Tcnicas de cultivo

INTRODUCCIN
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseado diversos mtodos que
permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo
condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las tcnicas
ms usadas en el laboratorio de microbiologa consiste en transferir una muestra
microbiolgica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener
cultivos microbianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el rea
de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar
precauciones para impedir que stos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra
parte, para considerar no slo el aspecto nutricional, sino tambin las condiciones ambientales
de su hbitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentracin
de sales y durante la incubacin condiciones tales como la temperatura, aireacin la
luminosidad. La aplicacin de estos procedimientos ha permitido propagar a los
microorganismos en cultivos mixtos, as como su aislamiento y la obtencin de cultivos puros,
facilitando de este modo, el estudio, caracterizacin, aplicacin y control de los mismos. La
forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propsito especfico
del estudio.
OBJETIVOS:
Aplicar la tcnica adecuada para preparar el rea de trabajo y evitar contaminaciones.
Organizar el material para su fcil manejo e identificacin.
Manipular adecuadamente los cultivos puros.
MARCO TEORICO
Aislamiento
Es la separacin de un determinado microorganismo del resto de microorganismos que le
acompaan. El mtodo ms usual es la siembra por estra sobre un medio de cultivo slido
adecuado dispuesta en una placa de petri.
Para ello se toma una pequea cantidad de muestra con un asa de platino y se reparte sobre la
superficie del medio de cultivo. Sobre el medio quedan separadas e inmovilizadas las clulas
bacterianas. Tras la incubacin en condiciones adecuadas, cada clula viable origina una
colonia visible resultado de sucesivas divisiones celulares. Cada colonia bacteriana tiene unas
caractersticas determinadas en cuanto a su forma, borde, elevacin, tamao , consistencia,
etc.. Los tipos de bacterias presentes en la muestra original son visibles como tipos diferentes
de colonias. A partir de colonias separadas suficientemente es posible obtener un cultivo puro
de cada uno de los tipos de bacterias presentes en la muestra original.

El xito del aislamiento, de la separacin sobre el medio de cultivo, depende de la superficie
sobre la que se ha distribuido la muestra. Es muy importante realizar el mayor nmero de
estras posible. En las primeras estras aparecern colonias confluentes o una masa continua
de microorganismos. En las estras finales debern aparecer colonias separadas unas de otras.
El aislamiento requiere un reducido inculo de partida. La sucesiva disminucin del tamao de
la poblacin sobre el asa (por descarga sobre el medio de cultivo) al recorrer el medio de
cultivo, debe asegurar que finalmente algunas clulas queden suficientemente separadas
(aisladas unas de otras) sobre la superficie.
Criterios para la diferenciacin de colonias El aspecto de las colonias, su coloracin, tamao,
etc. permiten diferenciar diferentes bacterias, aunque son propiedades generales muy
influenciadas por las condiciones de cultivo, por lo que a continuacin se realiza una
descripcin muy general. Las colonias pueden ser opacas, translucidas o transparentes.
Algunas producen pigmentos fluorescentes cuando se iluminan con luz ultravioleta. Otras
aparecen con superficie pulverulenta, otras son lisas, o rugosas, o poseen anillos concntricos.
En ocasiones el olor es tambin caracterstico.
Siembra
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra (inculo) en un medio
adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicacin. Una
vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.
Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:
Que se efecten aspticamente
Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estn esterilizados
Que se realicen solo los manipuleos indispensables
Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un mechero o bien
Flujo laminar.
Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los requerimientos del
microorganismo a estudiar.
Medios slidos:
Siembra por inmersin: se coloca el inculo en una placa o caja de Petri y sobre el mismo se
vierte el medio de cultivo previamente fundido. Este mtodo se utiliza para microorganismos
aerobios.
Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por inmersin.
Una vez solidificado el medio se vierte una cantidad extra de medio necesaria para cubrir la
capa anterior (generalmente 10 ml. aprox.). Este mtodo se utiliza para microorganismos
anaerobios facultativos y microaeroflicos.

Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido, se deja
solidificar y se coloca sobre la superficie el inculo. Con ayuda de una esptula de Drigalsky se
extiende el inculo hasta su absorcin total por el medio de c cultivo. Este tipo de siembra se
recomienda para microorganismos aerobios estrictos.
Siembra en estra: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido y se deja
solidificar.
Existen distintas tcnicas para la siembra en estras, el objeto es obtener colonias aisladas

Tcnica A
Consiste en cargar el ansa con la muestra y
hacer estras paralelas en la cuarta parte de
la superficie de la placa, se quema el ansa,
se enfra, se gira la placa a 90 y se vuelve a
estriar tocando 3 o 4 veces el rea sembrada
inicialmente y cubriendo otro cuarto de la
placa. Por ltimo, sin quemar el ansa, se
estra el resto de la superficie sin sembrar.

Tcnica B
Con el ansa cargada se hacen 3 o 4 estras; se
quema el ansa, se hacen 3 o 4 estras
perpendiculares a las anteriores, se quema el
ansa y se repite el procedimiento hasta agotar
la superficie de la placa.


Siembra en agar en tubo inclinado o bisel: en este caso se colocan 5 ml de medio de cultivo
fundido y estril, se inclina el tubo y se deja enfriar.

El inculo se siembra, con ayuda de ansa, de la siguiente manera:
En profundidad con ansa de punta: se pica con el ansa el cultivo a sembrar y se introduce
mediante pensin en el medio contenido en la parte inferior del tubo.

En superficie con ansa de aro: se pica con el ansa el cultivo a sembrar y se esparce el mismo
sobre la superficie en bisel en forma de zigzag.

MTODO DE SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O EN ESTRA
Con el asa estril tomamos la muestra y hacemos extensiones en la placa. Volvemos a
esterilizar el asa de siembra y extendemos parte de la extensin anterior en otra direccin.
Volvemos a esterilizar el asa de siembra y volvemos a extender parte de la segunda extensin
en otra direccin. Esterilizamos y repetimos la operacin.
Incubamos a 37 durante 24 horas y, en la primera zona, habr un amasijo de clulas. En la
segunda, parte de la primera zona estar mejor extendida, y en la tercera y en la 4 mejor an.
Si tomamos una colonia y la ponemos sobre una placa petri, tendremos un cultivo puro.
MTODO DE LAS DILUCIONES SUCESIVAS
Consiste en diluir una muestra hasta conseguir muy pocas clulas que, tras inocularse en un
medio de cultivo, generen colonias aisladas. Metodologa:


PROCEDIMIENTO
Tcnica de cultivo por Trasplante
Lquido a slido:
Esta tcnica se desarroll con una muestra de caldo TSB que contena E. coli y una placa Petri
que contena Mc Conkey. Primero se cogi una asa de siembra en aro esterilizada y se
sumergi en el tubo de caldo para poder obtener una gota de l, luego con mucho cuidado se
esparci por toda la placa (por estras), despus se procedi a dejarla en la incubadora todo el
fin de semana, esto se realiz en un rea esterilizado por el mechero.
Lquido a slido pico de Flauta
Tambin se realiz el trasplante del caldo de E. coli a un tubo con medio LIA que es un medio
semislido. Primero se esteriliz la asa de siembra en punta se sumergi en el caldo y se
procedi a inocular en el tubo con LIA de maneta vertical introduciendo el asa dos veces hasta
el fondo y saliendo por el mismo transepto y tambin a esparcir en la superficie (en estras).
Para as poder estudiar la movilidad de las bacterias, y se dej en la incubadora por el fin de
semana.

Slido a Solido por agotamiento de estras
Primero cogimos una colonia de una muestra ya preparada de cultivo con el asa en aro
previamente esterilizada y lo inoculamos en placas que contenan TSA y otra de SS, este
mtodo consiste en dividir la placa en cuatro cuadrantes; el primer cuadrante nos servirn
para realizar el inoculo inicial, el segundo el aislamiento por estras, el tercero volteamos el asa
y de nuevo por estras y en el cuarto de frente por estras y con ello se llega hasta el medio de
la placa, Y se dej incubar por el fin de semana.
De slido a solido con asa de Drigalsky
Para esto se tom una muestra de heces con un hisopo esterilizado y se inoculo en una placa
de TCBS, una vez introducida la muestra de heces en la superficie de la placa esta fue esparcida
con un asa de digrasky previamente esterilizada en alcohol al 70% por toda el rea de la placa
que se dej incubar por el fin de semana.
De slido a lquido
Primero cogimos una colonia de una muestra ya preparada de cultivo con el asa en punta
previamente esterilizada y lo introducimos en la parte superficial de una tubo que contena
TSB y enjuagamos el asa despacio para que salga toda la colonia poniendo de forma vertical el
tubo para que no ingrese ninguna otra bacteria. Y se dej en la incubadora por el fin de
semana.
Mtodo por diluciones sucesivas
para esta tcnica necesitamos solucin salina que va a ser distribuida a seis tubos 9ml en cada
uno una vez rotulados todos los tubos de

, en el primer tubo se agreg 1ml de

caldo de E.coli y se mezcl luego se procedi a sacar 1ml de este tubo y se insert en el tubo
10-2 se mezcl y se sac 1ml para el tubo 10 -3 y as hasta llegar hasta 10-6, una vez terminada
las diluciones se cogi 1ml del tubo de 10-4 y se vaci en una placa que contena TSA este fue
dispersado por una asa de drigalsky previamente esterilizada en alcohol y se dej incubar todo
el fin de semana.

RESULTADOS
Las placas realizadas de lquido a solido al ser observada no se pudieron diferenciar las
colonias, ya que apareci todo como un conglomerado; sea esas placas contenan una gran
concentracin de bacterias que no estaban aisladas. En relacin a la elevacin se observo un
desarrollo de colonia difuso, es decir no se pudo detectar si estas eran aplanadas o elevadas.
En los tubos de pico de flauta se observ colonias bien definidas en la parte superficial lo cual
quiere decir que las bacterias que fue inoculada en ella era aerbica ya que necesitaba de aire
para poder reproducirse.
En la placa de TSA y SS algunos salieron bien definidos y con colonias aisladas y otros solo un
conglomerado o en su efecto esparcidas pero no aisladas sea no tena una buena definicin.
En cuanto a la estructura interna se apreci el desarrollo de colonias transparentes, es decir,
que permiten el paso de la luz a travs de ella y se observ colonias opacas que por lo
contrario impiden el paso de la luz.

Las placas de TCBS que inicialmente eran de color verde tuvieron un viraje de color a amarillo y
en ella se encontraron colonias bien definidas y mucosas.
Los tubos de TSB algunos viraron de color amarillo a uno ms turbio (mostaza) y otros se
quedaron con el mismo color.
En el mtodo de diluciones sucesivas se pudo observar en la placa de TSA 173 colonias los
cuales estuvieron bien definidos y bien aislados.



No hay una explicacin adecuada para la variacin en la apariencia de las colonias, sin
embargo, parece que son consecuencia de la velocidad de crecimiento, la morfologa celular, la
tendencia para formar cadenas o filamentos (Walter, 1980)

DISCUSIN DE RESULTADOS
El crecimiento bacteriano realizando la siembra por estra no fue claramente observable,
presentando una forma de desarrollo en colonias separadas.
Cabe suponer que cada colonia aislada es la descendencia de una sola clula y, por
tanto un cultivo puro (Pelczar, 1977)
La forma de desarrollo es una de las caractersticas que contribuyen la morfologa de las
clulas bacterianas.
Entre las principales caractersticas de las bacterias figuran su tamao, su forma, su
estructura y tipo de agrupacin. Estas caractersticas constituyen la morfologa de la clula
bacteriana y la definen en un grupo taxonmico. (Pelczar, 1977)
en la siembra en tubos se pudo permitir claramente el crecimiento de microorganismos
presentando forma de desarrollo filiforme y predominando la consistencia viscosa. En la
siembra por puncin, se manifiesta el crecimiento de la lnea, esta representa la movilidad del
microorganismo.
Las caractersticas de las colonias que atraen mayor atencin son: el tamao, la forma, la
elevacin, el contorno, la superficie, la apariencia, el color y textura (Walter, 1980).
La movilidad se considera como una adaptacin que facilita la supervivencia al aumentar las
posibilidades de obtencin de alimento. (Carpenter, 1969)
Un organismo mvil crece solamente siguiendo la lnea de inoculacin por picadura
(Carpenter, 1969)
En este tipo de siembra medio liquido se observa el crecimiento de microorganismos mediante
el enturbamiento del medio de cultivo, la formacin de sedimento, desarrollo floculento y
formacin de membrana.
Estas son caractersticas que evidencian el desarrollo de los microorganismos en medio lquido.
Un organismo se disemina de la lnea de inoculacin a toda la masa de Agar hasta la pared del
tubo de ensayo, con lo que se produce turbidez en el medio de cultivo. (Carpenter, 1969)

CONCLUSIONES
v El desarrollo de colonias formadas a partir de las diluciones seriadas presentan
caractersticas que difieren en forma, borde, elevacin, superficie y estructura interna, lo cual
es notablemente influenciado por las concentraciones de carga microbiana del medio en el
cual dichas colonias se desarrollan.
v Esterilizar el rea antes de iniciar el trabajo.
v No colocar materiales sobre el mesn de trabajo.
v Trabajar con el rea estril.
v Hablar lo indispensable.
v No ingerir alimentos dentro del laboratorio.
v Al salir del laboratorio lavarse las manos con una solucin antibacterial.
v Debe asumirse que todas las superficies expuestas tales como la de las manos, las mesas,
instrumentos y aun los exteriores de los utensilios recin esterilizados estn contaminadas.
v En el momento de realizar la siembra la aguja y asa de platino deben esterilizarse por
calentamiento hasta rojo vivo.
Cuestionario
Cuando emplear un cultivo por dilusiones

BIBLIOGRAFIA
TECNICAS PARA LA SIEMBRA DE MICROORGANISMOS http://es.scribd.com/doc/14173131/5-
Tecnicas-Basicas-Para-El-Cultivo-de-Microorganismos#
BARRETO, Miriam. 1994. Manual Prctico de Microbiologa General. Canoabo
CARPENTER, Philip. 1969. Microbiologa. 2da Edicin. Editorial Interamericana, S.H. Mxico.
PELCZAR. 1990. Microbiologa. 2da Edicin. Editorial. Mc Graw-Hill. Mxico.
WALTER, W.G. 1980. Introduccin a la Microbiologa. Editorial Continental. Mxico.
GRASSINI, Luis. 1967. Microbiologa Agraria. UCV-Facultad de Agronoma. Caracas-Venezuela.
BLAIR, J. 1970. Manual Clnico de Microbiologa. Bethesda. AMER-Soc-Microbiolgica.
http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/aislamiento
http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practicoIII.pdf