Dos resonancias se observan en el espectro de RMN-H de agua en suspensiones de eritrocitos

hiladas en el ngulo mgico, una seal ancha a partir de agua dentro de las clulas y una seal
fuerte de agua extracelular . La separacin es el resultado de una diferencia de desplazamiento
qumico verdadera entre las dos poblaciones , como los efectos de susceptibilidad magntica a
granel son negados en el ngulo mgico . La dependencia del pH de esta diferencia de
desplazamiento qumico en suspensiones de eritrocitos fue investigado . Se observaron laminillas
de 16.760.1 , 18.960.9 , y 21,0 6 0,2 Hz a pH 6,0 , 7,0 , y 8,5 , respectivamente ; sin embargo , esto
fue acompaado por un cambio en el volumen medio de clulas . Para dar cuenta de cualquier
contribucin del cambio de volumen , la osmolaridad del pH 6.0 y 8.5 suspensiones se ajust para
igualar el volumen de las clulas entre las muestras en los tres valores de pH . En estas condiciones
, la divisin era 18.360.1 y 18.660.1 Hz a pH 6,0 y 8,5 , respectivamente . As, la diferencia de
desplazamiento qumico observado entre las dos resonancias de agua era independiente del pH .
Por lo tanto la divisin de la resonancia del agua se concluy a ser directamente proporcional a la
concentracin de protena dentro de la clula . Tambin se llevaron a cabo mediciones de la
diferencia de susceptibilidad magntica entre los dos compartimentos , produciendo un valor de
2,0 6 0,2 3 107 ( unidades SI ) para los eritrocitos en solucin salina isotnica a un pH de 7,0
INTRODUCCIN
En alta resolucin de ngulo mgico de giro RMN (MAS-RMN) experimentos en suspensiones de
eritrocitos, la seal de H2O se observa como dos resonancias separadas (1,2). Las resonancias
separadas son provocados por la centrifugacin de las clulas en el interior de la pared del rotor
MAS, la creacin de un sistema de dos fases que consta de dos cilindros concntricos interior-el
uno es el agua sobrenadante libre de clulas, y form el exterior de clulas apretadas (3). Esta
separacin espacial de las clulas y sobrenadante elimina eficazmente el intercambio de agua
entre los dos compartimentos, dando lugar a una seal de amplio asignado al agua intracelular y
una seal fuerte asignado para el agua sobrenadante. La asignacin ha sido confirmado por la
adicin de resonancia magntica agentes de contraste de formacin de imgenes que son
incapaces de cruzar la membrana de los eritrocitos y, por tanto ampliar y cambiar slo el
sobrenadante de resonancia (4). Surge la seal intracelular a partir de agua que es
verdaderamente intracelular junto con una pequea fraccin (; 3%) de agua intersticial. El agua
que esta seal representa a veces se describe como el agua de pellets (5). Esta agua intersticial no
parece dar una seal H-RMN separado, pero es de suponer en un intercambio rpido con la
fraccin intracelular. Recientemente, Bruno et al. (5) han confirmado la insignificancia de la bolsa
en la escala de tiempo de RMN entre el sedimento y el agua sobrenadante en experimentos del
MAS en las suspensiones de glbulos rojos (GR).
Para las muestras orientadas en el ngulo mgico, se eliminan los efectos de susceptibilidad
magntica a granel (6). Chen y col. (3) sugiri que la divisin de la seal de agua en las
suspensiones de clulas era debido a una diferencia de sensibilidad isotrpica entre las clulas y
sobrenadante. Desde entonces se ha demostrado, sin embargo, que mediante la introduccin de
la esfera de Lorentz'''' correccin de la divisin es debido a una diferencia de desplazamiento
qumico verdadera entre el agua en los dos compartimentos (2). Aime et al. (7) han demostrado
que la magnitud de la diferencia de desplazamiento qumico de H2O se correlaciona con la
concentracin de protena para las suspensiones de varios tipos de clulas en condiciones MAS y
que en soluciones de albmina de suero bovino (BSA) el desplazamiento qumico de agua es
dependiente de la concentracin de protena pero no sobre el pH. Su conclusin fue que el
principal determinante de la magnitud de la separacin pico de agua era la concentracin de
protena celular, excepto en el caso de los eritrocitos donde la presencia de desoxihemoglobina
paramagntico conduce a un aumento en la divisin pico debido a un cambio pseudocontact (7).
Aunque el efecto del pH sobre el desplazamiento qumico de agua en una solucin de protenas se
ha investigado, nos dispusimos a investigar la dependencia de la diferencia de desplazamiento
qumico de H2O sobre el pH en un sistema celular, donde debido al tamponamiento del pH por
protenas y componentes celulares un gradiente de pH a travs de la membrana celular es posible.
Los eritrocitos son ideales para un estudio de este tipo, ya que son fciles de obtener, son viables
en un rango de pH amplio, tienen un interior uniforme, y la hemo-magntico se puede convertir
en la forma diamagntica estable en carbonmonoxyhemoglobin de eliminar el turno de contactos
de pseudo. Adems, los mtodos de 31P-RMN estn bien establecidos para el seguimiento de su
pH intracelular (8), el volumen celular (9), y el potencial de membrana (10).
MATERIALES Y MTODOS
preparacin de eritrocitos
La sangre fresca se obtuvo por puncin venosa de un nico voluntario sano ( TJL ) , a continuacin,
se centrifuga durante 10 min a 30003 g, y la capa leucocitaria eliminado por aspiracin . Las clulas
se lavaron a continuacin con tres volmenes de solucin salina isotnica que contiene fosfato 25
mM , 30 mM de cido hipofosforoso ( HPA ) , metilfosfonato de 30 mM (MEP ) , metilfosfonato de
dimetilo 30 mM ( DMMP ) , fosfato de trietilo 10 mM ( TEP ) , 2,5 mM de 3 - ( trimetilsilil ) - 1 -
propano - sulfnico , y glucosa 10 mM , constituidos en 15 % ( v / v ) D2O , con un pH de 6.0 , 7.0 ,
o 8.5 ( lecturas de electrodo de pH de vidrio sin ajustar ) . A continuacin, el monxido de carbono
se hizo burbujear a travs de la suspensin durante 15 min para crear monoxyhemoglobin de
carbono diamagntico . Las clulas se incubaron a continuacin a 37 C durante 1 h para permitir
el equilibrio de MeP entre los compartimentos intracelulares y extracelulares , seguido de otros
dos lavados . Las clulas se suspendedto un hematocrito final ( HT) entre 77 % y 92 % , medido
utilizando una centrfuga capilar ( Clements , North Ryde , NSW, Australia ) . Recuentos de clulas
rojas de la final de suspensiones de eritrocitos y la concentracin de hemoglobina de la sangre
fresca se midieron con un Sysmex KX- 21 analizador de hematologa ( Sysmex , Kobe , Japn).
hemolisados
Muestras de lisado para valoraciones de pH de fosfato inorgnico (Pi) y MEP se prepararon a partir
de suspensiones Ht RBC altos (0,98%), se lav en tampones con pH entre 4 y 9, con tres ciclos de
congelacin / descongelacin en nitrgeno lquido. Las muestras de sobrenadante de la ltima de
lavado de estas muestras se utilizaron para la calibracin del pH sobrenadante.
modificado para incorporar un agujero y comida de nylon roscado de tornillo coaxial para permitir
la eliminacin de burbujas de aire , que interfieren con la resolucin espectral de los espectros
adquiridos en ngulos distintos de la ngulo mgico . Los espectros de RMN se registraron en un
DRX- 400 widebore espectrmetro Bruker con una sonda XC7 ngulo de giro variable de ( Doty
Cientfico ) . 1 H espectros se puede adquirir en todos los ngulos y con esta sonda , pero el
bloqueo de frecuencia de campo y canales de ncleo X no son eficaces cuando el estator es toB0
perpendicular y paralela , respectivamente . Las muestras se centrifugaron a 2 kHz para ; 30 s
centrifugar las clulas a la parte interior de la pared de la clula de sellado y, posteriormente, a
250 Hz . Todos los experimentos se realizaron a 37 C , temperatura de la muestra con calibrado
utilizando seco limpio etilenglicol en una clula de sellado . Para los experimentos sobre muestras
de lisados y sobrenadantes , el 30 - s de giro a 2 kHz se omiti . Los desplazamientos qumicos de
todos los picos pertinentes se identificaron utilizando el pico automtica recogiendo rutina en
Topspin 1.3 ( Bruker Biospin , Karlsruhe, Alemania ) despus de la correccin automtica de la
lnea de base de las regiones de inters .
RESULTADOS
La concentracin de hemoglobina
La concentracin media de hemoglobina en las muestras de sangre tomadas recientemente fue
155 6 5 gL1
Diferencias de desplazamiento qumico
H Representante y P espectros de los compuestos estudiados se muestran en las Figs . 1 y 2 ,
respectivamente . Observaron diferencias de desplazamiento qumico entre intracelular y
resonancias de sobrenadante en H y P espectros en el ngulo mgico se reportan en la Tabla 1 , y
las diferencias de desplazamiento qumico de H espectros adquiridos con el estator alineados con
y toB0 en la Tabla 2 perpendiculares .
TEP normalmente aparece como una sola resonancia en los espectros de las suspensiones de RBC
debido a su rpido intercambio travs de la membrana de glbulos rojos ( 11 ) . Cuando se teje en
el ngulo mgico , la separacin fsica de los dos ambientes reduce significativamente el
intercambio , y resonancias intracelulares y de sobrenadante se ven distintas . Para hacer
referencia a P espectros , se utiliz el promedio ponderado (ponderado por el pico integral)
desplazamiento qumico de TEP
Las relaciones entre el pH de la - tampn de suspensin y la separacin de los picos en el ngulo
mgico para H2O ( H ) , el DMMP ( P ) , y HPA ( 31P ) se muestran en la figura . 3 . Se registra la
relacin lineal entre la separacin de los picos y el pH del tampn . Relaciones lineales similares se
observaron para las resonancias de H de DMMP y el P resonancia del TEP para las muestras se
hicieron girar a la magia angulo. The H resonances of H2O and DMMP, when the sample was spun
aligned with and perpendicular toB0, showed a similar linear dependence of the peak separation
on the pH of the suspension. No correlation of the variation of peak separation with buffer pH was
observed for MeP or Pi
Tamao de la clula
La media de volumen de eritrocitos en fL se calcula utilizando el Ht: Conteo vol Est. / celular. Los
valores para cada uno de tampn de lavado se dan en la Tabla 3. Para las clulas en solucin salina
isotnica el volumen de la celda vara linealmente con el pH del tampn de lavado.
Las mediciones de pH
Medida del pH intra y extracelular usando los turnos P qumicas de MEP y Pi se han realizado en
eritrocitos en sondas normales RMN de alta resolucin (8). Este mtodo utiliza una ecuacin de
Henderson-Hasselbalch modificado, pH de pKa 1log10 dd? da = db? DTH; (1) donde d es el
cambio observado qumico de una especie y Da y Db son los desplazamientos qumicos (en ppm)
de las formas de cido y de base de la misma, respectivamente. Debido a la eliminacin de la
contribucin a su punto mximo la separacin de susceptibilidad magntica a granel en
condiciones MAS, curvas de calibracin de pH para MeP y Pi en lisados y las muestras de
sobrenadante se construyeron (Fig. 4). Los valores de pKa, da, y dB (Tabla 4) se determinaron
mediante el uso de regresin de mnimos cuadrados no lineal de la ecuacin. 1 en los datos en un
programa de Mathematica (Wolfram, Champaign, IL). El intracelular y valores de pH de
sobrenadante de glbulos rojos intactos se dan en la Tabla 3.


DISCUSIN
Kuchel et al . ( 12 ) han demostrado que en condiciones MAS no hay correlacin entre Ht y la
magnitud de la separacin entre intracelular y extracelular de DMMP resonancias en los espectros
de 31P . Esto se confirm en este estudio para una gama de compuestos de fsforo, DMMP , HPA ,
TEP , y H2O . Todas las muestras de sangre fueron tomadas de un solo donante , y no hubo
variacin significativa en la concentracin de hemoglobina en muestras de sangre fresca durante
los experimentos ; Por lo tanto, la variacin de la muestra no debera haber contribuido a la
variacin en la divisin . DMMP , HPA y H2O muestran una variacin lineal de la separacin de los
picos con el pH de la suspensin , mientras que el MEP y Pi
no lo hizo. DMMP y TEP son neutrales, por lo que cualquier cambio en la separacin de los picos
no depende de ningn cambio en el estado de carga de las propias molculas. Por lo tanto, debe
seguir que los cambios en la separacin de los picos de H2O y HPA , que se carga , se deben a otros
factores distintos o adems del pH . En el caso de DMMP la separacin entre resonancias
extracelulares e intracelulares se sabe que es debido a diferencias en el grado de unin de
hidrgeno del oxgeno de fosforilo al agua en el interior de los eritrocitos debido a la alta
concentracin de protena intracelular , predominantemente de hemoglobina ( 13 ) . De hecho, la
magnitud de la separacin se puede utilizar para controlar los cambios en el volumen de
eritrocitos ( 9,12 ) .
MEP y Pi no mostraron una relacin lineal entre el pH de la suspensin y la diferencia de
desplazamiento qumico entre intracelular y resonancias de sobrenadante , y en algunos casos las
resonancias intracelulares y de sobrenadante se superponen ( por ejemplo , Pi resonancia en . Fig.
3 ) . La separacin entre las resonancias para estas molculas depende de la diferencia de pH a
travs de la membrana celular y en los valores de pKa y DA y DB en el
entornos de sobrenadante y intracelulares . Philp et al . ( 2 ) inform una diferencia de
susceptibilidad magntica entre los compartimentos intracelulares y sobrenadante de
suspensiones de eritrocitos , de ngulo variable girando datos (VAS ) de ? 2,2 3 10 ? 7 ( unidades SI
) . Valores similares de la susceptibilidad magntica se obtuvieron en estos experimentos ; Sin
embargo , se observ la diferencia a variar con el pH de la muestra .
Como efectos de susceptibilidad magntica a granel se eliminan en el ngulo mgico , el cambio en
la susceptibilidad magntica con pH no contribuir al cambio observado en desplazamiento
qumico con el pH. En otros ngulos que el ngulo mgico , la diferencia de susceptibilidad puede
en cuenta la parte para el cambio en la divisin , junto con el cambio observado en el volumen
celular .
El volumen de eritrocitos se midi directamente en cada pH ( Tabla 4 ) , y la relacin entre el
volumen celular y la separacin entre el sobrenadante y resonancias intracelulares
para H2O (1H), DMMP , TEP y HPA ( 31P ) en caso de suspensin hiladas en el ngulo mgico se
muestra en la figura . 5 . Es evidente a partir de la figura . 5 que para cada una de las molculas
existe una relacin lineal entre el volumen celular y la magnitud del pico separacin . Como se
aument el volumen de la celda , por lo que la concentracin de hemoglobina se redujo , y el
tamao de la divisin para H2O , DMMP , y TEP todo disminuy . Para HPA , sin embargo , lo
contrario era cierto y la divisin se increment con el aumento de volumen de la celda ; esto est
relacionado con el cambio en el potencial de membrana con el pH ( 10 ) . Para confirmar que el
cambio en el volumen de la celda era responsable de los cambios observados en la separacin de
los picos y la susceptibilidad magntica , los glbulos rojos se lavaron con pH 6,0 y 8,5 con
tampones osmolalidad ajustados para dar el mismo volumen de clulas como las clulas a pH 7,0
en solucin salina isotnica . En estas condiciones, las diferencias de desplazamiento qumico para
H2O y DMMP en los espectros de 1H fueron las mismas que para las clulas a pH 7,0 , dentro del
error experimental , para las muestras de hilado en el ngulo mgico y con el estator paralelo y
perpendicular al campo principal . Del mismo modo , en 31P espectros de las muestras de RBC
ajustado al volumen hiladas en el ngulo mgico , los desdoblamientos DMMP y TEP eran los
mismos que los de las clulas de pH 7,0 , mientras que las laminillas para HPA fueron
significativamente diferentes . Una comparacin de la divisin HPA entre RBC en solucin salina
isotnica a un pH de 6,0 y 8,5 y los de las clulas de volumen ajustado revel que la divisin se
redujo a pH 6,0 (tampn hipertnico ) y aument a pH 8,5 ( tampn hipotnico ) . HPA no es un
especies valorables en los valores de pH cubiertos en la realizacin de las calibraciones de pH para
las muestras de sobrenadante y lisado (datos no presentados), y que existe en la forma de base
ionizado , hipofosfito ( H2PO2 ) ; por lo tanto, lleva una sola carga negativa a estos valores de pH (
pKa 1,1 ) ( 10 ) . El cambio en la magnitud de la divisin pico se lleg a la conclusin que es el
resultado del cambio en el potencial de membrana provocado por el cambio en la fuerza inica
necesaria para alterar el volumen de las clulas .
La diferencia susceptibilidad magntica en los eritrocitos volumeadjusted a pH 6,0 y 8,5 era el
mismo que el medido para las clulas a un pH de 7,0 , dentro del error experimental .
Por lo tanto la fuente ms probable de la variacin en la susceptibilidad magntica con pH es el
cambio en el volumen de clulas , como la diferencia global de susceptibilidad es la combinacin
de aditivos
de las susceptibilidades magnticas molares de los componentes individuales en los dos
compartimentos (ley de aditividad de Wiedemann ( 14 ) ) . El cambio en la concentracin de
solutos y de protenas y en la cantidad relativa de agua en la clula con el cambio de volumen
inducido pH es suficiente para explicar el cambio en la diferencia global susceptibilidad magntica
entre los compartimentos intracelulares y el sobrenadante.
Aime et al . ( 7 ) han demostrado que la magnitud de la separacin entre picos intracelular y
extracelular de agua para varios tipos de clulas est relacionada con la protena celular
concentracin . Adems , para las soluciones de BSA el tamao del cambio de desplazamiento
qumico era independiente del pH pero dependiente de la concentracin de protena . Esto
confirma la
trabajo anterior sobre eritrocitos en condiciones estticas ( 13 ) . En estos experimentos se
observ una variacin de la separacin con el pH , pero se encontr que ir acompaada de un
cambio en el volumen celular . Por lavado de las clulas en especialmente compuesta hipo - o
medios hipertnica a diferentes valores de pH , se elimina la diferencia en divisin , dentro del
error experimental .
Por lo tanto se concluye que en los eritrocitos la concentracin de protena celular es la
abrumadora determinante de la magnitud de la separacin de pico a travs de cambios en el
grado de unin de hidrgeno de agua a s mismo u otras molculas sonda .
Los valores de pH de sobrenadante de clulas lavadas a pH 8,5 ( Tabla 3 ) varan dependiendo del
mtodo de medicin , con los calculados a partir de 31P - RMN espectros de clulas enteras
suspensiones siendo significativamente menos que los de 31PNMR espectros del sobrenadante de
lavado final . Esta diferencia es sorprendente teniendo en cuenta que en los eritrocitos
suspensiones el sobrenadante y las clulas existen en compartimentos separados en el rotor . Por
consiguiente, la resonancia sobrenadante en una suspensin de clulas debe dar un valor de pH
similar al de un sobrenadante nica muestra . La fuente de esta discrepancia no est clara , pero el
pH ms alto de la ltima sobrenadante de lavado se considera ms fiable en este caso , como el
almacenamiento en bfer por la hemoglobina dentro de la clula debe dar un pH intracelular ms
bajo que el del sobrenadante en un eritrocito suspensin a pH 8,5 . Llegamos a la conclusin de
que el enlace de hidrgeno - efecto que se produce con compuestos de fosforilo en 31P - RMN
espectros de eritrocitos en condiciones MAS '' fraccin de pico '' tambin se produce con agua en
los espectros de 1H - RMN . Mostramos aqu que la variacin en la divisin pico con pH es debido
al cambio en el volumen de la celda con el pH.


Muestras de eritrocitos para ngulo variable de giro experimentos de RMN se colocaron en una
celda de sellado 300 - ml ( Doty Cientfica , Columbia, SC ) , cuya tapa se modific para incorporar
un agujero y nylon roscado coaxial de comida de screwto permitir la eliminacin de burbujas de
aire , que interfieren con resolucin espectral para los espectros adquiridos en ngulos distintos
de la ngulo mgico . Los espectros de RMN se registraron en un DRX- 400 widebore
espectrmetro Bruker con una sonda XC7 ngulo de giro variable de ( Doty Cientfico ) . Los
espectros de 1H se puede adquirir en todos los ngulos y con esta sonda , pero el bloqueo de
frecuencia de campo y canales X - ncleo no son eficaces cuando el estator es perpendicular y
paralela a B0 , respectivamente . Las muestras se centrifugaron a 2 kHz para ; 30 s centrifugar las
clulas a la parte interior de la pared de la clula de sellado y, posteriormente, a 250 Hz . Todos los
experimentos se realizaron a 37 C , con temperatura de la muestra calibrada usando seco limpio
etilenglicol en una clula de sellado . Para los experimentos sobre muestras de lisados y
sobrenadantes , el 30 - s de giro a 2 kHz se omiti . Los desplazamientos qumicos de todos los
picos pertinentes se identificaron utilizando el pico automtica recogiendo rutina en Topspin 1.3 (
Bruker Biospin , Karlsruhe, Alemania ) despus de la correccin automtica de la lnea de base de
las regiones de inters .