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VI Simposio de Tecnologa Avanzada

25-30 de noviembre de 2010. CICATA-IPN. MEXICO D. F.



Memorias en extenso

ISBN: 978-607-414-214-3 23 DTA-SD3-01
Vectorizacin de Nanotransportadores Polimricos
de Nanopartculas de Plata para Tratamiento de Cncer

R. Casaas Pimentel
1
, M. Da Silva Pinto
2
, A. Monroy-Garca
3
, J. Hinestroza
2
, C. Gmez-Garca
4
, E. San Martn-Martnez
1


1
Centro de Investigacin en Ciencia Aplicada y Tecnologa Avanzada, Instituto Politcnico Nacional, Mxico.
2
College of Human Ecology, Cornell University, Ithaca, NY, EUA.
3
Unidad de Investigacin Mdica en Enfermedades Oncolgicas, Instituto Mexicano del Seguro Social, Mxico.
4
Escuela Nacional de Medicina y Homeopata, Instituto Politcnico Nacional, Mxico


Resumen
Se reporta la sntesis de nanopartculas de plata de 5 nm de
dimetro y su encapsulacin en nanotransportadores
biocompatibles con dimetros entre 70 y 200 nm mediante
una modificacin del sistema emulsin-evaporacin del
solvente. Se evaluaron diversas dosis de las nanopartculas
de plata y de los nanotransportadores en las lneas celulares
de cncer del crvix uterino: Ca Ski y HeLa, demostrando
que en este modelo las nanopartculas de plata presentan
toxicidad an encapsuladas. Se propone el uso de la
aglutinina de frijol de soya (SBA) para el direccionamiento
del sistema de liberacin farmacolgica por su ya descrita
unin selectiva a carbohidratos especficos de membranas
plasmticas de clulas neoplsicas y por su accin
citotxica intrnseca, y se inicia con el estudio de su efecto
en la expresin gentica en la lnea celular HeLa mediante
microarreglos de cDNA a fin de aportar conocimiento sobre
su mecanismo de accin.
Introduccin
El cncer es actualmente la primera causa de muerte a nivel
mundial. En el 2008, se presentaron cerca de 7.6 millones
de muertes por cncer alrededor del mundo, la OMS ha
reportado que el nmero de casos de muerte por esta
enfermedad ir en aumento
1
. Por esta razn, se buscan
estrategias para el tratamiento de esta enfermedad.
Recientemente, varios grupos de investigacin han
reportado efectos citotxicos de las nanopartculas de plata
y han propuesto su uso potencial en la terapia oncolgica,
ya que reducen el contenido celular de ATP (trifosfato de
adenosina) y causan dao mitocondrial de manera dosis-
dependiente; adems de inducir apoptosis por la va
mitocondrial asociada a la generacin de especies reactivas
de oxgeno y a la activacin de JNK (Jun amino-terminal
cinasa)
2
. En diversos estudios se ha observado mayor
sensibilidad por parte de clulas neoplsicas, sin embargo,
el efecto de las nanopartculas de plata no es especfico para
las clulas de cncer, pudiendo causar toxicidad sistmica y
efectos adversos en los pacientes. El uso de
nanotransportadores permite minimizar el dao sistmico al
direccionar el efecto farmacolgico al sitio de accin
deseado, mediante una o ambas estrategias de
direccionamiento: A) Direccionamiento pasivo, dado por el
efecto de Permeabilidad y Retencin Aumentadas; debido
a que en los tumores, los vasos sanguneos formados de
novo presentan anormalidades estructurales y funcionales
que reducen el flujo sanguneo y favorecen la perfusin de
los componentes del plasma al intersticio tumoral; bajo
estas condiciones, aunadas al drenado linftico disminuido,
se lleva a cabo una acumulacin efectiva en la zona
tumoral; y B) Direccionamiento activo; mediante la
funcionalizacin de la superficie de los transportadores
empleando sistemas ligando-receptor o antgeno-anticuerpo.
Para lograr esto, los transportadores deben tener material
biocompatible en su superficie que permita reducir la
respuesta inmunolgica, como el poli(etilen)glicol (PEG),
un dimetro menor a 200 nm y un peso molecular mayor a
50 kDa, a fin de evitar su excrecin glomerular
3
. Dentro de
las estrategias de direccionamiento activo de los
nanotransportadores se encuentran las lectinas, un grupo de
glicoprotenas que se encuentran ampliamente distribuidas
en los sistemas biolgicos y que se unen de manera
reversible y especfica a residuos de polisacridos,
glicoprotenas o glicolpidos. En oncologa, las lectinas han
sido usadas para el diagnstico y el tratamiento, incluyendo
el direccionamiento de sistemas de liberacin dirigida.
Varias lectinas de origen vegetal han sido estudiadas y su
eficacia ha sido comprobada en el tratamiento de cncer, sin
embargo, el mecanismo preciso del efecto antitumoral no es
claro, an cuando varios han sido propuestos, entre ellos: la
reduccin de la divisin celular, el incremento del nmero
de macrfagos, el aumento de la susceptibilidad de las
clulas tumorales al ataque inmunolgico, etctera
4
.
Procedimiento Experimental
Se sintetizaron nanopartculas de plata va sol-gel, mediante
la reduccin de AgNO
3
con dextrosa, empleando gelatina
como pasivante a 58 C; posteriormente se
nanoencapsularon en PEG mediante una modificacin del
mtodo de emulsinevaporacin del solvente
9
evaluando
el efecto de los factores: pH, concentracin de PEG y
volumen de nanopartculas de plata en el dimetro
hidrodinmico, mediante un DCC con =1.68. Los
productos fueron evaluados por EDS, FT-IR (resultados no
mostrados), MET y dispersin de luz dinmica.
Las lneas celulares de crvix uterino: carcinoma
epidermoide, Ca Ski (ATCC No. CRL-1550) y de
adenocarcinoma, HeLa (ATCC No. CCL-2); fueron
crecidas en el medio base RPMI-1640 suplementado con
suero fetal bovino. Se evalu, mediante citometra de flujo,
la respuesta citotxica a las nanopartculas de plata, libres y
encapsuladas. Las clulas fueron teidas con CFSE al 1%,
Escuela Nacional de Medicina y Homeopata ENMH IPN Mxico
Rafael Avila
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en oscuridad, durante 15 min, se sembraron y se incubaron
durante 24 h. Posteriormente, se cambi el medio y se
adicionaron diferentes dosis del vehculo con gelatina y
dextrosa; de nanopartculas de plata, de nanotransportadores
cargados con nanopartculas de plata; solo el vehculo, y de
cisplatino empleado como control positivo. El tratamiento
se mantuvo en incubacin a 37 C durante 24 h. Las clulas
fueron cosechadas, teidas con IP durante 30 min y
analizadas por citometra de flujo. Se evalu mediante
microarreglos de cDNA el efecto en la expresin gentica
inducido por la aglutinina del frijol de soya (SBA) con el
fin de aportar al conocimiento del mecanismo de accin de
esta protena en la induccin de muerte celular y verificar
su actividad en la lnea celular HeLa, ya que se busca
sinergizar la accin del nanotransportador con la de la
protena al emplearla como agente para el direccionamiento
del nanotransportador. Para ello, se realiz una curva dosis
respuesta de tratamiento empleando azul de tripano.
Resultados y Anlisis
Se obtuvieron nanopartculas de plata de dimetro
aproximado a 5 nm y nanotransportadores de dimetro
hidrodinmico entre 70 y 200 nm, observando que el factor
que mayor influencia tiene sobre el tamao es la
concentracin de PEG, seguido por el volumen de
nanopartculas de plata, el pH no afecta el resultado. Los
dimetros menores se obtuvieron con 17 % de PEG y en los
extremos superior e inferior del volumen de nanopartculas
de plata empleados en el diseo experimental (Fig. 1 y 2).
Las micrografas electrnicas mostraron resultados
morfolgicos que coinciden con los reportados en
bibliografa para sistemas similares (Fig. 3).


Figura 1. Superficie de respuesta del Figura 2. Superficie de respuesta del
dimetro hidrodinmico de los dimetro hidrodinmico de los nano-
nanotransportadores respecto al transportadores respecto al pH y la
volumen de nanopartculas de plata y concentracin de PEG.
la concentracin de PEG.










Figura 3. Nanotransportadores de nanopartculas de plata evaluados por TEM.

Mediante citometra de flujo se determin que los vehculos
no tienen efecto en la viabilidad celular, mientras que tanto
las nanopartculas de plata como el nanotransportador con

nanopartculas de plata son citotxicos de manera dosis-
dependiente, induciendo hasta el 100% de muerte celular en
las dosis ms altas en las lneas celulares (resultados no
mostrados).
Se determin que la SBA caus dao a la membrana celular
en ensayos de viabilidad (grfica 1), comparando contra los
controles: negativo y positivo -doxorubicina 0.5 ug/ml-
(resultados no mostrados).



Empleando una dosis (no indicada), se evalu el RNA
extrado mediante el protocolo de QIAGEN, obteniendo
resultados favorables en la calidad del RNA. Los cambios
de expresin gentica fueron evaluados en la plataforma de
Affymetrix contra un control sin tratamiento que arroj una
relacin de cambio en la seal mayor a 1 en 1326 genes,
varios de ellos involucrados en los procesos de muerte
celular. El estudio del efecto global de la SBA en la lnea
celular HeLa bajo las condiciones de tratamiento sigue en
proceso, los datos sern corroborados mediante
inmunoqumica o RT-PCR para su publicacin.
Conclusiones
-El pH no influye en el tamao de los transportadores, mientras
que los extremos de las concentraciones de nanopartculas de
plata y la concentracin media de PEG empleada en el diseo
experimental favorecen tamaos menores de los
nanotransportadores, siendo ste ltimo el factor ms importante.
-La SBA es una estrategia prometedora para el direccionamiento
de los transportadores por su doble accin: especificidad
(reportada previamente) y toxicidad, demostrada
experimentalmente.
Agradecimientos
Agradecemos a la Secretaria de Investigacin y Posgrado, al
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa, a la Universidad de
Cornell, al Dr. Richard Cerione y al Dr. Marc Antonyak por su
apoyo a este trabajo.
Referencias
1. International Agency for Research on Cancer. Section of
Cancer Information. GLOBOCAN 2008. [19 de 10 de 2010].
2. Arora S, Cellular responses induced by silver nanoparticles:
In vitro studies. Toxicol Lett , 179, 93-100 (2008).
3. Nishiyama N, e. a. Current State, achievements, and future
prospects of polymeric micelles as nanocarriers for drug and
gene delivery. Pharmacology and Therapeutics , 112, 630-648.
(2006).
4. Ohba H. and Bakalova R. Relationships between degree of
binding, cytotoxicity and cytoagglutinating activity of plant-
derived agglutinins in normal lymphocytes and cultured leukemic
cell lines. Cancer Chemother Pharmacol. 51: 451458. (2003).