3) Tipos de Vectores

Plsmidos: son molculas de ADN, pequeas, bicentenarios circular que contiene muy
pocos genes. Permiten un inserto de 0-10 b.
Fagos: la principal des!enta"a de los pl#smidos como !ectores es que tiene una
capacidad limitada para aceptar insertos grandes. Para resol!er esta di$icultad se utili%a el
$ago lambda. &a part'cula !'rica lambda contiene un genoma de unos (0 b de DNA de
cadena doble, empaquetado dentro una capsula proteica. )uando el $ago se une a la
bacteria, las prote'nas de la cubierta se eliminan y el DNAse inyecta en el interior de la
celula. &os e*tremos del ADN lambda son (+ protuberantes de cadena simple y
complementarios entre si, por lo que se pueden aparear, por lo que act,an al igual que los
e*tremos co-esi!os generados por las .. /. A estas secuencias se las llama 0)123, una
!e% que est# dentro de la bacteriana, las secuencias cos se aparean y se genera un DNA
bicatenario. A partir de este momento el DNA del $ago puede -acer los dos caminos: ciclo
l'tico o el lisogenico.
.n el caso del ciclo l'tico el DNA de lambda se replica y $orma mult4meros, los cuales
luego se cortan para generar los segmentos unitarios del genoma lambda que acaban
siendo empaquetados dentro de las cubiertas proteicas. Algunos de los productos gnicos
de lambda lisan la celula -usped , lo que permite la dispersi5n de los !iriones para la
in$ecci5n de nue!as clulas.
Para disear un !ector de clonaci5n adecuado es necesario un sistema de uni5n entre el
ADN $or#neo y el !ector, y para que el DNA recomb'nate pueda trans$ormar clulas, esto
se logra con un sistema de empaquetamiento in !itro.
&a part'cula lambda solo puede incluir insertos entre 67 y (8 b. .l segmento central por
ser no esencial se elimina por digesti5n con endonucleasas, con lo que queda un bra%o
i%quierdo y uno derec-o, ese $ragmento eliminado es sustituido por ADN $or#neo que
puede ligarse a ambos bra%os.
Cromosomas Bacterianos Artificiales ( BAC):son !ectores basados en el sistema del
$actor 9 que son capaces de aceptar $ragmentos de DNA $or#neo de -asta 600 b, los
recombinantes pueden ser trans$eridos a clulas bacterianas por electroporacion.
.l $actor 9 es el pl#smido de $ertilidad de . coli, el cual contiene dos genes, par A y par :,
que mantiene el n,mero de copias en 1-8 por clula, esto permite superar la limitaci5n
que suponen estos cromosomas cuando se inserta DNA eucariota, ya que estos suelen
contener alto n,meros de secuencias repetidas, que resultan di$'ciles de clonar y de
mantener.
Cromosomas Artificiales de Levadura (YAC): la clonaci5n en le!aduras o$rece la
!enta"a de que algunas secuencias eucariotas resultan muy di$'ciles de clonar en
bacterias, que carecen de tales secuencias, en cambio las le!aduras las toleran.
2u principal !enta"a es que permiten clonar $ragmentos de DNA muy grandes ;0,8-8 <b.=
.ste a!ance surgi5 luego que se aclarara el -ec-o de que gran parte del ADN de un
cromosoma no es necesario para la $unci5n cromos5mica normal. &os componentes
esenciales para el $uncionamiento de un cromosoma de le!adura son tres: los
centr5meros, los tel5meros y las secuencias de replicaci5n aut5noma ;A/2=.
Para $abricar un >A) es necesario combinar dos tel5meros, un centr5meros y un A/2
;act,an como or'genes de replicaci5n=, "unto al ADN $or#neo. ?odo estos $ragmentos se
unen y $orman una molcula de ADN lineal, antes de trans$erirlo a la le!adura, a stas se
las debe tratar a $in de eliminar las paredes celulares e*ternas.
Csmidos: son !ectores -ibrido entre $agos y pl#smidos, contiene las secuencias cos y
permiten insertar secuencias entre 60 y @@ b.
A.)?1/ 1/BC.N ?A<AD1 D.
BN2./?1
P/BN)BPA&.2 D.
AP&B)A)B1N
P&A2<BD12 P&A2<BD12
NA?E/A&.2 D.
A&?1 NE<./1 D.
)1PBA
0-10 b )&1NAD1 D.
cDNA
9AC1 :A)?./B1CA91
&A<:DA
F-86 b )&1NAD1 D. DNA
C.N1<B)1 >
)&1NAD1 D.
.GP/.2B1N
)12<BD12 P&A2<BD12 )1N
2B?B12 )12 D.&
&A<:DA
60-@@ b )1N2?/E))B1N
D. C.N1?.)A2
:A) 9A)?1/ 9 D. ..
)1&B
HA2?A 600 b ANA&B2B2 D.
C.N1<A2
C/AND.2
>A) 2. )./.AB2BA. 0,8- 8 <b ANA&B2B2 D.
C.N1<A2 <E>
C/AND.2
(= &os !ectores de e*presi5n son los que permiten la e*presi5n de un gen e*trao en una
clula -ospedadora. &a producci5n in !itro de una prote'na a partir de un gen requiere que
el mismo sea transcripto y traducido, para ello es necesario que estos !ectores
dispongan:
!ri: origen de replicaci5n.
Promotor: regi5n que se encuentra al principio del gen donde se une la polimerasa.
"itio de unin a ri#osomas: importante a tener en cuenta cuando se quiere traducir el
A/N m.
"itio clonado m$ltiple: segmento del !ector donde se encuentra concentrado los sitios
de cortes para !arias en%imas, es donde se coloca el inserto.
I= Ena genoteca ;tambin llamada biblioteca gnica= es una colecci5n desordenada de
clones de un microorganismo -usped en el que -emos introducido ;con un !ector
adecuado= todo el genoma del organismo de inters en $orma de tro%os aleatorios. .n
teor'a, una genoteca gen5mica deber'a representar el genoma completo en $orma de un
con"unto de $ragmentos clonados parcialmente solapados, producidos de modo aleatorio y
mantenidos de $orma estable en la que no -aya una mala representaci5n de secuencias.
&os pasos principales para producir una genoteca gen5mica son:
.l ADN gen5mico del organismo de inters se rompe en tro%os aleatorios de tamao
medio adecuado a la capacidad del !ector que luego !amos a usar. .s muy $recuente
que para ello ese ADN se trate con una en%ima de restricci5n que reconoce una diana
de @ pares de bases ;pb=, como la Sau6AB. A-ora bien, si de"#ramos que dic-a en%ima
digiriera totalmente el ADN, producir'a por trmino medio un corte cada 8(J pb, lo que
rendir'a tro%os demasiado pequeos como para albergar genes completos ;que suelen
medir m#s de 1000 pb=. Por lo tanto, lo que se -ace es proceder a una digestin
parcial del ADN con la en%ima, controlando la dosis para que el tamao medio de
$ragmentos est dentro del margen que nosotros deseamos ;p. e"., 10 Kb=.
2e recuperan los $ragmentos aleatorios de ADN del rango de tamaos deseado.
2e me%clan los $ragmentos con un !ector gentico tratado con un en%ima de restricci5n
que produce e*tremos co-esi!os del mismo tipo que los generados por la Sau6AB.
A-ora se aade la ligasa de ADN, de modo que cada tro%o de ADN del organismo de
inters se liga co!alentemente con una copia del !ector. .l resultado son miles de
molculas recombinantes, cada una consistente en el !ector unido a un tro%o di$erente
del ADN gen5mico original.
Dic-as molculas recombinantes se introducen ;p. e"., por trans$ormaci5n= en un
organismo o agente -usped: una bacteria como E. coli, $agos, etc. De este modo
-emos logrado la genoteca gen5mica: disponemos de miles de clones independientes
del -usped, cada clon con una molcula recombinante portadora de un tro%o de ADN
gen5mico del organismo de partida.
Ena !e% disponible la genoteca, lo que nos queda es rastrearla en busca del clon o clones
que porten el ADN con el gen o genes de inters. .sta operaci5n, al igual que lo que
ocurr'a con el screening de microorganismos para buscar sustancias ,tiles, puede ser
m#s o menos $#cil o directa, dependiendo de si disponemos o no de alguna estrategia
racional de selecci5n o de rastreo.
2u $undamento estriba en la posibilidad de $ormaci5n de ADN de cadena doble entre
cadenas sencillas del ADN a sondear y cadenas sencillas de ADN marcado ;ADN sonda=.
En esquema de c5mo se rastrea una genoteca ser'a como sigue:
&os miles de colonias de una genoteca se replican a $iltros de nylon o de nitrocelulosa
situados sobre medio de culti!o s5lido, y se incuban -asta que apare%can las colonias
de rplica.
&as clulas de las colonias se lisan in situ con un tratamiento sua!e
.l ADN de las colonias se desnaturali%a ;se con!ierte a cadenas sencillas= y se $i"a a los
$iltros mediante alta temperatura
Por otro lado, se -a preparado el ADN sonda marcado de alguna manera que luego sea
$#cil de detectar ;!ase m#s aba"o=
.l ADN sonda se desnaturali%a para con!ertirlo a cadenas sencillas
A-ora me%clamos el ADN sonda desnaturali%ado y marcado con los $iltros que
contienen el ADN de la genoteca ;igualmente desnaturali%ado=. 2i el ADN sonda tiene
cierto grado de -omolog'a con el ADN de alguno de los clones, se empare"ar# con
dic-o ADN para generar doble -lice. .l ADN del resto de los clones no puede
empare"arse con la sonda. .n el la!ado ulterior eliminamos el e*ceso de sonda,
quedando s5lo aquella sonda unida por dobles enlaces al ADN de los clones con los
que tiene -omolog'a de secuencia.
9inalmente re!elamos el resultado. .sto suele consistir en que encontraremos una
manc-a peculiar correspondiente a la colonia o colonias que -ayan dado la -ibridaci5n
con la sonda. )on esta in$ormaci5n !amos a las placas matrices donde est#n las
colonias originales de clulas !i!as, y recuperamos los clones, que podemos seguir
estudiando.
Bi#liotecas de A%&c
&os pasos para su construcci5n son los siguientes:
&isis celular
.*tracci5n de A/N
A partir de de este A/N total se selecciona un A/N poliA
2e utili%a un cebador de oligod? que sir!a para que la transcriptasa in!erso
comience la s'ntesis. De esta manera se $orma un -eteroduple* ;A/N- ADNc=,
donde la cadena recin sinteti%ada termina en -orquilla.
2e le agrega -idr5*ido de sodio, el cual rompe la cadena de A/N, de"ando un
ADNc de cadena simple.
.l la%o o la -orquilla act,a como cebador. &a ADN polimerasa B "unto a la
nucleasa ;la cual rompe el la%o=, es agregada de manera que se $orma un ADNc
de cadena doble.
A este ADNc se le agrega linKers que contiene la secuencia de reconocimiento
para ../.
Agrego las ../. genero los e*tremos co-esi!os
&igar al !ector y proceder a la clonaci5n.
?rans$ormaci5n.
Plaquear para obtener colonias clulas bacterianas idnticas ;clones=.
.*pansi5n
F= &a -ibridi%aci5n molecular no tiene como $inalidad 0ampli$icar un gen3 sino detectarlo
espec'$icamente dentro de una me%cla comple"a de secuencias di$erentes.
&as di$erentes tcnicas son:
T'cnica de "out(ern
.l DNA se digiere con en%imas de restricci5n generando una poblaci5n -eterogneos de
$ragmentos de distintos tamaos. &uego se reali%a una electro$oresis en gel, en donde los
distintos $ragmentos cargados negati!amente migran, siendo retenidos en $orma
di$erencial seg,n su tamao.
.stos $ragmento dispuestos en el gel de agarosa son desnaturali%ados ;ya que el DNA de
cadena sencilla es el que puede unirse a la nitrocelulosa= para ello se utili%a una base
$uerte. .l gel de agarosa es $r#gil y el DNA podr'a di$undir, entonces se trans$iere los
$ragmentos a una membrana de nitrocelulosa, donde los mismos quedaran inmo!ili%ados
en una posici5n que resulta ser el re$le"o de la posiciones original.
&uego se incuba al $iltro en una soluci5n que contenga la sonda radioacti!a, que es
complementaria a la secuencia diana.
2e elimina las sondas no unidas la !a sonda y el $iltro se e*pone a rayos G.
&a sonda marcada radioacti!amente solo -abr# -ibridado con los $ragmentos
complementarios.
T'cnica de &ort(ern
&a tcnica es similar, solo que se parte de un A/N. &os di$erentes tamaos de
transcriptos son utili%ados para indica que el gen utili%a distintos promotores, que e*isten
lugares alternati!os de corte y empalme, o seales de poliadenilacion. :#sicamente
brinda in$ormaci5n sobre el patr5n de e*presi5n de un gen y la cantidad de A/N
transcripto se cuanti$ica midiendo la intensidad de la banda.
T'cnica )estern
.n este caso las prote'nas se separan por electro$oresis, luego se trans$ieren a una
membrana de nitrocelulosa ; la cual se bloquea con una prote'na neutral=, luego se coloca
esta membrana con las prote'nas inmo!ili%adas sobre ella, en una soluci5n que contiene
un anticuerpo contrala prote'na a identi$icar. 2e la!a la membrana para eliminar los
anticuerpos no unidos y nue!amente se coloca la membrana en una soluci5n con un
anticuerpo secundario que est# ligado a un isotopo radioacti!o o marcado con $os$atasa
alcalina, que es especi$ico del 1L anticuerpo y produce un producto !isible.
*i#ridi+acin en colonia
.sta tcnica requiere replicar colonias sobre una membrana como paso pre!io a la
-ibridi%aci5n de estas membranas con una sonda marcada. .l mtodo se aplica
-abitualmente para la identi$icaci5n de colonias que contengan el DNA recombinante,
siempre que se disponga de la sonda adecuada.
2e -acen crecer colonias sobre la super$icie de agar, y una !e% crecidas, se trans$ieren
por contacto a una membrana de nitrocelulosa. .sta membrana de ser tratada con una
base para ser desnaturali%adas. ?ras la -ibridi%aci5n se elimina el e*ceso de sonda, se
la!a, se seca y se somete a autoradiogra$ia. &a posici5n de seales radioacti!as se puede
relacionar con la posici5n que ocupaban las colonias en la placa original, de la que se
conser!a una placa maestra. .sto permite identi$icar colonias que contengan ADN
relacionado con la sonda utili%ada. .stas colonias pueden ser picadas una a una y
ampli$icadas en un culti!o liquido como paso pre!io a la a la e*tracci5n y puri$icaci5n del
ADN recombinante que contengan.
2i se utili%ara !ectores deri!ados de $agos, se utili%a una tcnica similar, la di$erencia es
que los $agos con ADN recombinante deben in$ectar un tapete bacteriano que crece sobre
un agar nutriti!o. All', donde in$ecta un $ago se produce la lisis de las bacterias, lo que se
acaba !iendo como una %ona translucida o cal!a. )olocando una membrana sobre esta
super$icie se obtiene, una rplica $iel de la placa original que contiene material de los
$agos en las cal!as y que puede ser -ibridad con una sonda adecuada.
?.)NB)A HB:/BDBMA)B1N
.N )1&1NBA
21E?H./N N1/?H./N N.2?./N
<1&.)E&A A
D.?.)?A/
DNA DNA /NA P/1?.BNA2
21NDA A
.<P&.A/
DNA DNA cDNA AN?B)E./P12
PA/A
D.?.)?A/
P/BN)BPA&.2
E212
BD.N?B9B)A/
)1&1NBA2 OE.
1:?.N)B1N
D. <APA2 D.
PA?/1N D.
.GP/.2B1N
)1N?.NCAN ADN
/.)1<:BNAN?.,
D.?.)?A/
9/AC<.N?12
OE. ?.NCAN
A&CENA
<E?A)B1N
/.2?/B))B1N D. C.N.2 >
).&E&A2 .N
&A OE. 2.
.GP/.2A .&
C.N
,strategias #sicas para el clonado molecular in vitro (PC-)
1= &a tcnica de la P)/ tiene como ob"eti!o la ampli$icaci5n selecti!a in !itro de
secuencias especi$icas de ADN dentro de una muestra. Normalmente se parte de DNA o
DNAc. Para que la ampli$icaci5n sea posible es necesario disponer de in$ormaci5n de la
secuencia que se desee ampli$icar, ya que se deben construir dos cebadores, que son
oligonucle5tidos de 1(-60 nucle5tidos de longitud y de cadena simple.
&a P)/ es una reacci5n en cadena porque las -ebras de DNA recin sinteti%adas, sir!en
de molde para reacciones posteriores, tras unos 60 ciclos, la P)/ genera unas 10
(

copias de la secuencia diana, una cantidad que es su$iciente para ser detectada
$#cilmente por una electro$oresis. 2e utili%a un polimerasa termoestable debido a que la
reacci5n pasa por ciclos en los que se cambia la temperatura.
&a tcnica consiste en:
Disponer el ADN que contiene la secuencia que queremos ampli$icar.
2e eligen o se construyen los cebadores cuyas secuencias se complementen con
el e*tremo 6+ 1H de una u otra cadena del gen diana. &as dos cadenas se separan
por calor, permitiendo que los cebadores se unan a sus secuencias
complementarias.de esta manera los cebadores $lanquean la secuencia blanco.
&a polimerasa ?aq sinteti%a entonces las primeras cadenas complementarias de la
reacci5n. .stas dos cadenas tiene longitud !ariable porque no tiene una seal de
terminaci5n com,n.
&as dos molculas de de cadena doble se calientan nue!amente y los cebadores
se une a los e*tremos 6Pde la regi5n diana
&a ?aq sinteti%a de !uelta dos cadenas complementarias. A pesar de que las
cadenas molde tenga longitudes !ariables las dos cadenas sinteti%adas a partir de
ellas tiene la longitud e*acta de la secuencia diana. .sto se debe a que cada
cadena nue!a comien%a en el sitio de uni5n del cebador y continua -asta que
termina la secuencia diana.
9inalmente cada cadena nue!a comien%a en una secuencia del cebador y termina
en la secuencia de uni5n del otro cebador.
&as !enta"as de la P)/ 21N:
RAPIDEZ Y SENCILLEZ: ya que permite clonar DNA en pocas -oras, utili%ando equipos
relati!amente pocos so$isticados. Ena reacci5n t'pica consiste en 60 ciclos de
desnaturali%aci5n, s'ntesis y reasociaci5n. )ada ciclo dura 6-( minutos y se utili%a un
termociclador automati%ado para cambiar las temperaturas correspondientes a cada paso
del ciclo. .sto supera ampliamente el tiempo requerido para la clonaci5n en clulas, que
suele ser de semanas o incluso meses.
SENCIBILIDAD: ya que puede ampli$icar de secuencias a partir de cantidades muy
'n$imas, incluso a partir de DNA contenido en una sola clula. .sta ele!ada sensibilidad
-a permitido su amplio uso en la medicina $orense, en diagnostico, estudios
paleontol5gicos, etc, donde las muestran pueden contener muy pocos clulas, pero
tambin es cierto que al tener una sensibilidad tan ele!ada, se debe e!itar la
contaminaci5n de la muestra.
ROBUSTEZ: permite la ampli$icaci5n de secuencias que pro!ienen de un material muy
degradado o incluido en un medio complicado de puri$icar, por eso es muy ,til en estudios
de antropolog'a y paleontolog'a molecular.
&as des!enta"as son:
NECESIDAD DE DISPONER INFORMACION SOBRE LA SECUENCIA DEL ADN
DIANA: esto es necesario para la construcci5n de cebadores. Aunque se puede utili%ar
una P)/ en ausencia de in$ormaci5n de manera que se obtiene una ampli$icaci5n
indiscriminada de secuencias de DNA cuando en la muestra el ADN es e*tremadamente
escaso.
TAMAO CORTO DE LOS PRODUCTOS: el tamao de $ragmento que puede clonar por
P)/ oscila entre 0-0,( b, a medida que el tamao !a aumentado la e$iciencia !a
disminuyendo.
INFEDELIDAD EN LA REPLICACION DEL DNA: esto se debe a que la en%ima utili%ada
es la ?aq polimerasa, la cual carece de la acti!idad correctora 6+Q(+. .sto -ace que la
tasa de errores cometidas por esta en%imas es bastante ele!ada para una secuencia de
1b que pasa por 80 ciclos de de ampli$icaci5n, apro*imadamente el @0R de las nue!as
-ebras contendr#n al menos un nucle5tido incorrecto. &a manera de reducir esta
in$idelidad de la replicaci5n es utili%ar otras DNA polimeras que si presentan acti!idad
correctora, como por e"emplo la obtenida de Pyrococcus furiosus, que reduce la tasa a 6,(
R.
8= )ada ciclo consta de 6 etapas:
%esnaturali+acin: se logra calentado la muestra a F6L-F(L).
-easociacin (*i#ridi+acin=: la temperatura puede !ariar entre (0 y 70L), dependiendo
de ?m del d,ple* esperado. &a temperatura de reasociaci5n se $i"a -abitualmente (L) por
deba"o de la ?m calculada para los -ibrido cebadorSADN.
".ntesis de A%& (,longacin): t'picamente a 70-7(L).
&os $actores determinantes en cada etapa son:
%esnaturali+acin: duraci5n: 8 minutosT depende del tipo ADN y la ?L.
-easociacin (*i#ridi+acin): duraci5n: 60 segundosT depende de la temperatura media
y los cebadores.
".ntesis de A%& (,longacin): duraci5n: 8 minutosT depende de la ?L de la ?aq ;78L)=
6= &os componentes de la me%cla de reacci5n para lle!ar a cabo una P)/ son:
DNA termoestable llamada ?aq, que sinteti%a (+Q6+ y lee 6+Q(+.
&os @ deso*inucle5tidos.
&os dos cebadores.
En termociclador.
Ena soluci5n bu$$er que brinda las condiciones de molaridad necesaria.
<g
U8
como co$actor.
Agua tridestilada para lle!ar a !olumen $inal la soluci5n y dar medio l'quido a la
reacci5n.
@= )ada etapa del ciclo dura apro*imadamente 8 minutos, 60 segundos y dos minutos,
para la desnaturali%aci5n, -ibridi%aci5n y s'ntesis, respecti!amente. .l ciclo total tiene una
duraci5n apro*imada de ( minutos.
(= &a tcnica de la P)/ es cualitati!a y e*ponencial, optima -asta los 6( ciclos
apro*imadamente.
J=
7= 2i es posible reali%ar una P)/ a partir de A/N, -aciendo primero un DNAc.
I=
V ?rans$erencia de Nort-ern utili%a electro$oresis en gel desnaturali%ante con sondas
marcadas de ADN, e*tensas etapas de la!ado, seguidos por m,ltiples e*posiciones de la
pel'cula para asegurar que se consigue una e*posici5n dentro del inter!alo lineal de la
pel'cula.
V ?rans$erencia de Nort-ern es relati!amente comple"o y lle!a muc-o tiempo y requiere
una gran cantidad de A/N, por lo que el e*amen de muc-as di$erentes transcripciones
di$'cil.
V Adem#s, la trans$erencia Nort-ern es pobre en la detecci5n de A/N especies poco
abundantes.
V )on el descubrimiento de la transcriptasa in!ersa, que con!ierte el A/N a ADN, la P)/
podr'a usarse para ampli$icar ni!eles muy ba"os de A/N ;P)/ transcriptasa in!ersa o /?-
P)/=.
V A/N podr'a ser con!ertido por la transcriptasa in!ersa en un ADNc en un solo paso, y a
continuaci5n, la P)/ podr'a ampli$icar el ADNc
V )on modi$icaciones menores, esta tcnica se puede -acer en tiempo real, lo que
permite la comparaci5n de la abundancia relati!a de di$erentes especies de A/N
V .n comparaci5n con la trans$erencia Nort-ern, /?-P)/ tiene !arias !enta"as: ;a= que
requiere poco procesamiento P)/ post, a di$erencia de los m,ltiples pasos engorrosos de
trans$erencia Nort-ern, ;b= se puede anali%ar un amplio rango ;W 10
7
!eces= de di$erencia
en cantidades de A/N, a di$erencia de la trans$erencia Nort-ernT y ;c= el ensayo es muc-o
m#s cuantitati!a de trans$erencia de Nort-ern, lo que permite mediciones m#s precisas de
especies de A/N cantidades !ariables.
21E?H./N P)/
D.?.)?A ENA 2.)E.N)BA DNA E?B&BMAND1
ENA 21NDA.
<A2 )1<P&B)AD1.
A<P&B9B)A
2.N)B&&A > /APBDA
N1/?H./N P)/
D.?.)?A A/Nm A<P&B9B)A
Hola c-icos, aqu' les en!'o las respuestas completas al inciso b: estrategias b#sicas para
el clonado molecular in !itro.
)on respecto al inciso a les respond' la pregunta 6 ;tipo de !ectores=, la I ;construcci5n
de bibliotecas= y la F ;tcnicas de rastreo=, las restantes no las considere necesario
porque eran preguntas que se supon'an ten'an que responder en el e"ercicio
1;caracter'stica del !ector, de la clula -ospedadora y el concepto de inserto, clonaci5n,
etc= o bien porque se estu!o !iendo en los e"ercicios. .n caso que les resulte m#s
con!eniente tenerlas por escrito me a!isan y se las completo.