2010 Teixeira Estudos

Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares
Autarquia Associada Universidade de So Paulo

ESTUDOS DAS PROPRIEDADES PTICAS DOS COMPLEXOS
EURPIO TETRACICLINAS E SUAS APLICAES NA
DETECO DE LIPOPROTENAS

Luciane dos Santos Teixeira

Dissertao apresentada como parte dos
requisitos para a obteno do Grau de
Mestre em Cincias na rea de
Tecnologia Nuclear Materiais.

Orientadora: Dra. Lilia Coronato Courrol

So Paulo
2010

Dedico este trabalho primeiramente a Deus que fortalece a minha f e
esperana a cada dia e aos meus pais Maria Ap. dos Santos Teixeira
e Ivanildo Ap. Peluco Teixeira pelo apoio e carinho oferecido em todo
momento de minha vida.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente gostaria de agradecer a Deus que tornou possvel a realizao de
mais um grande sonho.

Gostaria de agradecer tambm a Professora Lilia Coronato Courrol pelo carinho,
ateno e orientao durante a realizao deste trabalho.

Aos meus pais Maria Ap. dos Santos Teixeira e Ivanildo Ap. Peluco Teixeira e ao
meu irmo Carlos Eduardo dos Santos Teixeira pelo apoio e carinho oferecidos
em todo momento de minha vida e principalmente neste.

Ao meu namorado e eterno companheiro Andr, por todo apoio e incentivo.

Ao CNPq pela bolsa concedida.

A Flvia Rodrigues pela ajuda prestada no inicio deste trabalho.

A Andrea Nastri Grasso pela importante ajuda durante a realizao deste trabalho
e principalmente pela grande amizade.

Ao Dr. Antnio Martins Figueiredo Neto por conceder as amostras de fraes
colesterol e ao Dr. Magnus A. Gidlund e sua aluna Andra M. Monteiro do Instituto
de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo pela preparao destas
amostras.

Ao Dr. Larcio Gomes, pelas preciosas discusses a respeito do tema.

Aos Drs. Nilson, Luiz e Larcio pela utilizao da infraestrutura dos laboratrios.

Bom mesmo ir a luta com determinao, abraar a vida com paixo, perder com
classe e vencer com ousadia, pois o triunfo pertence a quem se atreve...
A vida muita para ser insignificante.
(Charles Chaplin)

ESTUDOS DAS PROPRIEDADES PTICAS DOS COMPLEXOS EURPIO
TETRACICLINAS E SUA APLICAES NA DETECO DE LIPOPROTENAS


RESUMO

Este trabalho apresenta as propriedades pticas dos complexos Eurpio
Tetraciclinas (EuTcs) na presena de LDL e de LDL oxidada com potenciais
aplicaes em anlises clnicas. Foram escolhidos quatro elementos da famlia
das Tetraciclinas: Tetraciclina (Tc), Clorotetraciclina (CTc), Metatetraciclina (MTc)
e Oxitetraciclina (OTc) para fazerem parte dos complexos com o on eurpio. As
melhores condies para se formar os complexos eficientemente foram
determinadas, atravs das medidas dos parmetros pticos como: absoro,
emisso e de tempo de vida. As melhores concentraes de eurpio nos
complexos EuTcs e possveis influncias de ons inorgnicos normalmente
presentes no plasma sanguneo tambm foram analisadas. As amostras foram
preparadas em pH neutro e a luminescncia visvel do lantandeo foi detectada
aps tempo de repouso das amostras de 15 minutos. Os resultados deste
trabalho mostraram que as molculas de LDL e de LDL oxidada apresentaram um
importante papel no aumento da intensidade de emisso dos complexos das Tcs.
As medidas realizadas com os complexos EuTcs no apresentaram
deslocamentos nos comprimentos de onda dos espectros de absoro e de
emisso na presena de LDL, o que demonstra a ausncia de interao direta
entre as molculas de Tcs e as molculas de LDL e LDL oxidada. No entanto, o
on eurpio pode interagir em diferentes stios das molculas de tetraciclinas o
que diferenciou a intensidade de emisso de cada complexo. Comparando os
resultados obtidos entre os complexos de EuTcs, o complexo EuTc foi o que
apresentou perspectivas promissoras na quantificao de LDL e LDL oxidada.

Palavras-chave: Eurpio, Tetraciclinas, LDL e LDL oxidada.

STUDIES OF OPTICAL PROPERTIES OF COMPLEXES EUROPIUM
TETRACYCLINE AND ITS APPLICATIONS IN DETECTION OF LIPOPROTEINS


ABSTRACT

This work presents the optical properties of europium complexes - Tetracyclines
(EuTcs) in the presence of LDL and oxidized LDL with potential applications in
clinical analysis. Four elements were chosen from the Tetracyclines family:
Tetracycline (Tc), Chlortetracycline (CTc), Metatetraciclina (MTc) and
Oxytetracycline (OTc) to be part of complexes with europium ion. The best
conditions to form the complex efficiently were determined through measurements
of optical parameters such as absorption, emission and lifetime. The best
concentrations of europium complexes in EuTcs and possible influences of
inorganic ions normally present in blood plasma were also analyzed. The samples
were prepared at neutral pH and the visible luminescence of lanthanide was
detected after resting time of the samples of 15 minutes. These results showed
that the molecules of LDL and oxidized LDL have an important role in increase of
the emission intensity for Tcs complexes . The measurements performed with the
complex EuTcs showed no shifts in the wavelengths of the absorption and
emission spectra in the presence of LDL, which demonstrates the absence of
direct interaction between the molecules of Tcs and the molecules of LDL and
oxidized LDL. However, the europium ion can interact at different sites of the
tetracyclines molecules which differed the emission intensity of each complex.
Comparing the results obtained between the complexes EuTcs, the complex EuTc
is the one that presented the promising prospects in the quantification of LDL and
oxidized LDL.

Keywords: Europium, Tetracyclines, LDL and oxidized LDL.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estrutura bsica das tetraciclinas ..........................................................19
Figura 2: Mecanismo de emisso de fluorescncia de complexos de Eu
3+
..........24
Figura 3: Ciclopentanoperidrofenantreno..............................................................26
Figura 4: Estrutura qumica do colesterol..............................................................26
Figura 5: Estrutura bsica de uma lipoprotena
33
..................................................28
Figura 6: Lipoprotenas do plasma sanguneo
33
. ..................................................29
Figura 7: Processo de formao da placa de ateroma..........................................32
Figura 8: Espectrofotmetro Olis Cary-17 D. ........................................................39
Figura 9: Espectrofotmetro Fluorolog 3...............................................................40
Figura 10: a) Espectro de absoro ptica das amostras de eurpio, tampo,
MOPS e tetraciclinas; b) Espectro de absoro ptica das tetraciclinas na
presena do eurpio. ............................................................................................43
Figura 11: a) espectros de emisso das tetraciclinas Tc, OTc, MTc e CTc.
Espectro das tetraciclinas Tc, OTc, MTc, CTc complexadas com o on eurpio...45
Figura 12: Espectro de absoro do complexo EuOTc em diferentes razes
molares de eurpio na presena de LDL ..............................................................46
Figura 13: Espectro de emisso dos complexos de EuOTc..................................47
Figura 14: Espectro de absoro ptica do complexo EuCTc em diferentes razes
molares de eurpio na presena de LDL. .............................................................47
Figura 15: Espectro de emisso dos complexos de EuCTc..................................48
Figura 16: Espectro de absoro ptica do complexo EuMTc em diferentes razes
molares de eurpio na presena de LDL. .............................................................48
Figura 17: Espectro de emisso dos complexos de MTc......................................49
Figura 18: Espectro de emisso de EuOTc com LDL............................................16
Figura 19: Espectro de emisso de EuMTc com LDL............................................16
Figura 20: Espectro de emisso de EuCTc com LDL............................................16
Figura 21: Espectro de emisso de EuTc com LDL...............................................16
Figura 22: Possveis stios em comum de ligaes do on eurpio com as Tcs ..52
Figura 23: Molcula de MTc..................................................................................53
Figura 24: Molcula de OTc..................................................................................53

Figura 25: Monocamada da molcula de LDL ilustrando as regies hidroflica
(regio externa) e hidrofbica (regio interna) da molcula..................................55
Figura 26: Curva de calibrao do complexo EuOTc na presena de diferentes
concentraes de LDL ..........................................................................................56
Figura 27: Curva de calibrao do complexo EuMTc na presena de diferentes
Figura 28: Curva de calibrao do complexo EuTc na presena de diferentes
Figura 29: Curva de calibrao do complexo EuCTc na presena de diferentes
Figura 30: Tempo de vida do complexo EuTc com LDL .......................................16
Figura 31: Tempo de vida do complexo EuCTc com LDL.....................................16
Figura 32: Stio de ligao dos ctions divalentes ................................................62
Figura 33: Curva de calibrao do complexo EuOTc na presena de LDL oxidada
..............................................................................................................................65
Figura 34: Curva de calibrao do complexo EuCTc na presena de LDL oxidada
..............................................................................................................................65
Figura 35: Curva de calibrao do complexo EuTc na presena de LDL oxidada66

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Elementos da Famlia das Tetraciclinas................................................19
Tabela 2: Elementos lantandeos e sua respectiva configurao eletrnica.........21
Tabela 3: Relao entre o tamanho e a proporo de lipdeos nas lipoprotenas
adaptado. ..............................................................................................................29
Tabela 4: Nveis de colesterol pela Sociedade Brasileira de Cardiologia. ............30
Tabela 5: Solventes e reagentes utilizados...........................................................36
Tabela 6: Valor de referncia dos interferentes encontrados no plasma sanguneo
..............................................................................................................................38
Tabela 7: Preparo dos complexos de EuTcs em diferentes razes molares de Eu
3+
..............................................................................................................................41
Tabela 8: Valores das posies dos mximos dos compostos TC, OTC, CTc e
MTc. ......................................................................................................................43
Tabela 9: Bandas de absoro dos compostos EuTC, EuOTC, EuCTc e EuMTc.
..............................................................................................................................44
Tabela 10: Parmetro do ajuste das equaes 1 e 2, para os dados experimentais
da Figura 30. .........................................................................................................60
da Figura 31. .........................................................................................................61
da Figura 35. .........................................................................................................67
da Figura 36. .........................................................................................................67

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS

EuTc: Eurpio-Tetraciclina
EuCTc: Eurpio-Clorotetraciclina
EuMTc: Eurpio-Metaciclina
EuOTc: Eurpio-Oxitetraciclina
LDL: Low Density Lipoproteins
HDL: High Density Lipoproteins
TC: tetraciclina
Mg: Magnsio
Mn: Mangans
Fe: Ferro
Ag: Prata
Al: Alumnio
Co: Cobalto
Ni: Nquel
Cu: Cobre
Ca: Clcio
Zn: Zinco
Xe: Xennio
Sc: Escndio
Y: trio
Sc: Escndio
La: Lantnio
Yb: Iterbio
Lu: Lutcio
Ce: Crio
Pr: Praseodmio
Nd: Neodmio
Pm: Promcio
Sm: Samrio
Eu: Eurpio
Gd: Gadolnio

Tb: Trbio
Dy: Disprosio
Ho: Holmio
Er: rbio
Tm: Tlio
OH: Hidroxila
S
0
: Estado singleto fundamental
S
1
: Estado singleto excitado
T: Estado tripleto
C
22
H
45
OH: Colesterol
LPL: Lipoproteina Lipase
VLDL: Very Low Density Lipoproteins
IDL: lipoprotena de densidade intermediria
: Comprimento de onda
CLA: Centro de Lasers e Aplicaes
IPEN: Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares
MOPS: cido propanesulfnico 3 (N-Morpholino)
ICB-USP: Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo
CTc: Clorotetraciclina
OTc: Oxitetraciclina
MTc: Metatetraciclina
AgNO4: Nitrato de prata
Al
2
(SO4)
3
: Sulfato de alumnio
CoSO
4
.7H
2
O: Sulfato de cobalto heptahidratado
CaCl
2
.2H
2
O: Cloreto de clcio dihidratado
Cu(NO
3
)
2
.3H
2
O: Nitrato de cobre trihidratado
FeCl
3
.6H
2
O: Cloreto de ferro hexahidratado
MgSO
4
.7H
2
O: Sulfato de magnsio heptahidratado
MnSO
4
.H
2
O: Sultato de mangans monohidratado
NiSO
4
.6H
2
O: Sulfato de nquel hexahidratado
ZnSO4.7H
2
O: Sulfato de zinco heptahidratado
EuCl
3
.6H
2
O: Cloreto de Eurpio Hexahidratado
H
2
O: gua bideionizada

NaOH: Hidrxido de sdio
LDL oxidada: Lipoprotena de baixa densidade oxidada
PMSF (fenil-metil-sulfonil-fluoreto)
PBS: Tampo fosfato salino
EDTA: cido etilenodiaminotetractico
CuSO
4
: Sulfato de cobre
CH
3
: Alcanos
CH
2
: Alcenos
a: Rudo de fundo
b: Coeficiente angular
x: Concentraes desconhecida de LDL
: Incerteza da medida
y: Intensidade do sinal
1
: Tempos de decaimento
A
1
: Amplitudes do sinal
av
: Mdia do tempo de vida

SUMRIO

1. MOTIVAO................................................................................................................ 16
2. OBJETIVOS ................................................................................................................... 17
3. INTRODUO TERICA ........................................................................................... 18
3.1 Tetraciclinas ............................................................................................................ 18
3.2 Lantandeos............................................................................................................. 19
3.3 Eurpio..................................................................................................................... 22
3.4 Complexo Eurpio-tetraciclina ............................................................................. 23
3.5 Colesterol e suas fraes...................................................................................... 25
3.6 Lipoproteina de baixa densidade (LDL).............................................................. 30
3.7 Principais mtodos para medir Colesterol total e LDL..................................... 32
3.7.1 Mtodo de Liebermann-Burchard ...................................................................... 32
3.7.2 Mtodo de Leffler-McDougald ........................................................................... 33
3.7.3 Mtodo que utilizam processo enzimtico- colorimtrico.................................. 33
4. MATERIAIS E MTODOS........................................................................................... 35
4.1 Produo das amostras......................................................................................... 35
4.2 Obteno das lipoprotenas................................................................................. 36
4.3 Solues .................................................................................................................. 37
4.4 - Tcnicas usadas para caracterizao das amostras..................................... 39
4.4.1 Medida de Absoro ........................................................................................... 39
4.4.2 Medida de emisso.............................................................................................. 39
4.4.3 Medida de Tempo de vida................................................................................... 40
5. RESULTADOS E DISCUSSO................................................................................... 41
5.1 Caracterizao dos complexos Eurpio-Tetraciclinas (EuTcs) ...................... 41
5.2 Estudo dos complexos EuTcs na presena de LDL......................................... 45
5.2.1 Melhores razes molares dos complexos EuTcs na presena de LDL............... 45
5.2.2 Comparao dos complexos EuTcs na presena de diferentes concentraes de
LDL.............................................................................................................................. 49
5.2.3 Curva de calibrao dos complexos na presena de LDL ................................. 55
5.2.4 Tempo de vida dos complexos EuTc e EuCTc na presena de LDL................... 58
5.2.5 Complexos EuTc+LDL e EuCTc+LDL na presena de possveis interferentes
inorgnicos. ................................................................................................................. 61
5.3 Medidas dos complexos EuTcs na presena de LDL oxidada....................... 64

5.3.1 Comparao das curvas de calibrao dos complexos EuTcs na presena de
diferentes concentraes de LDL oxidada................................................................... 64
5.3.2 Tempo de vida dos complexos EuTc e EuCTc na presena de LDL oxidada..... 66
5.3.3 Complexos EuCTc+LDL oxidada e EuTc+LDL oxidada na presena de
possveis interferentes inorgnicos.............................................................................. 68
6. CONCLUSES .............................................................................................................. 70
7. PRODUES BIBLIOGRFICAS.............................................................................. 73
16

1. MOTIVAO

O transporte do colesterol no corpo humano feito principalmente pelas
lipoprotenas LDL (lipoprotena de baixa densidade) e HDL (lipoprotena de alta
densidade). O excesso de colesterol associado lipoprotena LDL no sangue
um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento de doenas arteriais
coronarianas (principalmente o infarto do miocrdio), alm de doenas crebro-
vasculares
1
.
Para a determinao do colesterol alguns mtodos enzimticos so
empregados, utilizando, por exemplo, a enzima colesterol oxidase. Porm esses
mtodos exigem muitas vezes uma grande quantidade de reagentes e reaes,
fato esse que o torna um tanto indireto e caro, alm de no ser em tempo real
2
.
conhecido da literatura que o complexo Eurpio-Tetraciclina (EuTc)
apresenta propriedades pticas interessantes. Possui absoro em torno de 400
nm e emisso em torno de 615 nm e, portanto grande deslocamento Stokes. A
emisso do eurpio proveniente de um efeito antena fortemente dependente
das caractersticas da soluo, tais como pH
3
.
Estudos realizados recente indicaram um aumento da banda de emisso
do eurpio, no complexo EuTc na presena de colesterol e LDL. Neste caso
nenhum outro tipo de reagente precisou ser incorporado soluo, possibilitando
a quantificao de LDL
4
.
Portanto, esse trabalho nos motivou a estudar as propriedades pticas de
outras tetraciclinas tais como: oxitetraciclina, clorotetraciclina e metatetraciclina,
complexadas com o on eurpio e dessa forma analisar a possibilidade de
quantificao de LDL e LDL oxidada.
Esta observao abre o leque para uma ampla rea de pesquisa que vai
desde a obteno de curvas de calibrao de LDL e LDL oxidada at potencial
obteno de um sensor baseado na presena de EuTcs e utilizados como
marcadores fluorescentes para a arterosclerose.

17

2. OBJETIVOS

O objetivo deste trabalho a caracterizao espectroscpica de complexos
de Eurpio-Tetraciclinas (EuTcs) na presena de LDL e LDL oxidada em
solues aquosas, atravs da determinao de parmetros pticos tais como
absoro ptica, emisso e tempo de vida. Alm de outras medidas, como a
influncia de ons inorgnicos presentes no plasma sanguneo.
Atravs da anlise destes dados, pretende-se identificar, dentre os
complexos de Tcs, aquele que apresenta melhor desempenho na quantificao
de LDL e LDL oxidada.

18

3. INTRODUO TERICA

3.1 Tetraciclinas

Em meados de 1948 surge uma importante famlia de antibiticos
denominada tetraciclinas. Os primeiros membros foram isolados e purificados de
produtos naturais de fermentao de microorganismos (Streptomyces
aureofancins e S. rimosus) dando origem respectivamente clorotetraciclina e
oxitetraciclina
5,6
. Mais tarde, outros membros foram sintetizados como caso da
tetraciclina sintetizada a partir da clorotetraciclina, metaciclina, doxiciclina entre
outras
7
.
As tetraciclinas (Tc) so antibiticos de amplo espectro de ao contra
microorganismos como bactrias gram positivas, gram negativas, Chlamydias,
Mycoplasmas e Rickettsia
6
.
As principais indicaes clnicas das tetraciclinas so para as infeces
causadas por microorganismo acima citados como, por exemplo, infeces
respiratrias mistas, alm de serem utilizadas na medicina veterinria, nutrio
animal e aditivos alimentares destinado a uso pecurio
8,9
.
Quanto a sua estrutura qumica (Figura 1 e Tabela 1) as Tcs apresentam
em comum um sistema de quatro anis (A,B,C e D) unidos linearmente com seis
carbonos em cada anel, alm de possurem importantes stios de ligaes:
sistema - dicetona (posio 11 e 12), enol (posio 1 e 3) e carboxamida
(posio 2) anel A
3
.
As Tcs apresentam diferentes stios de ligaes dependendo do pH em
que as mesmas se encontram, de acordo com alguns estudos as tetraciclinas
apresentam em geral 3 constantes de acidez (pKa) que variam em torno dos
seguintes valores: pKa
1
= 3,30, pKa
2
= 7,29 e pKa
3
= 9,88
3
.
Em estudos recentes foi observado que em pH 7 as tetraciclinas
apresentaram ionizao das hidroxilas presentes nos anis BCD e com grande
potencial de formar complexos estveis com ctions multivalentes incluindo a
formao de complexos com ons de lantandeos trivalentes
6,3,10
.
O estudo de Palm e colaboradores
11
demonstrou que as tetraciclinas
formam complexos de coordenao estveis com ons metlicos da primeira srie
19

de transio, entre eles: Mg
2+
, Mn
2+
, Fe
2+
, Co
2+
, Ni
2+
, Cu
2+
, Ca
2+
e Zn
2+
e que os
mesmos ligam-se em stios semelhante ao do on eurpio.

Figura 1: Estrutura bsica das tetraciclinas

Tabela 1: Elementos da Famlia das Tetraciclinas.

Elementos da Famlia das Tetraciclinas R
1
R
2
R
3
R
4

Tetraciclina H CH
3
OH H
Clorotetraciclina Cl CH
3
OH H
Oxitetraciclina H CH
3
OH OH
Metatetraciclina H CH
2
- OH

3.2 Lantandeos
Os elementos lantandeos compreendem os dois membros do grupo IIIB
(Escndio e trio) e quinze membros da srie Lantandica (do Lantnio Z= 57 ao
Lutcio Z= 71)
1
.So conhecidos tambm como terras-raras quando os elementos
qumicos Escndio Z= 21 e o trio Z= 39 so includos
2, 12
.
A expresso terras deve-se ao fato de tais elementos serem isolados na
forma de seus xidos e raras pelas dificuldades iniciais na separao de um
mineral novo e incomum descoberto no final do sculo 18. Foi somente no inicio
do sculo XX que se obtiveram tcnicas capazes de separar esses elementos
tornando-os suficientemente puros para o estudo de suas propriedades
magnticas, qumicas entre outras
13
.
Os lantandeos apresentam configurao eletrnica que derivam do gs
nobre Xennio (Xe). Somente os elementos Escndio (Sc) e trio (Y) no derivam
dessa configurao
14
. Dentre outras propriedades, destacam-se que todos eles,
com exceo do Escndio (Sc), trio (Y), Lantnio (La), Itrbio (Yb) e Lutcio (Lu)
D C
D
A B
20

possuem a camada 4f incompleta o que lhes confere uma configurao eletrnica
[Xe] 4f
n
5d
1
6s
2
(0< n < 14),Tabela 2
15
.
A camada 4f a camada mais interna e acima dela esto a 6s e 5d e
mesmo as camadas 5p e 5s so mais externas que a camada 4f, por terem uma
extenso radial maior. As camadas pertencentes aos ons lantandeos que
participam das ligaes qumicas com outros elementos so as camadas 6s e 5d,
dessa forma, a camada 4f, ainda que incompleta, fica blindada pelas mais
externas.
As propriedades qumicas dos lantandeos so muito semelhantes entre si,
porm pequenas diferenas podem ser observadas como conseqncia da
diminuio progressiva dos raios inicos com o aumento do nmero atmico, fato
esse denominado contrao lantandica. A contrao lantandica deriva-se da
blindagem imperfeita que um eltron 4f exerce sobre outro eltron 4f, resultando
em um aumento da carga nuclear efetiva ao longo da srie lantandica
16
.
Os lantandeos quando esto na forma de ons apresentam-se em sua
grande maioria no estado trivalente de oxidao (+3), por ser o estado mais
comum e ainda o mais estvel termodinamicamente. Este estado de oxidao
(+3) no depende apenas da configurao eletrnica, mas tambm de um
balano entre as energias de ionizao, de ligao e de solvatao para o caso
de solues
17
.
Considerando que a energia para remover um quarto eltron da
subcamada 4f muito alta, os ons terras raras apresentam-se quase que
exclusivamente no estado de oxidao +3
16
.
Porm menos comum, alguns ons lantandeos podem ser encontrados em
outros estados de oxidao como o caso do trbio, praseodmio e neodmio que
podem apresentar estado de oxidao tetravalente (+4) mas so todos instveis
em soluo, podendo ser obtidos somente como slidos, na forma de fluoretos,
ou de xidos, e o eurpio que pode apresentar o estado de oxidao divalente
(+2) mas em soluo e em complexos, esse estado de oxidao mais difcil de
ser encontrado devido fcil oxidao para o estado de oxidao (+3)
13,16
.

21

Tabela 2: Elementos lantandeos e sua respectiva configurao eletrnica
ELEMENTO CONFIGURAO
Sc (21) [Ar]3d
1
4s
2

Y (39) [Kr]4d
15
s
2

La (57) [Xe]5d
16
s
2

Ce (58) [Xe]4f
15
d
16
s
2

Pr (59) [Xe]4f
36
s
2

Nd (60) [Xe]4f
46
s
2

Pm (61) [Xe]4f
56
s
2

Sm (62) [Xe]4f
66
s
2

Eu (63) [Xe]4f
76
s
2

Gd (64) [Xe]4f
75
d
16
s
2

Tb (65) [Xe]4f
96
s
2

Dy (66) [Xe]4f
106
s
2

Ho (67) [Xe]4f
116
s
2

Er (68) [Xe]4f
126
s
2

Tm (69) [Xe]4f
136
s
2

Yb (70) [Xe]4f
14
6s
2

Lu (71) [Xe]4f1
45
d
16
s
2

Nos compostos que apresentam os ons lantandeos no estado de
oxidao (+3), a camada 4f localiza-se na parte mais interna do tomo sendo
totalmente protegida pelos orbitais 5s e 5p, ocorrendo somente um pequeno
envolvimento com os orbitais dos ligantes devido a isso os lantandeos podem
formar complexos inicos
17
.
Os ons lantandeos, por apresentarem grandes nmeros de nveis de
energia, proporcionam emisses desde o infravermelho at o ultravioleta, porm
muitas emisses ocorrem na regio do visvel
15
.
De uma maneira geral as transies eletrnicas do estado 4f podem ser
explicadas de uma maneira geral pela teoria de Judd- Ofelt que considera as
transies dos lantandeos oriundas de uma mistura dos estados 4f e 5d
14
.
22

As propriedades espectroscpicas podem ser melhor entendidas
observando a absoro e as emisses pticas desses elementos.
Os ons lantandeos absorvem a radiao em bandas estreitas e bem
definidas oriundas das transies f-f. As transies f-f isoladas so proibidas pela
regra de seleo para o espectro atmico, de acordo com essa regra somente
transies que so acompanhadas da troca de paridade so permitidas como o
caso das transies f-d. As transies f-f s so permitidas quando a simetria do
on removida devido ao campo cristalino que no apresente simetria de
inverso
14
.
A excitao direta do on de lantandeo no favorvel devido a rpida
relaxao trmica da energia de excitao quando se utilizam ons lantandeos
para sistemas luminescentes
18
. Essa relaxao no radiativa pode ocorrer pela
interao dos nveis eletrnicos do on lantandeo com os modos vibracionais
ressonantes do solvente. Quando o solvente contm grupos OH na coordenao
do on lantandeo, ocorre eficiente relaxao no radiativa devido ao acoplamento
ressonante dos estados vibracionais dos osciladores OH
9
.
A blindagem dos eltrons do orbital 4f mostra que o espectro de absoro
dos ons lantandeos fracamente perturbado depois de ligado com um ligante
orgnico
15
.
J a eficincia do processo de emisso de radiao depende da diferena
energtica entre o estado excitado e fundamental, da energia vibracional do
oscilador e da vizinhana ao redor do on lantandeo
15
.
Neste trabalho utilizou-se o lantandeo eurpio para formar complexos
estveis com o ligante orgnico representado pelas tetraciclinas.

3.3 Eurpio
O elemento Eurpio (Eu) com nmero atmico 63 foi descoberto por Paul
mile Lecoq de Boisbaudran em 1980 quando obteve um concentrado de samrio
e gadolnio e observou que as linhas espectrais no pertenciam a nenhum dos
dois elementos. Porm a descoberta geralmente creditada ao qumico francs
Eugne-Antole Demaray em 1986, quando suspeitou que as amostras do
elemento samrio haviam sido contaminada por um elemento desconhecido.
23

Eugne isolou esse elemento em 1901 e nomeou esse elemento como eurpio,
em homenagem ao continente europeu
15
.
As propriedades pticas do on Eurpio so amplamente estudadas e
empregadas como, por exemplo, em luminforos para iluminao, agente de
contraste para ressonncia magntica nuclear de imagem, sondas marcadoras de
biomolculas, marcadores de protenas e aminocidos, entre outras aplicaes
16
.
O on Eurpio apresenta alta luminescncia na regio do vermelho e a
partir de seus espectros de emisso podem-se obter informaes sobre o
processo de transferncia de energia
16
.
O espectro de emisso do on Eurpio deriva das bandas oriundas das
transies intraconfiguracionais
5
D
0

7
F
j
(onde J = 0, 1, 2, 3, 4, 5 e 6), sendo que as
transies
5
D
0
7
F
5
e
5
D
0

7
F
6
apresentam intensidade muito baixa e dificilmente
podem ser notadas nos espectros de compostos de coordenao
16
.
As bandas e emisso do on Eurpio so de fcil interpretao na regio do
visvel devido estrutura dos nveis de energia, o que possibilita a sua utilizao
como sonda espectroscpica, e dessa forma possibilitando que sejam obtidas
informaes de sistemas bioinorgnicos
16
.

3.4 Complexo Eurpio-tetraciclina

conhecido da literatura que a emisso do on eurpio extensivamente
utilizada como sonda para anlise de sistemas biolgicos como, por exemplo,
estrutura de enzimas, protenas, funes celulares, entre outras
19
.
No entanto a luminescncia destes ons em soluo aquosa fraca, isso
porque os modos de vibrao das molculas de gua favorecem a perda de
energia por processos no luminescentes. Com a formao de complexos
utilizando ligantes orgnicos, se completam as oito coordenaes para impedir a
coordenao da gua com o on lantandeo
20
.
A formao do complexo eurpio-tetraciclina foi relatada pela primeira vez
por Hirschy et al
10
, que descreveu a transferncia da energia intramolecular da
tetraciclina para o on eurpio. A partir da houveram vrias aplicaes deste
complexo desde a deteco de teores de algumas tetracclicas, at deteco de
perxido de hidrognio, glicose, heparina, perxido de uria, etc
21,22,23,24.

24

A tetraciclina quando complexada com o on Eurpio (III) forma um
complexo altamente estvel e com forte luminescncia, o mecanismo de
transferncia de energia e de emisso ser apresentado a seguir e ilustrado na
Figura 2 (diagrama de Jablonski)
25
.
Primeiramente o complexo Eu-Tc excitado por uma radiao externa, e a
parte orgnica do complexo (TC) absorve a energia excitando os eltrons do
estado singleto fundamental (S
0
) para o estado singleto excitado (S
1
). Porm do
estado (S
1
) pode ocorrer uma decaimento no radiativo (processo de converso
interna) para o mais baixo nvel vibracional S
1
, no qual a emisso da fluorescncia
se origina. Outra possibilidade o decaimento no radiativo para o estado
fundamental (S
0
)
20
.
A partir do mais baixo nvel vibracional (S1), ocorre converso para o
primeiro estado tripleto (T
1
), processo conhecido como cruzamento intersistema.
Do estado tripleto (T
1
) h transferncia de energia do ligante para nvel mais alto
do on eurpio (
5
D
1
) cujo nvel de energia excitado mais baixo que o nvel (T
1
)
20
.

O estado excitado do eurpio depopulado, ocorrendo desta forma um
decaimento radiativo para o estado fundamental resultando na emisso do
eurpio atravs das transies
5
D
0

7
F
J
(J = 0, 1, 2, 3, 4) e
5
D
1

7
F
J
(J = 1, 2, 3,
5, 6), porm a transio mais provvel a
5
D
0

7
F
2
aproximadamente em
612nm
20
.

Figura 2: Mecanismo de emisso de fluorescncia de complexos de Eu
3+

25

Desta forma o complexo EuTc apresenta importantes caractersticas: como
o aumento da intensidade de emisso do Eurpio no sistema complexado que
cerca de dez vezes maior que no caso do eurpio livre, grande deslocamento
Stokes (absoro ~395 nm e emisso ~615 nm, ~220nm) e longo tempo de vida
de emisso (~20 s). Devido a blindagem realizada pelos eltrons 4f das
subcamadas 5s
2
e 5p
6
as bandas de emisso do on eurpio so extremamente
finas e bem definidas na regio do visvel
10, 20,26
.
Estudos realizados recentemente indicaram um aumento da banda de
emisso do eurpio, no complexo EuTc na presena de colesterol e tambm de
LDL. Nestes casos nenhum outro tipo de reagente foi incorporado s solues
27,28
.
O complexo EuTc na presena de colesterol e de LDL apresentou aumento
em sua intensidade de emisso em torno de 618 nm. Notou-se que com o
aumento do aumento da concentrao de colesterol tambm ocorria o aumento
progressivo na intensidade de emisso do complexo EuTc, desta forma foi
possvel determinar a curva de calibrao do complexo EuTc-colesterol e
tambm o tempo de vida, que foi na ordem de 80 s
27, 28
.

Semelhante ao
colesterol, o complexo EuTc apresentou aumento em sua intensidade de emisso
com o aumento da concentrao de LDL. A curva de calibrao tambm foi
determinada e o tempo de vida do complexo EuTc na presena de LDL foi da
ordem de 89 s
27,28
.
Desta forma a determinao do colesterol, seja total ou fracionado pode ser
simplesmente medido pela adio das fraes de colesterol soluo de EuTc.

3.5 Colesterol e suas fraes

O colesterol um esteride de frmula molecular C
22
H
45
OH, seu nome
origina-se do grego chole- (bile) e stereos (slido), e o sufixo qumico -ol para um
lcool
29
.
Nos seres humanos o colesterol apresenta importantes funes como, por
exemplo, reagente necessrio para a biossntese de vrios hormnios, vitamina D
e de cidos biliares, presena em quase todos os tecidos corporais e na maioria
das clulas com exceo das hemcias
29
,
30
.
26

Em sua estrutura qumica o colesterol deriva do
ciclopentanoperidrofenantreno um composto que apresenta quatro anis no-
planares fusionados
31
(Figura 3).

Figura 3: Ciclopentanoperidrofenantreno

O colesterol apresenta uma grande cadeia de hidrocarboneto e apenas um
grupamento hidroxila (OH) na posio do carbono 3, o que lhe confere uma baixa
caracterstica anfiptica
31
(Figura 4).

Figura 4: Estrutura qumica do colesterol

O colesterol pode ser obtido por meio de sntese celular (colesterol
endgeno -70%) e da dieta (colesterol exgeno- 30%). O colesterol endgeno
produzido em sua grande maioria pelo fgado, por um sistema compensatrio, isto
, quanto maior for a ingesto de colesterol vindo dos alimentos, menor a
quantidade sintetizada pelo fgado
29
.
Por apresentar caracterstica hidrofbica o colesterol transportado no
sangue por lipoprotenas
29
.
27

As lipoprotenas so sintetizadas pelos entercitos e pelos hepatcitos e
so constitudas por triacilgliceris, ster de colesterol, fosfolipdeos e
apoprotenas (protenas) que podem interagir com receptores de membrana
celular. Os fosfolipdeos, colesterol livre e protenas formam uma capa hidroflica
que reveste o centro hidrofbico constitudo de triglicerdeos e steres de
colesterol
1, 32
. As lipoproteinas so partculas menores que as hemcias.
As lipoprotenas so classificadas de acordo com a natureza e pela
densidade dos lipdeos e protenas. Dentre estas classes, destacam-se:
Quilomicrons, VLDL, LDL e HDL
29
.
Quilomicrons: So sintetizados pelas clulas intestinais e caracterizam
por serem ricos em triglicerdeos e pelo transporte de colesterol da dieta
29
. O
prprio intestino sintetisa suas principais Lipoproteinas. Uma delas, exclusiva do
Quilomicron a Apo B-48. O Quilomicron entra na circulao atravs do sistema
linftico intestinal, atingindo a circulao sistmica via ducto torcico. Na
circulao o Quilomicron distribui os triglicrides aos tecidos muscular e adiposo,
atravs da ao (hidrlise) da lipoproteina lipase (LPL), por ao da apo C II
33
.
VLDL (very low density lipoproteins): so sintetizadas no fgado e
apresentam principalmente triglicerdeos e as Apos B-100. Quando entram em
contato com a enzima lipase lipoprotica as VLDL podem dar origem as IDL
((intermediate density lipoproteins) sendo que 1/3 das IDL sofrem ao da lpase
heptica formando as LDL
29
.
LDL (low density lipoproteins): So as principais carreadoras de
colesterol para os tecidos perifricos (cerca de 70% de todo o colesterol no
sangue), quando no interior das clulas as LDL se fragmentam liberando o
colesterol
29
.
As LDL em excesso so as principais causadoras dos depsitos
arteriosclerticos nos vasos sanguneos podendo dar origem ao infarto agudo do
miocardio, angina e acidente vascular cerebral
29
.
HDL (high density lipoproteins): So sintetizadas no intestino e no
fgado, apresentam grande importncia no transporte de colesterol dos tecidos
perifricos para o fgado
30
.

28

Figura 5: Estrutura bsica de uma lipoprotena
34

Ao passar de partculas de maior tamanho para a de menor tamanho, a
densidade protica do envoltrio externo aumenta e o teor de lipdeo presente no
ncleo central diminui. A densidade das lipoprotenas so inversamente
proporcional quantidade de lipdeos, ou seja, quanto menor for a lipoprotena
maior quantidade de lipdeo ela carrega
34
.
A HDL possui menor tamanho, porm possui metade do seu peso formado
por apoprotenas, j a LDL possui cerca de 50% do seu peso representado por
colesterol
34
.
29

Figura 6: Lipoprotenas do plasma sanguneo
34
.

Tabela 3: Relao entre o tamanho e a proporo de lipdeos nas lipoprotenas adaptado
34
.
Qulomcros VLDL IDL LDL HDL
Densidade (g.cm
-3
) < 0,95 < 1,006 1,006-1,019 1,019-1,063 1,063-1,210
Dimetro (A) 750-12000 300-800 250-350 180-250 50-120
% de protena 1,5-2,5 5-10 15-20 20-25 40-55
% de fosfolipdeos 7-9 15-20 22 15-20 20-35
% de colesterol livre 1-3 5-10 8 7-10 3-4
% de triglicrides 84-89 50-65 22 7-10 3-5
% de colesterol 3-5 10-15 30 35-40 12

As principais causas de morte da populao so principalmente pelo infarto
agudo do miocrdio e pelo acidente vascular enceflico. Entre os fatores que
predispem ao aparecimento dessas doenas esto as dislipidemia tanto pelo seu
papel na gnese dessas doenas como pela possibilidade de atuao sobre elas.
A dislipidemia que est mais claramente associada com o aumento do
risco de desenvolvimento de doenas cardiovasculares em particular a
hipercolesterolemia, particularmente nveis elevados de LDL
35,36
.

30

Segundo a Sociedade Brasileira de Cardiologia os nveis ideais de
colesterol so:

Tabela 4: Nveis de colesterol pela Sociedade Brasileira de Cardiologia.

COLESTEROL Nveis Desejveis
Total (mg/dL) < 200
LDL (mg/dL) < 100
Homens > 40
HDL (mg/dL)
Mulheres > 50

3.6 Lipoproteina de baixa densidade (LDL)

A formao da LDL resultado da hidrlise da VLDL, catalisada pela lipase
lipoprotica plasmtica ou ainda pela lipase heptica, que remove os triglicerdeos
desta partcula e como conseqncia forma inicialmente a (lipoprotena de
densidade intermediria) IDL e a seguir a LDL
37
.
A LDL apresenta dimetro de 180 a 250 , constituda por uma molcula
de apolipoprotena apo B-100, e o ncleo constitudo principalmente por colesterol
esterificado
38
.
A remoo da LDL da circulao realizada mais lentamente em
comparao com a remoo das outras lipoprotenas. A captao de LDL
essencialmente feita pelos receptores de LDL presente em clulas que esto em
processo ativo de diviso celular e tambm por tecidos que utilizam colesterol na
sntese de hormnio
34
.
Devido ao seu tamanho, a LDL consegue atravessar o endotlio e alcanar
as paredes vasculares possuindo grande potencial aterognico.
Existem grandes evidencias que demonstram que a LDL circulante quando
se fixa no endotlio das artrias pode sofrer processo oxidativo produzido por
produtos metablicos, radicais livres e enzimas produzidas por macrfagos,
clulas musculares e endoteliais. Esse processo oxidativo catalizado pelos
metais cobre e ferro
38
.
31

Inicialmente, a LDL sofre oxidao sem apresentar modificaes da apo B,
formando a LDL minimamente oxidada que contribui para o estado inflamatrio
das paredes vasculares, atravs da sinalizao celular os moncitos so
recrutados para local onde se diferenciam em macrfagos e aderem-se nas
paredes dos vasos. A LDL fixada nos vasos sanguneo sofre intensa oxidao por
espcies reativas transformando-a em LDL altamente oxidada. Essa fase
marcada pela formao de produtos de decomposio lipdica que reagem com
resduos da apolipoproteina- B, tornando a LDL mais eletronegativa.
Os receptores dos macrfagos passam a reconhecer a LDL oxidada e
conseqentemente passam a capt-la, formando as chamadas clulas
espumosas
38
.
O acmulo das clulas espumosas leva a um processo de inflamao e
espessamento da parede arterial alm da migrao de clulas musculares lisas,
proteoglicanos, fibras colgenas e clulas de tecido conjuntivo denso dando
origem a placa de ateroma
32
.
Com a evoluo do processo h o acmulo de clcio e de clulas
necrticas, o processo pode evoluir para a ruptura e hemorragia da placa. A
placa ainda pode se desprender dos vasos sanguneos ocasionando a deposio
de plaquetas, coagulao sangunea, trombose e ocluso dos vasos
sanguneos
32
.

32

Figura 7: Processo de formao da placa de ateroma

3.7 Principais mtodos para medir Colesterol total e LDL

Colesterol total e suas fraes podem ser determinados por diferentes
variedades de mtodos laboratoriais, porm, os resultados desses mtodos
muitas vezes no exibem completa correspondncia e so expressos de
maneiras diversas. Esta noo importante para a interpretao dos resultados,
isto porque, os valores numricos fornecidos iro depender do mtodo
empregado.
A determinao do colesterol total inclui a medio das formas livres e
esterificadas do esteride, sendo que dois teros do colesterol total encontrado no
plasma esto na forma de ster e o restante na forma livre. Portanto o
conhecimento qumico de diferentes mtodos de medio assim como as
vantagens e as limitaes na escolha do mtodo a ser empregado so de suma
importncia.
Algumas tcnicas a seguir sero citadas:

3.7.1 Mtodo de Liebermann-Burchard

O mtodo se baseia na utilizao do cido sulfrico concentrado
adicionado a uma soluo de colesterol em anidro actico. A reao se processa
33

e ocorre a mudana de colorao que variam do vermelho ao violeta e ao azul
esverdeado. A cor esverdeada devida a formao de um derivado sulfnico de
colesterialeno.
O colesterol poder ser determinado qualitativamente medindo a absoro
do complexo reagente-colesterol em torno de 550nm.

3.7.2 Mtodo de Leffler-McDougald

No mtodo de Leffler- Mc Dougald utiliza-se o isopropanol para precipitar
as protenas e, ao mesmo tempo, extrair o colesterol. Em uma alquota do extrato,
adiciona-se o reativo frrico-actico que, em meio sulfrico, forma um composto
colorido que determinado espectrofotometricamente.

3.7.3 Mtodo que utilizam processo enzimtico- colorimtrico

Esse mtodo baseado na reao de hidrolise dos steres de colesterol
realizado pela enzima colesterol esterease formando como produto colesterol livre
e cido graxos. Em seguida utiliza-se a enzima colesterol oxidase, formando
como produto o perxido de hidrognio que reage com o fenol e 4-
aminoantipirina, catalisado pela peroxidase produz um complexo de cor
avermelhada. A medida de absorbncia (=500nm) proporcional a concentrao
de colesterol na amostra.
Os mtodos mais usuais para a determinao de LDL na rotina de
laboratrio so: LDL direto e o LDL indireto.
O mtodo indireto utilizado amplamente na rotina de laboratrio por
apresentar vantagens, tais como, baixo custo e a facilidade de utilizao. O
mtodo se baseia no clculo de resultados combinados de colesterol total,
colesterol HDL e triglicerdeos usando a equao de Friedwald
39
, onde:
concentrao de triglicerdeos/5 corresponde ao colesterol ligado VLDL. Esse
mtodo requer apenas uma rpida analise dos lipdeos e a rpida precipitao do
HDL sem a necessidade da ultracentrifugao.
A frmula de Friedwald pode ser utilizada apenas no jejum e apresenta
varias limitaes: no pode ser aplicada em amostras com valores de
34

triglicerideos maiores que 400 mg/dL, em amostras com quilomicrons, nem em
amostras de pacientes com disbetalipoproteinemia. Alguns autores ainda
consideram que a formula no deve ser utilizada para pacientes diabticos,
nefropatas e hepatopatas, mesmo com valores de triglicerdeos inferiores a 400
mg/dl
39
.
J nos mtodos diretos, utiliza-se combinaes fsico- qumicas de
surfactantes alm de complexos polimrico e molculas ligantes para medir
seletivamente o colesterol presente na LDL
39
.
Entre os mtodos diretos est o mtodo de primeira gerao que se baseia
na precipitao qumica das partculas de LDL pela utilizao de certos reagentes,
como heparina, polivinilsulfato, polimeros anfipticos inespecificos ou sulfato de
dextran. O LDL-colesterol precipitado pode ser medido diretamente depois de
dissolvido o precipitado.
J o mtodo de segunda gerao, utiliza reagentes contendo anticorpos
policlonais para apo A-I e apo E humanos que ligam-se a perolas de latex
poliestireno e removem partculas de quilomicrons, HDL-colesterol, VLDL-
colesterol e IDL-colesterol, permitindo a determinao direta de LDL-colesterol.
O mtodo de terceira gerao utiliza detergentes especficos que permitem
atingir especificamente o colesterol presente na LDL e medido enzimaticamente
na mesma cubeta
39
.
Comparando os mtodos indiretos e diretos, o mtodo direto apresenta a
vantagem de no sofrer a ao de outras lipoprotenas, alm de conseguir medir
LDL mesmo na presena de triglicerdeos acima de 400 mg/dL e a capacidade de
medir a LDL em indivduos que no esto em jejum
39
.
Porm os mtodos diretos apresentam alto custo, so pouco conhecidos e
muitas vezes apresentam tcnicas demoradas e trabalhosas.
Outras tcnicas utilizadas para a determinao de LDL so a
ultracentrifulgao e a eletroforese
34
.
A ultracentrifulgao a tcnica mais antiga e comum, o princpio dessa
tcnica ajustar apropriadamente a densidade do plasma e dessa forma isolar as
classes e as subclasses das lipoprotenas. No entanto essa tcnica envolve vrias
etapas e requer mais de um dia para ser concluda
34
.
35

A eletroforese uma tcnica amplamente utilizada para as medidas das
subclasses de LDL, utiliza-se gel de agarose submerso em um tampo contido
em uma cuba com diferena de potencial, dessa forma as partculas so isoladas
pelo seu tamanho e pela carga. As desvantagens dessa tcnica a necessidade
de produzir um gel de gradiente uniforme e tambm por ser uma tcnica refinada
que poucos laboratrios fazem uso dela
34
.
Este trabalho visa o estudo da interao entre os complexos EuTcs e as
lipoprotenas de baixa densidade permitindo a obteno de curvas de calibrao
para uma quantificao direta de LDL.

4. MATERIAIS E MTODOS

4.1 Produo das amostras

O preparo e as medidas presentes nesse estudo foram realizadas no
Centro de Lasers e Aplicaes (CLA) do Instituto de Pesquisas Energticas e
Nucleares (IPEN).
As tetraciclinas utilizadas foram importadas de Sigma Aldrich, tampo
MOPS (Carl Roth, Germany), cloreto de eurpio hexa-hidratado (Molecular
Probe), colesterol (kit comercial de dosagem de colesterol (200mg/dL) por mtodo
enzimtico da Laborlab) e a LDL gentilmente cedida pela equipe do Dr Magnus A.
Gidlund do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo (ICB-
USP).
Todos os reagentes foram pesados em uma balana analtica com
preciso de 0,0001g. Durante o procedimento de preparao das amostras
tomou-se os devidos cuidados com a limpeza das vidrarias, evitando assim
possveis contaminaes das amostras.
A Tabela 5 mostra os solventes e reagentes utilizados e as respectivas
nomenclaturas utilizadas para identificar cada um deles.
36

Tabela 5: Solventes e reagentes utilizados
Solventes e reagentes Nomenclatura
Cloreto de Eurpio Hexahidratado EuCl
3
.6H
2
O
Tetraciclina Tc
Clorotetraciclina CTc
Oxitetraciclina OTc
Metatetraciclina MTc
gua bideionizada H
2
0
Hidrxido de sdio NaOH
cido propanesulfnico 3 (N-Morpholino) MOPS
Lipoprotena de baixa densidade LDL
Lipoprotena de baixa densidade oxidada LDL oxidada
Prata Ag
Alumnio Al
Clcio Ca
Cobalto Co
Cobre Cu
Ferro Fe
Magnsio Mg
Mangans Mn
Nquel Ni
Zinco Zn

4.2 Obteno das lipoprotenas

As amostras foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Magnus A. Gidlund e o
procedimento foi realizado por sua aluna Andra M. Monteiro do Instituto de
Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo (ICB-USP). Coletou-se
sangue de doadores voluntrios saudveis normolipidmicos em jejum (12h). O
plasma foi obtido aps centrifugao a 10
3
g, a 4C, por 15 minutos. Depois disso
foi adicionado, ao plasma, benzamidine (2 mM), gentamicina (0.5%), cloranfenicol
(0.25%), PMSF (fenil-metil-sulfonil-fluoreto) (0.5 mM), e aprotinina (0.1 unid/mL).
As lipoprotenas do plasma foram ento isoladas por ultracentrifugao
seqencial. Para isolamento seqencial a densidade do plasma foi ajustada para
VLDL d < 1,006 g/mL, LDL d = 1.030-1.063 g/mL e HDL d = 1.063-1.21g/mL e
ento centrifugado a 10
5
g, 4C, por 20 horas, usando rotor 75 Ti ( Beckman
Instruments). Imediatamente aps a obteno, as lipoprotenas foram dialisadas
37

durante 48h (PBS-EDTA 0,01%) e filtradas (0,22 m de dimetro, Millipore). A
concentrao de protenas foi quantificada utilizando o kit BCA (PIERCE) de
acordo com as instrues do fabricante.
Oxidao das lipoprotenas por ons cobre: As amostras tambm foram
fornecidas pelo Dr. Magnus A. Gidlund e o procedimento foi realizado por sua
aluna Andra M. Monteiro do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de
So Paulo (ICB-USP). Para obteno de LDL oxidada por ons cobre, a
lipoprotena foi dialisada de um dia para o outro em PBS, sem EDTA, seguida de
incubao com CuSO
4
, 20 mM/mg de protena da LDL, 37C, de um dia pa ra o
outro. Obteve-se uma completa oxidao das lipoprotenas definida por uma fase
plat, medida pelo ensaio de TBARS. O processo de oxidao foi finalizado pela
adio de 1 mM de EDTA.

4.3 Solues

Foram preparadas as seguintes solues:

Soluo I: Soluo tampo de MOPS: 2.09 g de MOPS em 1000 mL de gua
destilada (o pH foi ajustado com NaOH para 6.9).

Soluo II: Soluo EuTcs: foram preparadas amostras em diferentes
concentraes de EuCl
3
.6H
2
O para 21 molL
1
das Tetraciclinas (Oxitetraciclina,
Clorotetraciclina e Metatetraciclina) completando o volume com a soluo I para
100 mL aguardou-se 15 minutos para a completa complexao).

Soluo III: EuTcs-LDL: 1mL de soluo III e 10L de LDL (aguardou-se 15
minutos).

Soluo IV: EuTcs-LDL oxidada: 1mL de soluo III e 10L de LDL oxidada
(aguardou-se 15 minutos).

38

Soluo V: Interferentes: Para obter as concentraes dos ons inorgnicos
normalmente encontrados no plasma sanguineo, utilizou-se os sais abaixo
relacionados, diludos em gua bideionizadas:

AgNO
4

Al
2
(SO
4
)
3

CoSO
4
.7H
2
O
CaCl
2
.2H
2
O
Cu(NO
3
)
2
.3H
2
O
FeCl
3
.6H
2
O
MgSO
4
.7H
2
O
MnSO
4
.H
2
O
NiSO
4
.6H
2
O
ZnSO4.7H2O

A tabela abaixo mostra o valor de referncia dos interferentes encontrados
no plasma sanguneo
40,41,42,43,44
:

Tabela 6: Valor de referncia dos interferentes encontrados no plasma sanguneo

Interferentes Valor de referncia no sangue
Ag 0.093 M
Al 12 M
Ca 1.12 M
Co 0.1 M
Cu 11.02 M
Fe 10.74 M
Mg 0.75 mM a 1 mM
Mn 0.2 M
Ni 0.1 M
Zn 20 M

39

4.4 - Tcnicas usadas para caracterizao das amostras

Nesta primeira etapa do trabalho utilizamos apenas as tcnicas de medida
de absoro e emisso. Passaremos a descrev-las.

4.4.1 Medida de Absoro

Os espectros de absoro ptica das amostras foram medidos em
temperatura ambiente, com o auxlio de um espectrofotmetro Olis Cary-17 D, da
Varian, do Laboratrio de Espectroscopia de Absoro ptica do Centro de
Lasers e Aplicaes (CLA) do IPEN, empregando-se cubeta de quartzo com
caminho ptico de 1 mm. As amostras foram analisadas na regio de 200 a 500
nm, com resoluo de 1 nm.

Figura 8: Espectrofotmetro Olis Cary-17 D.

4.4.2 Medida de emisso

Para a obteno dos espectros de emisso foi utilizado o sistema Fluorolog
3 da Jobin Yvon , Figura 9.
As medidas foram realizadas em temperatura ambiente e os espectros de
emisso foram obtidos com o auxilio do software FluorEssence. O aparelho
permite medidas espectrais e temporais.
Em todas as medidas de emisso as amostras foram colocadas em
cubetas com as quatro faces polidas, de 1 mm de caminho ptico.
40

Figura 9: Espectrofotmetro Fluorolog 3.
Excitao : Lmpada de Xe 450 Watts
Acurcia 0.5 nm
Velocidade 150 nm/s
Range 01100 nm
Grades 330 nm (200700 nm range) e 500 nm (3001000 nm range);
Sensibilidade S/N >5000:1 (R928 PMT) em 397 nm, com slits de 5 nm .

4.4.3 Medida de Tempo de vida

As medidas de tempo de vida foram obtidas no mesmo espectrofotmetro,
Figura 9, utilizando como fonte de excitao uma lmpada de xennio pulsada
que fornece a capacidade de discriminao em tempo. Devido a durao de cada
pulso de (~ 3 s), a interferncia da largura do pulso da lmpada durante a
aquisio da curva de decaimento minimizada. A excitao foi fixada em 400
nm e a emisso em 615 nm com 61 flashes em s.

41

5. RESULTADOS E DISCUSSO

A caracterizao dos complexos Eurpio-Tetraciclinas (EuTcs) na
presena de LDL e de LDL oxidada foram realizadas atravs de medidas de
absoro ptica, emisso e tempo de vida. Tambm foram realizadas medidas de
emisso dos complexos de EuTcs na presena de alguns ons comuns no plasma
sanguneo, verificando dessa forma se os mesmos interferem na intensidade de
emisso dos complexos de EuTcs.
5.1 Caracterizao dos complexos Eurpio-Tetraciclinas (EuTcs)
Na primeira etapa do estudo foram preparadas solues de Tcs (soluo
III) e soluo de eurpio na concentrao molar de 63 M. Foram preparadas
tambm as amostras EuTcs (soluo IV) na razo molar de (3:1), conforme
Tabela 7.
As amostras foram agitadas por cerca de 5 minutos para sua
homogeinizao e em seguida foram deixadas em repouso por 15 minutos antes
de serem medidas.
Estas amostras foram estudadas com o objetivo de avaliar o
comportamento espectroscpico das tetraciclinas quando complexadas com o on
eurpio.

Tabela 7: Preparo dos complexos de EuTcs em diferentes razes molares de Eu
3+

As medidas de absoro ptica foram realizadas em temperatura ambiente
nos comprimentos de onda de 200 500 nm.
Concentrao (M)
de
Eurpio

Concentrao (M)
de
Tetraciclinas (Tcs)
Melhores razes molares
de Eurpio e Tcs presente
no complexo
21 21 1: 1
31,5 21 1,5: 1
42 21 2: 1
52,5 21 2,5: 1
63 21 3: 1
73,5 21 3,5: 1
84 21 4: 1
42

A Figura 10a mostra o espectro de absoro ptica das amostras de
Eurpio com concentrao de 63M diludas em MOPS, Tampo MOPS e das
solues de tetraciclinas: Metaciclina (MTc), Clorotetraciclina (CTc),
Oxitetraciclina (OTc) e Tetraciclina (Tc) com concentraes molares de 21M
diludas em tampo MOPS.
Observa-se que o Eurpio em MOPS no apresenta banda de absoro
ptica nos comprimentos de onda medidos (200 500nm), isso pode ser
explicado devido as transies (f-f) do on Eurpio que so proibidas, resultando
em baixo coeficiente de absoro. Portanto a excitao direta desse on em
soluo desfavorvel
45
.
O tampo MOPS tambm no apresenta absoro ptica na faixa de 200
500nm demonstrando que o mesmo no interfere nos resultados obtidos nesse
estudo.
As solues de tetraciclinas apresentam bandas de absoro ptica mais
intensas em 359nm, 357nm, 370nm e 350nm respectivamente para a Tc, OTc,
CTc e MTc.
A Figura 10b mostra o espectro de absoro ptica das tetraciclinas na
presena do eurpio.
Nota-se, que quando as tetraciclinas esto na presena do on eurpio h o
deslocamento das bandas de absoro, o que demonstra a sua complexao com
o on eurpio, Figura 10b.
A MTc foi a que apresentou maior deslocamento da banda de absoro,
quando complexada com o on eurpio quando a banda de absoro em 350 nm
se desloca para 392 nm. O mesmo ocorre com as outras tetraciclinas estudadas,
porm a CTc foi a que apresentou menor deslocamento na banda de absoro
quando complexada com o on eurpio.

43

a) b)
Figura 10: a) Espectro de absoro ptica das amostras de eurpio, tampo, MOPS e
tetraciclinas; b) Espectro de absoro ptica das tetraciclinas na presena do eurpio.

Tabela 8: Valores das posies de mximo dos compostos TC, OTC, CTc e MTc.

A Figura 11a mostra os espectros de emisso das tetraciclinas com
bandas de emisso com mximos em torno de: 540nm, 501nm, 510nm e 544nm
respectivamente para Tc, OTc, MTc e CTc. As amostras foram excitadas nos
comprimentos de ondas relativos as bandas de absoro caracterstica de cada
Tcs, Tabela 8.
Nota-se que as Tcs apresentam em comum largas bandas de emisso,
caractersticas de compostos orgnicos eletroluminescentes. Quando as Tcs
esto complexadas com o on eurpio, Figura 11b, as bandas de emisso dos
complexos passam a ser extremamente finas e definidas, relativas as transies
proibidas (f-f) e oriundas da blindagem realizada pelas subcamadas mais
Compostos

Tcs em soluo
(nm)
EuTcs
(nm)
Shift
(nm)
Tetraciclina (Tc) 359 398
39
Oxitetraciclina (OTc) 357 391
34
Clorotetraciclina (CTc) 370 401
31
Metaciclina (MTc) 350 392
42
300 320 340 360 380 400 420 440
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
D
e
n
s
i
d
a
d
e

p
t
i
c
a

(
D
.
O
)
Comprimento de Onda (nm)
Eu em MOPS
MOPS sozinho
MTc
CTc
OTc
Tc

300 350 400 450 500
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8

D
e
n
s
i
d
a
d
e

p
t
i
c
a

(
D
.
O
)

Comprimento de onda (nm)
3,0 Eu : 1,0 CTc
3,0 Eu : 1,0 OTc
3,0 Eu : 1,0 Tc
3,0 Eu : 1,0 MTc

44

externas, 5s
2
e 5p
6
, o

que impede um maior envolvimento dos eltrons 4f do on
eurpio como o meio externo
45
.
A luminescncia dos complexos EuTcs resultado da energia de excitao
transferida do ligante tetraciclinas (Tcs) para o on Eu
+3
. O forte pico de emisso
(~616 nm) ocorre das transies
5
D
0

7
F
2
46
.
O deslocamento das bandas de emisso das Tcs, para comprimentos de
onda na regio em torno de 615nm, demonstram a efetiva transferncia de
energia intramolecular do ligante (Tcs) para o on Eurpio o que revela a
formao dos complexos de EuTcs. Para a realizaes das medidas dos
complexos EuTcs as amostras foram excitadas nos comprimentos de ondas
relativos s bandas de absoro caracterstica de cada complexo de EuTcs,
Tabela 9.
Analisando a Tabela 9 pode-se observar o deslocamento entre a banda de
absoro e a banda de emisso dos complexos EuTcs.
Os complexos que apresentaram maior deslocamento Stokes foram os
complexos EuOTc e EuMTc com deslocamento de 226nm. J os complexos
EuTc e EuCTc apresentaram deslocamento Stokes de 217nm.

Tabela 9: Bandas de absoro dos compostos EuTC, EuOTC, EuCTc e EuMTc.

Compostos
EuTcs
Absoro
(nm)
Emisso
(nm)
Stokes Shift
(nm)
EuTc 400 617
217
EuOTc 390 616
226
EuCTc 400 617
217
EuMTc 390 616
226
45

a) b)
Figura 11: a) espectros de emisso das tetraciclinas Tc, OTc, MTc e CTc. Espectro das
tetraciclinas Tc, OTc, MTc, CTc complexadas com o on eurpio.

5.2 Estudo dos complexos EuTcs na presena de LDL

5.2.1 Melhores razes molares dos complexos EuTcs na presena de LDL

A escolha das melhores razes molares de eurpio nos complexos EuTcs
na presena de LDL foram realizadas preparando as amostras de acordo com a
Tabela 7. Tambm foi utilizado o volume de 10L de LDL para 1mL dos
complexos de EuTcs. Aps a adio de LDL nos complexos de EuTcs as
amostras foram homogeinizadas por cerca de 5 minutos, em seguida mantidas
em repouso por 15 minutos antes de serem estudadas. Vale ressaltar que todas
as amostras foram preparadas e medidas em triplicatas.
As medidas de absoro ptica foram realizadas no intervalo 200 500
nm. J as medidas de emisso, foram realizadas excitando as amostras nos
comprimentos de onda relativo ao pico da banda de absoro ptica dos
complexos de EuTcs na presena de LDL.
As medidas foram realizadas com o objetivo de eleger a melhor razo
molar de eurpio nos complexos: EuOTc, EuCTc e EuMTc, para a quantificao
de LDL.
Como mencionado no incio desse trabalho, o complexo EuTc foi
extensivamente estudado por diversos pesquisadores devido s suas
propriedades pticas importantes que o torna mais seletivo e sensvel na
bioanlise de algumas molculas. Estudos recentes relataram aumento da
intensidade de emisso do complexo EuTc na razo molar (3:1) na presena de

450 500 550 600 650 700
0,0
2,0x10
5
4,0x10
5
6,0x10
5
8,0x10
5
1,0x10
6
S
i
n
a
l

(
C
o
n
t
.

f
t
o
n
s
)

Tc
CTc
MTc
OTc

570 580 590 600 610 620 630 640
0
1x10
6
2x10
6
3x10
6
4x10
6
5x10
6
6x10
6
7x10
6
8x10
6
9x10
6
1x10
7
3,0 Eu:1,0 Tc
3,0 Eu:1,0 OTc
3,0 Eu:1,0 CTc
3,0 Eu:1,0 MTc
S
i
n
a
l

(
C
o
n
t
.

f
t
o
n
s
)

46

LDL
47
. Portanto elegemos essa razo molar para prosseguimos as medidas do
complexo EuTc.
A Figura 12 mostra o espectro de absoro ptica do complexo EuOTc em
diferentes razes molares de eurpio na presena de 0,517mg/mL de LDL.
As bandas de absoro ptica dos complexos no apresentam
deslocamentos apreciveis, sendo o pico de absoro ptica em torno de 390 nm.
Nota-se maior aumento na banda de absoro do complexo nas razes molares
(4:1) e (3:1) e densidade ptica em torno de 3 x 10
-1
.
240 280 320 360 400 440 480
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35

D
e
n
s
i
d
a
d
e

p
t
i
c
a

(
D
.
O
)
1,0 Eu: 1,0 OTc + 10L de LDL (0,517mg/mL)

Figura 12: Espectro de absoro do complexo EuOTc em diferentes razes molares de eurpio
na presena de LDL

Posteriormente realizou-se medidas de emisso excitando as amostras dos
complexos de EuOTc no comprimento de onda de 390nm, Figura 13.
O complexo EuOTc na presena de LDL (0,517 mg/mL) apresentou maior
intensidade de emisso na razo molar de (1:1), com pico de emisso em torno
de 616 nm e intensidade de emisso em torno de 6 x10
6
ftons.

47

570 580 590 600 610 620 630 640
0
1x10
6
2x10
6
3x10
6
4x10
6
5x10
6
6x10
6
7x10
6

S
i
n
a
l

(
C
o
n
t
.

f
t
o
n
s
)

Figura 13: Espectro de emisso dos complexos de EuOTc

A Figura 14, mostra o espectro de absoro ptica do complexo EuCTc em
diferentes razes molares de eurpio na presena de 2,96 mg/mL de LDL.
As bandas de absoro ptica dos complexos apresentaram pico de
absoro ptica em torno de 400 nm. Nota-se maior aumento na banda de
absoro do complexo na razo molar de (2:1) e adensidade ptica em torno de
5x10
-1

300 350 400 450 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8

D
e
n
s
i
d
a
d
e

p
t
i
c
a

(
D
.
O
)
1,0 Eu: 1,0 CTc + 10L de LDL (2,96 mg/mL)

Figura 14: Espectro de absoro ptica do complexo EuCTc em diferentes razes molares de
eurpio na presena de LDL.

Em seguida, foram realizadas as medidas de emisso excitando as
amostras em 400nm, Figura 15.
48

O complexo EuCTc na presena de LDL (1,75 mg/mL) apresentou maior
intensidade de emisso na razo molar de (1,5:1) com pico de emisso em torno
de 616 nm e intensidade de emisso em torno de 4,4 x 10
6
ftons de emisso.
570 580 590 600 610 620 630 640
0
1x10
6
2x10
6
3x10
6
4x10
6
5x10
6

S
i
n
a
l

(
C
o
n
t
.
f
t
o
n
s
)
1,5 Eu:1,0 CTc + 10L de LDL (1,75 mg/mL)

Figura 15: Espectro de emisso dos complexos de EuCTc

A Figura 16, mostra o espectro de absoro ptica do complexo EuMTc
em diferentes razes molares de eurpio na presena de 3,6 mg/mL de LDL.
As bandas de absoro ptica dos complexos apresentaram pico de
absoro ptica em torno de 390 nm. O pico de absoro ptica do complexo
EuMTc nas razes molares (1:1), (2:1) e (3:1) foram as que apresentaram maior
densidade ptica, em torno de 3 x 10
-4
.
200 240 280 320 360 400 440 480
0,000
0,025
0,050
0,075
0,100

D
e
n
s
i
d
a
d
e

p
t
i
c
a

(
D
.
O
)
1,0 Eu: 1,0 MTc + 10L de LDL (3,6 mg/mL)

Figura 16: Espectro de absoro ptica do complexo EuMTc em diferentes razes molares de
eurpio na presena de LDL.

49

As medidas de emisso foram excitadas no comprimento de onda de
390nm. O complexo EuMTc na presena de LDL (1,5 mg/mL) apresentou maior
intensidade de emisso na razo molar de (1,5:1) com pico de emisso em torno
de 615 nm e intensidade de emisso em torno de 5,0 x 10
6
ftons de emisso,
Figura 17.
570 580 590 600 610 620 630 640
0
1x10
6
2x10
6
3x10
6
4x10
6
5x10
6
6x10
6
1,0 Eu:1,0 MTc + 10L de LDL (1,5 mg/mL)
S
i
n
a
l

(
C
o
n
t
.

f
t
o
n
s
)

Figura 17: Espectro de emisso dos complexos de MTc

As medidas realizadas com os complexos EuTcs revelaram que no
ocorreram deslocamentos nos comprimentos de onda dos espectros de absoro
e de emisso na presena de LDL, o que evidencia a ausncia de interao direta
entre as Tcs e as molculas de LDL
48
.
As melhores razes molares dos complexos EuTcs na presena de LDL
foram: EuTc (3:1), EuOTc (1:1), EuCTc (1,5:1) e EuMTc (1,5:1).

5.2.2 Comparao dos complexos EuTcs na presena de diferentes
concentraes de LDL

Aps a escolha das melhores razes molares dos complexos EuTcs,
prossegue-se o estudo com os complexos EuTcs em suas melhores razes
molares na presena de diferentes concentraes de LDL.
50

Realizou-se as medidas de emisso excitando as amostras nos
comprimentos de onda relativo ao pico da banda de absoro ptica dos
complexos de EuTcs na presena de LDL.
As amostras foram preparadas de maneira idntica etapa anterior,
porm nessa etapa utilizamos diferentes concentraes de LDL, as amostras e as
medidas foram realizadas em triplicata.
Os espectros de emisso das EuTcs com LDL esto apresentados na
Figura 18, Figura 19, Figura 20 e Figura 21. As amostras foram excitadas nos
comprimentos de ondas de 390nm para os complexos EuOTc e EuMTc e 400 nm
para os complexos EuTc e EuCTc; todos na presena de diferentes
concentraes de LDL.
A Figura 18 mostra o espectro de emisso do complexo EuOTc na
presena de LDL nas concentraes (mg /mL): 0; 0,20; 0,50; 1,00; 1,75; 2,00 e
2,50.
Verifica-se que o complexo EuOTc (1:1) na presena de LDL nas
concentraes de 1,50; 1,75; 2,0 e 2,5 mg/mL apresentaram praticamente o
mesmo aumento na intensidade de emisso, em torno de 20 x 10
6
ftons, o que
revela uma saturao dos stios de ligao do complexo EuOTc, isto , os sitos j
foram ocupados pelas molculas de LDL e mesmo com o aumento da
concentrao de LDL no h mais stios para as mesmas se ligarem.
A Figura 19 mostra o espectro de emisso do complexo EuMTc (1,5:1) na
presena de LDL nas concentraes (mg/mL): 0; 0,50; 1,00; 1,50;1,75; 2,00 e
2,50. Pode-se observar que no houve aumento gradativo da emisso do
complexo com o aumento da concentrao de LDL. As concentraes mais
baixas apresentaram praticamente a mesma intensidade de emisso comparada
com as concentraes mais altas. As amostras apresentaram intensidades em
torno de 5 x 10
6
ftons.
A Figura 20 e a Figura 21 mostram os espectros de emisso dos
complexos EUCTc (1,5:1) e EuTc (3:1) na presena de LDL na concentraes
(mg/mL): 0; 0,20; 0,50; 1,00;1,50; 1,75; 2,00; 2,50 e 3,00. Nota-se um aumento
gradativo na intensidade de emisso dos complexos com o aumento da
concentrao de LDL. Os complexos apresentaram maior intensidade de emisso
51

na presena de LDL na concentrao de 3,0 mg/mL, com intensidade em torno
de 13 x 10
6
ftons.

560 580 600 620 640 660 680 700 720
0,0
4,0x10
6
8,0x10
6
1,2x10
7
1,6x10
7
2,0x10
7

S
i
n
a
l

(
C
o
n
t
.
f
t
o
n
s
)
1,0 Eu: 1,0 OTc

560 580 600 620 640 660 680 700 720
0
1x10
6
2x10
6
3x10
6
4x10
6
5x10
6

S
i
n
a
l

(
C
o
n
t
.
f
t
o
n
s
)
1,5 Eu:1,0 MTc

560 580 600 620 640 660 680 700 720
0,0
4,0x10
6
8,0x10
6
1,2x10
7

S
i
n
a
l

(
C
o
n
t
.
f
t
o
n
s
)
3,0 Eu:1,0 Tc
3,0 Eu:1,0 Tc + 10L de LDL (0,20mg/mL)
3,0 Eu:1,0 Tc + 10L de LDL (0,50mg/mL)
3,0 Eu:1,0 Tc + 10L de LDL (1,00mg/mL)
3,0 Eu:1,0 Tc + 10L de LDL (1,50mg/mL)
3,0 Eu:1,0 Tc + 10L de LDL (1,75mg/mL)
3,0 Eu:1,0 Tc + 10L de LDL (2,00mg/mL)
3,0 Eu:1,0 Tc + 10L de LDL (2,50mg/mL)
3,0 Eu:1,0 Tc + 10L de LDL (3,00mg/mL)
560 580 600 620 640 660 680 700 720
0,0
4,0x10
6
8,0x10
6
1,2x10
7

S
i
n
a
l

(
C
o
n
t
.
f
t
o
n
s
)
1,5Eu: 1,0 CTc
1,5Eu: 1,0 CTc + 10L de LDL (0,20mg/mL)
1,5Eu: 1,0 OTc + 10L de LDL (2,50mg/mL)

Para propor os possveis stios de complexao das Tcs com o on
eurpio na presena de LDL, foram necessrios conhecer os possveis stios de
ligao das tetraciclinas no pH de estudo,Figura 22.
De acordo com alguns estudos as tetraciclinas apresentam em geral 3
constantes de acidez (pKa) que variam em torno dos seguintes valores: pKa1=
3,30, pKa2 = 7,29 e pKa3 = 9,88; h controvrsias quanto aos stios de ligaes
das tetraciclinas no pH em torno de 7.
Figura 19:

Figura 18:
Figura 21:

Figura 20:
Figura 18: Espectro de emisso de EuOTc
com LDL
Figura 19: Espectro de emisso de EuMTc
com LDL
Figura 20: Espectro de emisso de EuCTc
com LDL

Figura 21: Espectro de emisso de EuTc
com LDL
52

Hirschy e colaboradores observaram que em pH 7 as tetraciclinas
apresentaram ionizao das hidroxilas presentes nos anis BCD
3
. J Xia e
colaboradores investigaram pela tcnica fluoromtrica, que em torno desse pH a
hidroxila do C(3) ionizada, possibilitando a ligao com o on eurpio
49
.
Sanli et al em estudo recente determinaram a protonao das Tcs pelas
tcnicas de potenciometria e cromatografia lquida e obtiveram o resultado que
nessa faixa de pH, a regio ionizada nas tetraciclinas foi o sistema fenol -
dicetona compreendido entre C(10) C(12) dos anis BCD
50
.
De acordo com esses estudos e com os resultados que foram obtidos, foi
proposto que as Tcs apresentem stios de ligao semelhantes para o on
eurpio, isso porque todas apresentam uma estrutura qumica em comum, Figura
22. Porm existem regies diferenciadas, caracterizadas pela presena de
diferentes radicais localizados nas molculas das tetraciclinas, o que
possivelmente diferencia os stios de ligaes com o on eurpio resultando em
maior ou menor intensidade de emisso dos complexos formados.

R
1
R
2
R
3
R
4

Tetraciclina H CH
3
OH H
Clortetraciclina Cl CH
3
OH H
Oxitetraciclina H CH
3
OH OH
Metaciclina H CH
2
- OH
Figura 22: Possveis stios em comum de ligaes do on eurpio com as Tcs

A menor intensidade de emisso do complexo EuMTc na presena de LDL
pode ser explicada analisando a estrutura qumica da MTc. Na Figura 22
possvel observar que a MTc apresenta em sua estrutura qumica o radical CH
2

53

localizado em R2, diferentemente das outras tetraciclinas que apresentam os
radicais CH
3
e OH em R2 e R3 respectivamente.
O radical CH
2
favorece a hidrofobicidade na molcula de MTc devido a
caracterstica no-polar do radical, Figura 23. Dessa forma o on eurpio
impedido de se ligar nesse stio da molcula, diferente do que acontece com as
outras Tcs.

H
OH OH
OH
N(CH
3
)
2
OH
O O
CONH
2
CH
2
H H
OH

Figura 23: Molcula de MTc

J o complexo EuOTc apresenta maior intensidade de emisso na
presena de LDL. Provavelmente o pH em torno de 7 provoca a ionizao das
hidroxilas presentes em R3 e R4 favorecendo a ligao do on eurpio nesses
stios da molcula, Figura 24.

H
OH OH
OH
C H
3
OH
N(CH
3
)
2
OH
OH
O O
CONH
2
H H

Figura 24: Molcula de OTc

As molculas de LDL apresentam um importante papel no aumento da
intensidade de emisso dos complexos de Tcs. Visto que as medidas realizadas
com os complexos EuTcs no apresentaram deslocamentos nos comprimentos
de onda dos espectros de absoro e de emisso na presena de LDL, pode-se
deduzir que h ausncia de interao direta entre as molculas de Tcs e as
molculas de LDL.
A formao dos complexos EuTcs no completam o nmero de
coordenao do on eurpio que geralmente oito, portanto os complexos EuTcs
54

apresentam cargas lquidas positivas relativa ao nmero de coordenao
incompleto do on eurpio
47
. Com isso, o on eurpio interage com grupamentos
que possam estar ionizados com cargas negativas como, por exemplo, hidroxilas
e grupos fosfatos presentes na superfcie da LDL dessa forma completando o
nmero de coordenao do on eurpio.
A molcula de LDL apresenta em sua superfcie uma monocamada
constituda por fosfolipdios, colesterol no esterificado e apoprotenas que so
formadas por resduos de aminocidos
51
.
Os fosfolipdios so molculas anfipticas, isto , apresentam uma regio
polar caracterizada pelo grupo fosfato e uma regio apolar constituda por duas
longas cadeias de hidrocarbonetos. As duas cadeias de hidrocarbonetos se
estendem para o interior da particula e a parte polar se volta para o exterior onde
se encontra a fase aquosa
52
.
O grupo fosfato localizado na regio polar da particula de LDL quando em
soluo, apresenta-se com carga negativa; essa carga negativa pode interagir
com o on eurpio atravs da interao eletrosttica ou ainda como um co-ligante
completando o nmero de coordenao do on eurpio ligado as Tcs.
O colesterol no - esterificado apresenta uma regio polar caracterizada
pela hidroxila que se localiza na regio hidroflica da monocamada da molcula de
LDL, j o restante da molcula de colesterol caracteriza-se pelos quatro anis
fundidos localizados na regio interna da monocamada
52
. A hidroxila
possivelmente interage com o on eurpio semelhante como ocorre com o grupo
fosfato.
A formao do complexo ternrio EuTcs-LDL favorece o aumento da
fluorescncia do on eurpio diminuindo a perda de energia no radiativa para as
molculas de gua
53
.

55

Figura 25: Monocamada da particula de LDL ilustrando as regies hidroflica (regio externa) e
hidrofbica (regio interna) da molcula

5.2.3 Curva de calibrao dos complexos na presena de LDL

A construo da curva de calibrao de fundamental importncia para
descrever a resposta de um detector sobre uma faixa de concentrao de LDL.
Dessa forma, uma curva de calibrao permite a determinao da concentrao
de uma substncia em uma amostra desconhecida
54
.
As concentraes de LDL e a resposta do instrumento para cada padro
podem ser ajustadas atravs da equao da reta, expressa como: y = a + bx

,
onde (y) a resposta do instrumento de medida, (a) uma constante que
descreve o rudo de fundo e (b) representa o coeficiente angular. As
concentraes desconhecidas de LDL expressa por (x) que podem ser
calculadas a partir desta equao.
O coeficiente de deteco, definido como a concentrao mnima do
analito, foi calculado pela frmula: LD = 3/m, onde () a incerteza da medida
do parmetro b e (m) o coeficiente angular
54
.
A linearidade do mtodo foi determinada pela anlise de regresso linear
com auxlio do software Origin 7.0
.
Aps a realizao das medidas de emisso, as curvas de calibrao foram
construdas integrando a rea do grfico de emisso entre 560 a 720 nm, em
seguida foi plotado um grfico correlacionando a rea do sinal de emisso

Grupo
Hidroxila
Grupo
Fosfato
Regio
Hidroflica
Regio
Hidrofbica
Molcula de colesterol
Fosfolipdio
56

-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6
2,1x10
8
2,4x10
8
2,7x10
8
3,0x10
8
3,3x10
8
3,6x10
8
EuOTc (1:1) + LDL
r
e
a

(
u
n
i
d
.

a
r
b
.
)
[LDL]mg/mL
Equao: a+ bx
Coeficientes Valores Desvio padro
a 2,18E8 0,02E8
b 1,28E8 0,04E8
r
2
0,99

(Contagem de ftons) em funo da concentrao de LDL. Para cada curva
obtida estimou-se um erro de 5%.
A Figura 26 mostra a curva de calibrao do complexo EuOTc na presena
de diferentes concentraes de LDL.
Os resultado foram descritos pela funo linear (y = a + bx) entre 0 a 1,0
mg/mL de LDL, onde os valores de equao da reta com seus desvios padro
foram: a = (2,18 0,02) x 10
8
e b = (1,28 0,04) x 10
8
mg/mL. O limite de
deteco foi de 0,10 mg/mL.
Verifica-se que o complexo EuOTc na presena de LDL nas concentraes
de 1,50; 1,75; 2,00 e 2,50mg/mL apresentaram praticamente o mesmo aumento
na intensidade de emisso, o que revela uma saturao no nmero de
coordenao do on eurpio, isto , mesmo com o aumento da concentrao de
LDL no h mais stios para as mesmas se ligarem.
De acordo com a Sociedade Brasileira de Cardiologia acima de 1,6mg/mL
o indivduo apresenta um nvel no desejvel de LDL no sangue e
conseqentemente maior risco de adquirir doenas cardiovasculares
35
. Portanto a
saturao da emisso do complexo EuOTc a partir da concentrao de 1,00
mg/mL de LDL impossibilitaria a medio de LDL de indivduos que apresentam
nveis no desejveis de LDL
35
.

Figura 26: Curva de calibrao do complexo EuOTc na presena de diferentes concentraes de
LDL

A Figura 27, mostra a curva de calibrao do complexo EuMTc na
presena de diferentes concentraes de LDL. Analisando a curva de calibrao
possvel observar que aumentando a concentrao de LDL no ocorre o aumento
da intensidade de emisso, o que dificultaria a quantificao de LDL.
57

-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8 3,2
9,0x10
7
1,2x10
8
1,5x10
8
1,8x10
8
2,1x10
8
EuTc (3:1) + LDL
r
e
a

(
u
n
i
d
.

a
r
b
.
)
[LDL]mg/mL
Equao: a+ bx
a 1,09E8 0,05E8
b 0,40E8 0,04E8
r
2
0,95

-0,3 0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7
0,0
2,0x10
7
4,0x10
7
6,0x10
7
8,0x10
7
1,0x10
8

r
e
a

(
u
n
i
d
.

a
r
b
.
)
[LDL] mg/mL
EuMTc (1,5:1) + LDL

Figura 27: Curva de calibrao do complexo EuMTc na presena de diferentes concentraes de
LDL

A Figura 28 mostra a curva de calibrao do complexo EuTc na presena
de LDL. Os resultados plotados so descritos pela funo linear entre 0 a 2,00
mg/mL de LDL, os valores de equao foram: a = (1,09 0,05) x 10
8
e b = (4,1
0,4) x 10
7
mg/mL e o limite de deteco foi de 0,29 mg/mL.

Figura 28: Curva de calibrao do complexo EuTc na presena de diferentes concentraes de
LDL

A Figura 29, mostra a curva de calibrao do complexo EuCTc na
presena de diferentes volumes de LDL. Os resultados plotados so descritos
pela funo linear entre 0 a 2,00 mg/mL de LDL, obtendo os seguinte parmetros:
a = (4,7 0,4) x 10
7
e b = (6,1 0,3) x 10
7
(mg/mL). O limite de deteco de 0,15
mg/mL.

58

Equao: a+ bx
a 4,69E7 0,40E7
b 6,13E7 0,32E7
r
2
0,99

-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8 3,2
4,0x10
7
8,0x10
7
1,2x10
8
1,6x10
8
2,0x10
8
EuCTc (1,5:1) + LDL
r
e
a

(
u
n
i
d
.

a
r
b
.
)
[LDL]mg/mL

Figura 29: Curva de calibrao do complexo EuCTc na presena de diferentes concentraes de
LDL

Comparando as curvas de calibrao dos complexos EuCTc e EuTc na
presena de LDL possvel notar que o complexo EuCTc apresentou maior
linearidade na curva de calibrao e menor limite mnimo de deteco de LDL.
Os complexos EuMTc e EuOTc no apresentaram resultados adequado
para quantificao de LDL; o complexo EuMTc no apresentou linearidade em
sua curva de calibrao com o aumento progressivo da concentrao de LDL, o
que dificultaria a quantificao da mesma. J o complexo EuOTc na presena de
LDL apresentou uma saturao em sua curva de calibrao a partir da
concentrao de 1,00 mg/mL de LDL o que impediria quantificar concentraes
acima desse nvel.
Sendo assim prosseguimos o estudo com os complexos EuTc e EuCTc na
presena de LDL por apresentar maior linearidade na presena de concentraes
maiores de LDL.

5.2.4 Tempo de vida dos complexos EuTc e EuCTc na presena de LDL

A medida de tempo de vida, assim como as medidas de absoro ptica e
de emisso uma importante medida para a caracterizao dos complexos.
O tempo de vida o tempo que o sistema demora para retornar ao estado
fundamental, isto , o tempo de transio
5
D
0
7
F
2
do eurpio presente no
complexo.
Geralmente sistemas complexos podem apresentar mltiplas espcies
fluorescentes, e sendo assim, o perfil de decaimento da intensidade de
59

fluorescncia no pode ser ajustado por uma funo exponencial simples. Dessa
forma, foi ajustado por uma exponencial dupla:

( ) ) / (
2
/
1 0
2 1
t t
e A e A y y

+ + =
( 1)

onde o eixo y representa a intensidade do sinal (u.a) e o eixo x representa o
tempo (s),
1
e
2
so os tempos de decaimento e A
1
e A
2
so as amplitudes do
sinal
55
.
No caso de decaimento com mltiplas exponenciais, a mdia do tempo de
vida (
av
), proporcional a rea total abaixo da curva de decaimento da
fluorescncia, definida por:

=
i
i i
i
i i
av
A
A
2

( 2 )

Comparando o tempo de vida dos complexos EuTc e EuTc com LDL
(1,5mg/mL), Figura 30 e Figura 31 pode-se notar um expressivo aumento no
tempo de decaimento na amostra que contm LDL.
As mdias do tempo de vida para as amostras so: 32,64 s e 50,16 s
para EuTc e para a EuTc com LDL (1,5mg/mL), respectivamente.
O aumento no tempo de vida tambm pode ser notado analisando a Figura
30 e a Figura 31, que demonstram um expressivo aumento no tempo de vida do
complexo EuCTc na presena da lipoprotena. As mdias do tempo de vida para
as amostras so: 11,25s e 45,82s para EuCTc e para a EuCTc com LDL
(1,5mg/mL) respectivamente.
Para esse expressivo aumento no tempo de vida dos complexos na
presena de LDL, sugerimos que as molculas de gua na soluo contendo LDL
so agrupadas em torno das hidroxilas e dos grupos fosfatos das partculas de
LDL, isolando dessa forma o on eurpio que se encontra ligado com as
molculas de tetraciclinas. Com menos molculas na vizinhana do on eurpio, a
transferncia de energia para as molculas de gua minimizada, e a energia
60

ento praticamente mantida para o on eurpio, aumentando o tempo de vida e a
intensidade da luminescncia, resultando em um melhor rendimento quntico
47
.
Apesar do complexo EuCTc na presena de LDL apresentar menor tempo
de vida comparado com o complexo EuTc na presena de LDL, essa diferena
no to expressiva.
Analisando o grande aumento no tempo de vida do complexo EuCTc com
LDL comparado com o complexo EuCTc, podemos notar o efetivo isolamento do
on eurpio, sendo a diferena no aumento do tempo de vida cerca de 4 vezes.
Devido a este resultado, pode-se considerar que a medida temporal com a
utilizao do complexo EuCTc apresenta perspectivas promissoras na
quantificao de LDL. importante ressaltar que estudos de interferentes neste
sistema so de fundamental importncia para a aplicabilidade do complexo.

0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
0,0
2,0x10
4
4,0x10
4
6,0x10
4
8,0x10
4
1,0x10
5
1,2x10
5
1,4x10
5
S
i
n
a
l

(
u
.
a
)

Tempo (ms)
3,0 Eu: 1,0 Tc
3,0 Eu: 1,0 Tc + LDL (1,5 mg/mL)

0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
0,0
5,0x10
3
1,0x10
4
1,5x10
4
2,0x10
4
2,5x10
4
3,0x10
4
3,5x10
4
4,0x10
4
4,5x10
4
5,0x10
4
5,5x10
4

S
i
n
a
l

(
u
.
a
)
Tempo (ms)
1,5 Eu: 1,0 CTc
1,5 Eu:1,0 CTc + LDL (1,5mg/mL)

Tabela 10: Parmetro do ajuste das equaes 1 e 2, para os dados experimentais da Figura0.

Complexo Parmetros
av
( s)
EuTc
A
1
(7,0 0,4).10
4
A
2
(8,6 0,5).10
4

1
(2,00 0,06).10
2

2
(3,80 0,06).10
2

32,64
EuTc+LDL
A
1
(4,5 0,3).10
4
A
2
(1,27 0,02).10
4

1
(7,39 0,32).10
2

2
(2,17 0,04).10
2

50,16
Figura 31 Figura 30 Figura 30: Tempo de vida do complexo
EuTc com LDL

Figura 31: Tempo de vida do complexo
EuCTc com LDL

61

Tabela 11: Parmetro do ajuste das equaes 1 e 2, para os dados experimentais da Figura1.

5.2.5 Complexos EuTc+LDL e EuCTc+LDL na presena de possveis interferentes
inorgnicos.

Os complexos EuTc+LDL e EuCTc+LDL apresentaram os melhores
resultados at essa etapa do estudo. Portanto esses complexos foram eleitos
para a realizao das medidas de emisso na presena de possveis interferentes
inorgnicos encontrados normalmente no plasma sanguneo.
As amostras foram preparadas utilizando 500L dos complexos de EuTc
(3:1) e EuCTc (1,5:1) acrescidos de 10L de LDL e 500L de ons inorgnicos
nas concentraes normalmente encontradas no plasma sanguneo, Tabela 7. As
amostras ficaram em repouso por 15 minutos antes de se realizar as medidas de
emisso. As medidas de emisso foram realizadas excitando as amostras nos
comprimentos de onda de 400nm.
O Grfico 1 e o Grfico 2 foram construdas com o objetivo de avaliar as
possveis interferncias dos ons inorgnicos em relao a intensidade de
emisso dos complexos EuTc+LDL e EuCTc+LDL.
As tetraciclinas formam complexos de coordenao estveis com ons
metlicos da primeira srie de transio, entre eles esto os ons utilizados no
estudo
56
: Mg
2+
, Mn
2+
, Fe
2+
, Co
2+
, Ni
2+
, Cu
2+
, Ca
2+
e Zn
2+
.
Palm e colaboradores
56
utilizaram a tcnica de cristalografia para
demonstrar que os ctions divalentes, citados acima, complexam com a
tetraciclina no sistema dicetona compreendidos entre os carbonos (C11-C12) dos
anis BCD das tetraciclinas, semelhante ao que ocorre com o on eurpio, a
Figura 32 mostra o stio de ligao dos ctions divalentes representados por
Me
2+
.
Complexo Parmetros
av
( s)
EuCTc
A
1
(4,00 0,01).10
4
A
2
(4,00 0,01).10
4

1
(1,13 0,03).10
2

2
(1,13 0,03).10
2

11,25
EuCTc + LDL
A
1
(6,19 0,07).10
4
A
2
(2,5 0,1).10
4

1
(1,26 0,04).10
2

2
(6,2 0,2).10
2

45,82
62

Figura 32: Stio de ligao dos ctions divalentes

O estudo ainda constatou que apesar dos ctions divalentes se ligarem ao
mesmo stio a fora de ligao varia de on para on, uma das explicaes a
relao do tamanho do raio inico com a fora de ligao do on com o stio da
tetraciclina, dessa forma quanto menor for o raio inico mais forte a ligao do
on ao stio de ligao. O on Cu
2+
relatado no estudo de Palm foi o on que
apresentou maior fora de ligao com a tetraciclina, j o on Ca
2+
apresentou
uma baixa energia de ligao.
Os resultados obtidos neste trabalho, utilizando os complexos EuTcs+ LDL
na presena de interferentes inorgnicos, mostraram que o on Cu
2+
foi o on que
mais interferiu na emisso dos complexos, o que pode ser explicado pela grande
afinidade pelo stio de ligao e pela competio com o on eurpio pelo mesmo
stio, resultando em baixa emisso dos complexos EuTcs+LDL.
No complexo EuCTc+LDL o on Cu
2+
interferiu ainda mais na intensidade
do complexo, provavelmente devido ao cloro, presente na molcula da
clorotetraciclina, apresentar uma alta eletronegatividade, o que favorece a
interao com o on Cu
2+
.
No estudo realizado por Raya e colaboradores consideraram que os ons
Fe
3+
, Ni
2+
, Co
2+
podem interferir na intensidade de emisso dos complexos de
EuTcs devido sobreposio de seus espectros de absoro com algumas
Me
2+

63

bandas de emisso do on eurpio
57
. Pode-se observar as interferncias na
emisso do on eurpio nos complexos de EuTcs+LDL observando o Grfico 1 e
o Grfico 2.
Comparando de uma maneira geral os dois complexos na presena de ons
inorgnicos possvel afirmar que o complexo EuTc+LDL foi o que sofreu menor
interferncia em sua intensidade de emisso, comparado com o complexo
EuCTc+LDL na presena dos mesmos ons.

Grfico 1: Complexo EuTc+LDL na presena de interferentes inorgnicos

Grfico 2: Complexo EuCTc+LDL na presena de interferentes inorgnicos

64

5.3 Medidas dos complexos EuTcs na presena de LDL oxidada

5.3.1 Comparao das curvas de calibrao dos complexos EuTcs na presena
de diferentes concentraes de LDL oxidada.

Nessa etapa do estudo foram realizadas as medidas de emisso dos
complexos de EuTcs na presena de LDL oxidada para observar seu
comportamento em relao a intensidade de emisso dos complexos.
As medidas de emisso do complexo EuTc, EuCTc e EuOTc na presena
de diferentes volumes de LDL oxidada foram realizadas em triplicata, excitando os
complexos EuTc e EuCTc em 400 nm e EuOTc em 390 nm. Para a construo da
curva de calibrao dos complexos EuTcs na presena de diferentes
concentraes de LDL oxidada, foi realizada a integrao das reas das bandas
dos espectros de fluorescncia (obtidos em triplicata para cada concentrao de
LDL oxidada) calculada e plotada em funo das concentraes de LDL oxidada.
As concentraes de LDL oxidada (mg/mL) utilizadas nesse experimento so: 0;
0,20; 0,50; 1,00; 1,50; 2,00; 2,50 e 3,00.
A partir das curvas de calibrao apresentadas para todos os complexos
estudados, a presena de LDL oxidada leva a um aumento na intensidade de
emisso do eurpio no complexo. Os resultados foram descritos pela funo
linear (y = a + bx) onde x a concentrao de lipoprotena oxidada.
A curva de calibrao do complexo EuOTc na presena de LDL oxidada foi
construda com intervalo de linearidade entre (0 a 1,00mg/mL), os valores dos
parmetros obtidos foram: a = (2,18 0,02) x 10
8
e b = (1,35 0,03) x 10
8

(mg/mL) e o limite de deteco foi de 0,06mg/mL (definido como 3 /inclinao,
onde a incerteza da medida do parmetro b, Figura 33. A saturaao da
emisso do complexo EuOTc a partir da concentrao de 1,00 mg/mL de LDL
oxidada limita a utilizao desse complexo.

65

Equao: a+ bx
a 2,18E8 0,02E8
b 1,35E8 0,03E8
r
2
0,99

Equao: a+ bx
a 0,54E8 0,06E8
b 0,54E8 0,03E8
r
2
0,98

0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8
2,0x10
8
2,4x10
8
2,8x10
8
3,2x10
8
3,6x10
8
EuOTc (1:1) + LDL

r
e
a

(
u
n
i
d
.

a
r
b
.
)
[LDL oxidada]mg/mL

Figura 33: Curva de calibrao do complexo EuOTc na presena de LDL oxidada

A curva de calibrao do complexo EuCTc na presena de LDL oxidada foi
construda com intervalo de linearidade entre (0 a 3,0mg/mL), Figura 34. Os
resultados dos parmetros obtidos foram: a = (0,54 0,06) x 10
8
e b = (0,54
0,03) x 10
8
(mg/mL) e o limite de deteco foi de 0,16 mg/mL.

-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8 3,2
4,0x10
7
8,0x10
7
1,2x10
8
1,6x10
8
2,0x10
8
2,4x10
8
EuCTc (1,5:1) + LDL oxidada
r
e
a

(
u
n
i
d
.

a
r
b
.
)
[LDL oxidada]mg/mL

Figura 34: Curva de calibrao do complexo EuCTc na presena de LDL oxidada

J a curva de calibrao do complexo EuTc na presena de LDL oxidada
foi construda com intervalo de linearidade entre (0 a 3,00mg/mL), os resultados
dos parmetros obtidos foram: a = (1,32 0,02) x 10
8
e b = (0,33 0,01) x
10
8
(mg/mL) e o limite de deteco foi de 0,09 mg/mL, Figura 35.

66

Equao: a+ bx
a 1,32E8 0,02E8
b 0,33E8 0,01E8
r
2
0,99

-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8 3,2
1,2x10
8
1,5x10
8
1,8x10
8
2,1x10
8
2,4x10
8
EuTc(3:1) + LDL oxidada
r
e
a

(
u
n
i
d
.

a
r
b
.
)
[LDL oxidada]mg/mL

Figura 35: Curva de calibrao do complexo EuTc na presena de LDL oxidada

Os complexos EuTc e EuCTc apresentaram maior range de deteco em
comparao com o complexo EuOTc. J comparando as curva de calibrao dos
complexos EuTc e EuCTc na presena de LDL oxidada possvel notar maior
linearidade na curva de calibrao do complexo EuTc e o limite de deteco
desse complexo tambm menor tornando-o mais adequado para a quantificao
de LDL em concentraes menores.

5.3.2 Tempo de vida dos complexos EuTc e EuCTc na presena de LDL oxidada

Os complexos EuTc e EuCTc foram os que apresentaram melhores
desempenho na presena de LDL oxidada. Portanto prosseguimos o estudo com
as medidas de tempo de vida para esses complexos.
Analisando a Figura 36, Figura 37, Tabela 12 e Tabela 13, possvel
notar um expressivo aumento no tempo de decaimento na amostra que contm
LDL oxidada. As mdias do tempo de vida para as amostras so: 32,64 s e
47,97s para EuTc e EuTc com LDL oxidada (1,5mg/mL) respectivamente. J
para as amostras EuCTc e EuCTc na presena de LDL oxidada (1,5mg/mL) so:
11,25 s e 50,08 s.
Verifica-se desta forma que a presena da LDL oxidada leva a um aumento
no tempo de vida da emisso do Eurpio. No entanto o complexo EuCTc na
presena da LDL oxidada apresentou um aumento no tempo de vida maior que no
complexo EuTc.
A concentrao de LDL oxidada utilizada neste experimento
consideravelmente maior que a encontrada normalmente no plasma sanguneo
(0,1 mg/mL)
58
, desta forma em uma medida real seria muito difcil se quantificar
67

LDL oxidada ou se distinguir a LDL oxidada da LDL nativa, pela medida de tempo
de vida.

0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
0,0
2,0x10
4
4,0x10
4
6,0x10
4
8,0x10
4
1,0x10
5
1,2x10
5

S
i
n
a
l

(
u
.
a
)
Tempo (ms)
3,0 Eu: 1,0 Tc + LDL oxidada (1,5 mg/mL)
3,0 Eu: 1,0 Tc
0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
0,0
2,0x10
4
4,0x10
4
6,0x10
4
8,0x10
4
1,0x10
5
1,2x10
5

S
i
n
a
l

(
u
.
a
)
Tempo (ms)
1,5 Eu: 1,0 CTc + LDL oxidada (1,5 mg/mL)
1,5 Eu: 1,0 CTc

Tabela 12: Parmetro do ajuste das equaes 1 e 2, para os dados experimentais da Figura 36.

Tabela 13: Parmetro do ajuste das equaes 1 e 2, para os dados experimentais da Figura 37.

Complexo Parmetros
av
( s)
EuTc
A
1
(7,0 0,4).10
4
A
2
(8,6 0,5).10
4

1
(2,00 0,06).10
2

2
(3,80 0,06).10
2

32,64
EuTc +
LDL oxidada
A
1
(2,7 0,2).10
4
A
2
(1,3 0,2).10
4

1
(8,14 0,05).10
2

2
(2,25 0,04).10
2

47,97
Complexo Parmetros
av
( s)
EuCTc
A
1
(4,00 0,01).10
4
A
2
(4,00 0,01).10
4

1
(1,13 0,03).10
2

2
(1,13 0,03).10
2

11,25
EuCTc +
LDL oxidada
A
1
(9,3 0,1).10
4
A
2
(4,4 0,2).10
4

1
(1,43 0,05).10
2

2
(6,7 0,3).10
2

50,08
Figura 35:

Figura 36:

Figura 36: Tempo de vida medido do
complexo EuTc com LDL oxidada

Figura 37: Tempo de vida medido do
complexo EuCTc com LDL oxidada

68

5.3.3 Complexos EuCTc+LDL oxidada e EuTc+LDL oxidada na presena de
possveis interferentes inorgnicos.

As amostras dos complexos foram preparadas utilizando 500L dos
complexos acrescidos de 10L de LDL oxidada e 500L de ons inorgnicos nas
concentraes normalmente encontradas no plasma sanguneo,Tabela 6. As
amostras ficaram em repouso por 15 minutos antes de realizar as medidas de
emisso. As medidas de emisso foram realizadas excitando as amostras nos
comprimentos de onda de 400nm.
O complexo EuTc na presena de LDL oxidada sofre menor interferncia
em sua intensidade de emisso na presena de ons inorgnicos.
Verificou-se tambm que todos os ons estudados com exceo do cobre
levam a um aumento no sinal de emisso do eurpio no complexo EuCTc na
presena de LDL oxidada. A explicao para isto pode ser a equao de Fenton
(Equao 3) no sentido oposto, ou seja, a presena dos interferentes leva a
produo de perxido de hidrognio que aumenta o sinal de emisso do eurpio.

Cu
+2
+ H2O2 Cu
+3
+ OH
-
+ OH (3)

Esse processo ocorre com maior intensidade no complexo EuCTc devido a
presena do cloro na molcula da clorotetraciclina, o cloro apresenta grande
eletronegatividade favorecendo a interao com os ctions que por sua vez
interage com a molcula de LDL oxidada favorecendo a peroxidao da LDL
oxidada e dessa forma ocorrendo maior aumento na intensidade de emisso.

69

Grfico 3: Complexo EuTc+LDL na presena de interferentes inorgnicos

Grfico 4: Complexo EuCTc+LDL na presena de interferentes inorgnicos

70

6. CONCLUSES
Neste trabalho foram estudadas as propriedades pticas dos complexos
eurpio- tetraciclinas (EuTcs) na presena de LDL e LDL oxidada, com o objetivo
de obter um biossensor com potenciais aplicaes na quantificao de LDL e
LDL oxidada.
Com os resultados das medidas de absoro ptica e de emisso foi
possvel identificar a formao dos complexos de EuTcs. Em comum, as Tcs
apresentaram largas bandas de emisso, caractersticas de compostos orgnicos
eletroluminescentes, porm quando as Tcs estam na presena do on eurpio
ocorre o deslocamento das bandas de emisso das Tcs para comprimentos de
onda em torno do 615nm, demonstrando a efetiva transferncia de energia
intramolecular do ligante (Tcs), para o on eurpio, o que revela a formao dos
complexos de EuTcs. O forte pico de emisso (~616 nm) decorre das transies
5
D
0

7
F
2
do on eurpio.
As medidas de absoro ptica e de emisso permitiram eleger as
melhores razes molares do on eurpio nos complexos EuTcs. As razes
molares dos complexos EuTcs na presena de LDL foram: EuTc (3:1), EuOTc
(1:1), EuCTc (1,5:1) e EuMTc (1,5:1).
Os resultados obtidos atravs das medidas de emisso tambm
demonstraram que os complexos EuTc (3:1) e EuCTc (1,5:1) apresentaram
aumento gradativo na intensidade de emisso de acordo com o aumento da
concentrao de LDL. O complexo EuOTc (1:1) na presena de LDL nas
concentraes de 1,50; 1,75; 2,0 e 2,5 mg/mL apresentaram praticamente o
mesmo aumento na intensidade de emisso, em torno de 20 x 10
6
ftons, o que
revela uma saturao dos stios de ligao do complexo EuOTc que
possivelmente foram ocupados pelas molculas de LDL, e mesmo com o
aumento da concentrao de LDL no h mais stios para as mesmas se ligarem.
J para o complexo EuMTc (1,5:1) na presena de LDL nas concentraes
(mg/mL): 0; 0,50; 1,00; 1,50;1,75; 2,00 e 2,50, observou-se que no houve
aumento gradativo da emisso do complexo com o aumento da concentrao de
LDL.
De acordo com estes resultados, foi proposto que as Tcs apresentam stios
de ligao semelhantes para o on eurpio, isso porque todas possuem uma
71

estrutura qumica em comum, porm existem regies diferenciadas,
caracterizadas pela presena de diferentes radicais localizados nas molculas
das tetraciclinas, o que possivelmente diferencia os stios de ligao do on
eurpio resultando em maior ou menor intensidade de emisso dos complexos. J
as molculas de LDL apresentaram um importante papel no aumento da
intensidade de emisso dos complexos EuTcs. Visto que as medidas realizadas
com os complexos EuTcs no apresentaram deslocamentos nos comprimentos
de onda dos espectros de absoro e de emisso na presena de LDL, pode-se
concluir que h ausncia de interao direta entre as molculas de Tcs e as
molculas de LDL. A formao dos complexos EuTcs no completam o nmero
de coordenao do on eurpio que geralmente so oito, portanto os complexos
EuTcs apresentam cargas positivas relativa ao nmero de coordenao
incompleto do on eurpio. Com isso, o on eurpio interage com grupamentos
que esto ionizados com cargas negativas como, por exemplo, hidroxilas e
grupos fosfatos presentes na superfcie da LDL dessa forma completando o
nmero de coordenao do on eurpio.
Atravs das curvas de calibrao foi possvel descrever a resposta dos
complexos de EuTcs sobre uma faixa de concentrao de LDL. Os complexos
EuTc e EuCTc na presena de LDL foram os que apresentaram maior linearidade
na curva de calibrao e desta forma, esses dois complexos foram escolhidos
para a continuidade do estudo. Os complexos EuTc e EuCTc apresentaram faixa
de linearidade de 0 a 2,00 mg/mL e limites de deteco de 0,29mg/mL e 0,15
mg/mL respectivamente.
Os resultados das medidas de tempo de vida e emisso na presena de
possveis interferentes inorgnicos encontrados no plasma sanguneo,
demonstraram que o complexo EuTc na presena de LDL apresentou maior
aumento no tempo de vida comparado com o complexo EuCTc tambm na
presena de LDL, e as medidas realizadas na presena de ons inorgnicos
demonstraram que o complexo que sofre menor interferncia dos ons inorgnicos
em relao intensidade de emisso tambm foi o complexo EuTc. O on Cu
+2

foi o on que mais interferiu na intensidade de emisso dos complexos, sendo que
no complexo EuCTc ele interferiu ainda mais, possivelmente devido a
72

eletronegatividade do elemento cloro presente na molcula de CTc que acaba
atraindo o on Cu
+2
presente na soluo.
Foram realizadas medidas de emisso dos complexos na presena de
diferentes concentraes de LDL oxidada, e de acordo com as curvas de
calibraes os complexos que apresentaram maior range de deteco foram
EuTc e EuCTc, ambos com faixa de linearidade de 0 a 3,00 mg/mL. Porm
comparando as curva de calibrao destes dois complexos foi possvel notar que
o valor do limite de deteco do complexo EuTc foi de 0,09 mg/mL j o EuCTc foi
de 0,16 mg/mL, tornando-o mais adequado para a quantificao de LDL.
As medidas de tempo de vida mostram que o complexo EuCTc na
presena de LDL oxidada apresenta maior tempo de vida quando comparado com
o complexo EuTc na presena de LDL. J o estudo das medidas de emisso na
presena de ons inorgnicos demonstraram que o complexo que sofreu menor
interferncia em sua intensidade de emisso foi o complexo EuTc.
Sendo assim, o complexo que apresentou melhores resultados tanto na
presena de LDL e de LDL oxidada foi o complexo EuTc. Este complexo
apresenta potenciais caractersticas para ser um biossensor utilizado em
quantificao de LDL e LDL oxidada in vitro.

73

7. PRODUES BIBLIOGRFICAS

Artigos completos publicados em peridicos

Teixeira, Luciane dos Santos ; Grasso, Andra Nastri ; Monteiro, Andrea Moreira ; Neto,
A.M. Figueiredo ; Vieira Jr., Nilson Dias ; Gidlund, Magnus ; Courrol, Lilia Coronato .
Enhancement on the Europium emission band of Europium chlortetracycline
complex in the presence of LDL. Analytical Biochemistry (Print) , v. 400, p. 19-24,
2010.

GRASSO, A. N. ; Teixeira LS ; VIEIRA JUNIOR, Nilson Dias ; COURROL, L. C.
Optical Properties of Metacycline, Oxytetracycline and Chlortetracycline Europium
Complexes in the presence of Hydrogen Peroxide. Journal of Fluorescence , v. 19, p.
715-721, 2009.

Trabalhos completos publicados em anais de congressos

GRASSO, A. N. ; Teixeira LS ; VIEIRA JUNIOR, Nilson Dias ; COURROL, L. C.
.Comparison of optical properties of europium-oxytetracycline and europium-
tetracycline complexes in the presence of peroxides. In: XXXII Encontro Nacional de F
sica da Mat eria Condensada / ID: 261-1, 2009, Aguas de Lindoia. Anais da ptica, 2009.

Teixeira LS ; GRASSO, A. N. ; A. M. Monteiro ; FIGUEIREDO NETO, A. M. ;
GIDLUND, M. ; VIEIRA JUNIOR, Nilson Dias ; COURROL, L. C. Comparison of the
emission efficiencies of EUTC and EUOTc complexes in the presence of LDL. In:
XXXII Encontro Nacional de Fsica da Matria Condensada / ID: 261-1, 2009, Aguas de
Lindoia. Anais da ptica, 2009.

Resumos publicados em anais de congressos

GRASSO, A. N. ; Teixeira LS ; VIEIRA JUNIOR, Nilson Dias ; COURROL, L. C. .
Optical Properties of Metacycline, Oxytetracycline and Chlortetracycline Eu
Complexes in the presence of Hydrogen Peroxide and Urea Hydrogen Peroxide. In:
74

The 15th International Conference on Luminescence and Optical Spectroscopy of
Condensed Matter (ICL/08), 2008, Lyon. Procedia, 2008.
75

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

1. CONSENSO BRASILEIRO SOBRE DISLIPIDEMIAS DETECO,
AVALIAO E TRATAMENTO.
Disponvel em: < http://publicacoes.cardiol.br/abc/1996/6702/67020009.pdf> Acesso em
16 fev. 2009.

2. MARTINS, M. Biossensores de Colesterol Baseados no Sistema Poli(lcool inlico)
/ Ftalocianina. Dissertao apresentada a Faculdade de Engenharia da Universidade
Federal de Itajub.p.56-72, 2006.

3. HIRSCHY, L. M. et al. Characteristics of the binding of Europium(III) to
Tetracycline. Analytica Chimica Acta, v. 166, p. 207-219, 1984.

4. Silva, F. R.O. ; SAMAD, R. E.; GOMES, L.; COURROL, L. C. Enhancement of
Europium Emission Band of Europium Tetracycline Complex in the Presence of
Cholesterol. Journal of Fluorescence, v. 18, n. 1, p. 169-174, 2008.

5. MITSCHER, L. A. The Chemistry of the Tetracycline Antibiotics, New York: Marcel
Dekker, 1978.

6. CHOPRA, I.; ROBERTS, M. Tetracycline Antibiotics: Mode of Action,
Applications, Molecular Biology, and Epidemiology of Bacterial Resistence, Microbio.
And Mol. Bio. Rev., v. 65, n. 2, p. 232260, 2001.

7. RODRIGUES, M, GONZLES, G., PENI, B., et al. Tetraciclinas. Acta Medica; v. 8,
p. 75-9, 1998.

8. DALE, M., RANGE, H. P., RITTER, J. M. Farmacologia. 4 ed. Elsevier: So Paulo,
2003 p.584.

9. COUTO, C., CONCEIO, M., MONTENEGRO, B., REIS, S. Complexao da
tetraciclina, da oxitetraciclina e da clortetraciclina com o catio cobre (II). Estudo
potenciomtrico, Qumica Nova; v. 23, p. 457-459, 2000.
76

10. HIRSCHY, M., DOSE, E., WINEFORDNER, J., Lanthanide-sensitized
luminescence for the detection of tetracyclines. Anal. Chim. Acta, v. 147, p. 311316,
1983.

11. PALM, G. et. al. Specific binding of divalent metal ions to etracycline and to the
Tet repressor/tetracycline complex. J Biol Inorg Chem. v. 13, p. 1097-1100, 2008.

12. S, G. F. et al. Spectroscopic properties and design of highly luminescent
lanthanide coordination complexes. Coord. Chem.Rev., v. 196, p. 165-195, 2000.

13. MENDES, M,V. Desenvolvimento e caracterizao fototrmica de novos materiais
vtreos dopados com ons emissores terra-raras. Dissertao apresentada ao Instituto de
Fsica da Universidade de Uberlndia, p. 22, 2009.

14. GUIANINI, W. Produo e caracterizao de dispositivos orgnicos
eletroluminescentes (oleds) baseados em complexos (beta)-dicetonatos de terras-raras.
Dissertao apresentado ao Instituto de Fsica da Pontfica Universidade Catlica do Rio
de Janeiro- PUC-RIO. p. 75-90, 2007.

15. SANTOS, T.S. Emisso de luz em matrizes policristalinas de H3BO3. Dissertao
apresentada ao Instituto de Fsica da Universidade Federal de Sergipe. p. 23, 2008.

16. MONTEIRO, J. E. Estudo das propriedades spectroscpicas de matrizes de urnio
dopadas com eurpio. Dissertao apresentada ao Instituto de Pesquisas Energticas e
Nucleares, p. 36-43. 2007.

17. MARTINS, T., ISOLANI, P. Terras raras: aplicaes industriais e biolgicas.
Quim. Nova, v. 28, p.111-117, 2005.

18. MAAS, H.; CURRAO, A.; FERRI, G. C. Encapsulated lanthanide as Luminescent
Materials. Angew. Chem. Int. En., v. 41, n. 14, p. 2495-2497, 2002.

19. TURRO, C., FU, P., BRADLEY, P. Lanthanide ons as luminescent probes of
proteins and nucleic acid. Departamento de Qumica. Universidade do Estado de Ohio.
USA, 1998.
77

20. QUIRINO, W.G. Produo e caracterizao de dispositivos orgnicos
eletroluminescentes (OLEDS) baseados em complexos (Beta)-Dicetonatos de terras-
raras. Dissertao apresentada a Pontifcia Universidade Catlica do Rio de Janeiro (PUC-
RIO). 2007.

21. WOLFBEIS, O., DURKOP, A., MU, M., LIN, Z. Europium ion-based luminescent
sensing probe for hydrogen peroxide. Angew. Chem. Int. v. 41, p. 44954498, 2002.

22. WU, M.,LIN, Z., SCHAFERLING, M., DURKOP, O., WOLFBEIS, O. Fluorescence
imaging of the activity of glucose oxidase using a hydrogen peroxide sensitive
europium probe, Anal Biochem., v.1, p. 6673, 2005.

23. ZHU X. J.; WANG X. L.; JIANG C. Q. Spectrofluorimetric determination of
heparin using a tetracycline-europium probe. Analytical Biochemistry, v. 341, n. 2, p.
299-307, 2005

24. COURROL, L., BELLINI, M., TARELO, L., SILVA, F., MANSANO, R., VIEIRA,
N., SHOR, N., Urea hydrogen peroxide determination in whole blood using europium
tetracycline probe. Anal Biochem. v.355, p. 140-144, 2006.

25. ARNAUD, N.; GEORGES, J. Comprehensive study of the luminescent properties
and lifetimes of Eu
3+
and Tb
3+
chelated with various ligands in aqueous solutions:
influence of the synergic agent, the surfactant and the energy level of the ligand
triplet. Spectrochimica Acta, Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, v. 59A,
p. 1829-1840, 2003.

26. YATSIMIRSKII, K., DAVIDENKO, K., Coordination Chemistry Reviews,
Absorption spectra and structure of lanthanide coordination compounds in Solution,
v. 27, p. 223-73, 1979.

78

27. PEIXOTO,P.H.; COURROL, L.C.; TATUME, S.H. Aumento da banda de emisso
da sonda Eurpio-Tetraciclina sob ao do colesterol. Boletim Tcnico da Fatec, 20,
pp. 29-31, 2006.

28. COURROL, L. C.; MONTEIRO, A. M.; Silva, F. R.O.; GOMES, L.; VIEIRA JR, N.
D.; GIDLUND, M. A. ; FIGUEIREDO NETO, A. M. Novel Fluorescent Probe for Low
Density Lipoprotein. Optics Express, v. 15, p. 7066-7074, 2007.

29. GENNES, J.L., CARVALHO, M. O colesterol e a aterosclerose. So Paulo: Editorial
Presena, p.111, v.5.

30. GAW,A.,SHEPHERD, J. Lipids and atherosclerosis annual. New York: Editora
Martin Dunitz,P.250.

31. SILVA, A.M. Mtodos para avaliao do grau de oxidao lipdica e da
capacidade antioxidante. Qum. Nova. V.22. 1999

32. LEHNINGE, A. Principles of Biochemistry,. Editora: W.H. Freeman. p. 1119.

33. Manuais de Cardiologia. Disponvel em:
<http://www.manuaisdecardiologia.med.br/Dislipidemia/Lipid1_Page538.htm>Acesso em:
09 jan. 2010.

34. SILVA, A.N. Quatificao de Lipoprotenas por Espectroscopia de Ressonncia
Magntica Nuclear (RMN). Dissertao apresentada ao Instituto de Fsica da
Universidade de So Paulo. p .37-46, 2008.

35. Ministrio da Saude. Disponvel em:
<http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/coletiva_saude_061008.pdf> Acesso em: 09
abril. 2010.

36. ARAUJO, D. Efeitos pleiotrpicos com redues equivalentes do LDL-colesterol:
estudo comparativo entre sinvastatina e associao sinvastatina/ezetimiba. Dissertao
apresentada a Faculdade de Medicina daUniversidade de So Paulo. p.65-79, 2007.
79

37. ABDALLA, D. ET. AL. LDL: da Sndrome Metablica reviso Instabilizao da
Placa Aterosclertica Disciplina de Endocrinologia (AFAS). Universidade Federal de
So Paulo UNIFESP/EPM, p. 167, 2006.

38. DUARTE, M. MORESCO, R., FABRO, A. Assays for measurement of oxidized low
density lipoprotein and its application as a marker of cardiovascular risk. RBAC, v.
40,p. 101-106, 2008.

39. PIVAL, J., FERNANDES, T. Comparao analtica de valores de LDL-colesterol
utilizando a dosagem direta e o clculo pela frmula de Friedewald. RBAC, V. 40, p.
279-283, 2008.

40. SEILER, G.. Handbook on metals in clinical and analytical chemistry, 2006.

41. GITELMAN, J.. Aluminum and Health: a critical review. Nova York: Marcel
Dekker, 1989.

42. ANDRIOLO, A. Guia de medicina ambulatorial e hospitalar da UNIFESP. So
Paulo: Manole, p.256, 2006.

43. MANUAL MERCK. Exames Laboratoriais e de Diagnstico Comuns.

44. PERRELLI, G.; PIOLATTO, G.. Tentative reference values for gold, silver and
platinum: literature data analysis. The Science Of The Total Environment, Amsterdam,
n. , p.93-96, 1992.

45. MAAS, H.; CURRAO, A.; FERRI, G. C. Encapsulated lanthanide as Luminescent
Materials. Angew. Chem. Int. En., v. 41, p. 2495-2497, 2002.

46. SCHRENKHAMMER, P. et al. Time-Resolved Fluorescence-Based Assay for the
Determination of Alkaline Phosphatase Activity and Application to the Screening of
Its Inhibitors. J Biomol Scree, v. 13, p.9-16,2008.

47. PENG, Q. et. al . Fluorimetric study of the interaction between nicotinamide
adenine dinucleotide phosphate and tetracyclineeuropium complex and its
application. Analytica Chimica Acta, v. 549, p. 26-31, 2005.

80

48. LIU, X., ZONG, Y., XIANG, Y. Time-resolved fluorescence studies of the
interaction of the Eu3+ complexes of tetracycline analogues with DNA. Analytica
Chimica Acta, v. 345, p. 213-217, 1997.

49. Xia et al. Study on the interaction between protein and Eu(III)chlorotetracycline
complex and the determination of protein using the fluorimetric method
Luminescence v.19, p. 352-357, 2004.

50. SALI, et. al. Determination of Protonation Constants of Some Tetracycline
Antibiotics by Potentiometry and LC Methods in Water and Acetonitrile-Water
Binary Mixtures. J. Braz. Chem. Soc., v.. 20, p. 939-946, 2009.

51. ABDALLA, L., CAVALCANTI, K., SENA, M., Biomarcadores de peroxidao
lipdica na aterosclerose. Rev. Nutr., v. 21, p.10-16, 2008.

52. LEHNINGER, A., COX, M., NELSON, D., Princpios de Bioqumica. Sarvier, v. 4,
pg 53-60, 1995.

53. TURRO, C. PATTY, K., BRADLEY, M. Lanthanide Ions as Luminescent Probes of
Proteins and Nucleic Acids. Met Ions Biol Syst. v. 40, p. 323-340, 2003.

54. SILVIA, F.R.O. DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR DE PERXIDO
DE HIDROGNIO DE BAIXO CUSTO BASEADO NA EMISSO DO EURPIO
III. Dissertao apresentada Escola Politcnica da Universidade de So Paulo, p. 72,
2008.

55. SILVA, F.; COURROL, L.; GOMES, L.; MANSANO, R.; VIEIRA J., NILSON, D.
STUDY OF MATERIALS FOR HYDROGEN PEROXIDE AND UREA
HYDROGEN PEROXIDE BIOSSENSORS. In: SBPMat, 2006, Florianpolis. Anais do
Congresso SBPMat, p. 126, 2006.

81

57. RAYA, C. Fluorescence Quenching of the Europium Tetracycline Hydrogen
Peroxide Complex by Copper (II) and Other Metal Ions. Appl Spectrosc. v. 59, 1209-
1216, 2005.

58. ITABE, H. Sensitive detection of oxidatively modified low density lipoprotein
using a monoclonal antibody. Journal of Lipid Research, v. 37, p. 45-53, 1996.

2010 Teixeira Estudos

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