PRACTICA #8

ENTEROBACTERIAS


OBJETIVO DE LA PRACTICA
Desarrollar las tcnicas de aislamiento e identificacin de enterobacterias,
comprendiendo el significado de las pruebas bioqumicas.

INTRODUCCION
Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son bacilos gramnegativos,
anaerobios facultativos que fermentan la glucosa en anaerobiosis; citocromo
oxidasa negativos; reducen los nitratos a nitritos. Cuando son mviles son
flagelados peritricos. Son llamadas enterobacterias porque con frecuencia
residen en el aparato digestivo de animales y humanos, pero algunas especies
tambin viven en la tierra y en el agua. Incluye los gneros Escherichia, Shigella,
Edwardsiella, Salmonella, Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Serratia,
Morganella, Proteus, Providencia, Yersinia, Erwinia y Pantoea. La mayora
forman parte de la flora normal o son bacterias ambientales, a excepcin de los
gneros Salmonella, Shigella y Yersinia, quienes son causantes de infecciones
gastrointestinales; es por eso que cuando se detectan en heces, es muy
probable que estn causando dao.

Cuando las enterobacterias se introducen a un sitio del cuerpo estril, producen
enfermedades como neumona, infecciones de vas urinarias, septicemia,
infecciones neonatales, infecciones de heridas y de cirugas. Se comportan
como patgenos oportunistas sobre todo en pacientes inmunocomprometidos.

A semejanza de las enterobacterias, los gneros Campylobacter y Helicobacter
causan enfermedades gastrointestinales. Campylobacter es un bacilo curvo
gramnegativo, microaeroflico, con un solo flagelo polar. Causa enteritis aguda.
Helicobacter es un bacilo un poco curvo, microaeroflico, con flagelos polares
mltiples. Requiere medios especficos para cultivarse. Causa gastritis crnicas
y lceras gstricas y duodenales.


MATERIALES Y METODOS.

I. Aislamiento e identificacin de enterobacterias patgenas a partir de
heces.

Aislamiento en medios selectivos:
1. La muestra de heces sin orina debe colectarse en un frasco estril, durante
el curso de la enfermedad y antes de instituir el tratamiento. Con un hisopo
estril siembre las heces en frasquitos con caldo-cerebro-corazn o caldo
tripticasa. Descargue el inculo, moviendo el hisopo con cuidado.
2. A partir del caldo siembre por estra cruzada placas de SS, EMB y agar-
verde-brillante, descargando la muestra con el asa en un extremo de la caja y
extendiendo despus. Incube 24 hs a 37
o
C. Siembre cepas puras de
enterobacterias como testigos en los mismos medios.
3. Compare el crecimiento de las cepas testigo con las desarrolladas en las
heces.
- En agar-verde brillante todas las salmonellas, excepto S. typhi, forman
colonias rojas o rosas a las 48 hs de incubacin. El Proteus mirabilis
forma colonias amarillas o amarillo-verdosas con un halo amarillo
verdoso. E. coli no crece.
- En EMB E. coli forma colonias negruscas o moradas, usualmente
con brillo verde metlico. Las shigellas producen colonias sin color
- En SS el Enterobacter forma colonias rojas o rosas a las 24 hs.
Salmonella forma colonais sin color con centro negro. E. coli crece
poco.
4. Haga un Gram de las colonias sospechosas y compruebe que son de
bacterias
gramnegativas.


II. Pruebas bioqumicas para la identificacin de enterobacterias:
Elija las colonias sospechosas de enterobacterias a partir del desarrollo en las
placas de medio selectivo sembradas con heces. Cada tipo diferente de colonia
deber sembrarse en todos los medios para pruebas bioqumicas.

A. Medio Doble azcar (lactosa y dextrosa) en tubo inclinado (medio de color
naranja):
1. Con una asa normal con anillo, se toma una colonia bien aislada y se
siembra por estra en la superficie de agar del tubo
2. Usando una asa recta sin anillo, tome otra colonia igual a la anterior y
siembre por picadura en el centro del tubo, sin tocar el fondo, cuidando que
no le tiemble la mano. Incube 24 hs a 37
o
C . Al cabo de este trmino, la
fermentacin de la glucosa ocurre en anaerobiosis hasta cido, lo cual se
manifiesta por un cambio de color del indicador de pH en el medio, de rojo a
amarillo en el fondo del tubo. La degradacin de la lactosa en aerobiosis es
indicada por un color amarillo en la superficie del agar.

B. Medio de SIM en tubo (color beige):
A partir de una colonia siembre un tubo por picadura en el centro, sin tocar el
fondo, cuidando que no le tiemble la mano e incube 24 hs a 37
o
C .
- La produccin de sulfuros toma lugar a parti r de aminocidos con
azufre y es indicada por la aparicin de un color negro
- La movilidad positiva es demostrada al crecer la bacteria
homogneamente en todo el medio, observndose una turbidez
- La produccin de metabolito indol es indicada por un anillo de color
rojo que se forma despus de adicionar unas 2 o 3 gotas del reactivo
de Kovacs.

C. Medio MIO en tubo (color caf):
Siembre una colonia por picadura en el centro e incube igual. El indicador de pH
en el medio cambia de color, de caf a color violeta al alcalinizarse, lo que indica
la descarboxilacin de la ornitina por la enzima ornitn descarboxilasa

D. Citrato como nica fuente de carbono (color verde) en tubo inclinado:
Siembre una colonia por estra en la superficie del agar e incube igual. El
crecimiento y el cambio de color del indicador de pH a azul en condiciones
alcalinas, indica la utilizacin del citrato positiva.

E. Urea (color beige) en tubo inclinado.
Se siembra por estra y se incuba igual. La aparicin de un color fiucha (rosa
mexicano) en el medio, indica la accin de la ureasa y alcalinizacin del medido.
El indicador de pH se torna rosa en condiciones alcalinas.

Haga una tabla de resultados y compare con los datos de la literatura. La
identificacion de las bacterias encontradas en heces, puede efectuarse hasta
gnero o hasta especie, segn el nmero de datos. Una vez identificada la
bacteria, investigue las enfermedades que ocasiona.

III. Serotipificacin de Salmonella y de E. coli.

1. Para la identificacin de serotipos de estas bacterias despus del
aislamiento, haga pruebas con anticuerpos especificos obtenidos
comercialmente.
2. De acuerdo con la literatura describa los principales serotipos de cada
una de las dos bacterias.
3. En cada caso cuales serotipos son predominantes en Mxico, en cada
una de las dos bacterias.

RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.