IgM. Este dato, combinado con la ausencia de elevacin del
ttulo de anticuerpos IgG en el anlisis realizado 90 das despus del parto (ver ms adelante
apartado 2.3.), y la no evidencia de manifestaciones clnicas de infeccin congnita por CMV o
toxoplasma en ninguno de los recin nacidos, indica un estado de inmunizacin materna
consecutiva a una infeccin antigua, no activa durante el embarazo. No se descart, por tanto,
ninguna unidad de SCU en base a esta positividad para anticuerpos IgG frente a CMV o
toxoplasma.
TABLA 18. E n f e r m e d a d e s h e r e d i ta r i a s o c o n g n i ta s d e te c ta d a s e n e l d a O y d a 90
Patologa Incidencia
Da O Dficit de colinesterasa
Malformacin renal (rin doble) 2
Da 90 ~ -ta1asemiaheterozigota 1
Fibrosis quistica 1
75
Resultados
2.2.3.- Enfermedades hereditarias.
Solamente se detect un caso de deficiencia de colinesterasa en la investigacin realizada
en el momento del nacimiento (Tabla 18). Adems de este transtorno hereditario, dos recin
nacidos eran portadores de malformaciones congnitas del aparato urinario (rin doble).
Ninguna de estas alteraciones fueron consideradas causas de exclusin de la unidad de SCU, ya
que no son transmisibles con un eventual trasplante de sangre de cordn umbilical.
2.3.- Control a los 90 das del parto.
Para aumentar la seguridad de la unidades depositadas en el Banco, y siguiendo las
medidas adoptadas en otros bancos de SCU, se estableci un control a los 90 das del parto en el
que se revisaron los antecedentes familiares, se realiz un segundo estudio serolgico en la
madre y se comprob el estado fsico del nio. El objetivo fue descartar posibles infecciones
maternas adquiridas en fechas prximas al parto y que pudieran pasar serolgicamente
desapercibidas (periodo ventana), as como posibles transtornos de carcter hereditario no
detectados en el examen practicado al recin nacido o no identificados durante la anamnesis
realizada inicialmente. A pesar de que el criterio para mantener este control no es homogneo,
nosotros lo consideramos con el fin de comprobar la necesidad o no de llevarlo a cabo.
2.3.1.- Tasa decumplimentacin.
Como puede apreciarse en la tabla 19, solo un 41% de las madres acudieron a este
control de cuarentena, cifra acorde con la experiencia comunicada por otros bancos de SCU.
2.3.2.- Infecciones vfricas y parasitarias.
La tasa de seroconversiones a los 90 das del parto fue de un 7.3% (Tabla 19), la mayora
consistente en ttulos bajos de IgG para toxoplasma y citomegalovirus. Muy posiblemente, estas
seroconversiones no son realmente primoinfecciones sino que se trata de madres previamente
76
Resultados
TABLA 19. C o n tr o l a l d a 90d e l a d o n a c i n d e S C U .
T a s a d e s e r o c o n v e r i o n e s y d e r e s o l u c i n d e l ti p a j e H L A
Incidencia (%)
123 (41)
9(7.3)
Cumplimiento (n=300)
Seroconversiones (u =1 2 3)
Anti-VHC1
Anti-Toxoplasma (IgO) 3
Anti-CMV (IgO)
Resolucin tipaje HLA (n=1 00)
42 (42)
Cumplimiento: nmero de madres que realizan el control del da 90; Seroconversiones:
nmero de madres negativas a da O y positivas a da 90; Resolucin tipaje HLA:
nmero de unidades de SCU en las que el tipaje HLA no se pudo definir en la muestra
de SCUy sial realizar el estudio HLAen los padres.
Abreviaturas: Anti-VHC, test de EIA para anticuemos anti-virus de la hepatitis C; Anti-
Toxoplasma (IgO), test de EIA para anticuerpos IgG anti-toxoplasma; Anti-CMV (IgG),
test de EIApara anticuerpos IgO anti-citomegalovirus.
inmunizadas como consecuencia de una infeccin antigua, con niveles sricos de anticuerpos
muy prximos al umbral de deteccin por enzima-inmuno-anlisis y que no fueron detectados
en el anlisis coincidente con el parto. Por ello, estas unidades de SCU no fueron consideradas
como rechazables y se han mantenido en el Banco. Solo hubo un caso de hepatitis C positivo en
este control, habiendo sido negativo en el momento de la donacin. Esta unidad fue desechada
del inventario del Banco.
2.3.3.- Enfermedades hereditarias.
En cuanto a enfermedades hereditarias, se identificaron dos casos que no se haban
detectado en el momento del nacimiento, una ~ -talasemia heterozigota en la madre y una
fibrosis quistica en una hermana del recin nacido (Tabla 18). En el primer caso, la unidad est
debidamente identificada para ser empleada nicamente en el trasplante de pacientes no
talasmicos. La segunda unidad tampoco fue rechazada al tratarse de una enfermedad no
transmisible por el tejido hematopoytico.
77
Resultados
2.3.4.- Confirmacin del tipaje HLAmediante el haplotipo materno.
Una ventaja adicional y no menos importante de cumplimentar este control postparto es
la realizacin del estudio HLA materno, que en ocasiones puede llegar a ser especialmente til.
La tipificacin HLA en el periodo postparto puede verse dificultada por la presencia de
anticuerpos anti-HLA, circunstancia que ocurre hasta en el 17% de las madres (Clay y cols.,
1984). Por este motivo, preferimos diferir el anlisis a los tres meses despus del parto, con
objeto de que la concentracin de anticuerpos en las madres positivas haya descendido hasta
ttulos que no interfieran con la determinacin HLA.
El conocimiento de los alelos HLA maternos facilita, en primer lugar, la confirmacin
del tipaje HLA realizado en la SCU, al comprobarse la identidad del haplotipo materno.
Adems, puede ayudar a definir las variantes no resueltas en la tipificacin inicial de la SCU.
Por ltimo, existen con cierta frecuencia dificultades en el tipaje serolgico de sangre de cordn
debidas a una menor expresin de antgenos liLA en clulas fetales (Puri y cols., 1993) y, en
estos casos dudosos, el conocimiento del haplotipo materno puede suponer la caracterizacin
definitiva del tipaje liLA. La resolucin del tipaje de SCU derivada del conocimiento de los
alelos HLA de la madre se produjo en el 42% de las unidades de SCU en nuestra serie
(Tabla 19).
78
Resultados
3.- ESTANDARIZACIN DE LOS METODOS DE OBTENCIN Y PROCESAMIENTO
DELA SCU.
Con la seleccin cuidadosa de los donantes de SCU se ejerce un primer control dirigido a
conseguir la mayor calidad y seguridad posibles de las unidades que van a formar parte del
Banco. No menos importante para este fin, es la optimizacin de los procedimientos de
obtencin, fraccionamiento y criopresevacin de la SCU, de forma que las unidades recogidas
contengan el mximo nmero de clulas viables, se pierda el menor nmero de progenitores
hematopoyticos durante el procesamiento de las mismas y se preserve la viabilidad celular al
final de la congelacin, al tiempo que se procure un aprovechamiento mximo del espacio
disponible para almacenamiento en nitrgeno lquido de las unidades criopreservadas.
En este apanado se expone el trabajo de estandarizacin de los mtodos de
procesamiento de las unidades de SCU realizado en nuestro Banco. Hemos comparado los
resultados obtenidos con las distintas tcnicas de recogida, fraccionamiento, criopreservacin y
descongelacin de SCU empleadas, de forma que, tras la identificacin de los mejores
procedimientos, el estudio realizado ha dado lugar a la adopcin de los mtodos ms idneos
con los que en la actualidad se procesan en el Banco las unidades de SCU.
3.1.- Optimizacin del procedimiento de obtencin de SCU.
El parmetro ms predictivo de la probabilidad y velocidad de implante hematopoytico
en el trasplante de SCU es la dosis celular infundida (clulas nucleadas infundidas por
kilogramo de peso del receptor). La celularidad de las unidades de SCU es muy variable, y no
todas contienen un nmero suficiente de clulas, especialmente cuando se pretende realizar
trasplantes en pacientes adultos. De hecho, el anlisis retrospectivo de trasplantes de SCU
muestra un mayor xito de recuperacin hematopoytica en la poblacin infantil respecto a la
adulta~ fundamentalmente debido a que la dosis celular empleada en individuos adultos es menor
(Gluckman y cols.. 1997; Rubinstein y cols., 1998).
79
Resultados
Por ello, y con objeto de proveer unidades ptimas de SCUno solo en nios sino tambin
en adultos, es fundamental que parte del esfuerzo de un banco de SCU est dirigido a que las
unidades almacenadas sean de la mayor riqueza celular posible. El nmero total de clulas en
una unidad de SCU depende de la concentracin celular y del volumen recogido. A su vez, entre
los factores que pueden influir en el volumen de las unidades de SCU, junto a variables como el
peso del recin nacido y el nmero de gestaciones (ver ms adelante apartado 3.4.), el
procedimiento de obtencin empleado puede ser determinante.
Las unidades de SCU analizadas en este estudio consisten en la combinacin de dos
fracciones de sangre fetal, recogidas individualmente. La primera fraccin, siguiendo el
procedimiento habitualmente utilizado por la mayora de bancos de SCU, se obtiene mediante
puncin de la vena umbilical, dejando fluir la sangre por gravedad. De forma adicional,
recogimos una segunda fraccin realizando una perfusin arteriovenosa de la placenta (ver
tcnica de obtencin en apartado 2.2 de Materiales y Mtodos), tratando as de obtener una
cantidad complementaria de sangre neonatal y aumentar la riqueza celular de las unidades de
SCU.
3.1.1.- Volumen y celularidad total de las unidades de SCU.
Con este procedimiento de obtencin, el volumen de sangre efectivo (sin contar el
anticoagulante presente en las bolsas de recogida) fue 131.6846.77mI, con un rango de 38 a
290 ml (Tabla 20). El volumen medio de las unidades de nuestra serie fue entre un 18% y un
79% superior al comunicado por la mayora de bancos de SCU (Querol y cols., 1998; Navarrete
y cols., 1998., Dal Cortivo y cols., 1998; Pojda y cols., 1998; Kogler y cols., 1998b), en los que
la recogida se realiza nicamente por venopuncin.
La concentracin de clulas nucleadas y clulas mononucleadas (linfocitos, monocitos y
clulas grandes no teidas [clulas LUC]) fue 9.553.68y 3.5l.37x10
9L,respectivamente.
9
Estas cifras se correspondieron con unos valores absolutos de 1.220.51x10 clulas nucleadas y
80
Resultados
TABLA 20. V o l u m e n y c e l u l a r i d a d d e S C U
C. Nucleadas
Concentracin Total
9.5 5 1 .22
C. Mononucleadas
Porcentaje Concentracin
(%) (x10
9/l)
39.06 3.50
Total
(x109)
0.4 4 media
ds 46.77 3.68 0.51 8 .48 1.37 0.18
extremos 38- 290 1.44- 11.21 2.76 - 31 .35 0.34 - 3.4 3 23-65 0.1 3- 1
Los resultados muestran el anlisis realizado sobre 300unidades de SCU. Volumen: volumen efectivo
de la unidad de sangre de cordn umbilical (volumen total volumen de anticoagulante); C .
Nucleadas: concentracin y nmero absoluto de clulas nucleadas; C . Mononucleadas: porcentaje,
concentracin y nmero absoluto de clulas mononucleadas.
Abreviaturas: SCU, sangre de cordn umbilical; ds, desviacin estndar.
0.440.18x109clulas mononucleadas (Tabla 20). Anlogamente a lo que sucede con el
volumen, la celularidad total media fue entre un 16% y un 20% superior al contenido de clulas
nucleadas de las unidades obtenidas en otros bancos de SCU (Querol y cols., 1998; Navarrete y
cols., 1998; Kogler y cols., 1998b).
El volumen de SCU mostr una correlacin significativa con el contenido de clulas
nucleadas (Figura 7, coeficiente de correlacin de Pearson, r=0.62), lo cual subraya la
importancia de optimizar el procedimiento de recogida con el fin de lograr el mayor volumen
posible de sangre umbilico-placentaria y, por tanto, unidades de SCU con mayor riqueza celular.
Los resultados aqu descritos sugieren que la recogida complementaria de sangre mediante
perfusin de la placenta, adems de la obtenida por puncin de la vena umbilical, supone una
aportacin en volumen y celularidad cuantitativamente relevante. Para determinar la
contribucin exacta de esta segunda fraccin en la celularidad final, hemos realizado un anlisis
por separado del volumen y nmero de clulas nucleadas en la sangre obtenida por venopuncin
y en la sangre obtenida tras perfusin de la placenta.
Volumen
(mi)
1 31.68
81
Resultados
TABLA 21. V o l u m e n y c e l u l a r i d a d d e l a s f r a c c i o n e s d e S C U o b te n i d a s
p o r p u n c i n d e l a v e n a u m b i l i c a l (F r a c c i n 1 ! ) y tr a s p e r f u s i n d e l a p l a c e n ta (F r a c c i n 2~ )
Fraccin a Fraccin 2~ Unidad SCU Frac.2/UnidadSCU
(%)
Volumen (m) 87.335.2 46.5 28.7 13550.1 33.715.7
Clulas nucleadas (>&10~ ) 1.070.45 0.190.14 1.260.52 15.59.8
Los resultados (media ds, n=44) muestran el volumen y clulas nucleadas en cada una de las dos
fracciones de recogida y en la unidad completa de SCU. La columna de la derecha muestra la
proporcin (porcentaje medio ds) que aporta la fraccin
2 a en volumen y celularidad al contenido
total de la unidad de SCU.
figura 8. Aproximadamente en una de cada cuatro unidades, la fraccin segunda represent ms
del 20% de la celularidad total, mientras que en una de cada tres unidades la rentabilidad de esta
segunda fraccin fue mnima (<10% de las clulas nucleadas finales). En un porcentaje
pequeo, aunque significativo (9% de las unidades de SCU), la fraccin segunda supuso ms del
30% de las clulas finalmente obtenidas (Tabla 22 y Figura 8).
Sumando las dos fracciones, el 4 1 % de las unidades contuvieron un nmero igual o
superior a l.3,d0~ clulas, frente al 30% de unidades si nicamente se hubiera realizado la
recogida por venopuncin. Es decir, gracias a la segunda fraccin obtenida tras perfusin de la
TABLA 22. F r e c u e n c i a d e u n i d a d e s d e S C U d e a c u e r d o
c o n l a p r o p o r c i n d e v o l u m e n y c e l u l a r i d a d q u e a p o r ta l a F r a c c i n 2!
Fraccin 2~ 1 Unidad SCU
>50% >30% >2 0% <10%
Volumen 1 4 64 80 9
Clulas nucleadas 2 9 27 34
Los resultados (n=44) muestran, el porcentaje de unidades en las que la Fraccin 2a representa la
proporcin indicada en volumen y celularidad respecto a los valores globales de la unidad de SCU.
83
Resultados
TABLA 23. F r e c u e n c i a d e u n i d a d e s c o n <1 00m o clxi O > c l u l a s
e n l a F r a c c i n 1 ~ q u e a l c a n z a n v a l o r e s g l o b a l e s s u p e r i o r e s d e v o l u m e n y c e l u l a r i d a d
Fraccin a<oo ml Fraccin 1ac1x10
9 clulas
Unidad SCU>100 mi Unidad SCU>1x109 clulas
Unidades de SCU (%) 73 41
Los resultados muestran el porcentaje de unidades de SCU (n=44) en las que, siendo el volumen y la
celularidad de la Fraccin
1a inferiores a 100 ml (n=30) o lx 0
9 clulas nucleadas (n=22), se superan
estos valores con el contenido aportadopor la Fraccin 2.
En resumen, la recogida complementaria de SCU mediante perfusin arteriovenosa de la
placenta, sumada a la sangre habitualmente obtenida por venopuncin, es un procedimiento que
permite enriquecer de forma significativa el nmero de clulas nucleadas en una proporcin
considerable de unidades de SCU (ms del 20% de la celularidad total en el 27% de las
unidades). Empleando nicamente el mtodo de venopuncin, la mitad de las unidades de SCU
tendran una celularidad escasa para asegurar el implante hematopoytico en pacientes adultos
con ms de 50 kg de peso; la fraccin adicional de sangre placentaria permite alcanzar una
celularidad final suficiente para proporcionar 2dO7 clulas/kg en el 41% de estas unidades. En
el caso de receptores de trasplante de ms de 65 kg, solo un 30% de las unidades obtenidas
mediante venopuncin proporcionaran una celularidad suficiente, mientras que con la
combinacin de las dos fracciones de recogida, el 41% de las unidades alcanzan la dosis celular
recomendada para trasplante en pacientes adultos.
3.2.- Efecto de distintas medidas de asepsia preventivas de contaminacin bacteriana
durante la recogida de SCU.
Como ya se ha mencionado, la incidencia de contaminacin bacteriana en la muestra de
estudio fue del 9.2%, siendo Estafilococo epidermidis y Estreptococo agalactiae los grmenes
ms frecuentes dentro del grupo aerobio, y la contaminacin por Bacteroides fragilis la de
mayor frecuencia en el grupo anaerobio.
85
Resultados
indistintamente 40 o 22
0C (Broxmeyer y cols., 1989; Rubinstein y cols., 1993). La decisin
adoptada en nuestro Banco de SCU fue la de utilizar la temperatura de conservacin de 40Cpara
evitar exponer determinadas unidades a temperaturas superiores a 220C, especialmente en
pocas clidas del ao.
Debido a que en los estudios realizados hasta el momento no se han evaluado de forma
sistemtica los posibles efectos del tiempo transcurrido desde la obtencin de SCU hasta su
criopreservacin, decidimos llevar a cabo un anlisis que permitiera determinar con mayor
precisin el intervalo de tiempo disponible entre la obtencin y el procesamiento de la SCU sin
que tenga lugar una prdida celular significativa. Estudiamos la relacin entre el tiempo de
almacenamiento a 40C, en primer lugar, con la viabilidad de clulas nucleadas medida por
exclusin de azul tripn; en segundo lugar, con el nmero de clulas formadoras de colonias
granulocito-macrofgicas (CFU-GM) y eritroides (BFU-E). Ambos anlisis se realizaron en tres
momentos distintos: i) al final del periodo de almacenamiento e inmediatamente antes de iniciar
el procesamiento de las unidades; u) despus de aadir la solucin crioprotrectora
(dimetilsulfxido al 10% en medio 199); y iii) tras la descongelacin.
TABLA 24 . R e p e r c u s i n d e l ti e m p o d e c o n s e r v a c i n a 4 0C s o b r e l a v i a b i l i d a d c e l u l a r d e S C U
Viabilidad (%
)
Vi
83.915.3
(n=31 7)
Almacenamiento T. conservacin
(horas) V
1
0-6 8 horas 15.69.1 96.95.0 74 .4 11.9
(n=2 87) (n=2 1 ) (n=2 1 )
=1 2horas 6.44.2
(n=93)
> 1 2 horas 20.07.4
(n=I 94)
98.51.4 91.65.9 80.96.1
(n~) (n=86 ) (n=8)
96.25.8 81 .71 5.6 76.59.3
(n=i5 ) (n=1 91 ) (n=6 )
Porcentaje de clulas nucleadas viables de SCU analizadas mediante exclusin de azul tripn al final del
periodo de conservacin (V1), despus de aadir la solucin crioprotectora (y2) y tras la
descongelacin (y3). Los resultados (media ds) muestran la viabilidad celular en la muestra global
de unidades de SCU (tiempo transcurrido entre la obtencin y el procesamiento: 0-68 horas), as
como en las unidades procesadas antes o despus de 12 horas.
8 7
Resultados
TABLA 25. R e p e r c u s i n d e l ti e m p o d e
c o n s e r v a c i n a 4 00s o b r e p r o g e n i to r e s e r i tr o i d e s d e S C U
Almacenamiento BFU-E
E
1 E2 E3
0-6 8 horas 25.414.2 23.91 5.5 1 4 .1 1 1 .9
(n=1 31 ) (n=1 34) (n=2 1 )
=1 2horas 25.413.1 27.716.4 15.214.7
(n~S) (n~6 ) (n=8)
> 1 2 horas 25.815.0 22.1 14.8 14.57.0
(n=79) (n=81 ) (n~5 )
Eficiencia clonognica (numero de colonias en 540~ clulas sembradas en el cultivo) de progenitores
eritroides al final del periodo de conservacin (E1), despus de aadir la solucin crioprotectora (E2)
y tras la descongelacin (E3). Los resultados muestran la eficiencia clonognica (media ds) en la
muestra global de unidades de SCU (tiempo transcurrido entre la obtencin y el procesamiento:
0-68horas), as como en las unidades procesadas antes o despus de 12horas.
Abreviaturas: B F U -E , clulas formadoras de bursrs eritroides.
TABLA 26. R e p e r c u s i n d e l ti e m p o d e c o n s e r v a c i n
a 4 00s o b r e p r o g e n i to r e s g r a n u l o c i to -m a c r o f g i c o s d e S C U
Almacenamiento CFU-GM
GM1 GM2 GM3
0-68 horas 21 .61 4 .6 1 9.71 4 .5 1 2.08.3
(n=1 31 ) (n=1 38) (n=2 1 )
=12h o r a s 2 3.516.2 2 1.2 15.2 15.010.4
(n=45 ) (n=1 8) (n=8)
>12 horas 20.61 3.8 19.414.5 1 0.26.3
(n=79) (n=83) (n=C)
Eficiencia clonognica (numero de colonias en Sxo
4 clulas sembradas en el cultivo) de progenitores
granulocito-macrofgicos al final del periodo de conservacin (GM
1), despus de aadir la solucin
crioprotectora 3M2) y tras la descongelacin (0M3). Los resultados muestran la eficiencia
clonognica (media ds) en la muestra global de unidades de SCU (tiempo transcurrido entre la
obtencin y el procesamiento: O - 68 horas), as como en las unidades procesadas antes o despus de
12horas.
Abreviaturas: CFU-OM, clulas formadoras de colonias granulocito-macrofgicas.
91
Resultados
intervalo de conservacin mximo permisible es aproximadamente 12 horas, por encima del
cual existe una disminucin importante de la viabilidad celular. En algunos casos, el dao es lo
suficientemente intenso como para que se formen agregados macroscpicos con atrapamiento
ilTeversible de una parte o el resto de las clulas viables de la unidad. Este deterioro afecta no
solo a clulas diferenciadas (segn puede deducirse del anlisis mediante exclusin de azul
tripn), sino tambin a clulas progenitoras hematopoyticas (ensayos clonognicos).
El estudio revela, adems, que el dao celular sufrido durante el periodo de
almacenamiento debe ser comprobado una vez aadida la solucin crioprotectora, ya que es en
esta fase del procesamiento cuando se evidencia claramente el efecto lesivo sobre las unidades
de SCU. Los valores de viabilidad al final del periodo de conservacin (antes de iniciar el
procesamiento) o tras la descongelacin reflejan de manera insuficiente la magnitud de la
prdida celular que haya podido ocasionarse durante dicho intervalo.
3.4 .- Factores predictivos de volumen y celularidad de las unidades de SCU.
Como ya se ha indicado previamente, la dosis celular en los trasplantes de SCU es uno de
los factores ms determinantes tanto de la probabilidad de implante como de la velocidad de
reconstitucin hematopoytica. Asimismo, el contenido de clulas progenitoras debera tambin
predecir la tasa y rapidez del implante hematopoytico, aunque probablemente debido a la
insuficiente estandarizacin de los mtodos de cuantificacin de clulas progenitoras, solo en
algunas series de trasplante se ha podido demostrar la existencia de alguna correlacin entre la
dosis de progenitores infundida y la reconstitucin hematolgica.
Puesto que la riqueza celular de la SCU es muy variable, una proporcin significativa de
unidades HLA compatibles son en ltima instancia descartadas para efectuar un trasplante al no
proporcionar la dosis celular mnima requerida, especialmente cuando se trata de receptores
adultos o nios de mucho peso. Por esta razn, sera importante disponer de factores que
permitan predecir antes y/o durante el parto la celularidad de las unidades de SCU. As, podran
restringirse las recolecciones de SCU a aquellas que fueran consideradas adecuadas en base a
esta prediccin perinatal del contenido celular. De este modo, la limitacin impuesta por el peso
94
Resultados
del receptor afectara a un menor nmero de las unidades almacenadas, en contraposicin a si
todas las donaciones de SCU fuesen obtenidas y procesadas de forma indiscriminada.
Con este fin, se llev a cabo un anlisis de regresin mltiple en el que se contemplaron
una serie de caractersticas maternas y fetales potencialmente relevantes, para intentar predecir
la celularidad de las unidades de SCU.
3.4.1.- Variables dependientes.
Adems de la celularidad total, se seleccionaron como variables dependientes del anlisis
de regresin otros parmetros que tambin pueden ser indicadores de la idoneidad de las
unidades de SCU. De esta forma, al contemplar una serie de variables dependientes, se amplan
las posibilidades de encontrar la mejor ecuacin de regresin entre todas las calculadas a partir
de los mismos factores predictores.
Cada una de las variables dependientes con las que se han construido los modelos de
regresin que ms adelante se describen, fueron las siguientes:
a) Volumen (VOL): volumen efectivo de SCU (volumen total de la unidad menos
volumen de anticoagulante (m)
b) Concentracin celular (CC): recuento de clulas nucleadas (x10
9/L)
c) Clulas nucleadas totales (CT): nmero absoluto de clulas nucleadas (x10~ )
d) Porcentaje de clulas CD34~ (PCD34): frecuencia de clulas CD344 (%)
e) Clulas CD34~ totales (ACD34): nmero absoluto de clulas CD344 (x106)
1) Concentracin de CFU-GM(CGM): eficiencia clonognica de colonias granulocito-
macrofgicas (nmero de colonias en 5x104 clulas sembradas en el cultivo)
g) CFU-GM totales (AGM): nmero absoluto de CFU-GM (x104)
h) Concentracin de BFU-E(CE): eficiencia clonognica de burst eritroides
(nmero de colonias en 5x104 clulas sembradas en el cultivo)
4
i) BFU-E totales (AE): nmero absoluto de BFU-E(xIO )
95
Resultados
TABLA 2 7. V a r i a b l e s d e p e n d i e n te s u ti l i z a d a s e n l o s m o d e l o s d e r e g r e s i n
media cts mediana extremos
VOL(ml) 131.6846.77 131 38-290
CC(40~ /l) 9.553.68 8.88 2.76- 31 .35
CT (40~ ) 1.220.51 1.16 0.34 - 3.4 3
PC034 (%) 0.390.26 0.31 0.06- 1 .4 1
A C 034 (x 1 06) 4.664.28 3.4 3 0.53- 26.4 6
CGM(n/5M10
4) 1 7.581 1 .6 1 5.95 0-75
AGM(40~ ) 4 .393.72 3.33 0-24 .27
C E (n / 5x 1 04 ) 25.3316 22.55 0-1 04
AE (>d0~ ) 6.265.22 4.66 0-32.24
Les datos de cada una de las variables mostradas en la tabla se han obtenido a partir del anlisis de 300
unidades de SCU, excepto en PCD34 y ACD34 donde se han analizado 183 unidades.
Abreviaturas: ds, desviacin estndar; VOL, volumen efectivo de SCU (volumen total menos volumen
de anticoagulante); CC, concentracin de clulas nucleadas; CT, nmero absoluto de clulas
nucleadas; PCD34, porcentaje de clulas CD34 positivas; ACD34, nmero absoluto de clulas CD34
positivas; CGM, concentracin de CFU-GM (nmero de colonias granulocito-macrofgicas en
clulas sembradas); AOM, nmero absoluto de CFU-GM; CE, concentracin de BFU-E (nmero de
bursts eritroides en 5>d0~ clulas sembradas); AE, nmero absoluto de BFU-E.
El valor medio, la desviacin estndar, la mediana y el rango de cada una de las variables
dependientes se muestran en la Tabla 27.
3.4.2.- Variables predictoras.
Las potenciales variables predictoras (independientes) analizadas en cada uno de los
modelos de regresin fueron:
a) Sexo (SEX): sexo del recin nacido (M/ E)
b) Peso (PESO): peso del recin nacido (g)
c) Test de Apgar (APG): test de Apgar al minuto del nacimiento (0-10)
96
Resultados
d) Edad (EDAD): edad de la madre (aos)
e) Nmero de gestacin (GEST): nmero total de gestaciones incluida la de la donacin
de SC U (n )
O Consumo de tabaco (TABC): madre fumadora (S No)
g) Ingesta de alcohol (ETOH): ingesta superior a 30 g/da de alcohol (S/No)
El valor medio, la desviacin estndar, la mediana y el rango de las variables predictoras
cuantitativas PESO, APO, EDAD Y GEST se muestran en la Tabla 28. La distribucin de
frecuencias de las variables predictoras categricas SEX, TABC y ETOH fueron las siguientes
SEX (n=275): 53.5 (M) 46.5 (F)
TABC (n=287): 65.5 (No) 34.5 (Si)
ETOH (n=287): 98.6 (No) 1.4 (SO
3.4.3.-Modelos de regresin mltiple.
Para cada variable dependiente se construy un modelo de regresin mltiple con el
objetivo de identificar entre las potenciales variables predictoras el subeonjunto que permitiera
explicar una parte de la variacin de la variable dependiente (ver tabla 27).
TABLA 28. V a r i a b l e s p r e d i c to r a s c u a n ti ta ti v a s a n a l i z a d a s e n l o s m o d e l o s d e r e g r e s i n
PESO (g) APG (0-10) EDAD (aos) GEST (n)
me di a ds 3 2 41 . 9402 . 5 2 9. 7 4. 8
me di a n a 3 2 60 9 3 0 2
e x t r e mo s 3 - 1 0
1 85 0- 42 7 0 1 6 42 1 - 5
L o s da t o s de l a s v a r i a b l e s PESO y APG s e h a n o b t e n i do a p a r t i r de l a n l i s i s de 2 7 5 u n i da de s de SC U, y
l o s de EDAD y OEST a partirde 323 y 290 unidades, respectivamente.
Abreviaturas: ds , de s v i a c i n e s t n da r ; PESO, p e s o de l r e c i n n a c i do ; APO, t e s t de Ap g a r a l mi n u t o de l
n a c i mi e n t o ; EDAD, edad de la madre; OEST, nmero de gestaciones (incluida la de la donacin de
SC U) .
97
Resultados
Antes de la elaboracin de los modelos se comprob la ausencia de colinearidad entre las
variables independientes (considerndose que existe colinearidad cuando se demuestra
correlacin entre dos variables con un coeficiente >0.9), de forma que la estimacin de los
coeficientes de regresin de cada ecuacin pudiera considerarse estable. Por ejemplo, el
coeficiente de correlacin encontrado entre las variables EDAD y GEST, r=0.32, fue el ms
elevado, siendo inferior en el resto de combinaciones de variables analizadas.
El proceso de seleccin de la mejor ecuacin de regresin empleado en la construccin
de cada modelo consisti en las siguientes fases: i) la seleccin por pasos de las variables
predictoras, tanto en un sentido antergrado (incorporando en la ecuacin las variables una a
una) como retrgrado (incorporando todas las variables y retirndolas sucesivamente),
atendiendo a si el valor P de la prueba de significacin con cada variable incorporada o retirada
de la ecuacin satisfaca el criterio de inclusin (P.cO.05) o de exclusin (P>0.l0); u) una vez
incorporadas o retiradas solo aquellas variables que cumplan con los criterios de inclusin o
exclusin prefijados, el estudio de la significacin de cada modelo se realiz mediante el anlisis
de la variancia de la regresin (cociente F de medias cuadrticas), que permiti comprobar si la
parte de variacin explicada por la ecuacin de regresin era estadisticamente significativa. La
proporcin de la variacin total que es explicada por la regresin se obtuvo calculando el
coeficiente de determinacin ajustado (R
2a), el cual es una medida del poder de prediccin de la
ecuacin de regresin; iii) despus de obtener la ecuacin que mejor satisfaca el criterio de
seleccin, sta fue finalmente aceptada si el error estndar de los coeficientes de regresin no era
muy alto (<40%), de manera que el intervalo de confianza de dichos coeficientes fuese
suficientemente reducido.
Aplicando el procedimiento descrito, solamente las ecuaciones de regresin calculadas
para las variables dependientes VOL (volumen de SCU), CT (clulas nucleadas totales), ACD34
(clulas CD34~ totales), ACM (CFU-GM totales) y AB (BFU-E totales) cumplan los criterios
mencionados, mientras que los modelos construidos para las variables referidas a la
concentracin de clulas nucleadas o de progenitores hematopoyticos (CC, PCDS4, CGM y
CE) no resultaron significativos, o el error estndar de los coeficientes de regresin fue
excesivamente alto. En la tabla 29 se muestran las ecuaciones de regresin estimadas para las
98
Resultados
variables VOL, CT, ACD34, AGMy AB. Las variables predictoras que contribuyeron de forma
estadisticamente significativa a explicar una parte de la variacin de estas variables dependientes
fueron PESO (peso del recin nacido) y GEST (nmero de gestaciones), salvo en el modelo de
la variable dependiente CT en el que solo la variable independiente PESO alcanz significacin
estadstica. Es decir, a partir del peso del recin nacido y del nmero de gestaciones previas es
posible predecir el volumen, las clulas nucleadas y el contenido de progenitores de las unidades
de SCU, si bien la variacin residual (no explicada por la regresin) fue alta en todos los casos,
segn indican los valores reducidos de los coeficientes R
2
8: las ecuaciones de regresin
estimadas solo explicaron entre el 9 y el 18% de la variabilidad de las variables dependientes.
Hay que resaltar el hecho de que ninguna de las variables independientes que analizamos
demostr tener poder predictivo sobre los valores ide concentracin de clulas nucleadas ni de
progenitores hematopoyticos (clulas CD34~ , CFtJ-GM o BFU-E). Por tanto, el resultado de la
TABLA 29. M o d e l o s d e r e g r e s i n e s ta d s ti c a m e n te s i g n i f i c a ti v o s , i n te r v a l o s d e
c o n f i a n z a d e l 95% d e l o s c o e f i c i e n te s d e r e g r e s i n , y c o e f i c i e n te d e d e te r m i n a c i n a j u s ta d o (R
2a )
Variable
dependiente Ecuacin de Regresin IC 95%
VOL(m) VOL= 40.3 lxPESO+10.77xOEST 19.37
Peso: 25.65 - 54.97
Oest: 3.74 - 17.79 0. 1 3
CT (40~ ) CI = 0.S6xPESO 0.6 Peso: 0.41 - 0.72 0.18
ACD34 (~ l06) ACD34 =2.72xPESO+l.7><GEST 6.93
Peso: 0.64 - 4.80
Gest: 0.57 - 2.83 0. 09
AOM (40~ ) AGM= 23.65>$ESO+8.4lxOEST 48.23
Peso: 12.21 - 35.09
Oest: 2.89 - 1392 0.09
AE (40~ ) AE 40.13xPESO+14.32xGEST 94.44
Pe s o : 2 4. 41 - 5 5 . 86
Oe s t : 6. 66 - 2 1 . 7 7 0.13
Abreviaturas: VOL, volumen efectivo de SCU (volumen total menos volumen de anticoagulante); CT,
nmero absoluto de clulas nucleadas; ACD34, nmero absoluto de clulas CD34 positivas; AOM,
nmero absoluto de CFU-OM; AE, nmero absoluto de BFU-E; PESO, peso del recin nacido (kg);
QEST, nmero de gestaciones.
99
Resultados
regresin mltiple que se ha descrito, al explicar una parte de la variabilidad de los valores
absolutos, pero no de la concentracin celular en SCU, obliga necesanamente a pensar que los
factores con valor predictivo (PESO y GEST) identificados en los cinco anlisis de regresin
significativos solo predicen de forma independiente el volumen de SCU, y que los valores
absolutos de celularidad y progenitores hematopoyticos estn secundariamente determinados
por el volumen de la unidad. La existencia de una correlacin lineal entre el volumen de SCU y
el nmero absoluto de clulas nucleadas =0.62), clulas CD34~ (r=0.38), CFU-GM (r=0.41), y
BFU-E (r=0.43) corrobora en parte esta dependencia. En definitiva, el modelo de regresin
mltiple aplicado al volumen de SCU es el que emerge de entre los dems modelos como el
nico que define de forma independiente una relacin significativa entre las variables
predictoras PESOy GEST y la riqueza celular de las unidades de SCU.
El modelo de regresin correspondiente a las clulas nucleadas totales (CT) fue el que
demostr poseer el poder de prediccin ms elevado (R
2a=0. 18) y, por ello, el que mejor se
aproximaba a los valores observados. Aunque exista an un 82% de variacin residual, la
ecuacin de regresin del nmero de clulas nucleadas totales fue la que consigui definir con
mayor grado de precisin la riqueza celular de las unidades de SCU. Esta prediccin se realiza
exclusivamente a partir del peso del recin nacido (Tabla 29) sin que intervengan otras
variables. Por estas razones, consideramos que este modelo es el ms simple y til para predecir
la celularidad de las unidades de SCU y, con ello, estimar la probabilidad de que sean
trasplantadas en el futuro.
3.5.- Separacin celular y reduccin de volumen. Recuperacin obtenida con los diferentes
mtodos de fraccionamiento.
Para que un Banco de SCU pueda adquirir una buena operatividad, primero debe
procesar y almacenar un nmero suficiente de unidades, de forma que ante una solicitud de
bsqueda para un eventual trasplante exista una probabilidad elevada de encontrar al menos una
unidad HLA compatible. Aunque no se conoce an con precisin cual debera ser el nmero
idneo de unidades de SCU inventariadas, el tamao recomendado provisionalmente por la
Comisin Nacional de Trasplante de Mdula sea para los bancos de SCU en Espaa es de
loo
Resultados
3.000 unidades. Esta estimacin estA sujeta a revisiones futuras, derivadas esencialmente de la
evolucin que muestren los programas de trasplante de SCU en cuanto a la probabilidad de
localizacin de donantes compatibles, as como de la infonnacin generada a partir de estudios
poblacionales de suficiente entidad, a nivel nacional e internacional, sobre la distribucin de
frecuencias allicas del sistema HLA.
Una de las dificultades ms importantes que encierra este requisito de operatividad tiene
una naturaleza meramente logstica: el enorme espacio para el almacenamiento en nitrgeno
lquido de un nmero considerablemente elevado de unidades, especialmente si no se realiza
antes de la criopreservacin ningn procedimiento de reduccin de volumen. Dado que las
unidades de SCU tienen un volumen medio aproximado de 130 ml (extremos: 38~ 290 ml; ver
apartado 3.1.1.), al cual habra que sumar el volumen de la solucin de congelacin, es
relativamente frecuente que en la criopreservacin de una unidad de SCU no fraccionada haya
que emplear ms de una bolsa de 160 ml. Los depsitos de nitrgeno lquido disponibles
actualmente en el mercado tienen una capacidad aproximada para 300 a 500 bolsas de 160 ml
(segn los modelos), lo cual significa que se necesitaran de 6 a 10 contenedores para satisfacer
los requerimientos numricos indicados.
El fraccionamiento de la sangre de cordn es, por tanto, uno de los retos permanentes e
ineludibles de los bancos de SCU. Los procedimientos empleados para separar las clulas
nucleadas y/o clulas progenitoras hematopoyticas del resto de componentes sanguneos han
sido diversos, siendo tambin diferente la eficacia demostrada con cada uno de ellos. La
finalidad ltima que se persigue con el fraccionamiento es reducir al mximo el volumen de las
unidades de SCU, sin que ello se acompae de una prdida celular significativa. No siempre los
resultados conseguidos con un determinado mtodo son reproducibles en otros laboratorios, por
lo que es imperativo que cada Banco de SCU compruebe y seleccione el mtodo de separacin
con el que obtenga los mejores ndices de recuperacin celular.
101
Resultados
Por todas estas razones, el estudio comparativo de los diferentes mtodos de
fraccionamiento fue uno de los aspectos abordados ms precozmente en la estandarizacin de
nuestro Banco de SCU. Los primeros ensayos consistieron en el empleo de gradientes de
densidad, utilizados habitualmente para la separacin de clulas mononucleadas de mdula sea
y sangre perifrica. En una segunda fase, analizamos otros mtodos basados en el uso de agentes
de sedimentacin (metilcelulosa, gelatina e hidroxietil almidn). En este apartado se exponen los
resultados obtenidos con estos procedimientos de separacin celular en SCU.
3.5.1.- Gradientes de densidad.
El mtodo estndar de separacin con ficol (densidad 1.077 g/ml) consiste en aislar
solamente la interfase de clulas mononucleadas que se forma tras centrifugar la muestra sobre
un volumen determinado de ficol. Cuando se aplica esta metodologa a muestras de sangre de
cordn umbilical, la recuperacin de progenitores hematopoyticos es significativamente menor
que la que se obtiene en mdula sea y sangre perifrica, debido probablemente a la distinta
densidad de las clulas de uno y otro origen.
Algunos autores han introducido modificaciones en la tcnica con el propsito de
aumentar la eficiencia de la separacin de SCU con gradiente de ficol. Concretamente, se ha
sugerido que la obtencin conjunta de las interfases correspondientes a plasma y clulas
mononucleadas, ms todo el ficol restante hasta el botn de hemates, mejora sustancialmente la
recuperacin celular (Harris y cols., 1994a); adems, cuando se repite el procedimiento con las
clulas obtenidas en la separacin inicial, se consiguen fracciones de clulas mononucleadas
altamente purificadas de granulocitos y eritrocitos. Alternativamente, tambin se ha recurrido al
empleo de gradientes con una densidad superior a la del ficol (Charbord y cols., 1992),
basndose para ello en la mayor recuperacin de clulas accesorias que estimularan la
proliferacin de progenitores hematopoyticos mediante la produccin de citocinas.
Nosotros estudiamos la eficacia de la separacin con ficol (d=1.077 g/ml) y con
histopaque (d=1 .083 g/ml), utilizando en ambos procedimientos las mismas condiciones en
cuanto a dilucin de la muestra, velocidad, temperatura y tiempo de centrifugacin. Asimismo,
102
Resultados
en los dos mtodos fueron recogidas en su totalidad las tres fases superiores al sedimento de
hemates: plasma sobrenadante, clulas y gradiente residual (ver apartado 2.3.3.1. de Materiales
y Mtodos).
La tabla 30 muestra los resultados de estos experimentos. La recuperacin celular
obtenida con ficol e histopaque fue respectivamente 19 y 25%. La separacin de clulas
nucleadas con el gradiente de densidad 1.083 gm fue superior, como era de esperar, a la
conseguida con el gradiente de densidad 1.077 g/ml. La diferencia a favor del primero es
atribuible a la retencin de clulas con densidad intermedia entre ambos valores, principalmente
granulocitos polinucleados. El grado de contaminacin eritrocitaria y granuloctica fue superior
al descrito, aunque este aspecto fue considerado menos relevante que la posible prdida
adicional de clulas que pudiera producirse durante un segundo fraccionamiento. Por lo tanto,
no intentamos purificar an ms la fraccin celular obtenida con una nica separacion.
La recuperacin de clulas progenitoras clonognicas (CFU-GM y 8W-E) tambin fue
superior en la separacin realizada con el gradiente de densidad 1.083 g/ml, aunque el anlisis
de clulas CD34~ mostr una mejor separacin de estas clulas con el gradiente de densidad
1.077 g/ml (Tabla 30). En todo caso, la prdida de clulas progenitoras fue elevada con ambos
TABLA30. R e c u p e r a c i n d e c l u l a s n u c l e a d a s y p r o g e n i to r e s
h e m a to p o y ti c o s d e S C U tr a s s e p a r a c i n c o n g r a d i e n te s d e d e n s i d a d
Ficol (d = 1 .077 gml) Histopaque (d=1.083 gml)
24 .71 2.9
C N 1 9. 1 1 0. 8
CD34~ 83.638.4 64 .834 .7
CPU-CM 4028.8 78.351.1
BFU-E 3536.1 56.136.7
Recuperacin (porcentaje medio ds) de clulas nucleadas totales y clulas progenitoras hematopoyti-
c a s de SC Ut r a s s e p a r a c i n c o n g r a di e n t e s de de n s i da d 1 . 07 7 g /ml (n = 2 2 ) y 1 . 083 g I ml (n = 3 4) .
Abreviaturas: C N, c l u l a s n u c l e a da s ; C D3 4: c l u l a s C D3 4 p o s i t i v a s ; C F U- OM, c l u l a s f o r ma do r a s de
c o l o n i a s g r a n u l o c i t o - ma c r o f g i c a s ; BF U- E, c l u l a s f o r ma do r a s de bursts e r i t r o i de s .
1 03
Resultados
gradientes de densidad, oscilando entre el 20 y el 65% dependiendo del anlisis empleado para
su determinacin.
3.5.2.- Agentes de sedimentacin.
Los resultados anteriores de una recuperacin insuficiente de clulas progenitoras en
SCU fraccionada con gradientes de densidad, nos indujo a considerar otros mtodos de
separacin que demostraran mayor eficacia. La sedimentacin de hemates mediante
aglutinacin inducida por agentes como metilcelulosa, gelatina o hidroxietil almidn, es un
procedimiento relativamente rpido y sencillo que permite deplecionar hemates y separar las
clulas nucleadas en muestras de mdula sea y sangre perifrica. Para comprobar el
comportamiento de estos agentes de sedimentacin en SCU, ensayamos el fraccionamiento con
cada uno de ellos siguiendo las tcnicas previamente descritas excepto en la separacin con
hidroxietil almidn, en la que el paso de centrifugacin contemplado en el mtodo original fue
sustituido por una sedimentacin eritrocitaria por gravedad durante 90 minutos.
En la tabla 31 se resumen los datos de recuperacin de clulas nucleadas y clulas
progenitoras resultante del fraccionamiento de SCU con metilcelulosa 0.1%, gelatina 1.75% e
T A B L A 31 . R e c u p e r a c i n d e c l u l a s n u c l e a d a s y p r o g e n i to r e s
h e m a to p o y ti c o s d e S C U tr a s s e p a r a c i n c o n a g e n te s d e s e d i m e n ta c i n
Metilcelulosa 0.1 % Gelatina 1 .75 %
80. 7 1 7 . 9 98 .738 .5
Hidroxietil almidn 1.2 %
92.38.6 C N
C D 34 ~ 86.735.7 99.930.5
CFU-OM 1 1 9.1 63.8 1 04. 95 7 . 1 1 3 9. 1 69. 8
92 . 7 47 . 8 94. 2 5 0. 1 1 00. 447 . 7 BFU-E
Recuperacin (porcentaje medio ds) de clulas nucleadas totales y clulas progenitoras hematopoyti-
cas de SCU tras separacin c o n me t i l c e l u l o s a a l 0. 1 % (n = 2 7 ) , g e l a t i n a a l 1 . 7 5 % (n = 2 9) e h i dr o x i e t i l
almidn al 1.2% (n=80).
Abreviaturas: CN, clulas nucleadas; CD34t clulas CD34 positivas; CFU-GM, clulas formadoras de
colonias granulocito-macrofgicas; BFU-E, clulas formadoras de bursts e r i t r o i de s .
104
Resultados
los que se asociaron con una prdida inexistente o muy escasa de clulas totales y clulas
progenitoras hematopoyticas, demostrando ser los ms idneos para el fraccionamiento de
SCU.
Durante el ao 1996, coincidiendo con el desarrollo de este estudio, aparecieron en
Inglaterra los primeros casos de enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), que posteriormente se
relacionaron con el consumo de alimentos de origen bovino presuntamente contaminados con el
agente causante de esta entidad. La situacin de alarma sociosanitaria surgida di lugar a una
serie de restricciones impuestas por la Comunidad Europea, no solo referentes al consumo
alimenticio, sino tambin relativas a productos para uso cosmtico y farmacolgico que
contienen sustancias de naturaleza bovina, entre las que se encuentra la gelatina. El producto
empleado como fuente de gelatina en este estudio ha sido un expansor de volumen (Hemoce),
utilizado frecuentemente en la clnica en casos de hemorragia aguda, shock hipovolmico o
estados graves de hipotensin. En un primer momento, fue ste el agente seleccionado para
procesar las primeras unidades de SCU del Banco, una vez demostrada su eficacia y
considerando la seguridad clnica que hasta ese momento pareca tener. A partir del brote de
ECJ, y disponiendo ya de los resultados ptimos del fraccionamiento de SCU con hidroxietil
almidn, decidimos utilizar este agente en el procesamiento de las unidades subsiguientes. De
esta forma, salvo las 30 primeras unidades que fueron fraccionadas con gelatina, el resto de las
unidades depositadas hasta la actualidad en el Banco de SCU han sido fraccionadas con
hidroxietil almidn antes de proceder a la criopreservacin y almacenamiento posterior en
nitrgeno lquido.
3.6.- Criopreservacin.
Como ya se ha indicado previamente, son varias las ventajas del trasplante de SCU sobre
los trasplantes de MO o SP, siendo una de ellas la rapidez en la identificacin de unidades
compatibles y la inmediata disponibilidad de las mismas. Esta posibilidad se deriva
fundamentalmente de la existencia de unidades congeladas y almacenadas en Bancos de SCU, lo
cual permite su utilizacin a demanda. En los ltimos aos, se han determinado las condiciones
ptimas de criopreservacin para MO y SP (Gorin y cols., 1986; Lamana y cols., 1990) y, por lo
1 06
Resultados
general, stas se han mostrado vlidas para SCU (McCullough y cols., 1994; Rubinstein y cols.,
1994; Donaldson y cols, 1996). Sin embargo, estos protocolos introducen un nmero de
variables (por ejemplo, cintica de enfriamiento, volumen y formato de congelacin, etc.), por lo
que hemos considerado de inters para el establecimiento de nuestro Banco determinar de forma
sistemtica las condiciones ptimas de criopreservacin de SCU.
La tcnica de criopreservacin que hemos empleado ha seguido las directrices bsicas
sealadas para la congelacin de MO. Todas las unidades de SCU fueron mezcladas con un
volumen igual de una solucin de medio 199 con DMSO al 20 % (concentracin final 10%),
congeladas progresivamente hasta 120C a una velocidad controlada de 1
0C/min antes y
despus de la fase de transicin (cambio de fase lquida a fase slida), y almacenadas a 1960C
en nitrgeno lquido. Hemos preferido utilizar un equipo de congelacin programada por
considerar ms segura la congelacin controlada que la congelacin mecnica en un refrigerador
a 800C, en la que no se puede neutralizar el calor de fusin generado durante el cambio de fase
y adems no es factible monitorizar la evolucin del proceso. Mientras se llevaron a cabo los
estudios de separacin celular de SCU y se defina el mejor de los mtodos de fraccionamiento
(ver apartado 3.5 .), las primeras unidades fueron criopreservadas en bolsas de acetato de etileno-
vinilo en un volumen de 160 mi, sin ningn procedimiento previo de concentracin celular. Una
vez adoptada la sedimentacin con hidroxietil almidn como mtodo de eleccin, las unidades
fraccionadas pudieron ser criopreservadas en menor volumen, primero en tubos de polipropileno
de 4.5 ml (tres criotubos por unidad) y posteriormente en bolsas similares a las anteriores pero
de menor capacidad, en un volumen de 24 ml.
Por tanto, si bien las condiciones de criopreservacin fueron siempre las mismas durante
todo el estudio, el formato utilizado (bolsa o tubo) y el volumen de congelacin han ido
modificndose a medida que iban siendo optimizados los mtodos de fraccionamiento de SCU.
Esto exiga que los programas de congelacin tuvieran que ser ajustados, procurando reproducir
en cada caso la curva ptima de enfriamiento. Paralelamente, y con el fin de comprobar si las
distintas modalidades de congelacin que hemos utilizado preservaban por igual la SCU, hemos
comparado la recuperacin y la viabilidad de las clulas nucleadas y clulas progenitoras de
1 07
Resultados
unidades de SCU criopreservadas en bolsas (160 o 24 mi) o en criotubos (4.5 mI). Los
resultados de ambos estudios se presentan seguidamente.
3.6.1.- Optimizacin de los programas de congelacin segn formato y volumen.
Para cada una de las tres modalidades de criopreservacin (bolsa de 160 ml, bolsa de 24
ml o criotubo de 4.5 mi) se disearon especficamente programas de congelacin que se
diferenciaban solo en aquellos segmentos en los que se induce el cambio de fase y se compensa
el calor de fusin a travs de una entrada masiva y recortada de nitrgeno lquido en la cmara
de congelacin (ver apanado 2.3.3.5. de Materiales y Mtodos). El objetivo era mantener la
pendiente de enfriamiento constante en todos los casos. La figura 17 muestra las curvas de
congelacin representativas de cada combinacin de formato y volumen. Como puede
observarse, la velocidad de enfriamiento en las tres curvas fue de 1
0C/min antes y despus del
cambio de fase, existiendo en todas ellas una adecuada neutralizacin del calor de fusin. Este
comportamiento fue extremadamente reproducible en los tres formatos de criopreservacin
analizados. Por consiguiente, se puede concluir que la congelacin de SCU en bolsas de 160 mi,
bolsas de 24 ml y criotubos de 4.5 ml mediante los programas especficamente diseados
cumple en todos los casos los requerimientos establecidos de una criopreservacin eficaz de
clulas hematopoyticas (Gorin, 1986).
3.6.2.- Viabilidad de SCUcriopreservada en diferente formato y volumen.
El ajuste de los parmetros de congelacin idneos para cada combinacin de formato y
volumen era un paso obligatorio anterior al anlisis de posibles diferencias de eficacia en la
preservacin de clulas progenitoras de SCU. Una vez optimizados los programas de
congelacin, realizamos un anlisis comparativo de la recuperacin de clulas viables de SCU
cnopreservada en bolsas de 160 mi, bolsas de 24 ml y criotubos de 4.5 ml. El tiempo que las
unidades permanecieron en nitrgeno lquido antes de ser descongeladas para realizar el anlisis
oscil entre 2 y 16 meses. Las determinaciones llevadas a cabo inmediatamente dspus de la
descongelacin consistieron en recuento de clulas nucleadas, viabilidad por exclusin de azul
1 08
Resultados
A dr e s s 81 C o r o c e s s o r 1 x ADDRESS 81 01 1 1 8 b t e s r e c e i v e d
A dr e s s 81 ca r o c e s s o r 1 x ADDI 1 ESS 01 OX 1 1 9 L t e s r e c e i v e d
A
+29 C SC U BOL S 168 ML
C r y o s o n BU I B Bi o l o g i c a l F r e e z e r 1 6. 47
48
ea
1 88
1 8 28 38 48 58 bOflin.
B
8 % SC J BOL SA 2 4 ML
C r a s a n 2 1 . 1 1 8 Bi o l o g i c a l F r e e z e r 2 8. 44
-4
4 9
68
88
l e a
te 2 8 40 58 68 Mm.
1 09
Resultados
SCIJCBIOTUEO 4.5 fIL
Cryoson 5.118 Biological Freezer 18.33
za
48
G e
88
188
received
B8Min.
Adress 81 co processor 1 x ADDRESS 81 . OX 1 1 8 b y t e s
1 8 2 8 3 8 48 5 8
FIGURA 17. Curvas de congelacin de SCU en diferente formato y volumen de criopreservacion.
Los programas de congelacin han sido diseados especficamente para cada modalidad de criopreserva-
cin, consiguindose en cada una de ellas una velocidad de enfriamiento de 1
0C/min y una adecuada
neutralizacin del calor de fusin. A. Bolsa de 160 ml. B. Bolsa de 24 ml. C. Criotubo de 4.5 ml.
tripn y progenitores granulocito-macrofgicos analizados mediante ensayos clonognicos
(CFU-GM). El contenido de clulas ncleadas y CFU-GM antes de la criopreservacin sirvieron
para calcular su recuperacin tras la descongelacin.
En la tabla 32 se exponen los resultados obtenidos. La criopreservacin en bolsas de 160
ml y en criotubos de 4.5 mi presentaron valores de viabilidad y recuperacin de clulas
nucleadas por encima del 80%, mientras que las unidades criopreservadas en bolsas de 24 ml
tuvieron unas cifras ligeramente inferiores. Sin embargo, la recuperacin de CFU-GM fue
superior en las unidades criopreservadas en bolsas de 160 ml (86%) y 24 ml (78%) respecto a
las congeladas en criotubos (64%).
lo
c
Resultados
TABLA32. C o m p a r a c i n d e d i f e r e n te s f o r m a to s y v o l m e n e s d e c r i o p r e s e r v a c i n d e S C U
Bolsa 160 ml
Formato y volumen de criopreservacin
Bolsa 24 ml pt Criotubo 4.5 ml
83.27.3
V i a b i l i da d 83 . 3 8. 7 0. 01 7 7 . 3 8. 9 0. 03
C N 87 . 1 1 5 . 1 002 7 5 . 91 9. 6 NS 82 . 61 5 NS
85.943.9 N S 78.31 07.8 NS 64 .4 54 .3 NS
CFU-GM
V i a b i l i da d c e l u l a r de t e r mi n a da p o r e x c l u s i n de a z u l t r i p n , y r e c u p e r a c i n de c l u l a s n u c l e a da s y
p r o g e n i t o r e s g r a n u l o c i t o - ma c r o f g i c o s (p o r c e n t a j e me di o ds ) , o b t e n i da s t r a s l a de s c o n g e l a c i n de
SC U c r i o p r e s e r v a da e n b o l s a de 1 60 ml (n = 3 8) , b o l s a de 2 4 ml (n = 1 8) y c r i o t u b o s de 4. 5 ml (n = l 1 ) .
* C o mp a r a c i n e n t r e b o l s a de 1 60 ml y b o l s a de 2 4 ml .
tC o mp a r a c i n e n t r e b o l s a de 2 4 ml y c r i o t u b o de 4. 5 ml .
~ C o mp a r a c i n e n t r e b o l s a de 1 60 ml y c r i o t u b o de 4. 5 ml .
Abreviaturas: C N, r e c u p e r a c i n de c l u l a s n u c l e a da s ; C F U- G M, r e c u p e r a c i n de c l u l a s f o r ma do r a s de
c o l o n i a s g r a n u l o c i t o - ma c r o f g i c a s ; p , p r u e b a de s i g n i f i c a c i n e s t a d s t i c a (U de Ma n n - Wh i t n e y ) .
NS, di f e r e n c i a n o s i g n i f i c a t i v a .
NS
3.6.3.- Efecto del almacenamiento transitorio a 80
0C previo al definitivo en nitrgeno
lquido a 1960C.
La contaminacin del depsito de nitrgeno liquido por virus de la hepatitis B a partir de
unidades positivas, y su transmisin entre bolsas de MO criopreservadas y almacenadas en el
mismo contenedor, es un hecho descrito, aunque circunstancial (Hawkins y cols., 1996). A pesar
de que an no est suficientemente contrastado ni cuantificado, una manera de minimizar este
nesgo consiste en guardar las unidades recientemente congeladas en un contenedor diferente de
nitrgeno liquido hasta conocer los resultados de serologa, y transferir al depsito de
almacenamiento definitivo solo las unidades que resulten negativas. Otra opcin es conservar en
el mismo contenedor, en fase de vapor las unidades en espera de pruebas serolgicas, y en fase
lquida las unidades confirmadas negativas. Estas dos posibilidades presentan el inconveniente,
en la primera, de tener que destinar un contenedor exclusivo para unidades en cuarentena, y en
la segunda, de fluctuaciones importantes de la temperatura durante las aperturas del depsito, o
incluso que las unidades en fase de vapor entren en contacto con nitrgeno lquido debido a
turbulencias durante el llenado del contenedor. Como una posible alternativa, nosotros hemos
111
: 0
WULIOTE CA
Resultados
3.7.- Descongelacin.
El proceso de descongelacin y reinfusin tambin es un paso crtico a la hora de obtener
resultados ptimos en el implante. De hecho, no solo la recuperacin de clulas viables, sino
tambin los posibles efectos secundarios en el paciente derivados de la infusin de los agentes
criopreservantes, deben ser contemplados cuando se trata de adoptar una tcnica de
descongelacin ptima.
En nuestro laboratorio quisimos determinar las ventajas de protocolos recientemente
aparecidos en la literatura (Rubinstein y cols., 1995) y consistentes en una dilucin lenta de la
unidad descongelada con una solucin de albmina y dextrano, seguida de una centrifugacin
para retirar el sobrenadante (ver apanado 2.3.3.6. de Materiales y Mtodos). El anlisis se llev
a cabo en 18 unidades de SCU criopreservada, comparando este procedimiento con la tcnica
convencional de descongelacin (anlisis de la unidad descongelada, sin realizar ningn tipo de
procesamiento). Las unidades fueron descongeladas por inmersin en un bao a 37
0C. Una
alcuota de cada unidad fue procesada de acuerdo al nuevo mtodo de descongelacin, y la otra
TABL A 33. E f e c to d e l l a v a d o c o n d e x tr a n o / a l b m i n a tr a s l a d e s c o n g e l a c i n d e S C U c r i o p r e s e r v a d a
Tipo de descongelacin
lavado dextrano/albmina no lavado P
V i a b i l i da d 76.4 1 0.1 77.3 8.9 N S
C N 72.91 0.5 75.91 9.6 N S
C F U -G M 86.81 01 .1 78.31 07.8 N S
V i a b i l i da d celular determinada por exclusin de azul tripn y recuperacin de clulas nucleadas y
p r o g e n i t o r e s g r a n u l o c i t o - ma c r o f g i c o s (p o r c e n t a j e me di o ds ) de SCU criopreservada en bolsas de
24 mI t r a s descongelacin y l a v a do c o n de x t r a n o 1 0% y a l b mi n a 5 % (di l u c i n 1:2), en comparacin
con los resultados obtenidos en una alcuota no lavada y di l u i da 1 :1 0 e n I s c o v e s + SBF 20% (n=l8).
Abreviaturas: C N, recuperacin de clulas nucleadas; CFU-GM, recuperacin de clulas formadoras de
c o l o n i a s g r a n u l o c i t o - ma c r o f g i c a s ; p , p r u e b a de s i g n i f i c a c i n e s t a d s t i c a (p r u e b a t pareada). NS,
diferencia no significativa.
113
Resultados
4.- VALIDACIN DELAS UNIDADES PROCESADAS DESCU.
Las unidades que forman parte del Banco de SCUestn destinadas a ser empleadas como
fuente de clulas progenitoras hematopoyticas en pacientes que requieren un trasplante en el
curso de su enfermedad. Con el fin de ofrecer la mxima proteccin, es de particular
importancia asegurar la integridad e inocuidad del producto de trasplante un vez finalizado el
proceso seguido por el Banco, que comprende desde la obtencin, caracterizacin y
fraccionamiento, hasta la congelacin y almacenamiento de las unidades. Por ello, el Banco de
SCU tiene como imperativo realizar un escrutinio final de todos los resultados antes de validar
las unidades procesadas, introducirlos en bases de datos y enviar la informacin pertinente a los
registros de SCU. La finalidad ltima es disminuir todo lo posible el riesgo clnico inherente al
uso de un producto sanguneo alognico.
El procedimiento de validacin consisti en la revisin de los datos recogidos en
formularios diseados especficamente para capturar la informacin referente a la historia
materna, incidencias obsttricas, obtencin de la SCU, procesamiento, escrutinio de infecciones,
caracterizacin de la unidad y almacenamiento definitivo en nitrgeno liquido. Estos impresos
facilitaron la obtencin de todos los datos necesarios para determinar la elegibilidad de una SCU
como fuente potencial de clulas hematopoyticas para trasplante.
Para cada unidad de SCU, los datos de obtencin, procesamiento, pruebas analticas y
almacenamiento se cumplimentaron durante las primeras dos semanas. Posteriormente, todos
estos datos se revisaron de forma independiente por dos personas del Banco, atendiendo a los
criterios de elegibilidad, para su almacenamiento definitivo. Las unidades elegibles para ser
almacenadas a largo plazo fueron confirmadas como tales, e introducidas en la base de datos del
Banco, en el momento de recibirse el tipaje HLA. Las unidades no elegibles en esta primera fase
se sometieron a una segunda evaluacin, en la que se revis de nuevo la documentacin
existente para comprobar la veracidad de los datos y realizar, en su caso, los anlisis pendientes
o pruebas complementarias que completaran o confirmaran los resultados iniciales.
115
Resultados
4.1.- Tipaje HiLA. Frecuencias allicas y de baplotipos en las unidades de SCU procesadas.
El primer paso para proceder a la validacin de una unidad de SCU fue disponer de un
tipaje HLA con el mayor grado de resolucin posible. Este es un requisito imprescindible para
poder establecer el nivel de compatibilidad con un eventual receptor y seleccionar una unidad
para trasplante.
Durante la ltima dcada, la informacin sobre el polimorfismo del sistema de
histocompatibilidad se ha incrementado notablemente gracias a los mtodos de tipaje molecular,
habindose descrito hasta el momento ms de 450 alelos en los loci HLA-A, HLA-B y
HLA-DRB 1. La interpretacin de los datos de tipaje y la definicin de los genotipos HLA son
aspectos que estn continuamente en revisin. Por otro lado, el alto grado de polimorfismo HLA
hace que los estudios de compatibilidad sean cada vez ms complejos, especialmente en el caso
de parejas donante/receptor no relacionados, al tenerse que comprobar su compatibilidad para
cada antgeno y/o alelo. Todo ello conduce a que el principal objetivo de un Banco de SCU
respecto al tipaje HLA sea disponer de un sistema que pueda ajustarse al aumento continuado de
informacin sobre el polimorfismo HLAy a las innovaciones en los mtodos de tipaje, al tiempo
que ofrezca resultados con la mayor garanta y precisin posibles.
El tipaje HLA basado en tcnicas de DNAproporciona un anlisis de los alelos HLAcon
mayor precisin y nivel de resolucin que las tcnicas serolgicas. Por esta razn, las tcnicas
moleculares se consideran cada vez ms como el mtodo de eleccin para el tipaje de sangre de
cordn umbilical. Las unidades de SCU procesadas en nuestro Banco fueron analizadas por un
mtodo de gentica molecular (dot-blot reverso) en los antgenos de clase II (HLA-DR) que
proporciona una resolucin media. Los antgenos de clase 1 (HLA-A y HLA-B) se analizaron
iicialmente por mtodos serolgicos, y en la mayora de las unidades (80%) los resultados
obtenidos fueron confirmados a nivel molecular (PCR-SSP). Actualmente, todas las unidades se
tipan por gentica molecular utilizando los mtodos mencionados en clase 1 y clase II, y adems
se est implementando el tipaje HLA de clase 1 mediante la tcnica de dot-blot reverso que
proporciona una resolucin media de los alelos HLA-A y HLA-B. En los casos en los que
116
Resultados
TABLA 34. F r e c u e n c i a s d e f e n o ti p o s H L A -A , -B y -D R d e te r m i n a d o s s e r o l g i c a m e n te
e n S C U y e n u n a m u e s tr a r e p r e s e n ta ti v a d e l a p o b l a c i n e s p a o l a (M a r ti n e z -L a s o y c o l s ., 1995)
F r e c u e n c i a f e n o t p i c a (% ) Frecuencia fenotpica (%)
Antgeno SCU Pob. espaola Antgeno SCU Pob. espaola
(n=195) (n=176) (n495 ) (n=176)
A l
A2
3
A2 3
24
A2 5
A2 6
A h
A2 8
A2 9
A JO
A M
A32
A 33
A 34
A blanco
DRJ
DRJS
DRI6
DR3
DR4
DRIl
DRJ3
DRJ4
DR7
DR8
DR9
DRJO
DR blanco
16
46
19
4
15
3
6
22
8
15
1 1
1
8
4
1
20
20
1 9
3
1 9
22
29
22
5
32
3
2
1
1 8
23
45
14
3
1 4
5
12
1 6
7
1 8
12
3
9
6
2
12
23
21
4
27
26
1 8
16
5
38
8
3
7
BS
BS i 2
BS J
B7
B8
B44
B4S
B3
B4
B62
B63
B5 7
BS S
BIS
B49
B50
B5 5
B2 7
Bi S
B37
Bi S
B39
B60
B61
B41
B47
B70
B bl a n c o
1 6
3
1
12
1 3
26
5
5
1 0
8
2
7
1
15
5
4
4
4
23
3
3
2
5
1
3
3
O
21
14
4
2
14
1 0
2 9
3
7
19
8
1
6
2
16
7
6
3
5
13
4
3
4
2
2
2
1
1
1 1
8
Blanco, porcentaje de individuos en los que solo se detecta un alelo en el locus correspondiente.
117
Resultados
finalmente no se alcanza un tipaje definitivo con las tcnicas empleadas, se recurre a mtodos de
secuenciacin, los cuales ofrecen una resolucin mxima en la determinacin de alelos HLA.
La determinacin de los antgenos HLA-A, -B y -DR pudo ser realizada hasta el
momento en 195 de 372 unidades de SCU criopreservadas. Las frecuencias encontradas de los
distintos alelos de este sistema altamente polimrfico se compararon con las frecuencias
correspondientes en la poblacin espaola (Martnez-Laso y cols., 1995), tratando de ver si en la
muestra de estudio exista una representacin adecuada de los diferentes antgenos HLA. Los
resultados de este anlisis comparativo, empleando los datos obtenidos mediante tipaje
serolgico, mostraron que las frecuencias HLA-A, -B y -DR no diferan significativamente
(Tabla 34). En SCU fue ms frecuente la deteccin de un solo antgeno en al menos uno de los
tres loci HLA, dada la menor expresin de antgenos HLA en superficie de las clulas
neonatales (Puri y cols., 1993), aunque no se puede descartar la homozigosidad del alelo
correspondiente. Estas dudas quedarn resueltas al proceder al tipaje por gentica molecular.
TABL A35. H a p l o ti p o s H L A m s f r e c u e n te s e n S C U y e n u n a
m u e s tr a r e p r e s e n ta ti v a d e l a p o b l a c i n e s p a o l a (M a r ti n e z -L a s o y c o l s ., 1 995)
Frecuencia de haplotipos (%)
SCU (n=195) Poblacin espafiola (n=176)
A29 B44 DR7 4.2 4.5
A l BS DR3 3.6 3 . 4
A JO BI S DR3 2.1 3.1
A 33 B14 DR 0. 9 2 . 6
A 2 B7 DRI S 2.5 1.9
A h B27 DRI 0. 9 1 . 4
A 3 B7 DRI S 0.3 1 .4
A2 BIS DRil 1.3 1 .1
A30 BJ DR? 0 0.4
mediante clculos de Las frecuencias haplotpicas mostradas en la tabla han sido determinadas
desequilibrio de ligamiento de los loci A, B, DR.
1 1 8
Resultados
Se define como haplotipo HLA al material gentico que se transmite en bloque a travs
d.e generaciones debido al desequilibrio de ligamiento entre loci HLA prximos. Los haplotipos
HLA de la muestra de estudio se determinaron mediante clculos de desequilibrio de ligamiento
de los loci A, B y DR (Martnez-Laso y cols., 1995). Como puede observarse en la tabla 35, los
nueve haplotipos ms frecuentes en la poblacin espaola coincidieron aproximadamente en su
frecuencia con los haplotipos encontrados en la muestra de SCU.
4.2.- Criterios finales de elegibilidad.
La determinacin del tipaje HLA constituye el punto de partida para proceder a la
validacin y registro en la base de datos del Banco de las unidades que finalmente cumplen los
criterios de elegibilidad. En este apartado se describe el sistema de validacin empleado, las
unidades HLA tipadas que fueron rechazadas y los motivos de rechazo, y las unidades
pendientes de validacin. Finalmente, se indican las unidades confirmadas elegibles y enviadas
al Registro Espaol de Donantes de Mdula sea (REDMO), en donde estn accesibles para
comprobar por cualquier centro de trasplante la disponibilidad de unidades compatibles.
En la evaluacin final de las unidades de SCU, los criterios de exclusin que sesiguieron
para su validacin se resumen en la tabla 36
4.2.1.- Consentimiento informado.
La obtencin de SCU debe realizarse tras la firma ante testigo del consentimiento
informado para donacin de SCU. Sin embargo, cuando la rapidez del parto impide informar
con detalle sobre la finalidad del programa y requerir por escrito la participacin en el mismo de
la madre/donante, se solicita verbalmente la aceptacin para donar la sangre de cordn y se
pospone la firma del consentimiento a un mximo de 24 horas despus del parto. Si en este
plazo la madre/donante se niega en ltima instancia a dar su consentimiento por escrito, la
unidad de SCU se retira del Banco. Esta circunstancia se produjo en 10 donaciones de SCU en
las que no hubo una decisin firme de participacin tras la obtencin de la SCU y, por tanto, las
u n i da de s r e c o l e c t a da s f u e r o n de s e c h a da s de l i n v e n t a r i o de l Ba n c o .
1 1 9
Resultados
TABLA 36. C r i te r i o s f i n a l e s d e e x c l u s i n d e u n i d a d e s d e S C U p r o c e s a d a s
Co n s e n t i m i e n t o i n f o r m a do
Ausencia de consentimiento
Obt e n c i n /Pr o c e s a m i e n t o /Co n ge l a c i n de
SCU
Ausencia de etiqueta de identificacin en
la bolsa o datos incorrectos o
inadecuados
Dao o escape de sangre en la bolsa de
recogida
Clulas nucleadas procesadas <4x 1 0~
Fraccionamiento con metilcelulosa o
gelatina
Viabilidad <80% tras aadir DMSO
H i s t o r i a m a t e r n a y f a m i l i a r e s de p r i m e r
gr a do
Cncer (excepto carcinomas de piel de
clulas basales o de clulas espinosas)
Enfermedades autoinmunes
H i s t o r i a m a t e r n a y f a m i l i a r
Transtornos hematopoyticos
Inmunodeficiencias hereditarias
Coagulopatas hereditarias
Enfermedades metablicas o de depsito
H i s t o r i a m a t e r n a de e x p o s i c i n /r i e s go s o c i a l
C o n s a n g u i n i da d
Drogadiccin intravenosaa
SIDA o positividad para VIHb
Re v i s i n de l Pa r t o
Presencia de pus o inflamacin en la placenta
Emb a r a z o /p a r t o o e s t a do de l r e c i n n a c i do
inadecuados
Parto vaginal con infeccin herptica activa
Re v i s i n de l o s r e s u l t a do s a n a l t i c o s
Ensayo de progenitores: CFU-OM = c e r o
Resultados de viabilidad incompletos
Resultados tests infecciosos no revisados
C u l t i v o mi c r o b i o l g i c o p o s i t i v o
Resultados HLApendientes o incompletos
Resultado positivo de al menos alguno de los
siguientes marcadores: anticuemos lgM anti-
citomegalovirus (CMV), sfilis, anti-VCH
(anticuemos anti-virus hepatitis C), HBsAg
(antgeno de superficie hepatitis B), VIH 1/2
aHaber mantenido relaciones sexuales en el ltimo ao con una persona que responda a esta descripcin.
bHaber mantenido relaciones sexuales en el ltimo ao con alguna persona con SIDAo VIH positividad.
4.2.2.- ObtencinfProcesamiento/Congelacin.
Las primeras 33 unidades fueron procesadas con metilcelulosa (4) o gelatina (29), y no
fueron consideradas elegibles ante el posible riesgo de la utilizacin clnica de estos agentes de
separacin (la administracin por va parenteral de metilcelulosa no est aprobada para uso
clnico, y el empleo de gelatina conleva un riesgo de transmisin de la enfermedad de
Creutzfeld-Jacob). Todas las dems unidades fueron fraccionadas con hidroxietil almidn,
empleando una presentacin comercial de este producto aprobada para uso clnico.
12 0
Resultados
El mnimo de clulas nucleadas con el que se consigue el implante de SCU en la mayora
de los pacientes es 2x10
7/kg. La probabilidad de que una unidad con un contenido inferior a
4x 108 clulas nucleadas supere esta dosis celular mnima y sea utilizada para un trasplante es
muy reducida, incluso en pacientes peditricos de poco peso. Por ello, fijamos este lmite para
incluir en el Banco solo las unidades de SCU con una celularidad superior. En 5 . unidades el
nmero de clulas nucleadas fue inferior a 4x l0~ y fueron excluidas del Banco.
La viabilidad celular (exclusin de azul tripn) tras la adicin de DM50 fue inferior al
80% en 85 unidades de SCU. Estareduccin en la viabilidad guardaba relacin con el tiempo
transcurrido desde la obtencin hasta el procesamiento, y afectaba no solo a clulas maduras
diferenciadas sino tambin a progenitores hematopoyticos, tal como se explica en el apartado
3.3. Estas unidades de SCU sufrieron un dao celular significativo en el intervalo previo al
procesamiento y, por tanto, no fueron consideradas elegibles.
4.2.3.- Historia materna y familiar.
En un caso, la unidad no fue confirmada elegible por presentar la madre una
glomerulonefritis crnica membrano-proliferativa de etiologa autoinmune. Aunque no se
conoce si realmente existe alguna probabilidad de que un eventual receptor de dicha unidad
pueda desarrollar fenmenos autoinmunes (en teora, a partir de clulas linfoides fetales que
hubieran heredado el defecto), decidimos rechazar esta unidade con historia familiar de
autoinmunidad.
La presencia de enfermedades hereditarias fue detectada en tres casos. En una unidad la
madre/donante tena una ~ -alasemia heterozigota; esta unidad permanece en el inventario del
Banco, ya que su uso estara contraindicado nicamente en pacientes con talasemia. Las otras
do s u n i da de s c o r r e s p o n d a n a u n d f i c i t de c o l i n e s t e r a s a di a g n o s t i c a do e n l a ma dr e /do n a n t e , y a
una fibrosis quistica diagnosticada en una hermana del recin nacido. Ambos procesos no se
acompaan de transtornos hematolgicos ni se transmiten a travs de tejido hematopoytico, por
l o qu e t a mp o c o l a s u n i da de s de SC U e n e s t o s do s c a s o s f u e r o n de s e c h a da s .
1 2 1
Resultados
4.2.4.- Revisin de los resultados analticos.
En tres unidades se obtuvieron resultados positivos en el cultivo microbiolgico
(Bacteroides fragilis, Estreptococo agalactiae y Escherichia coli), y en otras tres unidades de
SCU la madre/donante fue positiva para anticuerpos anti-VHC. Todas ellas no fueron elegibles
para su inclusin en el Banco. Tres unidades adicionales quedaron pendientes de validacin en
espera de revisar los resultados completos de los tests infecciosos.
El tipaje HLA an no est disponible en 90 unidades de SCU, por lo que estas unidades
no han podido ser confirmadas, todava, en cuanto a su elegibilidad.
4.3.- Envo de unidades de SCU validadas al Registro Espaol de Donantes de Mdula
sea (REDMO).
Un a v e z c o mp l e t a do e l p r o c e s o de v a l i da c i n de s c r i t o e n l o s a p a r t a do s a n t e r i o r e s , s e h a n
confirmado hasta el momento 139 unidades de SCU que cumplan todos los criterios de
e l e g i b i l i da d. L o s da t o s c o r r e s p o n di e n t e s a e s t a s u n i da de s f u e r o n i n t r o du c i do s e n l a b a s e de da t o s
del Banco como unidades de SCU elegibles, y han sido remitidas al REDMO para su registro.
Como se ha mencionado, 93 unidades estn pendientes del tipaje HLA o de revisar los
resultados de las pruebas microbiolgicas para su validacin, y 140 fueron rechazadas por los
mo t i v o s e x p l i c a do s a n t e r i o r me n t e .
La informacin enviada al REDMO de las unidades de SCU confirmadas elegibles
consisti en el cdigo de la unidad, el volumen de sangre obtenido, las clulas nucleadas
cnopreservadas, el grupo sanguneo, la etnia de la madre/donante, el tipaje HLA y los resultados
de las pruebas infecciosas. Estos datos se enviaron por correo electrnico en un archivo
compatible para ser importado directamente en el registro del REDMO, y tambin se facilit un
informe escrito con estos mismos datos con objeto de detectar posibles errores que pudieran
o c u r r i r e n l a t r a n s mi s i n e l e c t r n i c a .
1 2 2
Resultados
En resumen, despus del estudio desarrollado en esta tesis, hemos podido estandarizar
metodologas y criterios reproducibles que han permitido la creacin y establecimiento de un
Banco de SCU en el Hospital 12 de Octubre. De esta forma, esperamos reunir en el pazo de tres
aos un nmero de unidades con el cual poder responder a las necesidades de un alto porcentaje
de pacientes con indicacin de trasplante de SCU.
1 2 3
DISCUSIN
Discusin
A lo largo de este trabajo, hemos descrito los procedimientos y estudios desarrollados
para llegar a establecer un Banco de Sangre de Cordn Umbilical en el Hospital 12 de Octubre.
La primera fase del programa de estandarizacin metodolgica y validacin final de unidades
procesadas ha dado como resultado el registro de 139 unidades de SCU en el Registro Espaol
de Donantes de Mdula sea (REDMO), donde pueden ser consultadas las caractersticas
bsicas de cada una de las unidades con objeto de seleccionar la ms idnea para un potencial
receptor de trasplante de SCU. Un 80%, 60% y 40% de las unidades podran ser utilizadas,
segn las series de trasplante de SCU recientemente publicadas (ver ms adelante), en pacientes
peditricos y adultos con un peso medio, respectivamente, de 20, 5 5 y 6 5 k g .
Los criterios y metodologas establecidos para la puesta en marcha y posterior desarrollo
del Banco de SCU -que en un plazo aproximado de 3-5 aos podra llegar a almacenar un total
de 3.000 unidades- han sido estandarizados en base a este estudio, en principio descriptivo de
las propiedades hematopoyticas e inmunolgicas de la muestra analizada de SCU, y
posteriormente operativo para la obtencin, procesamiento y almacenamiento de las unidades.
Nuestro objetivo primordial, por tanto, ha sido el conocimiento de las caractersticas biolgicas
de la SCU y la optimizacin de los mtodos a utilizar para asegurar el mayor potencial de
repoblacin hematopoytica de las unidades procesadas.
Como ya se ha indicado anteriormente, el valor de establecer un Banco de SCU radica
en la oportunidad de un acceso casi inmediato a un producto para trasplante alognico HLA-
tipado y prospectivamente testado para las enfermedades transmisibles ms prevalentes
(Rubinstein y cols., 1993; Broxmeyer, 1995). Pero adems, la SCU presenta algunas
propiedades especficas que le confieren un valor adicional respecto a MO y SPM.
Concretamente, la incidencia de enfermedad injerto contra husped (EICH) es menor en los
trasplantes de SCU, incluso ante disparidades importantes de los antgenos de
histocompatibilidad (Wagner y cols., 1995; Kurtzberg y cols., 1996; Gluckman y cols., 1997;
Rubinstein y cols., 1998; Locatelli y cols., 1999), lo cual puede indicar un estado de relativa
inmadurez funcional del sistema inmunitario neonatal. Adems, la correcta capacidad de
repoblacin medular demostrada en los trasplantes de SCU a pesar del menor nmero de clulas
12 5
Discusin
reinfundidas (Wagner y cols., 1995; Kurtzberg y cols., 1996; Gluckman y cols., 1997; Laporte y
cols., 1998; Rubinstein y cols., 1998), sugiere una elevada capacidad proliferativa de los
progenitores hematopoyticos fetales. Nosotros hemos realizado un estudio del contenido de
clulas primitivas y progenitoras, as como de las caractersticas de las clulas linfoides de SCU,
e n c o mp a r a c i n c o n MO y SPM, c u y a c o n c l u s i n g e n e r a l e s qu e l a SC U p r e s e n t a di f e r e n c i a s
biolgicas que podran explicar algunas de sus propiedades distintivas.
La SCUpresenta un mayorpotencial hematopoytico que la MOy SPM.
En p r i me r l u g a r , h e mo s de t e r mi n a do e l c o n t e n i do de c l u l a s C D3 4~ t o t a l e s de SC U. L o s
valores encontrados (4.664.28x106) son coincidentes con los recientemente hallados en otros
laboratorios (Dal Cortivo y cols., 1998; Kogler y cols., 1998a; Pojda y cols., 1998). Tambin
ponen de manifiesto una peculiaridad de la SCU, ya que, aunque estas cifras de clulas con
potencial hematopoytico son significativamente menores que las correspondientes a los
productos de MO y SPM utilizados para trasplante (100 veces menor), el hecho de que la tasa
de injerto en los trasplantes de SCU sea similar a la de los trasplantes de MO o SPM sugiere que
la capacidad proliferativa y de reconstitucin hematopoytica de las clulas progenitoras de
SCU es significativamente supenor.
Asimismo, el porcentaje de clulas progenitoras ms inmaduras en SCU es superior al
encontrado en MO y 5PM. Estos datos son bsicamente coincidentes con trabajos de otros
laboratorios (Hao y cols., 1995; Barbosa y cols. 1998). Sin embargo, existen algunas
discrepancias en cuanto al fenotipo que define a los progenitores ms primitivos en SCU. As,
mientras que algunos han sugerido que el inmunofenotipo comnmente utilizado para
identificar clulas hematopoyticas primitivas en MO de adulto (CD34~ /DBi) no es aplicable a
SCU, en donde la subpoblacin de clulas CD34~ ms primitivas coexpresaran el antgeno
HLA-DR (Traycoff y cols., 1994b; Huang y cols., 1998), otros autores encuentran que la
fraccin CD34~ /387DlC en SCU comprende la mayora de las clulas progenitoras ms
i n ma du r a s (Ha o y cols., 1995; Opie y cols., 1998). Nuestros resultados, a pesar de no haber
1 2 6
Discusin
r e a l i z a do u n a n l i s i s f u n c i o n a l de s u b p o b l a c i o n e s C D3 4~ p u r i f i c a da s , c o n c u e r da n m s c o n e s t o s
ltimos estudios y con otros que enmarcan el potencial de reconstitucin in vivo exclusivamente
e n c l u l a s C D3 4~/3 W (L a r o c h e l l e y cols., 1996; Verstegen y cols., 1998). Tanto en estos
trabajos como en nuestro anlisis, la mayora de las clulas CD34~ /38 en SCU son DPV,
estando porcentualmente ms representadas que en MO y 5PM. Esta diferente composicin del
c o mp a r t i me n t o de c l u l a s p r i mi t i v a s C D3 4~/C D3 W s u g i e r e , u n a v e z m s , u n ma y o r potencial
reconstitutivo a largo pazo de la SCU en comparacin con las otras dos fuentes de clulas
h e ma t o p o y t i c a s . De h e c h o , v a r i o s e s t u di o s f u n c i o n a l e s in vitro de c u a n t i f i c a c i n de c l u l a s
L TC - I C (Ho ws y c o l s . 1 992 ; Pe t t e n g e l y c o l s 1 994; Ha o y c o l s . , 1995) y estudios de repoblacin
in vivo e n e l mo de l o mu r i n o SCID/NOD (Wang y cols., 1997; Gan y cols., 1997; Noort y cols.,
1998) as lo indican.
Somos conscientes, como ya se indic en el apartado correspondiente, que el anlisis in
vitro de clulas primitivas y clulas progenitoras comprometidas no es el ptimo para evaluar el
potencial reconstitutivo de una fuente de clulas hematopoyticas, siendo el mtodo de eleccin
el modelo de ratn SCID/NOD (Dick, 1996). Debido tambin a que los ensayos clonognicos
presentan enorme variabilidad (Lamana y cols., 1998), hemos combinado anlisis
citofluorimtrico y potencial de formacin de colonias para evaluar la presencia de progenitores
granulocito-macrofgicos (GM), eritrocticos (E) y megacariocticos (Mk). De la conjuncin de
anlisis de marcadores de superficie por citometra de flujo y potencial clonognico, se puede
obtener informacin valiosa, sobre todo si, como es nuestro caso, pretendemos comparar la
SC U c o n o t r a s f u e n t e s de clulas hematopoyticas. Adems, estudios comparativos de anlisis
in vro e in vivo permiten correlacionar la capacidad de repoblacin con la riqueza en clulas
primitivas CD34~ /387Verstegen y cols., 1998; van Hennick y cols., 1998).
Los datos obtenidos en este trabajo muestran bsicamente que, si bien no existen
diferencias significativas en la proporcin de progenitores comprometidos al linaje GM y Mk
determinados por citometra de flujo, la capacidad formadora de colonias es consistentemente
mayor en SCU que en MO y SPM, lo cual apoya, en base a lo anteriormente expuesto, la idea de
12 7
Discusin
que la SCU tiene un potencial de repoblacin hematopoytica similar; si no mayor, respecto a
MO y SPM.
L o s r e s u l t a do s o b t e n i do s p o r n o s o t r o s , a de m s , s o n s u p e r p o n i b l e s a los hallados en otros
g r u p o s (Br o x me y e r y c o l s . , 1 992 ; No o r t y c o l s . , 1 998) . De h e c h o , y a u n qu e l o s v a l o r e s
a b s o l u t o s de c l u l a s f o r ma do r a s de c o l o n i a s s o n di f c i l me n t e c o mp a r a b l e s e n t r e di s t i n t o s
l a b o r a t o r i o s , da da l a v a r i a b i l i da d i n h e r e n t e a l a p r o p i a me t o do l o g a de l o s e n s a y o s
c l o n o g n i c o s , l a f r e c u e n c i a r e l a t i v a e n t r e BF U- E, C F U- G M y C F U- G EMM e n c o n t r a da e n
n u e s t r o e s t u di o e s s i mi l a r a l a de s c r i t a p o r o t r o s a u t o r e s (Ba u do u x y cols., 1998; Kgler y cols.,
1 998a ) .
De nuestros ensayos, tambin se puede inferir que, al menos para los precursores
me g a c a r i o c t i c o s , l a de t e r mi n a c i n de c l u l a s f o r ma do r a s de c o l o n i a s (C F U- Mk ) p o dr a p o n e r
de manifiesto diferencias entre diferentes fuentes hematopoyticas, puesto que si mediante
citometra de flujo no se evidencian diferencias importantes entre SCU, MO y SPM, la
capacidad clonognica es 2 a 3 veces superior en SCUque en 5PM.
A esta conclusin tambin han llegado otros autores (Broxmeyer y cols., 1989; Hows y
cols. 1992; Pettengel y cols., 1994; Hao y cols., 1995; Wang y cols., 1997; Lebeurier y cols.,
1997). Por tanto, nuestros resultados confirman la hiptesis de que el potencial hematopoytico
de la SCUpuede ser mayor que el de MO y SPM.
La SCU presenta una inmadurez inmunolgica posiblemente responsable de un menor
potencial de EICH.
Ap a r t e de l mayor potencial de reconstitucin hematopoytica de la SCU, una de las
mayores ventajas de esta fuente de trasplante es el posible potencial minimizado de
aloreactividad. Esto podra venir determinado por una inmadurez inmunolgica de la sangre
fetal, que, por otra parte, viene sugirindose desde hace varios aos al constatarse clnicamente
12 8
Discusin
una menor incidencia y severidad de EICH en los trasplantes de SCU (Wagner y cols., 1995,
Kurtzberg y cols., 1996; Gluckman y cols., 1997, Rubinstein y cols., 1998; Locaielli y cols.,
1 999) .
L a s c a r a c t e r s t i c a s de l a s c l u l a s l i n f o c i t a r i a s de l a SC U p u e s t a s de ma n i f i e s t o p o r
nuestro anlisis parecen indicar, efectivamente, que el neonato no ha alcanzado un estado de
madurez del Sistema Inmune comparable al del adulto. No obstante, hay que destacar el hecho
de que dicha inmadurez se circunscribe fundamentalmente a la funcionalidad del mismo, y no a
la ausencia de clulas responsables de la respuesta inmune, ya que el anlisis citofluorimtrico
que hemos realizado muestra que el nmero de linfocitos T, B y NK alcanza niveles relativos
comparables a los encontrados en sangre adulta.
Esta discrepancia entre un completo desarrollo de la ontogenia linfocitaria en el periodo
perinatal y la falta de madurez funcional de la misma, es una evidencia ampliamente aceptada,
ya que es bien conocido el hecho de que la plena respuesta inmunolgica se adquiere en
periodos posnatales (Siegal, 1981; Miyawaki y cols., 1985; Schelonka y cols., 1998; Millet y
cols., 1999). De hecho, estudios citomtricos de SCU semejantes a los realizados en este trabajo
obtienen resultados muy similares (Harris y cols., 1992; Han y cols., 1995; DArena y cols.,
1998a). As, hemos encontrado que el 89% de c l u l a s T C D4~ y e l 90% de c l u l a s B de SC U
presentan antgenos de superficie caractersticos de clulas inmaduras (CD45RA en linfocitos T
CD4~ y CD5 en linfocitos B, respectivamente), y que corresponden a poblaciones linfocitarias
no primadas antignicamente (Johannisson y Festin, 1995; Fischer y cols., 1997; Brezinschek y
cols., 1997; Klein y cols., 1 998) . Es t o s da t o s s o n c o mp a r a b l e s a l o s qu e a p a r e c e n e n l a l i t e r a t u r a
(1-larris y cols., 1992; Keever y cols., 1995; Han y cols., 1995; Paloczi y cols., 1998; Paiva y
cols., 1998), en donde, adems, se describen otras caractersticas fenotpicas consistentes con
inmadurez a nivel de clulas T (menor nivel de expresin de CD3, mayor frecuencia de
linfocitos dobles positivos CD4~ /CD8~ y linfocitos CD3YCD8~ ) y clulas B (menor nivel de
expresin de antgenos HLA de clase U, mayor expresin de CD9 e IgM de superficie), que
corroboran la naturaleza naive de l o s l i n f o c i t o s de SCU descrita en nuestro estudio.
12 9
Discusin
La inmadurez fenotpica puede asociarse a una inmadurez funcional tambin sugerida
por nuestro estudio citomtrico, que indica que el 71% de linfocitos T son clulas que
coexpresan CD38, una glicoproteina transmembrana que se expresa en fases tempranas de la
diferenciacin celular (y tambin en clulas activadas), cuya funcin es an desconocida
(Malavasi y cols., 1994). En SCU se demuestra una mayor proporcin de linfocitos
CD3~ /CD38~ , sin que de forma concomitante se detecten en estas clulas signos de activacin
(expresin de CD25 o HLA-DR), y que corresponden a la poblacin de clulas T CD45RA~
naive, as denominadas por sus caractersticas funcionales que denotan que no han sido todava
expuestas a determinantes antignicos (Prince y cols., 1992; Dianzani y cols., 1994). Es ms,
esta inmadurez funcional la muestran asimismo la mayora de las escasas clulas
CD4~ /CD45RO~ encontradas: de la pequea proporcin que del total de linfocitos CD4~ en
SCU representan un 11.3%, la mayora (11.2%) presentan caractersticas fenotpicas de clulas
llamadas transicionales (coexpresin de CD45RO y CD45RA), que son clulas que han
interaccionado recientemente con el antgeno (Kanegane y cols., 1991; Picker y cols., 1993; Lai
y cols., 1994), no existiendo apenas clulas de memoria CD4/CD45RO~ /RK (a diferencia de
la SPA en donde ms del 5 0% de los linfocitos CD4~ presentan este fenotipo). Distintos trabajos
indican que durante la transicin del estado naive al de memoria, las clulas T expresan
CD45RO al tiempo que dejan de expresar CD45RA. As, tras la activacin antignica de
linfocitos 1 naive, se observa una subpoblacin de clulas T transicionales CD45RO~ /RA~
antes de que se complete la conversin fenotpica de CD45ROYRA~ a CD45RO~ /RA7 (LaSalle
y Hafler, 1991; Hamann y cols., 1996). Por tanto, adems del mayor nmero de linfocitos CDC
naive y menor frecuencia de clulas Tde memoria, nuestro estudio revela que la mayora de las
clulas CD4~ /CD45RO~ en SCU son clulas inmaduras transicionales que coexpresan
CD45RA. Estos hallazgos coinciden con los descritos previamente por otros laboratorios (Bofil
y cols., 1994; Chheda y cols., 1996).
Si bien estos datos sugieren fuertemente que las clulas del sistema inmune neonatal son
inmaduras, tanto fenotpica como funcionalmente, no permiten necesariamente relacionarlos
con una menor gravedad e incluso incidencia de EICH tras el trasplante de SCU, ya que en este
proceso, consistente en una respuesta de rechazo frente a los tejidos del receptor mediada por
1 30
Discusin
linfocitos T del donante reactivos contra antgenos menores de histocompatibilidad, juega un
papel determinante la actividad citotxica, la capacidad aloreactiva y la secrecin de
mediadores proinflamatorios como JL-2. TNF-a e IFN-y, funciones efectoras que determinan,
en ltima instancia, el dao tisular. Se podra suponer que aunque la poblacin linfocitaria es
inmadura, su capacidad reactiva est plenamente desarrollada. Sin embargo, nuestros datos
permiten correlacionar el grado de inmadurez fenotpica con una menor funcionalidad
citotxica y aloreactiva, ya que muestran una presencia modesta de clulas T con actividad
citotxica y de clulas TH1 y TH2 secretoras de citocinas implicadas en dicha actividad.
As, no solo la proporcin de clulas TCD8~ citotxicas es muy minoritaria en SCU con
respecto a SPA (16% vs 30%), sino que no hemos encontrado en sangre fetal clulas que
expresen el antgeno CD57, que no solo sirve como marcador de una subpoblacin de linfocitos
T citotxicos, sino que su expresin indica adems un estado de diferenciacin terminal de
clulas T citotxicas activadas, con grnulos citoplasmticos positivos para perforinas
(protenas responsables de la formacin de poros transmembrana citolticos) y granzime B
(serna esterasa que puede participar en el proceso citotxico), y con actividad citoltica
espontnea (Berthou y cols., 1995; Mollet y cols., 1998); y aunque un reducido nmero de
linfocitos T en SCU expresan una isoforma de la molcula de adhesin neural N-CAM (CD56)
qu e l o s i de n t i f i c a i g u a l me n t e c o mo c l u l a s e f e c t o r a s c o n g r a n a c t i v i da d c i t o t x i c a (L a n i e r y
c o l s . , 1 986; Ho y l e y c o l s . . 1 998) , s u f r e c u e n c i a e s s i g n i f i c a t i v a me n t e me n o r qu e e n s a n g r e
a du l t a (0. 3 % v s 4%) . De ma n e r a s i mi l a r , l a de t e c c i n de c l u l a s NK C Dl 6~/C D5 U e n SC U,
prcticamente inexistentes en SPA, junto con la ausencia de clulas NK CD57~ , se corresponde
con una menor actividad ltica NK de SCU, repetidamente demostrada en estudios funcionales
(Harris y cols., 1992; Keever y cols., 1995; Perez-Cruz y cols., 1998). Resultados similares a los
nuestros han sido recientemente comunicados por otros autores (DArena y cols., 1998a; Paiva
y cols., 1998).
Igualmente, el estudio de activacin linfocitaria in vitt~o muestra que, a pesar de que los
linfocitos de SCU responden de manera eficiente a los agentes qumicos utilizados (steres de
forbol e ionimicina), sl el 3.4%, 0.4% y 2.5% son clulas productoras de 1L2, IL-4 e IFN-y,
131
Discusin
respectivamente, a diferencia de los linfocitos adultos, que alcanzan unos porcentajes
correspondientes del 37.8%, 2.2% y 18.2%. En SCU, las clulas mayoritariamente productoras
de las citocinas estudiadas son linfocitos CDC colaboradores, mientras que en SPA la
produccin de IFN-y se lleva a cabo tanto por clulas CDC como CD8~ . pudiendo ser este
hecho una de las posibles explicaciones de la menor produccin de esta citocina, al existir en
SCU muy pocas clulas CD8~ /CD45RO~ . Esta menor proporcin de clulas capaces de producir
citocinas implicadas en reacciones proinflamatorias est en concordancia con la inmadurez de
los linfocitos T de SCU, los cuales no han sido an activados hacia clulas tipo TH1 (secretoras
de IL-2 e IFN-y) o TH2 (secretoras de IL-4). Las propiedades de los linfocitos de SCU, que
nosotros describimos, relativas a la capacidad de produccin de citocinas activadoras de
l i n f o c i t o s 1 y NK e i n i c i a do r a s de r e a c c i n i n j e r t o c o n t r a h u e s p e d, s o n c o i n c i de n t e s c o n
estudios realizados en otros laboratorios (Sautois y cols., 1997; Racadot y cols., 1997; Chalmers
y cols., 1998).
Por otra parte, la capacidad aloreactiva probablemente es tambin inferior en los
linfocitos de SCU, segn puede desprenderse de la menor proporcin de linfocitos T que
expresan molculas de adhesin LFA-3 e ICAM- 1 (0-2% vs 34-42% en SCU y SPA,
respectivamente). Estas protenas han sido implicadas en el reconocimiento e interaccin clula-
clula y se ha sugerido su implicacin directa en la aloreactividad linfocitaria (Merkenschlager
y cols., 1991; Boussiotis y cols., 1994). Concretamente, LFA-3 (CDS8) es el ligando de la
protena CD2 (presente en ms del 90% de los linfocitos T maduros), promueve la adhesin
entre diferentes tipos de clulas con linfocitos T, aumentando la activacin mediada por TCR, y
puede ser crtica para la unin de clulas CD4~ a las clulas presentadoras de antgeno, as como
de linfocitos 1 citotxicos a sus clulas diana. La molcula ICAM-1 (CD54) e s u n o de l o s
ligandos especficos de la integrina 1 32 LFA-1 (CDl la) que, como se indica ms adelante,
participa en una amplia variedad de funciones linfocitarias adhesin-dependientes y que parece
tener una gran relevancia en las respuestas inmunes asociadas a EICH (Roy y cols., 1993;
Howell y cols., 1999).
132
Discusin
Por tanto, nuestros resultados apuntan hacia una capacidad aloreactiva menguada de los
linfocitos fetales, en comparacin con los adultos, lo cual ha sido tambin descrito por otros
autores (keever y cols., 1995; Paiva y cols., 1998). La expresin de otras molculas de
adhesin, como LFA-1 y HCAM (CD44), es similar en linfocitos de SCU y SPA, aunque en
nuestro anlisis se demuestra una densidad disminuida de LFA-1 en los linfocitos T de SCU, de
acuerdo con otros estudios (Han y cols., 1995; Keever y cols., 1995). La expresin de LFA-1 es
esencial para la estimulacin de clulas T colaboradoras por clulas presentadoras de antgeno,
la lisis celular mediada por linfocitos T citotxicos, y la adhesin linfocitaria al endotelio,
siendo por tanto una integrina que participa de forma muy importante en los procesos de
mi g r a c i n l i n f o c i t a r i a y a l o r e a c t i v i da d, y qu e h a s i do i mp l i c a da e n l o s me c a n i s mo s de EI C H
(Harning y cols., 1991; Howell y cols., 1995). Adems, la presencia de clulas CD8~ con baja
expresin de LFA- 1 se ha relacionado con una actividad supresora en SCU que podra
asociarse con una menor incidencia de EICH (Han y cols., 1995; Paiva y cols., 1998),
probablemente a travs de la inhibicin de respuestas secundarias en linfocitos CDC
aloestimulados primariamente (Risdon y cols., 1995). Igualmente, en estos estudios las clulas
naive CD45RA tambin han sido identificadas como clulas supresoras, existiendo en nuestro
anlisis una correlacin entre la menor densidad de LFA-1 en linfocitos T y el fenotipo
CD45RA. En definitiva, estos resultados permiten sugerir que la capacidad de respuesta inmune
de la SCU es inferior a la de poblaciones linfocitarias adultas, al no disponer an los linfocitos
fetales de una maquinaria completa de adhesin intercelular.
Todas estas diferencias en el perfil inmunofenotpico y de secrecin de citocinas
encontradas en linfocitos de SCU respecto a SPA, podran explicar en su conjunto la
observacin clnica de una menor incidencia de EICH en pacientes trasplantados con SCU
frente a los trasplantes de mdula sea o sangre perifrica de adultos. As, en estudios
recientemente publicados y dnde se describen un nmero considerable de trasplantes de SCU,
se puede comprobar que la incidencia y severidad de EICH es significativamente menor que en
los pacientes sometidos a trasplante de MO (Wagner y cols., 1995, Kurtzberg y cols., 1996;
Gluckman y cols., 1997, Rubinstein y cols., 1998; Locatelli y cols., 1999). Es ms,
recientemente se ha descrito un modelo humano de EICH in vitro en el que se observa una
1 33
Discusin
capacidad significativamente disminuida de la SCU para inducir aloreactividad tipo EICH,
asociada a una frecuencia reducida de precursores linfocitarios T citotxicos aloreactivos
(Wang y cols., 1998). En consecuencia, nuestro estudio, junto con otros llevados a cabo en
otros laboratorios (Harris, 1992; Han y cols., 1995; Keever y cols., 1995; Chalmers y cols.,
1998; Barbey y cols., 1998; Paiva y cols., 1998) permite seguir afirmando que la SCU presenta
propiedades distintivas en cuanto a sus caractersticas inmunoreactivas.
En resumen, este estudio de las propiedades bsicas de la SCU nos ha permitido, en
primer lugar, confirmar en nuestro laboratorio resultados comunicados por otros investigadores.
Pero, quizs ms importantemente, nos ha proporcionado las herramientas de evaluacin
necesarias para optimizar los procedimientos de obtencin, fraccionamiento, criopreservacin y
descongelacin de las unidades almacenadas, lo cual tiene especial trascendencia a la hora de
de mo s t r a r l a i n t e g r i da d de l p o t e n c i a l b i o l g i c o (c a p a c i da d c l o n o g n i c a , c o n t e n i do e n
progenitores CD34~ , etc.) al trmino del procesamiento de la SCU. De esta manera, se establece
un elemento fundamental de control y garanta de las unidades potencialmente trasplantables.
El p r o c e di m i e n t o de recogida mediante combinacin de puncin de la vena umbilical y
perfusin de laplacenta enriquece la celularidad de la unidad de SCU
Con el fin de potenciar al mximo la celularidad de las unidades almacenadas, hemos
recurrido a combinar la fraccin de sangre obtenida mediante puncin de la vena umbilical, con
una segunda fraccin de sangre obtenida tras perfusin arteriovenosa de la placenta. De esta
forma, el volumen de SCU ha sido, lgicamente, superior al obtenido nicamente por
venopuncin (132 ml vs 87 m, en valores medios). Se podra argumentar que un mayor
v o l u me n r e c o l e c t a do n o s u p o n e n e c e s a n a me n t e u n p a r me t r o detenninante a priori de una
mayor calidad de las unidades de SCU. Sin embargo, el anlisis de regresin mltiple que
hemos realizado (ver ms adelante) demuestra que tanto la celularidad total como el contenido
de progenitores hematopoyticos estn determinados por el volumen de la unidad. De hecho, la
134
Discusin
riqueza celular alcanzada con la combinacin de las dos fracciones es significativamente
superior a la conseguida solo con la primera (un 15% ms, como media, de clulas nucleadas).
As, en nmeros absolutos, hemos aumentado la celularidad de las unidades de SCU desde
1.070.45 a 1.220.51x o~ clulas. Estas cifras demuestran que esta mejora introducida en el
p r o c e di mi e n t o de o b t e n c i n p e r mi t e a u me n t a r h a s t a u n 60% e l n me r o de u n i da de s c o n
clulas, y por tanto, con posibilidad de ser trasplantadas en sujetos de ms de 50 kg superando
la dosis celular de 2*l0~ clulas/kg, sugerida como una dosis suficiente para garantizar el
implante en pacientes adultos (Laporte y cols., 1998). Estos porcentajes son difcilmente
alcanzables con el mtodo ms comnmente utilizado de recogida nica de sangre de la vena
umbilical, y nuestro estudio, de hecho, as lo demuestra. Las cifras obtenidas con la primera
f r a c c i n de l a v e n a u mb i l i c a l s o n , a s i mi s mo , mu y s i mi l a r e s a l a s c o mu n i c a da s p o r o t r o s Ba n c o s
de SCU que emplean el procedimiento habitual de recogida por venopuncin (Thierry y cols.,
1990, Rubinstein y cols., 1994; Querol y cols., 1998; Navarrete y cols., 1998; Kogler y cols.,
1998b), en los cuales el promedio obtenido de clulas nucleadas est entre 1.02 y l.14x10
9.
Adems, y en consonancia con nuestros resultados, la adopcin de tcnicas de recoleccin de
sangre umbilical mediante perfusin arteriovenosa de la placenta similares a la propuesta por
nosotros (Tumer y cols., 1992; Harris y cols., 1994a), haba anticipado ya de forma preliminar
la mayor riqueza celular que se consigue en unidades de SCU obtenidas con procedimientos de
recogida como el que describimos nosotros.
Estos resultados suponen una contribucin significativa, si se tiene en cuenta, como ya
se ha indicado anteriormente, que las clulas nucleadas infundidas por kilogramo de peso del
receptor es el parmetro ms predictivo del potencial de recuperacin hematopoytica. Por
ejemplo, en el anlisis retrospectivo de 143 trasplantes de SCU comunicados antes de finales de
1996 al registro europeo Eurocord, la recuperacin de neutrfilos (>500/.il) y de plaquetas
(>20.000/g) fu ms rpida en los pacientes que recibieron =3.7x107clulas nucleadas / kg de
peso (Gluckman y cols., 1997). La mayora de estos pacientes son nios menores de 6 aos y
con menos de 20 kg de peso. Sin embargo, dado el nmero limitado de clulas de las unidades
de SCU, queda la incertidumbre sobre si esta nueva fuente de trasplante es capaz de reconstituir
135
Discusin
pacientes adultos o pacientes con ms de 45 kg de peso. An as, la experiencia en adultos
muestra que con una dosis celular media de 2.l>40
7/kg y un promedio de 55 kg de peso, la
sangre de cordn posee un potencial suficiente de reconstitucin hematopoytica tambin en
pacientes adultos (Laporte y cols., 1998; Rubinstein y cols., 1998). Por consiguiente, la
combinacin de las dos fracciones de sangre umbilical obtenidas por venopuncin y perfusin
de la placenta permitira, a la luz de nuestro anlisis, utilizar el 41% de las unidades de SCU
a l ma c e n a da s e n n u e s t r o Ba n c o e n p a c i e n t e s de m s de 65 k g de p e s o , mi e n t r a s qu e c o n l a
primera fraccin el porcentaje hubiera sido nicamente del 30%.
Un problema potencial podra derivarse del aumento consiguiente del tiempo de
recogida; sin embargo, dicho lapso es poco significativo, ya que aunque el tiempo invertido en
la obtencin conjunta de ambas fracciones es necesariamente mayor que si solo se lleva a cabo
la recogida de sangre por venopuncin (aproximadamente 15 mm en lugar de 5 r u i n ) , e n
nmeros relativos es insignificante con respecto al invertido en su procesamiento (ver ms
adelante). Por tanto, el beneficio obtenido en cuanto a clulas recolectadas es mayor que la
prdida potencial de viabilidad de las mismas. Respecto a posibles incidencias adicionales,
como es la mayor posibilidad de contaminacin bacteriana, nuestra experiencia muestra que,
adoptando medidas rigurosas de asepsia durante el procedimiento de obtencin, el riesgo
potencial de contaminacin es despreciable frente a la efectividad en la recuperacin celular.
As, hemos constatado una reduccin en la tasa de cultivos positivos (aerobios y anaerobios) de
un 11.8% a un 4.7% al aumentar el grado de asepsia del lugar de venopuncin, lo cual sita el
r i e s g o de c o n t a mi n a c i n mi c r o b i a n a e n c i f r a s s e me j a n t e s a l a s o b t e n i da s e n u n i da de s de SC U
recogidas sin perfusin placentaria (Rubinstein y cols., 1994; Cairo y Wagner, 1997).
En base a todas estas consideraciones y al hecho de que ms del 60% de las unidades de
SCU obtenidas mediante el procedimiento descrito contienen ms de l>d0~ clulas nucleadas,
hemos tomado recientemente la decisin de establecer este lmite para procesar y almacenar
solamente aquellas unidades de SCU que superen dicha cifra. Aunque asumimos que con esta
medida la tasa de crecimiento del Banco puede verse reducida, consideramos que esta seleccin
de unidades de SCU con una riqueza celular apropiada incrementada significativamente las
136
Discusin
probabilidades de su utilizacin en pacientes adultos, al proporcionar a priori mayores garantas
de un implante hematopoytico eficaz que las que ofreceran unidades de menor riqueza celular.
Podemos concluir, por tanto, que esta modificacin en el procedimiento de obtencin de
SCU supone una mejora sustancial que nos ha permitido alcanzar un rendimiento ptimo en
unidades con un potencial repoblador suficiente, no solo en pacientes peditricos, sino tambin
en receptores adultos de trasplante con =65 kg de peso.
Un intervalo superior a 12 horas entre la obtencin y el procesamiento reduce la viabilidad
celular de la unidadde SCU.
Una contribucin del trabajo de estandarizacin metodolgica realizado en nuestro
Banco ha sido la observacin de la influencia negativa que sobre la viabilidad celular ejerce el
tiempo transcurrido ente la recogida de las unidades de SCU y su llegada al laboratorio. De este
anlisis se desprende que las unidades de SCU procesadas en las primeras 12 horas y
mantenidas a 4C durante este tiempo, tienen una viabilidad celular por encima del 90% y
muestran valores ms altos de eficiencia clonognica que las unidades procesadas ms tarde de
12 horas desde su obtencin, en las que se detecta una disminucin significativa en la
viabilidad celular. Esta observacin es relevante puesto que algunos estudios haban sugerido
previamente que no se producen prdidas significativas de clulas progenitoras
hematopoyticas durante las primeras 48 horas (Broxmeyer y cols., 1989; Rubinstein y cols
1993) y, en consecuencia, muchos centros han incorporado en sus protocolos la aceptacin de
unidades de SCU obtenidas 24 o incluso 48 horas antes del procesamiento. En estos estudios,
as como en el realizado por nosotros, no se evidencia un deterioro importante de la SCU en las
primeras 48 horas cuando se analiza la viabilidad celular antes de la criopreservacin. Sin
embargo, a diferencia de nuestro anlisis, en los estudios citados no se evala la posibilidad de
una excesiva toxicidad inducida por la criopreservacin en aquellas unidades almacenadas por
un intervalo de tiempo prolongado antes de su recepcin en el laboratorio.
1 3 7
Discusin
Nuestros resultados muestran claramente el efecto nocivo que conleva la adicin del
crioprotector cuando la SCU ha permanecido ms de 12 horas sin ser procesada. Demostramos
que la viabilidad celular (exclusin de azul tripn) y la eficiencia clonognica (CFU-OM y
BFU-E) de los progenitores hematopoyticos de SCU, ambas determinadas despus de aadir
dimetilsulfxido al 10%, disminuyen significativamente en funcin del tiempo de conservacin
a 4
0C, y especialmente cuando han transcurrido ms de 12 horas. Por tanto, el deterioro
progresivo que sufren las clulas de SCU durante el almacenamiento previo al procesamiento de
la unidad, se manifiesta especialmente al aadir la solucin crioprotectora, y puede no ser
detectado si la viabilidad celular se analiza solamente antes de la criopreservacin (Broxmeyer y
cols., 1989; Abdel-Mageed y cols., 1997).
Concluimos que el tiempo de conservacin de la SCU hasta su procesamiento influye en
la viabilidad celular y en el potencial clonognico de las clulas progenitoras hematopoyticas
(especialmente BFU-E), por lo que es importante procesar y criopreservar rpidamente las
unidades de SCU, preferiblemente en las primeras 12 horas desde la recogida. Recientemente se
han comunicado resultados muy similares, describindose una reduccin significativa en el
nmero de clulas progenitoras hematopoyticas de SCU a partir de 9 horas de almacenamiento
(Shlebak y cols., 1999). Las repercusiones que para el Banco de SCU se derivan de estos
resultados son notables, ya que una proporcin significativa de los partos se producen fuera de
las horas de rutina. La opcin que hemos adoptado nosotros es, por un lado, criopreservar todas
las unidades de SCU obtenidas durante la noche anterior en das laborables y, por otro,
determinar la viabilidad celular en el momento de la llegada al laboratorio de las unidades
conservadas ms de 12 horas, procesando solamente las que muestren valores superiores al
90%. De esta manera, se pretende reducir al mnimo el nmero de unidades de SCU depositadas
en el Banco que, sin embargo, no seran posteriormente validadas al no superar la tasa del 80%
de viabilidad celular tras aadir la solucin crioprotectora.
1 38
Discusin
El peso del recin nacidopredice la celularidadtotal de la unidad de SCU.
Todo lo discutido hasta el momento pone de manifiesto lo imprescindible que resulta
disponer de herramientas experimentales slidas que permitan seleccionar entre las unidades
recolectadas nicamente aquellas que ms interesa procesar y almacenar, dada la gran
variabilidad que muestran las unidades de SCU en el contenido de clulas nucleadas totales y
progenitores hematopoyticos. Diversos factores pueden ser responsables de esta gran
heterogeneidad de la SCU, y nuestro estudio tambin contempla la posibilidad de identificar
alguno de estos factores predictivos de celularidad entre diversas variables perinatales materno-
fetales. Su definicin puede ayudar a establecer criterios de aceptacin de una donacin como
potencial unidad del Banco. Despus de un anlisis de regresin mltiple en el que se han
incluido un nmero de variables predictoras maternas y fetales, hemos llegado a la conclusin
de que el peso del recin nacido puede ser una informacin de gran ayuda para el Banco de
SC U.
Los resultados del estudio de regresin muestran que, siendo la celularidad total el
parmetro ms importante para considerar una unidad vlida para trasplante, la riqueza celular
de la SCU viene determinada pnmariamente por el volumen de la unidad, una vez optimizado el
mtodo de recogida de SCU anteriormente discutido, y que ambos parmetros dependen a su
vez, al menos en parte, del peso del recin nacido y del nmero de gestaciones. Los restantes
factores estudiados (consumo de tabaco o alcohol, edad de la madre, test de Apgar y sexo del
neonato) no han demostrado tener impacto en el rendimiento de la SCU. El poder predictivo del
mo de l o de r e g r e s i n qu e de t e r mi n a l a c e l u l a r i da d a p a r t i r de l p e s o de l r e c i n n a c i do e s de u n
18%, lo que implica la existencia de otros cofactores perinatales e incluso genticos, como
sugiere un estudio reciente respecto a la contribucin del origen tnico de la madre (Shlebak y
cols., 1998), que tambin pueden influir en la riqueza celular de las unidades de SCU. La
relacin entre el peso del recin nacido y la celularidad de la unidad de SCU ha sido mostrada
igualmente por otros autores (Brossard y cols., 1990; Hiett y cols., 1995; Shlebak y cols., 1998),
aunque el anlisis de regresin logstica mltiple que hemos realizado, a diferencia de los
estudios univariantes utilizados en estos trabajos, permite cuantificar con exactitud la
1 39
Discusin
variabilidad del contenido de clulas nucleadas de SCU que es explicada de forma
independiente por el peso del recin nacido.
La importancia de este estudio reside en la posibilidad de decidir prontamente la
pertinencia o no de proceder a la obtencin de una unidad de SCU. Utilizando la ecuacin de
regresin calculada para la variable CT (clulas nucleadas totales) en funcin del peso del
recin nacido, y estableciendo como criterio de seleccin un mnimo de clulas prefijado, puede
restringirse las donaciones de SCU a las que dieran lugar a las unidades ms favorables en
celularidad. La consecuencia primordial es que estas unidades tendran mayor probabilidad de
sobrepasar el umbral de dosis celular requerido para trasplante de SCU en pacientes adultos.
Pero adems, presenta ventajas adicionales, como minimizar el nmero de procesamientos de
unidades con celularidad escasa y optimizar el espacio de almacenamiento en nitrgeno lquido,
lo cual redunda en un abaratamiento del coste del Banco de SCU.
El m t o do de f r a c c i o n a m i e n t o c o n h i dr o x i e t i l a l m i d n e s e l de e l e c c i n para la separacin
de l a s c l u l a s r e p o bl a do r a s de l a u n i da d de S CU.
Uno de los primeros objetivos que nos propusimos al iniciar la estandarizacin del
Banco de SCU, fue la validacin de los mtodos de reduccin de volumen de las unidades antes
de su criopreservacin. La prioridad de estos estudios vino motivada por la limitacin de
espacio disponible para almacenamiento en nitrgeno lquido de las unidades criopreservadas.
Dicha reduccin de volumen se consigue por aislamiento de clulas progenitoras y posterior
congelacin de una suspensin de las mismas. La conclusin final de nuestro estudio, despus
de comparar el fraccionamiento con gradientes de densidad y con agentes de sedimentacin es
que la separacin con hidroxietil almidn ofrece los mejores indices de recuperacin celular y la
mxima seguridad para uso clnico. La tcnica de separacin con hidroxietil almidn que hemos
empleado es una modificacin de la descrita originalmente por Rubinstein en 1995, si bien la
eficacia demostrada en nuestro laboratorio es similar a la publicada por ste y otros grupos que
1 40
Discusin
han adoptado la misma tcnica (Rubinstein y cols., 1995; Querol y cols., 1998; Kogler y cols.,
1998b; Regidor y cols., 1999).
A pesar de los buenos resultados comunicados por Harris y cols. (1994a) y Charbord y
cols. (1992) empleando, respectivamente, ficol (1.077 g/rnl) y percol (1.080 g/ml) para separar
SCU, nuestra experiencia con gradientes de densidad es insatisfactoria, ya que se llega a perder
en tomo al 50% de clulas progenitoras. Resultados similares a los nuestros han sido
comunicados por otros autores (Broxmeyer y cols., 1989; Thierry y cols., 1992; Campos y cols.,
1995). La discordancia entre la separacin con ficol (1.077 g/ml) y con histopaque (1.083
gml) en cuanto a recuperacin de clulas CD34~ y progenitores clonognicos (CFU-GM y
BFU-E) que hemos observado en nuestro anlisis, podra ser explicada por algn tipo de
interaccin no conocida entre alguna sustancia de la composicin del histopaque y el anlisis
citomtrico de clulas CD34~ , o bien por una peor eficiencia clonognica de clulas
progenitoras separadas con ficol. En cualquier caso, estos mtodos no demuestran ser
suficientemente reproducibles, y requieren adems transferir la sangre desde la bolsa de
recogida a los tubos donde se lleva a cabo la separacin, aumentando el riego de contaminacin
bacteriana y fngica.
Entre los mtodos de sedimentacin estudiados, la sedimentacin con hidroxietil
almidn al 1.2% ha sido el finalmente elegido para el fraccionamiento de las unidades de SCU,
por cumplir con dos criterios, a nuestro entender, esenciales: i) el uso de este agente no conleva
riesgo para el paciente; u) la recuperacin celular es altamente satisfactoria. As, la
metilcelulosa se ha descartado para el procesamiento de las unidades de SCU al mostrar una
recuperacin celular ligeramente inferior (80-90%) a la de los otros dos agentes, adems de no
ser un producto aprobado para uso clnico, y la gelatina tambin se desestim por razones ya
comentadas anteriormente relativas al riesgo de transmisin de la enfermedad de Creutzfeldt-
Jakob (ver apartado 3.5. de Resultados), aunque la eficacia de separacin celular conseguida es
superponible a la demostrada por el hidroxietil almidn. La recuperacin celular que se
consigue con el procedimiento elegido es superior al 90%, siendo el volumen final de la unidad
criopreservada de 24 ml. La consecuencia inmediata es que el nmero de unidades
141
Discusin
criopreservadas que pueden almacenarse en el mismo depsito de nitrgeno lquido se
multiplica por 5 a 10 veces, dependiendo de la capacidad del sistema de almacenamiento
(Rubinstein y cols., 1995). Excepto las primeras 30 unidades procesadas con gelatina, el resto
de las ms de 400 unidades del Banco de SCU del Hospital 12 de Octubre fraccionadas con
hidroxietil almidn ocupan el espacio correspondiente a la mitad de un depsito de nitrgeno
lquido de 350 l i t r o s de capacidad. Este almacenamiento hubiera sido imposible en tan poco
espacio si las unidades de SCU hubieran sido criopreservadas sin ningn procesamiento previo.
En resumen, el fraccionamiento con hidroxietialmidn permite almacenar un numero
elevado de unidades de SCU en un espacio relativamente reducido, y establecer as un panel de
unidades criopreservadas suficientemente amplio, lo cual resulta esencial para que la SCU
pueda ser una fuente prctica de clulas hematopoyticas para trasplante. La reduccin de
volumen conseguida con la sedimentacin en sistema cerrado con hidroxietil almidn ofrece
ventajas pragmticas de conveniencia, coste y eficacia en comparacin con las alternativas
actuales de separacin con gradientes de densidad o con otros agentes de sedimentacin.
La mayor viabilidad de clulas progenitoras criopreservadas de SCU se consigue
combinando congelacin en bolsa, almacenamiento en nitrgeno lquido y descongelacin
lenta en solucin de albmina/dextrano.
Una de las funciones primordiales de un Banco de SCU consiste en la conservacin
ptima de unidades congeladas durante tiempo prolongado. La reciente descripcin de que el
potencial clonognico de SCU se mantiene ntegro tras 15 aos de criopreservacin (Kobylka y
cols., 1998) despeja muchas incertidumbres y consolida las posibilidades de almacenamiento a
larg plazo de SCU como fuente de clulas hematopoyticas para futuros trasplantes. Los
p r o y e c t o s de c r e a c i n de b a n c o s de SCU comienzan a plantearse aproximadamente una dcada
despus de haberse establecido los principios generales de criopreservacin de MO e iniciado
con xito los primeros ensayos teraputicos de trasplante autlogo (Mazur, 1970; Gorin, 1986).
Dado que la criopreservacin es el nico mtodo capaz de mantener clulas progenitoras viables
142
Discusin
a largo plazo, los avances logrados durante estos aos en el campo de la criobiologa
hematopoytica han posibilitado el desarrollo y establecimiento de los bancos de SCU de una
forma relativamente rpida (Donaldson y cols., 1996; Cao y cols., 1998). Los requerimientos
para una criopreservacin eficaz de MO han demostrado ser aplicables a SCU (Almici y cols.,
1995; Campos y cols., 1995; Donaldson y cols., 1996), como lo haban sido previamente
tambin en el caso de precursores hematopoyticos de 5PM obtenidos por citafresis.
Para establecer el protocolo de crioconservacin de nuestras unidades de SCU, hemos
tenido en cuenta, adems de los requisitos inherentes a esta tcnica (asegurar no solo el
mantenimiento en el tiempo de las propiedades hematopoyticas, sino tambin la integridad de
las clulas tras la descongelacin), determinados aspectos importantes a la hora de aunar las
necesidades de ahorro de espacio y el rendimiento ptimo del proceso. Por tanto, ha sido
esencial establecer los parmetros que definieran tanto la congelacin como la descongelacin
en las condiciones por nosotros elegidas. As, en el proceso de congelacin hemos
interrelacionado: i) el volumen que se va a congelar; u) la cintica de congelacin; iii) la
adicin de agente crioprotector; y iv) la temperatura de almacenamiento de las muestras
criopreservadas.
Como se ha comentado anteriormente, el espacio de almacenamiento puede llegar a
suponer una limitacin importante en el establecimiento del Banco de SCU. Tras un anlisis de
diferentes protocolos, hemos llegado a la conclusin de que la congelacin en bolsas de 24 ml
presena suficientemente bien los progenitores hematopoyticos de SCU, con una eficacia
similar a la congelacin en bolsas de 160 m, siendo ambas a su vez superiores a la congelacin
en criotubos de 4.5 ml. Cabe resaltar el hecho de que la necesidad de este anlisis ha venido
dictada en funcin de que nuestra experiencia en criopreservacin de clulas progenitoras de
MO y 5PM desde hace diez aos es operativa solamente para volmenes de congelacin de 100
a 160 mi (Lamana y cols., 1990). Por ello, este estudio ha comprendido la comparacin de
diferentes formatos y volmenes de congelacin y el anlisis de la viabilidad y recuperacin
celular de SCU criopreservada en volmenes mucho menores, y se ha realizado como requisito
previo al empleo de hidroxietil almidn como procedimiento de rutina para el fraccionamiento
143
Discusin
de SCU. En cuanto a la validez de nuestros protocolos, podemos concluir que la tasa de
recuperacin de CFU-GM es casi del 80%, coincidiendo con las descritas por otros autores
(Broxmeyer y cols., 1989; Harris y cols., 1994a; Almici y cols., 1996).
Otros dos parmetros cuyo estudio se ha hecho imprescindible han sido la velocidad de
congelacin y el efecto del agente crioprotector dimetilsulfxido (DM50). En la
criopreservacin de nuestras unidades de SCU, hemos preferido asegurar la dinmica de
congelacin utilizando programas especficos de congelacin para cada uno de los formatos y
volmenes estudiados, y empleando DM50 a la concentracin ptima del 10%. Nuestro estudio
se ha basado en protocolos establecidos en los que se demuestra que las condiciones ptimas
para la conservacin viable a largo plazo de clulas hematopoyicas incluyen la utilizacin de
DM50 como agente crioprotector en una proporcin final del 10%, una velocidad constante de
congelacin entre 1 y 3
0C por minuto antes y despus de la fase de transicin (cambio de fase
lquida a fase slida), la compensacin del calor de fusin generado durante el cambio de fase, y
el almacenamiento en nitrgeno liquido ( 1960C) para preservar la viabilidad celular de forma
mantenida (Gorin, 1986; Perez-Oteyza y cols., 1998). La importancia de la concentracin al
10% de DM50 y de la velocidad de enfriamiento a 10C/min para la criopreservacin ptima
de SCU ha sido subrayada por Donaldson y cols. (1996). El empleo de equipos de congelacin
programada nos ha permitido controlar la velocidad de enfriamiento y la monitorizacin de todo
el proceso, aunque tambin se han descrito procedimientos de congelacin mecnica no
programada en un refrigerador a 800C capaces de mantener una velocidad ptima de
enfriamiento (Stiff y cols., 1987; Rubinstein y cols., 1993).
Nuestro estudio indica tambin que las unidades criopreservadas requieren desde el
primer momento temperaturas de almacenamiento inferiores a 800C, es decir nitrgeno liquido
( 1960C), o al menos nitrgeno en fase de vapor ( 140C), puesto que la viabilidad celular
decrece de forma muy significativa con el almacenamiento en un congelador mecnico ( 800C).
De estos resultados se deduce la imposibilidad de utilizar cualquier sistema de conservacin no
basado en nitrgeno lquido, ni siquiera durante un periodo transitorio de cuarentena. Estas
consideraciones tendran consecuencias negativas en cuanto a disponibilidad de espacio, en
144
Discusin
caso de requerirse este periodo de cuarentena, durante el cual las unidades pendientes de
pruebas de esterilidad deberan estar fsicamente separadas de las que ya han sido analizadas y
se conoce su negatividad. Sin embargo, y como se ha comentado en el apartado 3.6.3. de
Resultados, dicha necesidad es por lo menos dudosa, puesto que nicamente existen
de s c r i p c i o n e s e s p o r di c a s de t r a n s mi s i n mi c r o b i a n a b o l s a a b o l s a a t r a v s de n i t r g e n o l qu i do
(Hawkins y cols., 1996; Fountain y cols., 1997). No obstante, en aras de la mxima seguridad
para el futuro receptor de un trasplante de SCU, la recomendacin ms extendida es la de
practicar la cuarentena utilizando un contenedor separado de nitrgeno lquido o, en su defecto,
emplear una proteccin externa de la bolsa primaria de congelacin, sellada de tal foma que
impida el intercambio de material entre la muestra de SCU y el nitrgeno lquido (Tedder y
cols., 1995). La conservacin de la unidad en vapor de nitrgeno no parece adecuada para este
fin, porque supone el riesgo de fluctuaciones de temperatura importantes con cada apertura del
depsito de almacenamiento y la subsiguiente prdida de clulas viables.
Todos estos resultados indican que las condiciones de congelacin que hemos
s e l e c c i o n a do p a r a e l f o r ma t o de b o l s a de 24 ml son ptimas, y en la actualidad constituyen el
procedimiento estndar de criopreservacin de las unidades del Banco de SCU.
A esta mayor eficacia de la congelacin en bolsas de 24 m, hay que aadir una serie de
ventajas como son el procesamiento de la muestra en sistema cerrado y el aislamiento hermtico
de las bolsas. Por su parte, las unidades criopreservadas en criotubos, al estar divididas en tres
fracciones de 4.5 mi, permitiran la manipulacin de una parte de la SCU antes del trasplante
con procedimientos de terapia gnica o de expansin ex vivo de progenitores hematopoyticos.
Adems, el espacio requerido para el almacenamiento de criotubos es menor al ocupado por
bolsas, especialmente las de mayor tamao. Sin embargo, el empleo de criotubos implica el
procesamiento de la SCU en un sistema abierto, con el consiguiente riesgo de contaminacin, y
un cierre no hermtico que posibilita la entrada de nitrgeno lquido en el interior del tubo. En
una valoracin de conjunto, hemos considerado prioritarios los factores relativos a la mejor
conservacin de progenitores hematopoyticos, mayor grado de esterilidad y tamao apropiado
de las bolsas de 24 ml para la congelacin y almacenamiento de las unidades de SCU.
1 4 5
Discusin
Finalmente, tambin hemos comparado la descongelacin de SCU criopreservada
mediante dos procedimientos diferentes. La tcnica convencional de descongelacin consiste en
la inmersin de la unidad de SCU en un bao a 37
0C y, en su caso, la reinfusin directa al
paciente a travs de una va central. Con ello se persigue minimizar el dao potencial derivado
del fenmeno de recristalizacin intracelular que tiene lugar en descongelaciones ms lentas, y
reducir el tiempo de exposicin a DM50 al diluirse rpidamente la SCU descongelada en el
torrente circulatorio. Como contrapartida, la infusin intravenosa de DM50 puede acompaarse
de efectos secundarios (vmitos, hipertensin arterial, taquicardia, broncoespasmo). Los
intentos por retirar el DMSO mediante lavado con solucin salina generalmente se han
acompaado de prdidas importantes en la celularidad de las unidades descongeladas
(Broxmeyer y cols., 1989), razn por la que algunos no recomiendan este tipo de
manipulaciones (Broxmeyer, 1995).
Sin embargo, recientemente se ha descrito un nuevo mtodo de descongelacin que
aumenta la viabilidad celular in vitro, c o n s i s t e n t e e n u n a di l u c i n l e n t a de l a u n i da d
descongelada con una solucin de albmina y dextrano, seguida de una centrifugacin para
retirar el sobrenadante (Rubinstein y cols., 1995). El fundamento por el que se propone este
mtodo se basa en una reduccin progresiva de la concentracin extracelular de DM50,
amortigundose de esta manera el choque hipotnico sufrido por las clulas durante la
de s c o n g e l a c i n y r e i n f u s i n di r e c t a . El b e n e f i c i o c l n i c o de e s t e t r a t a mi e n t o h a s i do c o n t r a s t a do
en una serie de trasplantes de SCU, en la que los pacientes reinfundidos con SCU procesada con
este nuevo mtodo experimentaron una aceleracin en la recuperacin de neutrfilos en sangre
perifrica (Kurtzberg y cols., 1996). Nosotros hemos querido comprobar la mayor eficacia de
e s t e s e g u n do m t o do de de s c o n g e l a c i n , o b t e n i e n do u n a r e c u p e r a c i n de p r o g e n i t o r e s
hematopoyticos superior en casi 10 puntos a la conseguida mediante el procedimiento habitual.
Por tanto, nuestros resultados reproducen los descritos inicialmente por Rubinstein y cols.
(1995).
En definitiva, las condiciones para la criopreservacin y descongelacin ptimas de
SCU que se extraen del estudio que hemos realizado incluyen: i) congelacin en bolsas de 24
146
Discusin
ml. con DMSO al 10% y velocidad de enfriamiento de 1
0C/min; u) almacenamiento inmediato
e n n i t r g e n o l qu i do ; y i i i ) de s c o n g e l a c i n l e n t a e n s o l u c i n de a l b mi n a /de x t r a n o . Es t a
combinacin de factores es la que, en nuestra experiencia, permite la mxima recuperacin de
clulas progenitoras tras la criopreservacin de SCU.
El objetivo fundamental que hemos perseguido con la estandarizacin y optimizacin de
los mtodos de obtencin y procesamiento de la SCU ha sido procurar el mximo potencial de
reconstitucin hematopoytica en el conjunto de las unidades depositadas en el Banco. Pero
adems de asegurar un implante rpido y sostenido en los pacientes sometidos a trasplante, las
unidades de SCU disponibles deben estar correctamente tipadas y rigurosamente controladas
p a r a e v i t a r l a t r a n s mi s i n de p o s i b l e s e n f e r me da de s i n f e c c i o s a s o h e r e di t a r i a s . Es t o h a e x i g i do
poner a punto un complejo proceso de validacin de las unidades de SCU que garantice
finalmente la idoneidad de las mismas de cara a un futuro trasplante, y en el que se tienen en
cuenta diferentes aspectos como son el tipaje HLA, la viabilidad y celularidad total, los
antecedentes de trastornos hereditarios en la familia y la esterilidad de la unidad de SCU. En
esta fase de validacin, es una obligacin directa de los responsables del Banco de SCU
asegurar la conformidad con los requerimientos predefinidos relativos a la elegibilidad o no
e l e g i b i l i da d de l a s u n i da de s de SC U p a r a s u a l ma c e n a mi e n t o p e n n a n e n t e .
El t i p a j e H LA p o r t c n i c a s de gentica molecular constituye el mtodo de eleccin y es un
requisitopara la validacin de las unidades de SCU.
La tipificacin de los antgenos HLA en las unidades de SCU de nuestro Banco ha
experimentado con el tiempo una mejora ciertamente importante, habiendo desembocado en el
tipaje HLA de clase 1 y clase II por tcnicas de gentica molecular. En la actualidad, el tipaje
HLA de alta resolucin se contempla como uno de los requisitos que deben reunir las unidades
de SCU, dentro del proceso de validacin desarrollado en nuestro Banco de SCU, para poder ser
consideradas elegibles para trasplante.
1 4 7
Discusin
La determinacin mediante mtodos de DNAde los alelos DRB1 ha sido una prctica de
rutina desde el inicio del Banco de SCU en la bsqueda y seleccin de unidades para trasplante.
Por el contrario, los antgenos HLA-A y -B se han venido definiendo hasta no hace mucho
tiempo nicamente por mtodos serolgicos clsicos, los cuales no son capaces de distinguir
entre ciertas variantes allicas fenotpicamente muy similares que reaccionan con un mismo
antisuero. En el transcurso de este estudio, hemos implementado el tipaje HLA-A y -B de
manera que, en la actualidad, despus de una primera fase de tipaje serolgico, todas las
unidades de SCU de nuestro Banco se tipan en clase 1 y clase II por tcnicas de gentica
mo l e c u l a r , e mp l e a n do p r o c e di mi e n t o s de l a b o r a t o r i o e n c o n f o r mi da d con los estndares de la
Asociacin Europea de Inmunogentica (European Foundation for lmmunogenetics) (Curtoni,
1993). Consideramos que solo de esta manera, al identificar con mayor grado de precisin el
n i v e l de c o mp a t i b i l i da d de l o s t r a s p l a n t e s de SC U, e s p o s i b l e e v a l u a r l a i mp o r t a n c i a c l n i c a de
las diferencias HLA entre donante y receptor. La mayor capacidad resolutiva de las tcnicas
moleculares respecto a las serolgicas en la tipificacin HLA de clase 1 se muestra en un estudio
reciente, en donde se descubren disparidades HLA-A o HLA-B en el 7% y 27%,
respectivamente, de parejas donante/receptor inicialmente compatibles (Scott y cols., 1998). La
importancia clnica de tales diferencias an no est claramente definida. As, existen casos
aislados de trasplantes de MO en los que se han implicado alorespuestas originadas por
diferencias de un solo aminoacido en subtipos HLA-B44, tanto en el rechazo de injerto
(Fleischhauer y cols., 1990) como en la aparicin de EICH (Keever y cols., 1994). Por el
contrario, datos preliminares sobre disparidades a nivel HLA-C y -DQB 1 ponen de manifiesto
qu e e s t a s di f e r e n c i a s n o a f e c t a n a l r e s u l t a do c l n i c o de l t r a s p l a n t e de SC U (El i a y c o l s . , 1 999) .
Por tanto, a pesar de no conocerse an cual es el nivel ptimo de resolucin que debera
perseguirse en el tipaje HLA de las unidades de SCU, creemos que la caracterizacin genotipica
de los loci HLA-A, -B y -DRB 1 permitir una seleccin de parejas donante/receptor ms
apropiada que en la actualidad. Los actuales procedimientos de bsqueda de unidades
c o mp a t i b l e s s o l o c o n t e mp l a n e l t i p a j e s e r o l g i c o de los antgenos HLA-A y -B, adems del
tipaje molecular de alta resolucin a nivel DRB1. Debido a la relativa inmadurez de las clulas
linfoides de SCU, y a la menor incidencia y severidad de EICH observada en los trasplantes de
1 48
Discusin
SCU, generalmente se consideran aceptables diferencias de 1 o 2 antgenos HLA entre la unidad
de SCU y el receptor (Gluckman y cols., 1997; Rubinstein y cols., 1998). Sin embargo, los
datos disponibles se basan sobre todo en estudios multicntricos retrospectivos con regmenes
de acondicionamiento pretrasplante diferentes y sin tipaje molecular de alta resolucin en los
antgenos de clase 1 y II en muchos de los casos, por lo que la relacin que pueda existir entre la
tasa de implante o de EICH y el grado de disparidad HLAno est todava claramente definida.
La determinacin por tcnicas moleculares de los alelos HLA-A, -H y -DRB 1 en las unidades de
SCU facilitar en gran medida la realizacin de este tipo de anlisis y, por tanto, la
identificacin de las unidades ms idneas para receptores de futuros trasplantes de SCU.
Nuestra decisin de tipar molecularmente todas las unidades de SCU como requisito previo a su
v a l i da c i n o b e de c e f u n da me n t a l me n t e a c r i t e r i o s de c a l i da d, y p r e t e n de a s p o de r e v a l u a r c o n
ma y o r e x a c t i t u d l a s c o n s e c u e n c i a s c l n i c a s de r i v a da s de l a di s p a r i da d HL A e n e l t r a s p l a n t e de
SCU.
El estudio de frecuencias allicas y haplotipos HLA en las unidades de SCU que hemos
t i p a do e n n u e s t r o c e n t r o de mu e s t r a u n a c o r r e s p o n de n c i a mu y e s t r e c h a e n t r e l a di s t r i b u c i n
o b s e r v a da e n l a mu e s t r a de SC U y l a e x i s t e n t e e n l a p o b l a c i n e s p a o l a (Ma r t n e z - L a s o y c o l s . ,
1995) Al g u n o s de l o s h a p l o t i p o s i de n t i f i c a do s e n SC U t a mb i n s e e n c u e n t r a n c o n f r e c u e n c i a s
s i mi l a r e s e n p a s e s e u r o p e o s o c c i de n t a l e s (A2 9- B44- DR7 , Al - B8- DR3 y A3 - B7 - DR1 5 ) y
mediterrneos (A33-B14-DRI). Teniendo en cuenta la posibilidad de realizar trasplantes de
SCU con una o dos diferencias HLA sin que exista un riesgo elevado de EICH severa (Wagner y
cols., 1995; Kurtzberg y cols., 1996; Rubinstein y cols., 1998), y de acuerdo con estudios de
simulacin de bsqueda de unidades compatibles de SCU (van Rood y cols., 1998), esta
correspondencia de frecuencias HLA permite prever que con un nmero suficientemente alto
(cercano a 10.000) de unidades recolectadas en Madrid (considerada como una poblacin
representativa de la mayor parte de la poblacin espaola), el Banco de SCU del Hospital 12 de
Octubre podra proporcionar clulas a casi el 90% de los pacientes que necesitaran un trasplante
de SC U e n Es p a a .
1 4 9
Discusin
La eligibilidad final de las unidades de SCU comienza con la seleccin de donantes y
termina con la comprobacin de la viabilidadcelular de las mismas.
Los criterios que hemos establecido para determinar la integridad de las unidades de
SCU y proceder a su almacenamiento definitivo en el Banco de SCU, han sido rigurosamente
observados de acuerdo con una serie de estndares descritos en los procedimientos de trabajo.
La conformidad en todo momento con estos estndares es crucial para el bien de los donantes y
r e c e p t o r e s de t r a s p l a n t e , p a r a l o s r e s p o n s a b l e s de l Ba n c o de SCU y, en ltima instancia, para la
comunidad cientfica y la administracin sanitaria. La adherencia a los criterios de exclusin
de f i n i do s e n l o s p r o c e di mi e n t o s n o r ma l i z a do s de t r a b a j o h a s i do c o mp r o b a da de f o r ma
sistemtica e independiente por dos miembros del Banco, de forma que solamente se han
introducido en la base de datos del Banco de SCU las unidades que cumplan todos los criterios
de elegibilidad para un almacenamiento permanente. Dichas unidades son las que finalmente
han sido registradas en el REDMO, a travs del envo de los datos bsicos pertinentes.
El proceso de validacin, como se ha indicado previamente, considera toda deficiencia o
variacin que pudieran darse respecto de los estndares en cualquiera de las fases del
procesamiento de las unidades de SCU, y conduce a una seleccin cuidadosa de las mismas en
base a un nmero amplio de posibilidades de exclusin. El control realizado antes de la
donacin muestra que un 32% de potenciales madres/donantes son descartadas para la
obtencin de SCU, fundamentalmente por causas de naturaleza obsttrica, riesgo de infeccin
neonatal, o sufrimiento fetal. El motivo ms frecuente de exclusin de las unidades ya recogidas
h a s i do l a c o n t a mi n a c i n b a c t e r i a n a , qu e e n t o do e l p e r i o do de e s t u di o h a s u p u e s t o u n 9%, s i
bien hay que sealar que al extremar las medidas de asepsia en la maniobra de puncin de la
vena umbilical, hemos logrado disminuir esta cifra al 4.7%. Por ltimo, una vez
criopreservadas, en la revisin final de los datos correspondientes a cada una de las unidades, la
viabilidad celular inferior al 80% tras aadir el DMSO ha sido el criterio que con ms
frecuencia ha motivado la no elegibilidad de unidades almacenadas (un 65% de las unidades
e x c l u i da s e n e s t a f a s e ) .
1 50
Discusin
El resto de las exclusiones han sido motivadas por causas de diversa ndole, incluida la
deteccin de marcadores de hepatitis B y C en el suero de la madre en un pequeo porcentaje.
Por el contrario, las tasas de inmunidad materna frente a citomegalovirus y toxoplasma
demostradas en nuestra serie son relativamente elevadas, similares a las descritas en una
poblacin de mujeres embarazadas de una localidad cercana a Madrid (Prez-Rivilla y cols.,
1996), sin que a pesar de ello hayamos detectado nign caso de infeccin congnita producida
por alguno de estos dos patgenos. Teniendo en cuenta la baja incidencia de infeccin
congnita por CMV (0.3%) y que la mayora de los casos se producen en el contexto de una
infeccin recurrente materna (Prez-Rivilla y cols., 1996), y asimismo que la toxoplasmoss
c o n g n i t a e s i g u a l me n t e mu y p o c o p r e v a l e n t e (s e e s t i ma , a u n qu e n o e x i s t e n da t o s p r o c e de n t e s
de estudios reglados, que es inferior al 0.1%), consideramos cuestionable la utilidad de la
serologa materna para investigar una posible infeccin de SCU por alguno de estos dos
agentes. El cultivo de orina o saliva neonatal se utiliza en otros Bancos de SCU para descartar
infeccin congnita por CMV (Rubinstein y cols., 1993). Sin embargo, creemos que la
a p l i c a c i n de t a l e s me di da s de de s p i s t a j e a t o da s l a s do n a c i o n e s t i e n e u n a r e n t a b i l i da d r e du c i da ,
y podran ser sustituidas por la deteccin de estos patgenos nicamente en las unidades de
SCU seleccionadas para trasplante, mediante PCR o tcnicas de probada sensibilidad.
Por ltimo, nuestro estudio muestra que el control a los 90 das del parto puede ser de
gran importancia, an cuando el hallazgo de causas de exclusin no detectadas en el momento
del parto sea estadisticamente poco significativo. En efecto, la rentabilidad en trminos de
seguridad microbiolgica que proprociona este anlisis es muy baja, pues aunque el 7.3% de las
madres/donantes mostraron seroconversin frente a citomegalovirus o toxoplasma, todas
consistieron en una aparente ms que verdadera seroconversin, como as lo indican los niveles
reducidos de las correspondientes IgGs. Adems, solo en un caso se detect positividad para
hepatitis C, lo cual, desde un punto de vista estadstico, es poco relevante, pero quizs sea
suficiente para plantear la disyuntiva entre tener que efectuar este control postparto para
asegurar la mxima proteccin, o bien tener que asumir un riesgo derivado de la falta de dicho
c o n t r o l . De s g r a c i a dme n t e , l a a u s e n c i a de l a e v a l u a c i n p o s t p a r t o e n u n a p r o p o r c i n
considerable de madres/donantes (59%) introduce un elemento de conflicto en lo que se refiere
1 51
Discusin
a la posible utilizacin para trasplante de las unidades de SCU no controladas. No todos los
centros realizan esta segunda evaluacin y, por tanto, no la consideran una exigencia para la
validacin final y uso de las unidades en un eventual trasplante.
Otro aspecto adicional que, en nuestra opinin, confiere an mayor importancia a esta
evaluacin es la posibilidad de confirmar e incluso resolver el tipaje HLA de la unidad
almacenada, ya que en el periodo postparto no es posible hacer dicho tipaje por tcnicas
serolgicas hasta en un 17% de los casos, debido a la presencia de anticuerpos anti-HLA
matemos. Por lo tanto, es necesario plantear frmulas para potenciar este control a los 90 das
del parto, reforzando ante las madres/donantes de SCU la necesidad de garantizar la mxima
seguridad a los futuros receptores de trasplante y, al mismo tiempo, la importancia de descartar
enfermedades potencialmente severas (SIDA, hepatitis B, hepatitis C, hemoglobinopatas,
enfermedades autoinmunes, etc.) que podran no ser detectadas sin la prctica del control de
cuarentena.
Con estos criterios, y como hemos comentado en un principio, 139 unidades de SCU han
podido ser validadas y remitidas al REDMO, lo cual identifica al Banco de Sangre de Cordn
Umbilical del Hospital 12 de Octubre, establecido en base a los procedimientos descritos en esta
t e s i s , c o mo e l c u a r t o Ba n c o de SC U de l o s e x i s t e n t e s e n Es p a a (Me mo r i a An u a l s o b r e
Tr a s p l a n t e de Pr o g e n i t o r e s He ma t o p o y t i c o s de l a ONT, 1 998) , y e n t r e l o s di e z b a n c o s
e u r o p e o s c o n ma y o r n me r o de u n i da de s de SC U di s p o n i b l e s p a r a t r a s p l a n t e .
152
CONCLUSIONES
Conclusiones
CONCLUSIONES
1 . - L a SC U mu e s t r a u n a ma y o r p r o p o r c i n de c l u l a s p r i mi t i v a s C D3 4~/C D3 8YDW y u n a
ma y o r p r o l i f e r a c i n de c l u l a s p r o g e n i t o r a s c l o n o g n i c a s e n c o mp a r a c i n c o n MO y 5 PM de l
a du l t o , l o qu e s u g i e r e u n ma y o r p o t e n c i a l de r e p o b l a c i n h e ma t o p o y t i c a .
2.- El e s t u di o de l a s c l u l a s l i n f o c i t a r i a s de SC U c o n f i r ma u n a r e l a t i v a i n ma du r e z f e n o t p i c a y
f u n c i o n a l de l a s mi s ma s , l o qu e p e r mi t e p r e de c i r u n me n o r p o t e n c i a l de e n f e r me da d i n j e r t o
c o n t r a h u s p e d a s o c i a do a l a SC U.
3.- Con la combinacin de puncin de la vena umbilical y perfusin de la placenta, se ha
c o n s e g u i do i n c r e me n t a r l a r i qu e z a c e l u l a r de l a s u n i da de s e n u n 1 5 % qu e , a de m s , e s
e s t a d s t i c a me n t e p r e de c i b l e p o r e l p e s o de l r e c i n n a c i do . En n u e s t r o Ba n c o , e l p o r c e n t a j e de
unidades de SCU potencialmente trasplantables a individuos de ms de 65 kg asciende al 41%.
4 . - En las condiciones de recoleccin empleadas, la viabilidad celular y la clonogenicidad de la
SCU disminuyen significativamente en funcin del tiempo transcurrido entre la obtencin y el
procesamiento de las unidades. La prdid celular puede llegar hasta el 20% cuando el intervalo
e s ma y o r de 1 2 h o r a s .
5 . - El e s t u di o c o mp a r a t i v o de di s t i n t o s p r o t o c o l o s de s e p a r a c i n c e l u l a r , c o n g e l a c i n ,
a l ma c e n a mi e n t o y de s c o n g e l a c i n de SC U h a c r i s t a l i z a do e n l a e s t a n da r i z a c i n de m t o do s de
p r o c e s a mi e n t o b a s a da e n e l e mp l e o de h i dr o x i e t i l a l mi d n , b o l s a s de 2 4 mi , i n me r s i n e n
n i t r g e n o l qu i do y s o l u c i n de a l b mi n a /de x t r a n o , r e s p e c t i v a me n t e , qu e c o n s i g u e n e n c o n j u n t o
p r e s e r v a r c a s i e l 90% de l p o t e n c i a l h e ma t o p o y t i c o de l a s u n i da de s .
6.- La distribucin de frecuencias allicas y de haplotipos HLA observada es comparable a la
e x i s t e n t e e n l a p o b l a c i n e s p a o l a . L a t i p i f i c a c i n de a l e l o s HL A- A, - B y - DRi B 1 p o r t c n i c a s
de g e n t i c a mo l e c u l a r , j u n t o c o n e l r e s t o de c r i t e r i o s de v a l i da c i n a p l i c a do s , g a r a n t i z a n l a
i do n e i da d de l a s u n i da de s de SC U y l a s e l e c c i n de p a r e j a s do n a n t e /r e c e p t o r c o n ma y o r g r a do
de p r e c i s i n qu e e n l o s p r o t o c o l o s de t r a s p l a n t e s e g u i do s e n l a a c t u a l i da d.
7.- Como consecuencia de este estudio, se ha establecido un Banco de SCU en el Hospital 12 de
Octubre de Madrid con la inclusin, hasta el momento, de 139 unidades validadas y
p o t e n c i a l me n t e e l e g i b l e s , e n e l c o n t e x t o de l REDMO, p a r a s u u t i l i z a c i n c o mo f u e n t e de c l u l a s
p r o g e n i t o r a s h e ma t o p o y t i c a s p a r a t r a s p l a n t e .
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1 79
ANEXOS
Anexo 1
BANCO DE SANGRE DE CORDN UMBILICAL
HOSPITAL 12 DE OCTUBRE
Ctra AIlDALUCAIt 3 . 4 , 2 80 4 1 IODRfl
Dt. R. BORNSTEIN Tfno:91 3 90 8 4 1 9; Fa: 91 3 90 8 3 5 8
Dra. F. GILSAiIZ Tfno:91 3 90 8 65 4 ; Faie 91 3 90 8 3 5 8
HOJA DE INFORMACIN SOBRE LA DONACIN
DE SANGRE DE CORDN UMBILICAL
E n l a s p r i m e r a s h o r a s d e v i d a , l a s a n g r e d e l r e c i n n a c i do c o n t i e n e g r a n c a n t i da d de c l u l a s
p r o g e n i to r a s s i m i l a r e s a l a s q u e r e s i d e n e n l a m d u l a s e a , e s p e c i a l i z a d a s e n l a r e n o v a c i n
p e r m a n e n te d e l a s c l u l a s m a d u r a s d e l a s a n g r e (l e u c o c i to s , h e m a t e s y p l a q u e ta s ). E s ta s
c l u l a s p u e d e n o b te n e r s e d e s p u s d e l n a c i m i e n to a p a r ti r d e l a s a n g r e c o n te n i d a e n e l c o r d n
u m b i l i c a l , sin que ello ocasione ningn perucio para la madre ni para el nio, y s e r
tr a s p l a n ta d a s e n p a c i e n te s c o n e n f e r m e d a d e s d e m d u l a s e a q u e n o d i s p o n e n d e d o n a n te . L o s
r e s u l ta d o s te r a p u ti c o s c o n tr a s p l a n te d e s a n g r e d e c o r d n u m b i l i c a l s o n m u y p r o m e te d o r e s .
L o s b a n c o s d e s a n g r e d e c o r d n p r e te n d e n d i s p o n e r d e u n n m e r o a l to d e d o n a c i o n e s p a r a l a
r e a l i z a c i n d e e s te ti p o d e tr a s p l a n te s , y s u o b j e ti v o e s c o n f i r m a r l a s e x p e c ta ti v a s g e n e r a d a s c o n
e s te n u e v o tr a ta m i e n to . P a r a l l e v a r a c a b o s u ta r e a n e c e s i ta n d e l a c o l a b o r a c i n d e m u c h a s
p e r s o n a s , p o r l o q u e l e p r o p o n e m o s s u p a r ti c i p a c i n , a c e p ta n d o d o n a r d e s i n te r e s a d a m e n te l a
s a n g r e d e l c o r d n u m b i l i c a l d e s p u s d e l n a c i m i e n to d e s u h i j o p a r a c u a l q u i e r p a c i e n te q u e
p r e c i s e u n tr a s p l a n te d e e s te ti p o .
In te r s te r a p u ti c o d e l a s a n g r e d e c o r d n :
T o d o s l o s a o s , m i l e s d e p e r s o n a s d e s a r r o l l a n u n a e n f e r m e d a d g r a v e d e l a m d u l a s e a o
n a c e n c o n a l te r a c i o n e s g e n ti c a s d e l a m i s m a q u e c o m p r o m e te n s u v i d a . P a r a e l l o s , l a n i c a
p o s i b i l i d a d d e c u r a c i n e s u n tr a s p l a n te d e m d u l a s e a . L o s m e j o r e s r e s u l ta d o s s e p r o d u c e n
c u a n d o e l d o n a n te d e m d u l a s e a e s c o m p a ti b l e c o n e l p a c i e n te . E s e d o n a n te s e b u s c a
h a b i tu a l m e n te e n tr e l o s h e r m a n o s d e l p a c i e n te , o a p a r ti r d e u n a l i s ta d e d o n a n te s v o l u n ta r i o s .
L a m e n ta b l e m e n te , s o l o s e e n c u e n tr a n d o n a n te s c o m p a ti b l e s e n e l 30% d e l o s e n f e r m o s .
L a r e a l i z a c i n d e u n tr a s p l a n te d e m d u l a s e a i n c o m p a ti b l e c o m p o r ta r i e s g o s m u y i m p o r ta n te s
p a r a e l p a c i e n te . L a s c l u l a s d e s a n g r e d e c o r d n u m b i l i c a l s o n inmunolgicamente ms
inmaduras, l o q u e p e r m i te r e a l i z a r tr a s p l a n te s aunque no sean totalmente compatibles s i n u n
r i e s g o ta n e l e v a d o c o m o c u a n d o s e tr a s p l a n ta m d u l a s e a .
L a s a n g r e d e c o r d n u m b i l i c a l e s u n a n u e v a f u e n te d e tr a s p l a n te , c o n u n a s caractersticas
biolgicas especiales. T o d o e l l o f a c i l i ta e l q u e p u e d a n b e n e f i c i a r s e d e l a p o s i b i l i d a d d e u n
tr a s p l a n te c a d a v e z m a y o r n m e r o d e p a c i e n te s . L a v e n ta j a a d i c i o n a l d e l a s a n g r e d e c o r d n
u m b i l i c a l e s q u e e s t d i s p o n i b l e e n u n B a n c o d e C o r d n , l o c u a l s i g n i f i c a q u e puede ser
trasplantada inmediatamente, e v i ta n d o r e tr a s o s q u e s o n c r ti c o s e n m u c h o s e n f e r m o s e n
e s p e r a d e tr a s p l a n te .
Procedimiento de la donacin de la sangre de cordn umbilical
L a s a n g r e de c o r d n u mb i l i c a l s e r e c o g e de s p u s de l n a c i mi e n t o de l n i o y t r a s l a s e c c i n de l
c o r d n u mb i l i c a l . Pa r a e l l o , s e r e a l i z a u n a s i mp l e p u n c i n de l c o r d n u mb i l i c a l mi e n t r a s qu e l a
p l a c e n t a e s t t o da v a e n e l t e r o . Sepa Ud. que esta recogida no comporta ningn peligro,
ni para usted, ni para su hijo.
Pa r a l a do n a c i n de l a s a n g r e de c o r d n r e s u l t a i mp r e s c i n di b l e r e a l i z a r :
1 . - Un a h i s t o r i a c l n i c a de t a l l a da a c e r c a de l a s p o s i b l e s e n f e r me da de s de l o s p a dr e s de
n a t u r a l e z a i n f e c c i o s a o h e r e di t a r i a , qu e c o n t r a i n di qu e n e l e mp l e o de l a s a n g r e de c o r d n .
2 . - L a r e a l i z a c i n a l a ma dr e e n e l mo me n t o de l p a r t o , y o p c i o n a l me n t e t r e s me s e s de s p u s ,
de u n a n l i s i s de s a n g r e p a r a de s c a r t a r c u a l qu i e r p r o c e s o i n f e c c i o s o qu e p u di e r a s e r
t r a s mi s i b l e a l a s a n g r e de c o r d n , e n e s p e c i a l e l t e s t de l a h e p a t i t i s 8, e l t e s t de l a
h e p a t i t i s O, y e l t e s t de l V I H de l SI DA.
3 . - Un e x a me n c l n i c o de l r e c i n n a c i do , y o p c i o n a l me n t e t r e s me s e s de s p u s , p o r u n
p e d i a tr a .
C u a l qu i e r r e s u l t a do p a t o l g i c o qu e s e de mu e s t r e e n l o s e s t u di o s r e a l i z a do s c o n mo t i v o de l a
d o n a c i n d e l a s a n g r e d e c o r d n u m b i l i c a l s e l e c o m u n i c a r a U d . d e b i d a m e n te p o r e l m d i c o
r e s p o n s a b l e .
L a s a n g r e d e c o r d n u m b i l i c a l o b te n i d a c o n m o ti v o d e l a d o n a c i n s e r e m p l e a d a p a r a l a
r e a l i z a c i n d e u n tr a s p l a n te a c u a l q u i e r p a c i e n te a n n i m o d e l m u n d o q u e l o p r e c i s e , s i n o tr a
p r e f e r e n c i a q u e l a m e j o r c o m p a ti b i l i d a d p o s i b l e e n tr e d o n a n te y r e c e p to r .
L o s d a to s s o b r e l a s a n g r e d e c o r d n s e r n i n c l u i d o s d e f o r m a c o d i f i c a d a e n l a s b a s e s d e d a to s
de n u e s t r o b a n c o y l a i n f o r ma c i n p o dr s e r i n t e r c a mb i a da c o n o t r o s da t o s s i mi l a r e s de o t r o s
p a i s e s . Todos los datos sern tratados de forma confidenciaL E s to s c r i te r i o s d e
c o n f i d e n c i a l i d a d ti e n e n c o m o c o n tr a p a r ti d a l a i m p o s i b i l i d a d d e s a b e r c u n d o s e r u ti l i z a d a s u
d o n a c i n , p a r a q u p a c i e n te y c o n q u r e s u l ta d o .
P u e d e o c u r r i r q u e l a u n i d a d d e s a n g r e d e c o r d n u m b i l i c a l n o r e n a l o s r e q u i s i to s m n i m o s p a r a
s e r p r o c e s a d a (p o r e j e m p l o , q u e e l c o n te n i d o d e c l u l a s s e a i n s u f i c i e n te ). E n e s e c a s o , l a u n i d a d
o b te n i d a no se guardar en el Banco de Sangre de Cordn, y p o d r s e r d e s e c h a d a o ,
a l te r n a ti v a m e n te , u ti l i z a d a c o n f i n e s i n v e s ti g a c i o n a l e s .
N o s e e n tr e g a r n i n g u n a i n d e m n i z a c i n e c o n m i c a n i d e n i n g n o tr o ti p o p o r l a d o n a c i n d e l a
s a n g r e de c o r d n u mb i l i c a l .
Anexo II
BANCO DE SANGRE DE CORDN UMBILICAL
HOSPITAL 12 DE OCTUBRE
Otra. M~DALUOAIt 5 . 4 . 2 80 4 1 !O. flRID
Dr. RaORNSTEIU Tfno:91 3 90 8 4 1 9; Fax: 91 3 90 8 3 5 8
Dra. F. GILSABZ Tfno:91 3 90 8 65 4 ; Fax: 91 3 90 8 3 5 8
CONSENTIMIENTOINFORMADO
PARA LA DONACIN VOLUNTARIA
DE SANGRE DE CORDN UMBILICAL
F e c h a :________________
O a :
D N I E d a d c o n d o m i c i l i o e n _______________
E n l a c a l l e
C di g o Po s t a l _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ C i u da d_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
P r o v i n c i a _________________________T e l f o n o _________________________
N o m b r e d e l a p e r s o n a q u e i n f o r m _____________________________________
De c l a r o qu e :
E n ti e n d o q u e l a s a n g r e d e c o r d n u m b i l i c a l q u e c o n s i e n to e n d o n a r c o n
l a f i r m a d e e s te d o c u m e n to , s e r u ti l i z a d a p a r a r e a l i z a r u n tr a s p l a n te p a r a
c u a l q u i e r p a c i e n te a n n i m o q u e a s l o p r e c i s e .
En t i e n do qu e l a i n f o r ma c i n r e f e r e n t e a mi p e r s o n a y a l a de mi h i j o /a
s e r tr a ta d a d e f o r m a c o n f i d e n c i a l y c o d i f i c a d a d e f o r m a q u e q u e d e
p r o te g i d a m i i d e n ti d a d y l a d e m i h i j o / a .
C o n s i e n t o qu e s e r e a l i c e u n e x a me n c l n i c o a mi h i j o e n e l mo me n t o de l
n a c i m i e n to y o p c i o n a l m e n te d e s p u s d e l o s 3m e s e s p o r u n p e d i a tr a .
C o n s i e n t o e n qu e s e me e x t r a i g a u n a mu e s t r a de s a n g r e p a r a l a
r e a l i z a c i n de l o s a n l i s i s e x i g i b l e s (V I H- SI DA, He p a t i t i s B, He p a t i t i s C ,
S f i l i s , T o x o p l a s m o s i s y C i to m e g a l o v i r u s ) e l d a d e l p a r to y o p c i o n a l m e n te
d e s p u s d e l o s 3m e s e s .
E n ti e n d o q u e c u a l q u i e r r e s u l ta d o p a to l g i c o e n l o s e s tu d i o s r e a l i z a d o s
a m o a m i h i j o / a c o n m o ti v o d e l a d o n a c i n d e l a s a n g r e d e c o r d n m e
s e r n e c e s a r i a me n t e c o mu n i c a do p o r e l m di c o r e s p o n s a b l e .
H o j a n
2 2
- En t i e n do qu e e s t e c o n s e n t i mi e n t o n o o b l i g a a l a r e c o g i da de l a s a n g r e
d e c o r d n u m b i l i c a l s i l a s c i r c u n s ta n c i a s d e l p a r to n o s o n l a s i d n e a s .
- En t i e n do qu e l a s a n g r e de c o r d n u mb i l i c a l r e c o g i da p u e da n o s e r
a de c u a da p a r a t r a s p l a n t e y , e n e s e c a s o , s e r de s e c h a da o u t i l i z a da c o n
f i n e s i n v e s ti g a c i o n a l e s .
- E n ti e n d o q u e n o r e c i b i r n i n g u n a c o m p e n s a c i n e c o n m i c a n i d e n i n g n
o tr o ti p o p o r l a d o n a c i n .
- C o n s e r v o l a p o s i b i l i da d de r e n u n c i a r a e s t e c o n s e n t i mi e n t o e n c u a l qu i e r
m o m e n to h a s ta e l n a c i m i e n to d e m i h i j o , s i n q u e te n g a q u e d a r e n s u
c a s o n i n g n t i p o de e x p l i c a c i n .
- H e l e d o y c o m p r e n d i d o to d a l a i n f o r m a c i n d a d a , e s to y s a ti s f e c h a d e l a
i n f o r m a c i n r e c i b i d a , h e p o d i d o f o r m u l a r to d a s l a s p r e g u n ta s q u e h e
c r e d o c o n v e n i e n te y m e h a n a c l a r a d o to d a s l a s d u d a s p l a n te a d a s .
E n c o n s e c u e n c i a , d o y m i c o n s e n ti m i e n to p a r a l a d o n a c i n d e l a s a n g r e
d e c o r d n u m b i l i c a l .
F i r ma de l a p e r s o n a qu e i n f o r m :
F i r m a d e l a d o n a n te :
Anexo III
BANCO DE SANGRE DE COED N UMBILICAL
HOSPITAL 12 DE OCTUBRE
Otra. MmALDCA
Dr R. BOENSTRIN
Dra.F.GXLSAfl
It 5 . 4 . 2 80 4 1 IO. DRID
Tfno:91 3 90 8 4 1 9; rn: 91 3 90 8 3 5 8
Tfno:91 3 90 8 65 4 ; Fax: 91 3 90 8 3 5 8
PROTOCOLODEEXTRACCIN DESANGRE DECORDN UMBILICAL
1- RECOGIDADE DATOS DEBANCODESANGRE
Nombre:
N~ Historia:
Domicilio:
Lugar de nacimiento (Pas)
SCU N
0:
Edad:
Telfono:
Raza:
1 . - N~ de embarazos previos:
2.- N2 de hijos vivos: _____________
3 . - Ha t e n i do h i j o s c o n ma l f o r ma c i o n e s , a l g u n a
enfermedad congnita o subnormalidad?
4.- Hbitos txicos:
4. 1 . Ta b a c o
4 .2. Alcohol
4 .3. Drogas
4.4. Medicamentos
S ___ No
S ___ No
C i g a r r i l l o s / d a
Cantidad:
S ___ No
S ___ No
Cules?:
5 .- Presenta historia de malformaciones, abortos, o anemia en su familia o en la de su marido?
(subrayar la respuesta afirmativa)
6. - Pa de c e a l g n t i p o de e n f e r me da d e n e l mo me n t o a c t u a l ? :
7.- Serologa durante el embarazo : (indicar Pos o Neg)
7.1. Ag-HBs:______ 7.2. Anti-VHC:______
7.3. Anti-VIH:
8.- Grupo sanguneo y Rh:
9.- Escrutinio de anticuerpos irregu]ares
1 0.- Se extrae muestra para serologa
Positivo Negativo
S ___ No ___
NOTA: Si la respuesta en 3, 4.3., 7.1., 7.2., 7.3. 9 es afirmativa o positiva,
protocolo
Fecha:
no continuar con el
Firmado:
S
No __
Hoja n9 1
II- RECOGIDADEDATOS DEPARITORIO
1.- Seleccin de donantes: Neonatos sanos a trmino, nacidos de parto vaginal.
Causas de exclusin
:
1 .1 Parto prematuro (<32 semanas de gestacin).
1.2 Rotura de bolsa de liquido amnitico de ms de 12 horas
1.3. Fiebre materna (> 38
0C)
1.4. Presencia de meconio en el liquido amnitico.
1.5. Sospecha de sufrniento fetal.
1 .6. Anemia materna (Hb .c 10.5 g/dL)
1.7. Anticuerpos irregulares en la madre.
1.8. Cesrea.
1.9. Serologa positiva:
Toxoplasmosis
Rubeola
CMV
Anti-VIH
Anti - VHC
A g -H IB s
Lues (RPR)
1.10. Otros:
IgM (la positividad para IgG no es causa de exclusin)
IgiN4 ( )
IgM____ ( )
Pos
Pos
Pos
Pos ___
Neg
Neg
Neg
Neg
2.- Existe alguna anomala evidente
etc? S____ No____ Cul?
en el recin nacido: malformaciones, disfuncin orgnica,
3.- Se ha utilizado anestesia epidural? S___ No ___
el parto
Otras medicaciones administradas durante
4 .- Se realiza recogida de sangre de cordn en bolsa?
5.- Planta y habitacin de ingreso:
SI NO
S ___ No
Fecha y hora de parto:
Firmado:
BANCO DE SANGRE DE CORDON UMBILICAL
NOSPITAL 12 DE OCTIJERE
Ctra MZDALUCIA It 5 . 4 . 2 80 4 1 WDRID
Dr. R. BORflBTEIN ?fno;91 3 90 8 4 1 9; Fax: 91 3 90 8 3 3 8
Dra. F. GILSMJZ Tfno:91 3 90 8 65 4 ; Fax: 91 3 90 8 3 5 8
PROTOCOLO DEEXTRACCIN DESANGRE DE CORDN UMBILICAL
1- RECOGIDADEDATOS DEL RECTENNACIDO
Nombre de la madre:
Edad:_______________ N
2Historia:
1- Peso: _______
2- Sexo: _______
3- APUAR: 1 _____
5
4 - Grupo sanguneo: ________ CD: _________
5- Examen fsico del recin nacido:
5.1 Estado general
5.2 Movnientos espontneos
5.3 Reaccin a estmulos
5.4 Llanto
5.5 Color
5.6 Piel, pelo, uas
5.7 Respiracin
5.8 Cabeza
5.9 Cara
5.10 Ojos
5.1 1 Odos
5.12 Nariz
5.1 3
5.14
5.15
5.16
5.17
5.18
5.19
5.2 0
5.21
5.2 2
5.23
5.24
Paladar
Cuello
Trax
Corazn
Pulmones
Abdomen
Cordn, ombligo
Genitales
Ano
Espalda
Ex t r e mi da de s
Neurolgico
Patologa:
Fecha y hora del reconocimiento:
Firmado:
SCU N~ :
Hojan93
II- RECOGIDADEDATOS DESEROLOGAY LACTANTE
Nombre de la madre:
Edad:______________
1- Serologa en el parto:
VIH
VHC:
HBsAg
Toxoplasma:
CMV:
Sfilis
2- Serologa a los 3
VIH
VHC:
HiBsAg:
Toxoplasma
CMV:
Sfilis
meses:
N
9Historia:
Fecha:
Fecha:
3- Estado clnico del lactante:
Estudio metablico: Negativo: Positivo:_______
Ha presentado algn tipo de patologa importante desde el momento del parto hasta el
momento actual?: S:______ No:______
En caso afirmativo Cul ha sido?____________________________________________
Fecha:
Firmado:
Anexo IV
BANCO DE SANGRE DE CORDON UNE ILICAL
HOSPITAL 12 DE OCTUBRE
Otra. MDALUCIA ni 5 . 4 . 2 80 4 1 MADRID
Dr. R. BOflSTEIN Tfno:91 3 90 8 41 9; Fax: 91 3 90 8 3 5 8
Dra. F. GILSANZ Tfno:91 3 90 8 65 4 ; Fax: 91 3 90 8 3 5 8
RECOGIDADEDATOS DELFRACCIONAMIENTO Y CRIOPRESERVACIN
SCU n~ Cdigo
Recogida de la sangre: Fecha
Hora
Procesamiento: Fecha
Sangre conservada a _______ ~ Cdurante
Datos de la madre:
Apellidos
W Clinica n
2 Origen tnico
HLA:
Microbiologa
a los tres meses
Hepatitis B:
Hepatitis C:
vm 1y2:
Sfilis:
Toxoplasmosis:
CMV:
Muestra Inicial:
Volumen (mi): __________ volumen procesado:
Conc. leucoc.(x106 /ml)
Leucoc.totales (x109)
CMN: ____
Control microbiolgico:
Leucoc. procesados (KW9)
CMIN totales (xlOt: __________
Grupo ABO, Rh:
Hora
Horas.
Nombre
Serologa: Retipaje
Hoja n2 4
Fraccionamiento con HES 6% (Grifols)
Leucoc. (x10
6/ml.): ________ Vol. ml Vol. para mezclar _________
Leucoc. totales recuperados (xlOt: __________ Leucoc. para mezclar _________
Rendniento fraccionamiento: (leucoc. recuperados / leucoc. procesados):
CD34: __________% CD34 totales (x106): ______________________
CFU-GM(5x104 cel):________ CFU-GMtotales (xlOt:___________________
BFU-E (5x104 ccl): BFU-Etotales (xlO%:______________________
CFU-GEMM (5x104 ccl): _______ CFU-GEMM totales (x104): _______________
FILA:
Congelacin. Muestra fmal (Mezcla)
Concentracin Leucoc.(x106/ml):_________ Viabilidad (azul tripan): _______
Almacenamiento.: Recipientes Localizacin
SCU: __________ __________________
Suero Materno: ______________ ________________________
DNA Cordn: ______________ ________________________
Plasma Cordn: ______________ ________________________
Cl. congeladas: _________________________
Descongelacin.
Bolsas: Fecha _______________ Viabilidad: (azul tripan) __________
Concentr. celular (x106/ml): __________ Leucoc. totales (x l0~ ): __________
Rendimiento criopreservacin: (leucoc. descongelacin / leucoc. HES)________
CFU-GM(Sx1 O4cel.): __________ CFU-GMtotales (xlO%: _______ Rend.:______
BFU-E(5x104 ccl.): ___________ BFU-E totales (xlOt: _________ Rend.:______
CFU-GEMM(5x104 cel): ______ CFU-GEMM totales (xlO%: Rend.:_____
Tubos 1,8 mi: Fecha Estudio: __________________________
Suero Materno: Fecha ____________ Estudio: ____________________________
DNACordn: Fecha ____________ Estudio: ____________________________
Plasma Cordn: Fecha Estudio:
Anexo V
BANCO DE SANGRE DE CORDON UMBILICAL
HOSPITAL 12 DE OCTUBRE
Cta. A3 DALUCAIt 5 . 4 , 2 80 4 1 MADRID
Dr. R. EORNBTEIN flfno 91 3 90 8 4 1 9; Fax: 91 3 90 8 3 5 8
Dra. F. GILSAflZ Tfno:91 3 90 8 65 4 ; Fax. 91 3 90 8 3 5 8
SOLICITUD DE BSQUEDA
Apellidos: Nombre: _____________________ Fecha: ___________
Fecha nacimiento: ______________________ Raza Pas de origen:
Sexo: Masc: 2 Fem: 2 Peso corporal (kg): ABO: _______ Rh: _______
Di a g n s t i c o y Es t a di o :_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ F e c h a de l Di a g n s t i c o :_ _ _ _ _ _ _ _ _ _
Ti p a j e HL A de l Pa c i e n t e
Antgenos: A: _________ B: _________ C: _________ DR: _________________ DO: ________________
Laboratorio HLA: __________________________________ Fecha del anlisis: ______________
NOTA: POR FAVOR adjntese el INFORME DEL ESTUDIO HLA
NOTA: En caso de localizarse una unidad compatible, se requerir un tipaje de confirmacin
Mdico Responsable: __________________________ BSQUEDA DE DONANTE DE MDULA
Centro de Trasplante: __________________________ Preliminar 2 Fecha: ____________
Direccin: ____________________________________ Formal J Fecha de inicio: ____________
Donante Compatible: S 2 NO 2
Telfono: ______________ Fax: _________________
Tipaje Familiar (POR FAVOR adjntese el INFORME DEL ESTUDIO HLA)
[PAREN
TESCOj NOMBRE] lILA -A ] HLA -5 ]MLA-C DR 1 DO
Madre
Padre
Hermano [1]
Hermano [2 ]
Hermano [3]
Hermano 14]
Comentarios sobre la Urgencia y otras consideraciones especiales: _____________________
En v i a r l a s solicitudes al Dr. Rafael Bornstein, Tfno 390-8 419; Fax 390-8 358 , o a la Dra.
G i l s a n z , Tf n o 3 90- 865 4; F a x 3 90- 83 5 8.
Florinda
Por favor, comuniquenos si no fuera necesario continuar la bsqueda despus de solicitada.
Anexo VI
BANCO DE SANGRE DE CORDN UMBILICAL
HOSPITAL 12 DX OCTUBRE
Ot r a . AflDALUOIA It 5 . 4 . 28041 MA f l i D
Dr. R. EOflSTEIN Tfno:91 3 90 9 4 1 9; Fax: 91 3 90 8 2 5 8
Dra. F. GILSAfl Tfno:91 3 90 8 65 4 ; Fax: 91 3 90 8 3 5 8
INFORME PRELIMINAR DE COMPATIBILIDAD
Fecha del informe:
Bsqueda solicitada por:
Centro de Trasplante:
Direccin:
TEL.IFAX:
Datos del Paciente
ID Paciente:
Fecha Solicitud:
Ultima bsqueda:
Apellidos: Fecha Nacimiento: Sexo:
Nombre: Etnicidad: Peso (kg):
Diagnstico:
FILA-A FILA- A-DR ULA-DREl
L ID D L I L ID [1 1 H 1 1 ]
Unidades de Sangre de Cordn Umbilical
Vol CN Nivel
CODIGO FILA-A HLA-B HLA-DR HLA-DRB1 (mi) (x1O6) Comp.
Unidades con O incompatibilidades
Unidades con 1 incompatibilidad
Unidades con 2 incompatibilidades
Por favor confirme la recepcin por FAX: 91-390-8358
Nmero de pginas recibidas ( ) fecha: firma:
Anexo VII
BANCO DE SANGRE DE CORDN tIMBILICAL
HOSPITAL 12 DX OCTUBRE
Ot r a . AnDALUCIA
Dr. RaOflBTEIN
flra. F. GILSMJZ
It 5 . 4 . 2 80 4 1 MADRID
Tfno:91 3 90 8 4 1 9; raj e: 91 3 90 8 3 5 8
Tfno:91 3 90 8 65 4 ; Fax: 91 3 90 8 3 5 8
INFORME: UNIDAD SCU-OOO
Fecha del informe:
Dirigido a:
Centro: FAX:
PACIENTE: ID Paciente:
HLA-A HLA- A-DR HLA-D
DLI DLI DLI WW
UNIDAD: Cdigo SCU-000
Volumen sangre de cordn obtenido (mi): 000
Separacin celular: HES 1,2% volumen (mi): O
Solucin crioprotectora (DMSO 10%) (mI): O
Criopreservacin: Bolsa Cryocyte (ml): 00
Nmero total de clulas nucleadas (x 0
7): 00,0
Nmero total de clulas CD34+ (x 106): 0,00
Nmero total de CFU-GM (x ot: 00,0
HLA: A 0,0 B 0,0 DR 0,0 DRiB 1*0000,0000
Cultivos bacterianos (acrbico y anaerbico):
Ompo ABORh: Sexo: Raza:
Pruebas serolgicas (suero materno):
Parto (dd/mm/aa) Control (dd/mrn/aa)
HBsAg
Anti-HBc
Anti-VHC
Anti-VIH 1/2
TPHA
Toxoplasma (IgG)
CMV (IgG)
Por favor, indquese lo antes posible si esta Unidad debe ser asignada a su paciente. En ese caso,
despus del trasplante se le solicitar regularmente los datos de seguimiento para el control de
calidad y evaluacin del programa de trasplante de sangre de cordn umbilical.
13 0 LIOTS CA