PRODUCCIN DE POLIHIDROXIBUTIRATO A PARTIR DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES

Tesis para optar por el ttulo de Magister en Ingeniera_Ingeniera Qumica presentado por el Ingeniero Qumico:

JAVIER MAURICIO NARANJO VASCO

2.3.3. Proceso de
separacin

Despus de la
fermentacin, el siguiente
paso es el aislamiento y
purificacin del PHB. En
este nivel, el PHB es
extrado del citoplasma
celular y para ello la
membrana celular es
destruida y el PHB es
disuelto en solventes. Es
as como el PHB queda
separado de la biomasa
residual.

El proceso de separacin se
puede dividir en tres partes
[55]: Pretratamiento,
extraccin y purificacin.

El pretratamiento se realiza
para debilitar la membrana
celular y as realizar la
disrupcin celular de una
forma ms fcil. Este
pretratamiento se puede
dar con: calor, lcalis, sales,
o por congelamiento.

Hay diferentes mtodos de
extraccin para separar el
PHB de la biomasa
residual- Las ventajas y
desventajas de ellos se
pueden observar en la
Tabla 16.










- Extraccin con solventes:
La extraccin de PHA con solventes es el mtodo ms antiguo. La accin del solvente puede ser dividida en 2 etapas,
en la primera modifica la permeabilidad de la membrana celular y en la segunda disuelve el PHA. Los principales
solventes utilizados son: hidrocarburos clorados (cloroformo, 1,2.dicloroetano, cloruro de metileno), solventes de
carbonatos cclicos (cabonato de propileno y etileno), solventes halogenados (cloroetanos y cloropropanos), solventes
no halogenados, alcoholes, steres, amidas y ketonas, entre otros [28]. Este tipo de extraccin a pesar de su eficiencia
en cuanto a la pureza del PHA obtenido, requiere grandes cantidades de solvente por gramos de PHA extrado.
Adems las repercusiones ambientales y en la salud humana que conllevan su uso hacen que sea necesario combinarlo
o sustituirlo por otros mtodos de extraccin que tengan un mejor rendimiento y sobre todo disminuyan los impactos
ambientales.

- Digestin:

La digestin puede ser qumica o enzimtica. La digestin qumica consiste en el uso de diferentes agentes qumicos
para destruir componentes de la membrana celular como lpidos, carbohidratos, protenas y enzimas. De acuerdo con
el agente qumico usado la digestin puede ser con biosurfactantes, hipoclorito de sodio, hipoclorito de sodio y
cloroformo, surfactante hipoclorito, surfactante-kelatos. La digestin enzimtica consiste en el uso de enzimas para
degradar la membrana celular. Diferentes enzimas proteolticas tienen altas selectividades en disoluciones de
protenas y pocos efectos sobre la degradacin del PHA. La digestin enzimtica puede ser complementada por otros
mtodos de extraccin como el de solventes y tambin por pretratamientos de la biomasa.

- Disrupcin mecnica:

La disrupcin celular mecnica es ampliamente usada en la recuperacin intracelular de protenas. Esta puede ser de
diferentes tipos, tales como: disrupcin con molino de bolas, Homogenizacin a alta presin, disrupcin con
ultrasonido, centrifugacin y tratamientos qumicos.

Extraccin con fluidos supercrticos:
Los fluidos supercrticos tienen unas propiedades muy atractivas: alta densidad y baja viscosidad, hacindolos muy
interesantes en procesos de extraccin. El CO2 es el fluido ms usado para este propsito debido a que este tiene baja
toxicidad y reactividad, temperatura y presin crtica moderada, disponibilidad, bajo costo y no inflamable. El
rendimiento de la extraccin con CO2 supercrtico es muy parecido al rendimiento obtenido por otros mtodos. Este
tipo de extraccin puede ser combinado con pretratamientos con NaOH o sales, con el fin de obtener una mayor
disrupcin celular.

Uso de fragilidad en la membrana celular:

Este mtodo utiliza la debilitacin de la membrana celular de los microorganismos despus de acumular grandes
cantidades de PHA. Esto permite el uso de mtodos sencillos de extraccin Liberacin espontnea algunas especies de
Escherichia coli recombinante tiene la habilidad de liberar espontneamente los grnulos de PHB intracelular. De esta
forma solo es necesario un mtodo simple de purificacin como la centrifugacin y/o lavado con agua destilada.











MODOS ELEMENTALES DE FLUJO: HERRAMIENTA PARA LA MEJORA DE LA PRODUCCIN DE PHB POR Herbaspirillum
seropedicae
Ana Ins Catalna , Karen Malna , Guadalupe Martnezb , Vernica Saravia1b, Marcia Rodrguezc, Fernando
Ferreirac y Silvia Batistaa

Cuantificacin de Biomasa:

La densidad celular se determin mediante medidas de turbidometra a 620nm inmediatamente despus de
extrada la muestra. Adems, la biomasa se determin por gravimetra, luego de centrifugar 1 mL de muestra por 3
minutos a 10000g, lavar el pellet 3 veces con agua destilada y secar hasta peso constante a 60C.

Cuantificacin de PHB:

La concentracin de PHB se determin mediante gravimetra.. Para ello, se tomaron muestras de cultivo bacteriano
y se centrifugaron por 10 minutos a 10,000rpm. Para la extraccin del polmero, el pellet celular se someti a lisis
con igual volumen de hipoclorito de sodio 5% por 2 horas a 37C. El contenido celular liberado se centrifug a
10,000rpm por 10 minutos y se lav dos veces con agua destilada. Se determin el PHB acumulado por unidad de
volumen mediante el pesado del material luego de secado en estufa a 65C hasta peso constante. El contenido de
PHB se define como el porcentaje en peso de PHB acumulado en las clulas totales y se calcula a partir de los
datos de biomasa y concentracin de PHB.





Poli-hidroxibutiratosGeneralidades, aislamiento y cuantificacin
Autores: Grisel Ortega, Miguel A. Otero, Daniel Bello Gil, Gustavo Saura, Jorge Martnez

Resumen
El aislamiento y purificacin de los polmeros de poli-hidroxibutirato (PHB) con hipoclorito de sodio es una metodologa sencilla y
barata. La adicin de EDTA 10 mM en mezcla con el hipoclorito de sodio mejora notablemente la pureza del producto final. La
extraccin del PHB utilizando solventes orgnicos como el cloroformo, el dicloroetano y el cloruro de metileno ha resultado ser una
metodologa poco factible desde el punto de vista econmico debido a que se requieren grandes cantidades de solventes para lograr
la purificacin parcial del polmero. La cuantificacin del PHB por el mtodo espectrofotomtrico tradicional es sencilla pero
sobrestima los resultados porque no solo las unidades monomricas del polmero pueden convertirse a cido crotnico despus del
tratamiento con cidos orgnicos. Esto puede mejorarse si previo a la determinacin se realiza una etapa de extraccin del polmero
y el tratamiento con cidos orgnicos se realiza en presencia de EDTA 10 mM. El uso de la cromatografa lquida de alta eficacia
(HPLC) y lquida-gaseosa (GLC) resulta particularmente ventajoso para la cuantificacin del PHB. El tratamiento cido de las
muestras para su posterior anlisis por HPLC no es recomendable para polmeros que contengan unidades monomricas de ms de
cuatro tomos de carbono debido a que el porciento de conversin a cido crotnico es diez veces menor. Sin embargo el
tratamiento de estas muestras con alcalis ha resultado ser efectivo.
*no se puede visualizar completo por derechos de autor*




Seleccin de Bacterias Productoras de Poli-hidroxibutirato.
Daniel Bello Gil y Helmut Brandl

Cuantificacin de la produccin de PHB
Preparacin de las muestras para HPLC (tratamiento alcalino)
El tratamiento alcalino rompe el polmero de PHB en unidades pequeas de hidroxibutirato (Figura
1). Bajo estas condiciones, las unidades monomricas continan su oxidacin hasta rendir cido
crotnico que tiene un mximo de absorcin a los 210 nm [12].

Muestras de 2 ml de cultivos lquidos fueron congeladas en nitrgeno lquido y liofilizadas
Se pesaron 5-10 mg de clulas liofilizadasy se le adicion 0.5 ml de NaOH 2N
Se incubaron las muestras a 100 C durante 30 min y cada 10 min se agitaron en Vortex por 30
segundos
Las muestras se enfriaron en hielo y posteriormente se neutralizaron con 0.5 ml de HCl 2N
Se agitaron en Vortex por 30 segundos y se centrifugaron a 1000 rpm por 30 min.
Se tomaron los sobrenadantes y se filtraron por filtros de Nylon de 0.45 m











DETERMINACIONES CINTICAS DE ACETONA, 3-HIDROXIBUTIRATO/3-HIDROXIVALERATO
Y GLICEROL EN SISTEMAS DE FLUJO.
Karina Beatriz Hueso Domnguez

2.2.4. Determinacin de 3HB y 3HV

Como polmeros biodegradables, los PHAs pueden ser degradados por microorganismos pero
tambin mediante otros procesos (reacciones qumicas, fotodegradacin, degradacin trmica).
Desde el punto de vista de su aplicabilidad, el conocimiento de la cintica de degradacin de un
determinado PHA es esencial ya que la extensin y velocidad de la degradacin y los productos
resultantes pueden determinar su uso potencial. Para un determinado proceso, la cintica de
degradacin depende de las condiciones experimentales (temperatura, medio, tiempo, etc.) pero
tambin de la estructura, morfologa o cristalinidad del PHA (114,143,144). As, por ejemplo, los
procesos de (bio)degradacin del copolmero PHB/PHV son ms rpidos que los del homopolmero
PHB, y an ms rpidos en presencia de plastificantes que disminuyen la cristalinidad.

El control de la degradacin es tambin fundamental en algunos mtodos analticos en los que la
cantidad y composicin de los PHAs se evalan indirectamente a travs de los productos formados
en la degradacin de los polmeros en condiciones adecuadas (120,
137,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153). Dado que PHB, PHV y sus copolmeros son
los componentes ms comunes de los PHAs, los monmeros que los constituyen, 3HB y/o 3HV o
sus derivados, estn frecuentemente entre los productos de degradacin y su determinacin puede
proporcionar informacin sobre la cintica del proceso (velocidad y mecanismo) y tambin sobre la
composicin y estructura de estos biopolmeros. Esta determinacin se lleva a cabo habitualmente
mediante mtodos cromatogrficos o enzimticos.

Para determinar la composicin de copolmeros PHB/PHV con diferentes porcentajes de 3HV,
SATO y col. (137) efectan la degradacin trmica de los polmeros a 350 C en presencia de
hidrxido de tetrametilamonio y miden mediante cromatografa de gases (GCFID) los 3-metoxi-
derivados formados.

En medio cido sulfrico concentrado, el PHB se convierte mayoritariamente en cido crotnico
(cido trans-2-butenoico) que puede ser analizado mediante HPLC con deteccin ultravioleta
(144,145). Esto no es aplicable a PHV (154).

La hidrlisis alcalina del PHB proporciona una mezcla de cido crotnico y 3HB mientras que el
PHV se convierte en 3HV. Estos productos se determinan generalmente por mtodos
cromatogrficos (144,146). Los porcentajes de 3HB y cido crotnico en la degradacin alcalina de
PHB dependen en gran medida de las condiciones de degradacin (tiempo, temperatura, grado de
alcalinidad) y de la morfologa del polmero (grnulos, pelcula, precipitado).

Otra forma comn de degradacin de PHAs es la alcoholisis en medio cido clorhdrico o sulfrico.
Se aplica en la cuantificacin indirecta de PHB, PHV y sus copolmeros. Los polmeros son
transformados en steres de 3HB y/o 3HV que pueden ser extrados en cloroformo u otros
disolventes y determinados mediante cromatografa de gases con detector de ionizacin de llama
(GC-FID) (147,148,149,150) o espectrometra de masas (GC-MS)(146,151). En estos mtodos, la
recuperacin de PHB y PHV no es completa, debido a la distribucin de los steres entre las fases
acuosa y orgnica. Alternativamente, los steres pueden ser hidrolizados a sus respectivos
hidroxicidos y determinados directamente en disolucin acuosa mediante cromatografa de
intercambio inico con deteccin
conductimtrica (143). HESSELMANN y col. (143) han comparado la eficacia de la degradacin
con diferentes alcoholes en medio cido sulfrico y proponen la propanlisis seguida de hidrlisis
alcalina de los steres propinicos para obtener la recuperacin completa de los polmeros
comerciales PHB y PHV. La recuperacin con etanol es menos eficaz y menos an con metanol.