INTRODUCCION

Coprocultivo. Las Enterobacterias representan la mayor parte de la flora

microbiana del tracto intestinal del hombre. En ella se incluyen grmenes
comensales (Proteus y bacilos coliformes), as como patgenos del gnero
Salmonella y Shigella. El vibrin colrico puede ser aislado de casos de clera.
Durante las infecciones entricas, cuando se presentan patgenos tales como
Salmonella y Shigella, el bacterilogo debe distinguir entre los habitantes normales
del intestino y los agentes etiolgicos de enfermedad.
Es importante destacar que las bacterias intestinales toman parte en los procesos
digestivos tanto del hombre como de los animales. Ellos ayudan a la sntesis de
vitaminas del complejo B y de la vitamina K.
La materia fecal evacuada debe ser reciente y deben cultivarse lo ms pronto
posible despus de haber sido recolectada. Las muestras debern obtenerse al
inicio del cuadro clnico, antes de iniciar el tratamiento antimicrobiano.
Las muestras de heces se pueden tomar directamente en un frasco limpio de boca
ancha y con tapa hermtica, de preferencia estril. Si la muestra se toma en el
mismo laboratorio donde se va a realizar el aislamiento, no es necesario usar
medio de transporte y hay que sembrar de inmediato.
En estudios de campo o cuando el laboratorio no est cercano, la muestra se toma
con un hisopo, el cual debe quedar bien impregnado de materia fecal. El hisopo se
coloca en un medio de transporte como el Cary-blair.

OBJETIVOS
Identifica Enterobacterias por medio del coprocultivo.

MATERIALES Y METODOS

Asa bacteriolgica Mechero Fisher
Estufa de incubacin a 37C
Agares estriles de SS, EMB, Mc Conkey,
Caldo tetrationato, agar sulfito bismuto
Agar verde brillante.
Una muestra de heces recolectada en frasco estril
Hisopos estriles


PROCEDIMIENTO

1. Introducir un hisopo estril en varios puntos de la muestra.
2. Descargar la muestra en un rea pequea de los medios de cultivo: SS, Mc
Conkey y EMB y realizar el estriado.
3. Incubar las cajas a 37C durante 24 o 48 horas
4. Observar las caractersticas morfolgicas de las colonias desarrolladas
indicando si existen cambios en el medio, pigmentos en la colonia etc.
5. Tratar de identificar si existe crecimiento de Salmonella o Shigella que se
manifiestan como colonias de color blanco en Mc Conkey e incoloras en
EMB.
6. Al mismo tiempo que las placas, con la muestra fecal se inocula un medio
de enriquecimiento como el caldo tetrationato, colocando el hisopo
impregnado con la muestra en el caldo al cual se le agreg previamente 0.2
ml de yodo por gramo de materia fecal.
7. Incubar este medio de enriquecimiento por 12 o 18 horas a 37C
8. A partir del caldo tetrationato se siembran placas con medios inhibitorios
como el agar verde brillante y el agar sulfito de bismuto, este ltimo si se
est buscando S. typhi. Despus de incubar a 37C durante 24 horas la
placa de verde brillante y 48 horas la de sulfito bismuto, se revisan
cuidadosamente en busca de colonias sospechosas. En el verde brillante
Salmonella crece como colonias rojas y en sulfito de bismuto como colonias
negras.
9. Para mayor seguridad en la identificacin de Enterobacterias es necesario
realizar pruebas bioqumicas a las cepas aisladas en los medios de cultivo.
Las ms comunes son IMVIC






Enterobacterias a travs de pruebas bioqumicas (IMVIC)

El indol, es un bencilpirrol, es uno de los productos de degradacin metablica del
aminocido triptfano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son
capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano con produccin de indol, cido
pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para
la identificacin de muchas especies de microorganismos, siendo especialmente
til para diferenciar Escherichia coli (positiva) de miembros del grupo Klebsiella-
Enterobacter (la mayora negativos).

La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo de color rojo
cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo.
Este es el principio activo de los reactivos de Kovac y ehrlich. Se debe utilizar un
medio rico en triptfano. En la prctica se emplean medios combinados tales como
sulfuro-indol-movilidad (SIM), movilidad-indol-ornitina (MIO) o indol-nitrato.

La prueba de rojo de metilo es cuantitativa para la produccin de cido y
requiere organismos positivos que produzcan cidos fuertes (lctico, actico,
frmico) a partir de glucosa, por la va de la fermentacin cida mixta. Dado que
son muchas las especies de Enterobacterias que pueden producir cantidades
suficientes de cidos fuertes detectables con el indicador rojo de metilo durante la
fase inicial de la incubacin, slo se consideran rojo de metilo positivos aquellos
organismos que pueden mantener este pH bajo luego de una incubacin
prolongada (48 a 72 horas), contrarrestando el sistema estabilizador de pH del
medio.

La reaccin de Voges-proskauer: el cido pirvico, componente fundamental
formado en la degradacin fermentativa de la glucosa, es metabolizado luego a
travs de varias vas, de acuerdo con los sistemas enzimticos que poseen las
diferentes bacterias.

Una de dichas vas lleva a la produccin de acetona (acetilmetilcarbinol), un
subproducto de reaccin neutra. Los organismos tales como los miembros del
grupo Klebsiella-Enterobacter producen acetona como principal subproducto del
metabolismo de la glucosa y forman cantidades menores de cidos mixtos.

En presencia de oxgeno atmosfrico y de hidrxido de potasio al 40%, la acetona
se convierte en diacetil y el alfa-naftol acta como catalizador para revelar un
complejo color rojo.

Citrato: la utilizacin de citrato por una bacteria se detecta en un medio con citrato
mediante la formacin de subproductos alcalinos. El medio incluye citrato de
sodio, un anin como nica fuente de carbono y fosfato de amonio como nica
fuente de nitrgeno.

Las bacterias que pueden utilizar citrato tambin pueden extraer nitrgeno de la
sal de amonio, con produccin de amonaco (NH3+) alcalinizando el medio por
conversin del amoniaco en hidrxido de amonio (NH4OH). El azul de bromotimol,
amarillo a pH menor a 6 y azul a pH mayor de 7.6 es el indicador.


OBJETIVO

Realiza la prueba bioqumica del Indol, rojo de metilo, voguesproskauer y
citrato para la diferenciacin de Enterobacterias, especialmente de
Escherichia coli.

MJATERIALES Y METODOS

Caldo triptfano (MIO o SIM)
Reactivo de Kovac
Reactivo de Ehrlich
Cepa reciente del organismo en estudio.
Caldo RM/VP
Indicador de pH de rojo de metilo
Medio de Citrato Simmons
Cloroformo
Reactivo de alfa-naftol al 5%
KOH al 40%
Tubos de ensayo de 13x100
Pipetas graduadas de 5 ml
Pipetas pasteur
Incubadora


DESARROLLO

a. Prueba de Indol

1. Inocular caldo triptfano (u otro medio con indol) con el organismo en
estudio e incubar a 35-37C.

2. Al finalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo por la pared interior
del tubo. Si se emplea reactivo de Ehrlich, este paso debe ser precedido
por la adicin de 1 ml de cloroformo. Esto no es necesario con el reactivo
de Kovac.

INTERPRETACIN
El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el
caldo (o en la capa de cloroformo) segundos despus de aadir el reactivo
indica la presencia de indol y una prueba positiva.

NOTA: Es aconsejable probar los reactivos con controles positivos
(Escherichia coli) y negativos (Klebsiella pneumoniae).

b. Prueba de Rojo de Metilo

1. Inocular el caldo RM/VP con un cultivo puro del organismo en estudio.
Incubara 35C durante 48 a 72 horas (no menos de 48 horas). Finalizado
este perodo, aadir directamente al caldo 5 gotas de reactivo de rojo de
metilo.

INTERPRETACIN: El desarrollo de un color rojo estable en la superficie
del medio indica que la produccin de cido es suficiente como para bajar el
pH a 4.4 y es una prueba positiva. Dado que otros organismos pueden
producir cantidades menores de cido a partir del sustrato, es posible el
desarrollo de un color naranja intermedio entre el amarillo y el rojo. Esto no
indica una prueba positiva.

NOTA: no olvidar probar medios y reactivos con controles positivos y
negativos.

c. Prueba de Voges-proskauer

1. Inocular un tubo de caldo RM/VP con un cultivo puro del organismo en
estudio. Incubar durante 24 horas a 35C. Al finalizar este periodo,
transferir 1 ml de caldo a un tubo de ensayo limpio. Aadir 0.6 ml de alfa-
naftol al 5% y 0.2 ml de KOH al 40%. Es esencial adicionar los reactivos
en ese orden. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al
oxgeno atmosfrico y dejarlo reposar durante 10 o 15 minutos.

INTERPRETACIN: Una prueba positiva est indicada por el desarrollo de
un color rojo a los 15 minutos de aadir los reactivos, revelando la
presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona. Las pruebas
no deben leerse luego de ms de 1 hora, ya que cultivos de voges-
proskauer negativos pueden producir un color cobrizo, con la consecuente
posibilidad de una interpretacin falsa positiva.

d. Prueba de Citrato

1. Tomar una colonia bien aislada de la superficie de un medio de
aislamiento primario e inocularla en una sola estra en el pico de agar
citrato de Simmons. Incubar a 35C durante 24 a 48 horas.

INTERPRETACIN: El desarrollo de un color azul intenso en 24 a 48 horas
indica una prueba positiva y revela que el organismo en estudio ha sido
capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con la formacin de
productos alcalinos.
RESULTADOS:

Los resultados son normales cuando se comprueba una flora saprfita normal,
es decir que no presenta peligro del organismo.

Los resultados deben ser los siguientes:
50 al 70 % de bacterias Gram negativas.
30 al 50 % de bacterias Gram positivas.
Ningn glbulo blanco (leucocitos) o glbulo rojo (hemates).
Ninguna bacteria patgena.

DISCUSION
La porcin inferior del intestino tiene una flora bacteriana normal
excesivamente amplia. Los microorganismos con mayor prevalencia son los
anaerobios (Bacteroides, bcilos gram positivos, Estreptococos),
microorganismos entricos gran negativos y Enterococcus faecalis. Cualquier
intento por aislar bacterias patgenas de las heces implica la separacin de
las especies patgenas, usualmente a travs del empleo de medios selectivos
diferenciales y de cultivos enriquecidos.
Las principales causas de trastornos gastrointestinales agudos incluyen a los
virus, las toxinas (de: Estafilococos, Vibriones, Escherichia coli ), bacilos
entricos gran negativos invasores, los fermentadores lentos de la lactosa,
la Shigella, la Salmonella y la Campilobacterias.
La importancia relativa de estos grupos tiene grandes discrepancias en las
distintas partes del mundo. Las heces y los raspados rectales son los
especimenes de que se dispone con mayor facilidad. Debe anotarse, en el
examen macrocpico la presencia de sangre, moco o helmintos en la
inspeccin inicial.
Se suspenden los especmenes en un caldo selectivo como el Caldo de
Tetrationato y se cultivan sobre medios ordinarios as como en medios
selectivos diferenciales, por ejemplo Agar EMB, Agar McConkey, Agar S-S,
para permitir la separacin de los bacilos gran negativos que no fermentan la
lactosa de otras bacterias entricas comunes.
Los frotis teidos pueden revelar una prevalencia de leucocitos y de ciertos
microorganismos anormales como Cndida o estafilococos, pero no pueden
utilizarse para diferenciar las bacterias entricas patgenas de las de la flora
normal, por lo que deben realizarse otro tipo de pruebas para discriminar los
tipos de bacterias presentes en la muestra como son las pruebas bioqumicas.



COPROPARASITOLOGICO
Para poder identificar y diagnosticar las principales enteroparasitosis se utiliza el
Exmen Parasitolgico Seriado de Deposiciones, el cual puede realizarse a travs
de varios mtodos (Telemann, PAF, SAF) sin embargo, el que ms se utiliza es
el Mtodo de Telemann por su simplicidad y buen rendimiento en el diagnstico.
Lo ms importante para poder realizar este exmen, es una correcta toma de
muestra. Sin embargo, por las caractersticas del exmen, la muestra es tomada
por el mismo paciente, por lo tanto, el profesional de la salud debe conocer con
exactitud, las instrucciones que debe informar al paciente, para el cumplimiento
de las medidas necesarias para efectuar un examen coproparasitario, con el fin de
que el resultado del laboratorio sea lo ms exacto posible.
El anlisis coproparasitoscpico es un estudio prescrito bajo sospecha de
presencia parasitaria, larvas, o huevos de diferentes familias de helmintos,
amebas, tenias y protozoos.

El mdico ordena este estudio cuando el paciente presenta:
Diarrea, Gases, Dolores o clicos, etc. Cuando los parsitos se alojan en el
aparato digestivo, una proporcin de ellos, o las larvas, o los huevos son
eliminados con las heces.

Como la cantidad que se elimina en cada defecacin puede ser variable, y si hay
poco nmero de parsitos en el intestino, lgicamente tambin sern escasos en
las muestras que se tomen, no siempre que una muestra sale negativa se puede
descartar la infeccin. Por eso, normalmente se toman tres muestras de heces, en
tres das distintos. De esta forma se confirma la infeccin.
Durante al menos tres das previos a la prueba el paciente deber evitar tomar
medicamentos (antiparasitarios, antibiticos, anti-diarreicos, laxantes o purgantes).

El examen directo macroscpico permite observar directamente las
caractersticas morfolgicas de los parsitos adultos, enteros o fraccionados, as
como los cambios en las caractersticas organolpticas de las heces eliminadas
(color, presencia de sangre y/o moco, consistencia etc.)







OBJETIVO:
Realizar el examen macroscpico directo de heces fecales. Realizar el
anlisis coproparasitolgico mediante la tcnica de tamizado, as
observando directamente las caractersticas morfolgicas de los parsitos
adultos, enteros o fraccionados.
MATERIALES:

1 Gradilla
4 Tubos de ensaye 13 x 100 mm
2 Abate-lenguas
1 Papel parafilm
2 Portaobjetos
2 Cubreobjetos
2 Pipetas Pasteur
1 Bulbo de hule

REACTIVOS:

Lugol
Sulfato de Zinc (con densidad de 1.180)

MUESTRA BIOLGICA:

Heces

EQUIPOS:

Centrfuga
Microscopio ptico

PROCEDIMIENTO:

1. Mezclar una porcin de materia fecal con 9 porciones de agua comn.

2. Realiza un tamizado de la muestra.

3. Vaciar a un tubo de ensayo 13 x 100 mm hasta partes del mismo, el
sobrenadante, las partes gruesas se quedan en el frasco.

4. Centrifugar a 1800 r.p.m. durante 3 minutos.

5. Decantar el sobrenadante. Homogeneizar el sedimento con agua comn.

6. Centrifugar a 1800 r.p.m. durante 3 minutos.

7. Decantar. Adicionar Sulfato de Zinc hasta del tubo.

8. Centrifugar a 1800 r.p.m. durante 1 minuto.

9. Llenar con ms Sulfato de Zinc hasta el borde, hasta formar un menisco, sin
que se derrame.

VALORES NORMALES
Color: Ocre
Consistencia: Pastosa
Aspecto: Slido
Presencia de alimentos no digeridos: No se observ
Presencia de sangre macroscpica: No se observ
Presencia de moco o pus: No se observ
Presencia de macro-parsitos: No se observ
Determinacin de sangre oculta en heces: Negativo
Determinacin de azucares reductores: Negativo
Presencia de grasas en heces: Negativo


DISCUSION

El examen coproparasitolgico es uno de los estudios de laboratorio en el que
se analiza la materia fecal. En particular este estudio se utiliza para detectar la
presencia de parsitos intestinales, lo que sirve para establecer un diagnstico
definitivo de parasitosis. Las infestaciones por helmintos (gusanos) se
diagnostican mediante la identificacin de los huevos en las heces, las
infestaciones por protozoos (p. ej., amebas) se diagnostican mediante los
hallazgos de trofozoitos (estado activo), quistes (estadios acorazados) en las
heces. Se requiere una muestra de heces reciente, la cantidad de muestra es
importante y sta preferentemente no debe exceder el tamao de una nuez.



REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

EMILIA ELIZABETH BOLIO SALAZAR, MANUAL DE PRCTICAS ANLISIS
CLNICOS III, UNIVERSIDAD DE COLIMA, DIRECCIN GENERAL DE
EDUCACINMEDIA SUPERIOR, MXICO, 2009.

HECTOR RIVERA VALENZUELA, MANUAL DE LABORATORIO DE
PARASITOLOGIA Y MICOLOGIA, UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BAJA
CALIFORNIA, FACULTAD DE MEDICINA Y PSICOLOGIA, MXICO, 2008.

http://salud.kioskea.net/faq/5994-examen-bacteriologico-de-las-heces-
coprocultivo

http://procedimientosmicrobiologicos.wikispaces.com/COPROCULTIVO