Universidade Nova de Lisboa Faculdade de Cincias e Tecnologia

Tecnologia de enzimas


Estudo da actividade da enzima
invertase de clulas de Saccharomyces
Bayanus



Ana Raquel Sousa, n 35372 LBq
Marisa Coelho, n 34648 LQA
Susana Pulido, n31438 LQA

Docente: Prof. Ceclia Roque



Ano Letivo 2013/2014
Campus de Caparica, 26 de Maio de 2014.


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Tecnologia de Enzimas 2013/2014
ndice

Abreviaturas ....................................................................................................................................... 3
Resumo ............................................................................................................................................... 4
Abstract .............................................................................................................................................. 4
1. Introduo .................................................................................................................................. 5
2. Parte experimental ..................................................................................................................... 6
2.1. Materiais e Reagentes ........................................................................................................ 6
2.2. Mtodo ............................................................................................................................... 7
3. Apresentao e Discusso de Resultados .................................................................................. 7
3.1. Trabalho 1 - Estudo da actividade da invertase de clulas de Saccharomyces bayanus ....... 7
3.2. Trabalho 2 - Estudo da actividade da invertase imobilizada covalentemente a um suporte
inorgnico (slica porosa) ................................................................................................................... 9
3.3. Trabalho 3 - Estudo da atividade da invertase de clulas de Saccharomyces bayanus
imobilizadas em alginato de clcio ................................................................................................... 12
4. Concluso/Conclusion .............................................................................................................. 15
5. Bibliografia ................................................................................................................................ 16
6. Apndice...................................................................................................................................16














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Tecnologia de Enzimas 2013/2014
Abreviaturas

As abreviaturas utilizadas ao longo do texto so aqui apresentadas, seguidas da correspondente
definio. No texto so explicadas quando aparecem, mantendo-se as abreviaturas na forma em que so
reconhecidas internacionalmente.
Vo Velocidade inicial
KM Constante de Michaelis
Vmx Velocidade mxima
global Factor de efectividade global
global mdio Factor de efectividade global mdio
Porosidade interna
a rea superficial da partcula por unidade de volume
D Difusividade do substrato
De Difusividade efectiva
Mdulo do substrato, d uma razo entre os efeitos difusionais e os cinticos
Tortuosidade
KL coeficiente de transferncia de massa do substrato
Mdulo de Thiele representa a importncia relativa dos efeitos cinticos face aos difusionais
Vcintica Velocidade cintica
B Concentrao adimensional do substrato
B Concentrao adimensional do subtrato
Vobs Velocidade observada
Vobs Velocidade observada superfcie dos poros da matriz
interno Factor de efectividade interno
externo Factor de efectividade externo
Ss Concentrao de substrato superfcie da matriz
Ss Concentrao de substrato superfcie dos poros da matriz
[Sac] concentrao de sacarose







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Tecnologia de Enzimas 2013/2014
Resumo

Nestes trabalhos prticos pretendeu-se estudar a actividade do enzima invertase de clulas de levedura
Saccharomyces bayanus para a determinao dos parmetros cinticos (V0, KM e Vmx) da hidrlise da
sacarose, em trs condies diferentes: clulas livres, imobilizadas covalentemente a um suporte inorgnico
de slica porosa e imobilizadas em alginato de clcio. Para tal, foram realizados ensaios com diferentes
concentraes de sacarose (10, 15, 25, 35, 45, 55, 70, 80, 90 e 100 g/L). O nosso grupo de trabalho operou
com as concentraes de 35, 70 e 100 g/L.
A quantidade de produto foi determinada colorimetricamente pelo mtodo do 3,5-dinitrossalicilico
(DNS), aps a recolha de amostras de soluo enzima-substrato ao longo do tempo e a sua concentrao foi
obtida a partir da leitura da densidade ptica a 540 nm.
A determinao dos parmetros cinticos foi possvel admitindo uma cintica de Michaelis-Menten, o
que permitiu calcular as velocidades iniciais da reao para cada uma das concentraes de sacarose e em
cada situao. A velocidade mxima (Vmx) e a constante de Michelis-Menten (KM), foram determinadas a
partir das linearizaes da equao de Michelis-Menten: Lineweaver-Burk, Hanes Woolf e Eadie Hofstee.
No estudo com o enzima livre obteve-se um KM de 64,100 g/L e um Vmx de 0,231 g/L.min, com o enzima
imobilizada covalentemente a um suporte inorgnico um KM de 565,123 g/L e um Vmx de 0,982 g/L.min e,
finalmente, para o enzima imobilizada em alginato de clcio um KM de 66,453 g/L e um Vmx de 0,183
g/L.min.
Abstract

The aim of this work was to study the activity of the enzyme invertase of Saccharomyces bayanus
yeast cells, for the determination of kinetic parameters (Vo, Km and Vmax) for hydrolysis of sucrose in three
different conditions: free cells, immobilized covalently to a inorganic porous silica support and immobilized
in calcium alginate. To this study, trials with different sucrose concentrations (10, 15, 25, 35, 45, 55, 70, 80,
90 and 100 g/L) were used. Our working group operated with concentrations of 35, 70 and 100 g / L.
The amount of product was determined colorimetrically by the 3,5- dinitrosalicylic (DNS ) method
after sampling the enzyme-substrate solution over time and its concentration was obtained from reading
the optical density at 540 nm.
The determination of the kinetic parameters is possible assuming a Michaelis- Menten kinetics,
which allowed us to calculate the initial rates of reaction for each concentration of sucrose and in each
case. The maximum velocity (Vmax) and the Michelis-Menten constant (KM) , were determined from the
linearization of the Michelis-Menten equation: Lineweaver-Burk, Hanes Woolf and Eadie Hofstee.
In the study with the free enzyme was obtained a KM of 64.100 g/L and Vmax of 0.231 g/L.min,
with the immobilized covalently to a inorganic porous silica support a KM of 565.123 g/L and a Vmax of
0.982 g/L.min and finally to the enzyme immobilized in calcium alginate, KM of 66.453 g/L and Vmax of
0.183 g/L.min .

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Tecnologia de Enzimas 2013/2014
1. Introduo
Os organismos, como a Saccharomyces bayanus, necessitam de energia, para sobreviver, que obtm
atravs de processos metablicos. No entanto, esses processos metablicos so, muitas vezes, demasiado
lentos e, assim, sem viabilidade para o organismo, por isso necessrio a existncia de biocatalisadores
enzimas
1
.
Os enzimas tm a capacidade de acelerar as reaes qumicas, sem interferir com o equilbrio qumico,
bem como aumentar a especificidade para o substrato, devido carga, tamanho e/ou caractersticas
hidrofbicas/hidroflicas
2
.
Ao longo dos trabalhos prticos, estudou-se a actividade de um enzima em particular, a -
frutofuranosidase (invertase) da Saccharomyces bayanus. Esta catalisa a hidrlise da sacarose (dissacrido
composto por -D-frutose e -D-glucose ligadas atravs de uma ligao glicosdica -1,4) em glucose e
frutose
3
. (Figura 1)
Figura 1. Reao de hidrlise da sacarose, catalisada pelo enzima invertase
4
.
De forma a estudar a cintica da hidrlise, admitiu-se uma cintica de Michaelis-Menten e recorreu-se a
um mtodo colorimtrico com DNS. Este mtodo baseia-se no facto do DNS apenas sofrer uma reduo na
presena de acares redutores, como a glucose e a frutose; a sua forma reduzida (3-amino-5-
nitrossaliclico) possui uma elevada absorvncia a 540nm e identifica-se facilmente pela colorao
acastanhada
5
.
Os trabalhos experimentais tiveram como objectivo o estudo da actividade da invertase em trs
condies distintas: o enzima livre, o enzima imobilizada covalentemente a um suporte inorgnico (slica
porosa) e as clulas de Saccharomyces bayanus imobilizadas em alginato de clcio. Assim, possvel
perceber a forma como afectam a cintica da invertase.
A imobilizao de um enzima apresenta vrias vantagens, entre elas destacam-se o facto de aumentar a
resistncia a alteraes de temperatura e pH do meio e de permitir, aps a reao, a separao entre o
enzima e os produtos formados, o que possibilita a sua reutilizao, aumentando, desta forma, a viabilidade
do enzima
6
.
No entanto, a imobilizao de enzimas tambm acarreta algumas desvantagens, como o aumento do
custo de todo o processo e a diminuio da actividade enzimtica devido aos efeitos de imobilizao. Os
efeitos de imobilizao incluem: efeitos estereoqumicos, a imobilizao provoca uma obstruo do centro
ativo do enzima; efeitos conformacionais modificao da estrutura terciria do centro ativo; efeitos de
partio entre micro e macro ambientes, onde se verifica uma variao do pH timo do enzima e, por
ltimo, os efeitos de transferncia de massa (externos e internos) que esto relacionados com a resistncia
difuso do substrato para o centro ativo e do produto
7
.
Relativamente ao Trabalho nmero 2, utilizou-se o mtodo de imobilizao por ligao covalente a um
suporte de slica porosa. A ligao covalente estabelecida entre os grupos aldedo do suporte e os grupos
amina dos aminocidos do enzima invertase. (Figura 2) Uma das vantagens deste mtodo de imobilizao
a forte ligao entre o suporte e o enzima, o que confere uma maior estabilidade ao complexo formado
8
.

6
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Figura 2. Representao da ativao das partculas de slica porosa com 3-aminopropiltrietxisilano, reao com
glutaraldedo e imobilizao de um enzima ao suporte inorgnico 4.

Em relao ao Trabalho nmero 3, recorreu-se o mtodo de aprisionamento de clulas em gel. As
clulas de Saccharomyces bayanus so incorporadas numa soluo de alginato de sdio que, por conter
ies monovalentes (Na
+
), solvel em gua e, posteriormente, so adicionados a uma soluo de cloreto de
clcio. Tendo em conta a presena de ies divalentes (Ca
2+
), forma-se um gel (gelificao por troca inica)
no qual esto aprisionadas as clulas (biocatalisadores)
9
. (Figura 3) Este mtodo apresenta vantagens como
a possibilidade de utilizar as vrios enzimas do biocatalizador e evita a sua extrao do mesmo 4.






Figura 3. Representao do processo de gelificao, por troca inica, e imobilizao do biocatalizador 4.

2. Parte experimental
2.1. Materiais e Reagentes

Tabela 1. Material utilizado no presente trabalho e as respectivas marcas.



Material Marca
Espectrofotmetro Utrospec 3100 pro
Balana analtica Sartoruis
Reator -
Banho termostatizado -
Material corrente de laboratrio -

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Tabela 2. Reagentes utilizados no presente trabalho e as respectivas marcas.
Reagente Marca
Sacarose Pam reac
Alginato de clcio Sigma
DNS Sigma
Slica Sigma
Clulas Saccharomyces bayanus -

2.2. Mtodo

Para a realizao do presente trabalho experimental seguiu-se o protocolo fornecido pelo docente 4,
contudo foram efetuadas algumas modificaes: 1) Foram utilizadas todas as concentraes de sacarose
(15, 25, 35, 45, 55, 70, 80, 90 e 100 g/L) exceo da concentrao de 10 g/L no trabalho n1 e 2, e da
concentrao 100 g/L no trabalho n2; 2) O nosso grupo de trabalho executou os ensaios com as
concentraes de sacarose de 35, 70 e 100 g/L, e as respectivas temperaturas dos ensaios encontram-se na
tabela 3;
A etapa de adio do cido 3,5-di-nitrosaliclico (DNS) cessa a reao da sacarose com a invertase e, com
o posterior aquecimento, ocorre a desnaturao das protenas e o fim da ao cataltica do enzima. A etapa
de adio da gua, aps o aquecimento, tem como finalidade a diluio das soluces, para as
concentraes estarem dentro da faixa de sensibilidade do mtodo.

Tabela 3. Temperatura (C) dos ensaios efectuados por o nosso grupo nos vrios trabalhos experimentais.
[Sacarose] (g/L)
Trabalhos experimentais 35 70 100
1 44 43,5 44
3 44,5 44,5 44,5
3. Apresentao e Discusso de Resultados
Neste trabalho foram executados e estudados dois mtodos de imobilizao de enzima de modo a ser
possvel comparar parmetros cinticos da hidrlise da sacarose pelo enzima invertase de clulas de
Saccharomyces bayanus. No trabalho 2 utilizou-se uma imobilizao por ligao covalente por slica porosa
e no trabalho 3 utilizou-se uma imobilizao de adsoro por alginato de clcio.
Atravs da cintica de Michaelis-Menten, determinaram-se as constantes KM e Vmx, KM corresponde
afinidade enzima-substrato e corresponde concentrao de substrato para metade da velocidade mxima,
e Vmx velocidade mxima que corresponde velocidade inicial quando se atinge a saturao,
respectivamente.

3.1. Trabalho 1 - Estudo da actividade da invertase de clulas de Saccharomyces bayanus

Neste primeiro trabalho em que as clulas no esto imobilizadas, permitiu estudar a cintica do enzima
livre clulas Saccharomyces bayanus, sem limitaes difusionais, pois no existem efeitos conformacionais
e estereoqumicos que possam resultar da imobilizao do enzima e influenciar a atividade da mesma,
servindo assim como meio de comparao com os outros estudos nos quais existe imobilizao.
Determinaram-se as diferentes concentraes de acares redutores - Produto (tabela 5) em que foram
retiradas, do reator, amostras de enzima-substrato de um em um minuto at se atingir sete minutos de
reao, para as diferentes concentraes de sacarose. De seguida a quantidade de acares redutores
produzida foi determinada colorimtricamente atravs do mtodo de DNS. Por fim, leu-se a absorvncia
das amostras num comprimento de onda de 540 nm (tabela 4). Para a obteno de melhores resultados
foram desprezadas algumas concentraes de sacarose, tais como, as concentraes 55, 80 e 90 g/L.

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De todos os valores de concentrao obtidos foram tidos em conta os que permitiram uma melhor
linearizao, isto , um ndice de correlao prximo de 1, obtendo-se o grfico da figura 4.
A partir dos resultados obtidos, possvel comparar os parmetros cinticos da hidrlise de sacarose
pelo enzima invertase de clulas Saccharomyces bayanus por uma tcnica de enzima livre e imobilizada.
Neste trabalho no foram utilizados quaisquer mtodos de imobilizao.

Tabela 4. Absorvncia medida a 540 nm do
produto obtido, para cada concentrao,
durante 7 min.

Tempo
[Sacarose] (g/L)
15 25 35 45 70 100

0 0 0 0 0 0 0
1 0,012 0,005 0,052 0,044 0,043 0,067
2 0,051 0,076 0,093 0,091 0,056 0,189
3 0,084 0,106 0,115 0,138 0,190 0,216
4 0,088 0,247 0,182 0,234 0,279 0,312
5 0,140 0,205 0,226 0,302 - 0,402
6 0,158 0,206 0,345 0,383 - 0,548
7 0,185 0,233 0,330 0,386 0,513 0,623



Tabela 5. Concentrao (g/L) dos produtos
obtidos.


A partir da figura 4, concentrao de produto (g/L) em funo do tempo (min), possvel calcular as
velocidades inicias (Vo) da reao para cada concentrao de sacarose, correspondente ao declive de
cada reta.
Os clculos realizados para a obteno das concentraes dos acares redutores ([Produto])
Figura 4 e velocidades iniciais (Vo) encontram-se em anexo (Anexo II).
No caso em estudo, apenas acompanhamos o momento inicial da reao, por isso, conseguimos
obter diretamente a velocidade inicial pelo declive. Como era espectvel, para concentraes de
substrato maiores verificam-se valores de velocidade inicial mais elevados. A partir destes valores
aplicaram-se as linearizaesde Lineweaver-Burk, Hanes Woolf e Eadie Hofstee, de modo a obter os
parmetros cinticos KM e Vmx.




Figura 4. Representao da concentrao de Produto obtido (g/L) em funo do tempo (min).




y = 0,044x
R = 0,9812
y = 0,0644x
R = 0,8327
y = 0,082x
R = 0,9607
y = 0,0972x
R = 0,9757
y = 0,1157x
R = 0,9541
y = 0,1442x
R = 0,9833
0,0
0,5
1,0
1,5
0 2 4 6 8
[
P
r
o
d
u
t
o
]

(
g
/
L
)
Tempo (min)
[Produto] vs Tempo
15 g/L
25 g/L
35 g/L
45 g/L
70 g/L
100 g/L
Tempo
[Sacarose] (g/L)
15 25 35 45 70 100

0 0 0 0 0 0 0
1 0,0202 0,0084 0,0875 0,0740 0,0723 0,1127
2 0,0858 0,1279 0,1565 0,1531 0,0942 0,3180
3 0,1413 0,1783 0,1935 0,2322 0,3197 0,3634
4 0,1480 0,4155 0,3062 0,3937 0,4694 0,5249
5 0,2355 0,3449 0,3802 0,5081 - 0,6763
6 0,2658 0,3466 0,5804 0,6443 - 0,9219
7 0,3112 0,3920 0,5552 0,6494 0,8631 1,0481

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Tabela 6. Velocidades iniciais (Vo) calculadas para cada concentrao.
[Sacarose] (g/L) Velocidades Iniciais (g/L.min)
15 0,044
25 0,064
35 0,082
45 0,097
70 0,116
100 0,144
possvel verificar que a velocidade inicial aumenta gradualmente com o aumento da concentrao
de sacarose, uma vez que a reao segue a cintica de Michelis-Menten Figura 4.

- Linearizaes da equao de Michaelis-Menten
Admitindo uma cintica de Michaelis-Menten e correlacionando as velocidades iniciais para
diferentes concentraes de sacarose, possvel obter a constante de Michaelis-Menten (KM) e a
velocidade mxima (Vmx). A equao de Michelis-Menten pode ser rearranjada em trs linearizaes,
para a determinao desses parmetros, a linearizao de Lineweaver-Burk, a linearizao de Eadie
Hofstee e a linearizao de Hanes-Woolf.

Tabela 7. Parmetros das linearizaes de Michaelis-Menten.
[Sacarose] (g/L) Vo 1/Vo 1/[S] Vo/[S] [S]/Vo
15 0,044 22,727 0,067 0,003 340,909
25 0,064 15,528 0,040 0,003 388,199
35 0,082 12,195 0,029 0,002 426,829
45 0,097 10,288 0,022 0,002 462,963
70 0,116 8,643 0,014 0,002 605,013
100 0,144 6,935 0,010 0,001 693,481


Tabela 8. Valores de KM, Vmax e linearizaes obtidos.
Linearizao KM (g/L) Vmx (g/L.min) Equao Linearizaes obtidas
Lineweaver-Burk 63,351 0,229
1

=
1

[]

y=276,05x + 4,3575
R
2
=0,9987
Eadie-Hofstee 63,431 0,230 =

[]

y=-63,431x + 0,2298
R
2
=0,9777
Hanes-Woolf 65,517 0.234

+
1

[]
y=4,2708x + 279,81
R
2
=0,9895
Mdia 64,100 0,231


Como se pode observar, com o aumento de concentrao de substrato, os valores de
velocidade inicial vo aumentando e aproximam-se de Vmx, o que demonstra a proximidade
concentrao de substrato saturante, que quando o enzima se encontra totalmente complexada com
o substrato. Uma vez compreendida a cintica do enzima em clulas livres, faz agora sentido estudar o
enzima em clulas imobilizadas.
3.2. Trabalho 2 - Estudo da actividade da invertase imobilizada covalentemente a um
suporte inorgnico (slica porosa)

A imobilizao em slica envolve a criao de ligaes covalentes entre o enzima e os grupos reativos
do suporte originando biocatalizadores muito estveis. Neste tipo de imobilizao, a ligao pode inibir
o movimento do enzima e assim reduzir a sua atividade no permitindo mudanas conformacionais.

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y = 0,0221x
R = 0,835
y = 0,0325x
R = 0,9386
y = 0,0478x
R = 0,8819
y = 0,0584x
R = 0,9801
y = 0,074x
R = 0,9143
y = 0,0844x
R = 0,9877
y = 0,1185x
R = 0,9559
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
0 2 4 6 8 10
[
P
]
Tempo (min)
15 g/L
25 g/L
35 g/L
45 g/L
55 g/L
70 g/L
90 g/L
Tal como nos estudos anteriores, a imobilizao do enzima em slica permite analisar os efeitos de
transferncia de massa envolvidos, permitindo a comparao com outro tipo de suporte.
Foram calculados os valores de velocidade inicial (tabela 11) e comparados com os obtidos
anteriormente (tabela 6), verificando-se que os mais elevados so os do enzima livre, tal como seria de
esperar, apesar das diferenas no serem muito acentuadas.
Para a obteno de melhores resultados foram desprezadas algumas concentraes de sacarose, tais
como, a concentrao de 80 g/L.

Tabela 9. Absorvncias a 540nm do produto obtido para cada
concentrao (a vermelho so pontos desprezados).

Tempo
[Sacarose] (g/L)
15 25 35 45 55 70 90

0 0 0 0 0 0 0 0
1 0,052 0,044 0,096 0,015 0,108 0,071 0,061
2 0,022 0,020 -0,003 0,045 0,113 0,099 0,075
3 0,032 0,049 0,014 0,087 0,180 0,135 0,188
4 0,035 0,066 0,060 0,070 0,196 0,219 0,359
5 0,076 0,092 0,119 0,196 0,198 0,276 0,406
10 0,135 0,21 0,289 0,348 0,417 0,485 0,668

Tabela 10. Concentrao (g/L) dos produtos obtidos.

Tempo
[Sacarose] (g/L)
15 25 35 45 55 70 90

0 0 0 0 0 0 0 0
1 0,087 0,074 0,162 0,025 0,182 0,119 0,059
2 0,037 0,034 -0,005 0,076 0,190 0,167 0,079
3 0,054 0,082 0,024 0,146 0,303 0,227 0,108
4 0,059 0,111 0,101 0,118 0,330 0,368 0,214
5 0,128 0,155 0,200 0,330 0,333 0,464 0,367
10 0,227 0,353 0,486 0,585 0,702 0,816 0,559


Os clculos realizados para a obteno das concentraes dos acares redutores (indicado
como produto) Figura 5 e velocidades iniciais (Vo) encontram-se em anexo. (Anexo II)
Figura 5. Representao da concentrao de produto (g/L) em funo do tempo (min).

Tabela 11. Velocidades iniciais (Vo), calculadas para cada concentrao.
[Sacarose] (g/L) Velocidades Iniciais (g/L.min)
15 0,022
25 0,033
35 0,048
45 0,058
55 0,074
70 0,084
90 0,119


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De modo a completar e corroborar os parmetros cinticos foram feitas as linearizes de
Michaelis-Menten.

- Linearizaes da equao de Michaelis-Menten
Admitindo uma cintica de Michaelis-Menten e correlacionando as velocidades iniciais para
diferentes concentraes de sacarose, possvel calcular os parmetros cinticos (Vmx e KM).

Tabela 12. Valores de KM e Vmx obtidos.
Linearizao KM (g/L) Vmx /g/L.min) Equao Linearizaes obtidas
Lineweaver-Burk 243,344 0,399
1

=
1

[]

y=663,19x + 2,1411
R
2
=0,9921
Eadie-Hofstee 38,782 0,123
=

[]

y=-195,62x + 0,3214
R
2
=0,2501
Hanes-Woolf 1413,243 2,425

+
1

[]
y=1,0075x + 709,38
R
2
=0,3085
Mdia 565,123 0,982 - -
.
Como se pode constatar o KM bastante superior relativamente ao KM do trabalho 1, e isto
deve-se ao facto das ligaes covalentes poderem alterar quimicamente o enzima, fazendo com que
este diminua a sua afinidade para com o substrato, no entanto, os resultados das linearizaes foram
muito diferentes entre si, e por isso estes valores de KM podero no ser fiveis. O Vmx exibe um valor
superior, porm seria de esperar um valor inferior, pois com a ligao covalente o enzima perde
atividade, no entanto, tal como os valores de KM, estes valores resultantes das linearizaes tambm
so muito diferentes entre si, o que torna estes valores no muito credveis.

Tabela 13. Velocidades iniciais do enzima livre.
Enzima Livre
[Sacarose] (g/L) Velocidades iniciais (g/L.min)
10 0,327
15 0,399
25 0,555
45 0,582
55 0,666
70 0,794
100 0,940

De acordo com os dados disponibilizados no protocolo para o enzima livre, determinaram-se a Vmx e
o KM e, consequentemente, foi possvel calcular a efetividade global para cada concentrao de
substrato, bem como o fator de efetividade mdio.
Para a obteno de melhores resultados, excluiu-se a concentrao de sacarose de 80 g/L, pois os
resultados obtidos laboratorialmente (do enzima em estudo) no foram os esperados. Para os clculos
dos parmetros das linearizaes de Michaelis-Menten, procedeu-se tal como no trabalho n 1,
obtendo-se os resultados da Tabela 14.


Tabela 14. Valores de KM e Vmx obtidos para o enzima livre.
Linearizao KM (g/L) Vmx /g/L.min) Equao Linearizaes
Lineweaver-Burk 19,184 0,937
1

=
1

[]

y= 20,473x+1,0672
R
2
= 0,9619
Eadie-Hofstee 20,883 0,980
=

[]

y = -20,883x + 0,9802
R
2
= 0,8
Hanes-Woolf 31,435 1,154

+
1

[]
y= 0,8662x + 27,229
R
2
= 0,9362

Em anexo apresentam-se os clculos da velocidade cintica do enzima livre (Vcintico) e do factor de
efetividade global (global). Para os clculos foram utilizados os valores de Vmx e KM do enzima livre
obtidos por linearizao de Lineweaver-Burk por se ter obtido um R
2
mais prximo de 1.

12
Tecnologia de Enzimas 2013/2014

Tabela 15. Valores de Vcintico (enzima livre) e Vobservado

(enzima em ligao covalente equivalente velocidade

inicial) utilizados para o clculo do fator de efetividade.
[Sacarose] (g/L) Vcintico (g/L.min) Vobservado (g/L.min) global
10
0,411 0,024 0,059
15
0,530 0,036 0,068
25
0,605 0,043 0,071
45
0,657 0,063 0,096
55
0,695 0,082 0,118
100
0,735 0,094 0,127
global mdio
0,099

A reteno de atividade (RA) outro parmetro que permite comparar a atividade, neste caso
velocidade mxima, do enzima livre com a do enzima imobilizado. Para tal, calculou-se a velocidade
cintica do enzima livre, atravs de valores de velocidade inicial e concentrao de substrato fornecidos
no protocolo. Com os valores fornecidos foi tambm possvel determinar o global, apresentando-se
todos os clculos necessrios no anexo (Anexo II).
A reteno de atividade calculada atravs das velocidades mximas dos enzimas (livres e em
ligao covalente), sendo utilizado para ambas o valor obtido pelas linearizaes de Lineweaver-Burk.

Reteno de atividade =
atividade inicial (ligao covalente)
atividade inicial (livre)
x 100% R. A =
0,399
0,937
x 100%
R. A = 42,571 %

Ento, a reteno de atividade igual a 42,571%, este valor diz-nos que a atividade do enzima
imobilizada 42,571% inferior atividade do enzima livre.
O valor obtido para a reteno superior ao esperado, uma vez que as condies reacionais de
imobilizao poderiam desnaturar o enzima, alterando-o quimicamente e obstruindo o centro ativo e
por isso obter-se-ia um valor de RA mais baixo. Relativamente aos valores de global, verifica-se que a
mdia um valor muito reduzido, o que permite concluir que se sentiram limitaes difusionais.
3.3. Trabalho 3 - Estudo da atividade da invertase de clulas de Saccharomyces bayanus
imobilizadas em alginato de clcio
A imobilizao de biocatalizadores garante a reteno de atividade cataltica e a sua utilizao
repetida ou contnua mas pode tambm alterar a sua atividade, pois iro existir outras interaes alm
da interao enzima-substrato, refletindo-se nos seus parmetros cinticos. Estas alteraes podem
ocorrer devido a vrios fatores, tais como, efeitos conformacionais e estereoqumicos, efeitos de
partio ou efeitos de transferncia de massa ou difuso.
No caso em estudo, esto apenas a ser analisados os efeitos de transferncia de massa, que provm
das resistncias difusionais ao transporte do substrato at ao centro ativo da enzima e do produto para
o meio reacional. Foram ento calculados os valores de velocidade inicial do enzima nas clulas
imobilizadas em alginato de clcio, do mesmo modo que foram calculados para as clulas livres.

Tabela 16. Absorvncias a 540nm do produto obtido para cada concentrao.
Tempo
[Sacarose] (g/L)
15 25 35 45 55 70 80 90 100
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3 0,098 0,150 0,121 0,063 0,1315 0,099 0,039 0,046 0,145
6 0,096 0,194 0,257 0,207 0,414 0,298 0,235 0,088 0,365
9 0,193 0,520 0,345 0,361 0,637 0,49 0,44 0,215 0,633
12 0,223 0,624 0,433 0,53 0,897 0,737 0,62 0,376 0,908
15 0,323 0,853 0,553 0,688 1,1075 0,908 0,829 0,508 1,177



13
Tecnologia de Enzimas 2013/2014
Tabela 17. Concentrao (g/L) dos produtos obtidos.
Tempo
[Sacarose] (g/L)
15 25 35 45 55 70 80 90 100
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3 0,165 0,252 0,204 0,106 0,221 0,167 0,066 0,077 0,244
6 0,162 0,326 0,432 0,348 0,697 0,501 0,395 0,148 0,614
9 0,325 0,875 0,580 0,607 1,072 0,824 0,740 0,362 1,065
12 0,375 1,050 0,728 0,892 1,509 1,240 1,043 0,633 1,528
15 0,543 1,435 0,930 1,157 1,863 1,528 1,395 0,855 1,980




Figura 6. Representao da concentrao de produto (g/L) em funo do tempo (min).

Tabela 18. Velocidades iniciais (Vo), calculadas para cada concentrao.
[Sacarose] (g/L) Velocidades Iniciais (g/L.min)
15 0,034
25 0,090
35 0,063
45 0,073
55 0,122
70 0,098
80 0,086
90 0,050
100 0,125
Seria de esperar uma diminuio das velocidades inicias neste trabalho, uma vez que as clulas
estavam imobilizadas com alginato, e o substrato teria de difundir atravs dos poros at chegar ao
enzima, havendo portanto, uma maior resistncia do que se as clulas estivessem livres, e por isso a
velocidade inicial teria de ser inferior, mas tal no se verifica.
Comparando as velocidades iniciais do enzima nas clulas livres (tabela 6) e imobilizadas com
alginato (tabela 18) pode se observar que os valores oscilam muito, no podendo afirmar-se que existe
um padro.





y = 0,0344x
R = 0,9554
y = 0,0903x
R = 0,9615
y = 0,0629x
R = 0,9926
y = 0,0726x
R = 0,9733
y = 0,1223x
R = 0,9902
y = 0,0984x
R = 0,981
y = 0,0862x
R = 0,9584
y = 0,0501x
R = 0,9158
y = 0,1253x
R = 0,9825
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 2 4 6 8 10 12 14 16
[
P
r
o
d
u
t
o
]

(
g
/
L
)
Tempo (min)
[Produto] vs Tempo
15 g/L 25 g/L 35 g/L 45 g/L 55 g/L 70 g/L 80 g/L 90 g/L 100 g/L

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Tecnologia de Enzimas 2013/2014
- Linearizaes da equao de Michaelis-Menten
Admitindo uma cinetica de Michaelis-Menten e correlacionando as velocidades iniciais
para diferentes concentracoes de sacarose, e possivel calcular os parametros cineticos (Vmax e KM).

Tabela 19. Valores de KM, Vmx e linearizaes obtidos.
Linearizao KM (g/L) Vmx (g/L.min) Equao Linearizaes
Lineweaver-Burk 62,105 0,176
1

=
1

[]

y=352,74x + 5,6797
R
2
=0,9852
Eadie-Hofstee 60,872 0,176
=

[]

y=-60,872x + 0,1757
R
2
=0,7224
Hanes-Woolf 76,382 0,198
=

[]

y=5,0416x + 385,09
R
2
=0,8111
Mdia 66,453 0,183 - -

Sendo o KM um fator de afinidade, o seu aumento relativamente ao do enzima livre era de
esperar, uma vez que a imobilizao das clulas leva a uma diminuio de afinidade do enzima para com
o substrato, no entanto este aumento foi pouco acentuado (de 64,100 para 66,453).
O valor de Vmx menor, o que nos indica que o enzima ir converter o substrato em produto
mais devagar, embora no caso do alginato, a diferena no seja muito significativa. Posto isto, faz
sentido calcular o fator de efetividade externo e interno, visto estarmos na presena de efeitos
difusionais externos e internos que podem afetar diretamente a velocidade e cuja influncia deve ser
estimada em separado (anexo II). Uma vez determinada a influncia de cada um, estima-se o fator de
efetividade global, atravs do produto destes dois fatores.
Quando este fator est prximo de 1 significa que as limitaes difusionais so poucos sentidas
e quando est prximo de 0 quer dizer as limitaes difusionais so muito sentidas, e neste caso, sendo
que os valores de externo e interno esto muito prximos de 0, mostra como as resistncias externas
e internas so ambas muito sentidas. Todos os clculos necessrios para a elaborao da tabela seguinte
encontram-se no anexo II.


Tabela 20. Valores obtidos para Vobs (a velocidade observada corresponde a velocidade inicial (Vo)), velocidade
cinetica (Vcintica), factor de efectividade externo, interno e global (externo, interno, global), concentracoes de
substrato a superficie da matriz (SS) e superficie dos poros da matriz (Ss).
[sacarose]
g/L
Vobservado
(g/L.min)
Vcintico
(g/L.min)
externo interno global Ss
(g/L)
Ss (g/L) global*
15 0,005 0,034 0,150 0,180 0,027 1,888 15,345 1,019
25 0,008 0,050 0,160 0,150 0,024 3,039 64,475 1,801
35 0,013 0,063 0,200 0,170 0,034 4,925 34,697 0,994
45 0,019 0,074 0,250 0,185 0,046 7,461 43,554 0,981
55 0,023 0,083 0,280 0,187 0,052 9,650 133,080 1,473
70 0,028 0,094 0,300 0,190 0,057 12,087 76,956 1,046
80 0,032 0,100 0,320 0,193 0,062 14,077 58,951 0,861
90 0,035 0,105 0,330 0,195 0,064 15,571 24,982 0,475
100 0,037 0,110 0,340 0,200 0,068 17,058 143,388 1,137
Mdia 0,048
* - calculado sem ter em conta limitaes difusionais.

Tabela 21. Parmetros das linearizaes de Michaelis-Menten.
[Sacarose] (g/L) Vo 1/Vo 1/[S] Vo/[S] [S]/Vo
15 0,034 29,070 0,067 0,002 436,047
35 0,063 15,898 0,029 0,002 556,439
45 0,073 13,774 0,022 0,002 619,835
70 0,098 10,163 0,014 0,001 711,382
80 0,086 11,601 0,013 0,001 928,074
100 0,125 7,981 0,010 0,001 798,085


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Tecnologia de Enzimas 2013/2014
O fator de efetividade global pode ainda ser calculado pela diviso da velocidade observada
(velocidade inicial) pela velocidade cintica, no tendo em conta os parmetros difusionais reais
presentes no ambiente, que revelaram valores de global mais elevados do que quando se teve em
conta os parmetros difusionais.
Relativamente s concentraes de substrato superfcie da matriz (Ss) e superfcie dos poros
da matriz (Ss), verifica-se que valores obtidos no foram os esperados. Os valores de Ss deveriam ser
inferiores ou iguais aos valores de Ss, que por sua vez seriam inferiores aos de SB. Isto porque, a
concentrao de substrato est dependente das limitaes difusionais externas at atingir a superfcie
da matriz e ao atravessar os poros desta, ficar exposta s limitaes internas at conseguir por fim
atingir o centro ativo.
4. Concluso
Em suma, observando os valores de Vo, nota-se que estes aumentam com a concentrao.
Ao ser imobilizado, o enzima vai influenciar a velocidade mxima da reaco que catalisa,
alterando tambm a afinidade da enzima para com o substrato.
O mtodo que permite ao enzima ter uma maior afinidade o mtodo de enzima livre, uma vez
que o Km nesta experincia o mais baixo (23,834 g/L), ao passo que o mtodo ao qual se atribui uma
maior velocidade mxima o mtodo do enzima livre tambm (1,024 g/L.min). Concluiu-se, assim, que
os resultados obtidos no esto de acordo com o esperado provavelmente devido a variaes de
temperatura nos vrios ensaios ou a impreciso na execuo do protocolo.
Para o enzima imobilizado em slica, o fator de efetividade mdia foi de 0,099 devido a
possveis alteraes estruturais da enzima que consequentemente alteram a velocidade de converso
de substrato, como foi demonstrado tambm pela baixa reteno de atividade (42,571%).
No possvel comparar os valores de Km do enzima imobilizado em slica (565,123 g/L) e em
alginato de clcio (66,453 g/L), uma vez que o valor de Km do enzima imobilizado em slica pode no ser
fivel. Seria de esperar que a imobilizao em alginato de clcio apresentasse uma maior afinidade do
enzima ao substrato, devendo ser este o mtodo que apresenta menores limitaes difusionais, quando
comparado com o mtodo da slica porosa; uma vez que, quando o biocatalisador imobilizado em
silica porosa, perde grande parte da sua actividade, por sua vez, quando imobilizado em alginato de
clcio, este tem grandes limitaes difusionais, logo no nos possvel concluir qual o melhor mtodo
de imobilizao.

Tabela 22. Comparao dos parmetros cinticos obtidos para as quatro condies de trabalho.
Condies KM (g/L) Vmx (g/L.min) Reteno de actividade (%)
Clulas livres 64,100 0,231 -
Enzima imobilizado covalentemente 565,123 0,982 42,571 *
Clulas imobilizadas em alginato de clcio 66,453 0,183 -
Enzima livre 23,834 1,024 -
*Em relao ao enzima livre
Conclusion
In short, looking at the values of Vo, it shows that these increase with the concentration.
When immobilized, the enzyme will influence the maximum rate of reaction that catalyzes also
altering the affinity of enzyme towards the substrate.
The free enzyme method allows a higher affinity of enzyme-substrate, since the Km in this
experiment is lower (23.834 g/ L), whereas the method which is assigned a higher maximum speed is
also the method of free enzyme (1.024 g / L.min). Thus it was concluded that the results are not as
expected probably due to temperature variations in the various tests or imprecision in the execution of
the protocol.
For the enzyme immobilized on silica, the average effectiveness factor was 0.099 due to
possible structural changes of the enzyme that consequently alter the rate of conversion of substrate, as
was demonstrated by the low retention of activity (42.571 % ).

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Tecnologia de Enzimas 2013/2014
It is not possible to compare the Km values of the enzyme immobilized on silica ( 565.123 g / L)
and calcium alginate (66.453 g/L) , since the Km value of the enzyme immobilized on silica could be
unreliable. It would be expected that the immobilization in calcium alginate would present a greater
affinity to the substrate and, therefore, it should be the method that has lower diffusional limitations
compared to the method of the porous silica; since, when the biocatalyst is immobilized on porous
silica, loses much of its activity, in turn, when its immobilized in calcium alginate, this has large
diffusional limitations, then we cannot conclude which is the best method of immobilization .

Table 22. Comparison of the kinetic parameters obtained for the four conditions.
Conditions KM (g/L) Vmx (g/L.min) Retention of activity (%)
Free cells 64,100 0,231 -
Covalently immobilized enzyme 565,123 0,982 42,571 *
Cells immobilized in calcium alginate 66,453 0,183 -
Free enzyme 23,834 1,024 -
* Compared to the free enzyme.

5. Bibliografia

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78.









17
Tecnologia de Enzimas 2013/2014


6. Apndice
6.1. Anexo I Velocidade inicial (Vo) e constantes cinticas Trabalhos 1, 2 e 3.
Para ser possvel calcular a velocidade inicial e, consequentemente, o KM e Vmx, recorreu-se a uma
reta de calibrao e lei de Lambert-Beer onde se calculou a concentrao do produto da hidrlise de
sacarose.
Tabela 23. Concentraes de sacarose (g/l) e absorvncia medida a 540 nm para a realizaco da recta de calibrao
Concentrao (g/L) Abs 540 nm
0 0
0,1 0,046
0,2 0,109
0,3 0,162
0,4 0,223
0,5 0,288
0,6 0,341
0,7 0,447
0,8 0,496
0,9 0,561
1,0 0,561


Figura 7. Reta de calibrao.

6.2. Anexo II

- Exemplo do clculo da concentrao do produto de hidrlise:

[Sacarose] (g/L) Absorvncia 540 nm Tempo (min)
15 0.045 3

Lei de Lambert-Beer: A=b c A Absorvncia (y).
B Distncia que a luz atravessa pela clula.
- Absortividade molar.
C Concentrao (x).

Recta de calibrao: y = 0.5944x, ento: 0,045 = 0,5944 x x = 0,076 g/L

y = 0,5944x
R = 0,9897
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
A
b
s

5
4
0

n
m
Cocncentrao (g/L)

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A velocidade inicial (Vo) calculada atravs do grfico da concentrao do produto (g/L) em funo
do tempo, sendo este valor o do declive da reta.

Clculos da velocidade cintica (Vcintico) e do fator de efetividade (global) - Trabalhos 2 e 3.

Aps a realizao das linearizaes de Michaelis-Menten e, consequentemente, da obteno da
velocidade mxima, possvel calcular a velocidade cintica da enzima livre e o fator de efetividade com
as seguintes frmulas:

Vcintico =
Vmax [sacarose]
Km + [sacarose]
global =
Vobservado
Vcintico

Vmx e KM relativo enzima livre.
Vobservado relativo velocidade inicial (Vo) da enzima em ligao covalente

- Exemplo do clculo da velocidade cintica e do factor de seletividade:

Vmax (g/L.min) KM (g/L) [Sacarose] (g/L) Vcintico (g/L.min)
0.937 19.184 10 0.04


Vcintico =
Vmax[sacarose]
Km+[sacarose]
Vcintico =
0,937 x 10
19,184+10
Vcintico = 0,321g/L. min

global =
Vobservado
Vcintico
global =
0,04
0,321
global = 0,123


- Clculos dos factores de efectividade (externo, interno e global) e das concentraes de
substrato a superfcie dos poros da matriz e a superfcie da matriz (tabela 20) Trabalho n 3

Vmax (g/L.min) Km (g/L) [Sacarose] (g/L) Vobservado (g/L.min)
0,198 76,382 15 0,005

Vobservado

=
VmaxiSs
Kmi+Ss
0,005 =
0,198Ss
76,382+Ss
Ss

= 1,978 g/L

Vmaxi Velocidade mxima da enzima imobilizada (g/L.min).
Kmi Constante de Michaelis-Menten da enzima imobilizada (g/L).
Vobservado Velocidade inicial (Vo) (g/L.min).
Ss Concentrao do susbtrato superfcie dos poros da matriz (g/L).

Dados fornecidos no protocolo:
Porosidade interna: 0,3
Tortuosidade: 3
Difusividade do substrato: 3x10-10m2/s
Coeficiente de transferncia de massa do substrato: 2x10-7m/s

Modulo do substrato: =
Vmaxi /Kmi
Kla

Area a superficial da particula (particulas esfericas): =
6
Dp

Concentracao do substrato adimensional: Bb =
SB
Km i


Vmaxi velocidade maxima da enzima imobilizada;
Kmi Constante de Michaelis- Mentem;
KL- Coeficiente de transferencia de massa;
Dp Diametro da particula;
SB Concentracao de sacarose (g/L).


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Tabela 24. Valores dos diversos parmetros para o clculo do factor de efetividade externo
[sacarose] (g/L) Diametro da particula (m) a Bb
15 0,003 2000,000 0,226 6,898
25 0,004 1363,636 0,376 10,118
35 0,004 1500,000 0,527 9,198
45 0,004 1500,000 0,677 9,198
55 0,004 1500,000 0,828 9,198
70 0,004 1500,000 1,053 9,198
80 0,004 1500,000 1,204 9,198
90 0,004 1500,000 1,354 9,198
100 0,004 1500,000 1,505 9,198

Para se calcular o valor do fator de efetividade externo utilizou-seo grfico representado na figura 8.
(f(Bb,))

Figura 8 . Factor de efetividade externo em funo do mdulo do substrato. As linhas correspondem
concentrao adimensional do substrato.


- Concentrao do substrato superfcie da matriz (Ss)

A concentrao de substrato calculada atravs da velocidade observada (Vobservda) pela seguinte
frmula:

Vobservado =
Vmaxi x Ss
Kmi + Ss
= Vcintico x externo

D Difusidade do substrato.
Porosidade interna;
- Tortuosidade;
L raio do suporte (particula);
Ss concentracao do substrato a superficie da matriz.

Factor de efectividade interno (interno):
Difusidade efetiva: De = D x

Modulo de Thiele: =
Vmaxi
Kmi x De

Tabela 25. Valores dos diversos parmetros para o calculo do fator de efetividade externo.
[Sacarose] (g/L) Ss (g/L) L (m) B De

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15 1,888 0,0015 14,386 35,201



3E-11

25 3,039 0,002 21,099 21,863
35 4,925 0,002 19,181 13,493
45 7,461 0,002 19,181 8,907
55 9,650 0,002 19,181 6,887
70 12,087 0,002 19,181 5,498
80 14,077 0,002 19,181 4,721
90 15,571 0,002 19,181 4,268
100 17,058 0,002 19,181 3,896

Para se calcular o fator de efetividade interno utilizou-se o grfico representado na figura 9. Fator de
efetividade interno (interno): f (B, )


Figura 9. Fator de efetividade interno em funo do mdulo de Thiele. As linhas correspondem ao .

- Clculo da concentrao do substrato superfcie dos poros da matriz (Ss)

A partir dos valores obtidos do fator de efetividade interno calculou-se a velocidade observada
e consequentemente a concentrao do substrato a superfcie dos poros da matriz.

interno =
Vobservado
Vobservado
Vobservado =
Vmaxi x Ss
Kmi+ Ss