PRCTICA N 3

NUMERACION DE MICROORGANISMOS POR METODOS INDIRECTOS

(METODO DE MICROORGANISMOS VIABLES)

I. INTRODUCCIN:
La leche es un excelente medio de cultivo para el crecimiento microbiano, gracias a su elevada
actividad de agua, su pH (6.4 6.6) y su abundante cantidad y calidad y calidad de nutrientes.
Esto exige unas rigurosas normas de higiene tanto en su produccin como en su tratamiento.
La leche aunque proceda de vacas sanas y se haya obtenido en las mejores condiciones
higinicas, siempre est contaminada con microorganismos en mayor o menor grado. Los
microorganismos que se encuentran en la leche tienen tres orgenes: el interior de la ubre, el
exterior de los pezones y sus alrededores prximos, y el ordeo y los utensilios que se utilizan
normalmente para manipular la leche.
Normalmente, se trata de grmenes saprofticos del pezn y de los canales galactforos, como
micrococos, estreptococos lcticos y lactobacilos. En caso de enfermedad del animal, se
pueden presentar otros microorganismos patgenos y peligrosos desde el punto de vista
sanitario, por ejemplo, los agentes de la mastitis tales como: Staphylococcus aureus,
Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Corinebacterium bovis, etc.
Por otra parte, entre los microorganismos patgenos para el ser humano procedentes de
animales se encuentran Mycobacterium bovis, M. Tuberculosis, Brucella abortus, etc.
El anlisis microbiolgico de la leche proporciona datos muy tiles que reflejan las condiciones
en las que se han obtenido y conservado. Los recuentos bacterianos elevados no inician
necesariamente que la leche contenga bacterias patgenas, peri revelan intensa contaminacin
o temperaturas de conservacin defectuosas.
El desarrollo de mtodos rpidos y/o automatizados en el diagnstico de la calidad higinico
sanitaria de la leche y sus productos constituye en los ltimos aos una necesidad enfocada en
lo fundamental en la obtencin de la respuesta en el menor tiempo posible para tomar las
medidas correctivas sobre las posibles brechas en la higiene de algunas de las fases de la
cadena productiva antes de que el producto sea liberado en el mercado.
Estos mtodos rpidos de diagnstico bacteriolgico en leche se han clasificado atendiendo a
diferentes puntos de vistas, no obstante, en lo fundamental han tomado como base los
aspectos siguientes: Rapidez con que se obtienen las respuestas, la actividad metablica de los
microorganismos, posibilidades de automatizacin y principios de medicin en que se basan las
lecturas.
Teniendo en cuenta la diversidad de estas clasificaciones y para una mayor inclusin de
mtodos rpidos empleados en el diagnstico microbiolgico de la leche, estn agrupados en
tres grupos: mtodos directos, indirectos y en mtodos para diagnstico de microorganismos
especficos.
El mtodo usado en esta prctica es un mtodo indirecto, el mtodo de reduccin de
colorantes (Reductasa), usando azul de metileno.


Azul de metileno

Los tests de reduccin de colorantes se han utilizado durante muchos aos como indicadores
de la calidad microbiolgica de la leche y otros productos alimenticios. Estn basados en la
medicin de la actividad metablica de las bacterias, ya que muchas de ellas poseen las enzimas
deshidrogenasas, las cuales transfieren hidrgeno de un sustrato a un aceptor biolgico
reducindolo. Tal es el uso de la Prueba de Reduccin del Azul de Metileno, de la Resazurina y
del Trifenilfetrazolium, no obstante, a partir de los aos 60 la introduccin masiva de la
refrigeracin trajo consigo la predominancia en la microflora de la leche de los grmenes
psicrfilos, los cuales tienen poco poder reductor, limitando con ello la utilidad de la prueba de
reduccin (ya que se realiza a 37 C).
En el procedimiento se utilizan patrones de azul de metileno o resazurina y se observa el
proceso de reduccin del colorante (de azul a blanco para el azul de metileno; de azul
apizarrado a rosa o blanco para la resazurina). El tiempo necesario para que se produzca la
reduccin del colorante est relacionado con el nmero de microorganismos de la muestra.
Teniendo en cuenta que los mtodos de reduccin no funcionan eficazmente en leches
refrigeradas, se ha sugerido la sustitucin de estas por otras tcnicas rpidas.





II. OBJETIVOS:
Determinar las clulas viables presentes en la muestra de leche a partir de la prueba de
la reductasa.
Determinar a calidad de las muestras de leche.

III. MATERIALES:
TIPO MATERIALES
Biolgicos Leche fresca
De vidrio Tubos tapa rosca
Frascos de boca ancha
Pipetas
Equipos Bao Maria
Colorantes Azul de metileno
Otros Gradilla de acero inoxidable
Reloj









IV. PROCEDIMIENTO:
1. Encender el bao mara, y colocarlo a 37C
2. Homogenizar la muestra




3. Se coloca 1 ml del colorante en un tubo con tapa rosca.
4. Seguidamente, colocar 10 ml de la muestra.














5. Tapar los tubos y suavemente mezclar.
6. Llevar inmediatamente a bao Mara (37C).
7. Aflojar ligeramente la tapa y observar cada 30 min hasta por 4 horas (en estos tiempos se
invierte el tubo y se anota el color hasta cuando este blanco).
8. El tubo control negativo se hace hirviendo la leche.

V. RESULTADOS:











CONTROL
NEGATIVO
CONTROL
POSITIVO
Pasado las 4 horas el tubo
problema no vir.
VI. INTERPRETACION

Segn el sistema de clasificacin utilizado para la prueba de azul de metileno, la
Leche analizada pasada las 4 horas, su nivel bacterial es baja por lo tanto la calidad
de sta es muy buena de Clase A.











VII. CONCLUSIONES:

Lea muestra de la leche analizada se puede catalogar como una leche tipo A, por no
presentar viraje durante 4 horas.
la temperatura y el tiempo son factores importantes, ya que de estos dependen la
actividad microbiana.
Un nmero de microorganismos presentes en la muestra es directamente proporcional
a la coloracin de la muestra e indirectamente proporcional al tiempo de decoloracin.

VIII. CUESTIONARIO

1) Qu otros colorantes se usan para determinar la poblacin microbiana?
Resazurina.- tiene lugar en 2 fases, desde color rosa hasta pasar a
incoloro.
Sales de cloruro de trifenil tetrazodio.- incoloro a color intenso.
Azul de metileno.- Que va desde azul a incoloro.
2) Para qu otros alimentos se utiliza este mtodo?
Se utiliza la prueba de reductasa para muestras de:
Miel.
Jugo de caa.
Yogurt.
Kifer.
Cremas de leche.
Natas.
3) Cmo debo preparar la solucin de metileno para la prueba de reductasa?
Para su preparacin (100 mL) primero pesamos 0.31g de azul de metileno (como
es slido se tritura en un matraz), luego agregamos 30 mL de alcohol etlico,
Muestra: Leche Tiempo de viraje Calidad Color del viraje
Leche muy buena mayor a 4 horas Clase A Azul
Buena 3 4 horas Clase B Blanco
Aceptable 30 min 3 horas clase C Blanco
Inaceptable menos de 30 min clase D Blanco
mezclamos y agregamos los 100 mL de agua destilada (para evitar precipitados
lo pasamos por papel filtro).
El azul de metileno de Loeffler tiene en vez de agua destilada una solucin de
KOH al 0.01%.


4) Norma tcnica peruana de leche cruda