Sintesis de Materiales para Sustitución de Cartilago Condral Basados en Quitosano/AMPS

UNIVERSIDAD SIMN BOLVAR
DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES

COORDINACIN DE INGENIERA DE MATERIALES

PREPARACIN DE MATERIALES PARA LA REGENERACIN DE CARTLAGO
CONDRAL BASADO EN QUITOSANO / AMPS

Por:
Eduardo Gustavo Hernndez Ojeda

INFORME DE PASANTA
Presentado ante la Ilustre Universidad Simn Bolvar
como requisito para optar al ttulo de
Ingeniero de Materiales

Sartenejas, Enero de 2014

UNIVERSIDAD SIMN BOLVAR
DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES
COORDINACIN DE INGENIERA DE MATERIALES

CONDRAL BASADO EN QUITOSANO / AMPS

Por:
Eduardo Gustavo Hernndez Ojeda

Realizado con la asesora de:
Tutor Acadmico: Karem Noris
Tutor Industrial: Luis Rodrguez Lorenzo

INFORME DE PASANTA
Presentado ante la Ilustre Universidad Simn Bolvar
como requisito para optar al ttulo de
Ingeniero de Materiales

Sartenejas, Enero de 2014

ACTA DE EVALUACIN DEL PROYECTO

iv

CONDRAL BASADO EN QUITOSANO/AMPS
Realizado por: Eduardo Gustavo Hernndez Ojeda
RESUMEN

Durante esta investigacin se sintetizaron copolmeros de quitosano-AMPS (cido
2-acrilamido-2-metilpropano sulfnico) entrecruzados con tripolifosfto de sodio
(TPP) con la finalidad de obtener andamios porosos para el cultivo de clulas
condrocticas que servirn para crear un tejido cartilaginoso para la sustitucin del
mismo tejido daado en el cuerpo. As se evalu en estos andamios su correcta
sntesis (verificacin del mecanismo de sntesis), sus propiedades mecnicas y su
microestructura mediante SEM. Para lograr todo esto se realiz la sntesis del
copolmero quitosano-AMPS usando dos quitosanos de diferentes marcas
registradas, Protasan e Idebio, previamente caracterizados mediante FTIR, DRX y
RMN
1
H; adems de un iniciador de persulfato de sodio (PS) en medio acuoso bajo
atmsfera de nitrgeno. Se vari el porcentaje de AMPS, TPP y PS. Asimismo se
verific el mecanismo de copolimerizacin entre quitosano y AMPS. Tambin se
realiz el anlisis del porcentaje de injerto obtenido para cada muestra y su
distribucin mediante EDS. Posteriormente, fueron realizados pruebas de
hinchamiento y degradacin en PBS a distintos pHs. Del mismo modo, se valor la
porosidad de las muestras, se determin el tamao de poro promedio y la distancia
entre lminas haciendo uso de fotomicrografa de SEM. Finalmente fue calculado el
peso molecular entre nudos (MC) a travs de los modelos viscosimtricos y de Peppas
y Merrill. Se obtuvo que el mecanismo de copolimerizacin se ocurre a travs de los
grupos aminos y no por apertura de anillo. Los porcentajes de injerto se encuentran
entre 22 y 95% obtenindose los ms altos valores con el mayor porcentaje de AMPS,
iniciador y entrecruzante. Todas las muestras presentaron una distribucin del
AMPS homognea. Con respecto al hinchamiento ambos tipos de muestra (con
quitosano Protasan o Idebio) presentan una tendencia a hinchar ms mientras
tengan mayor porcentaje de injerto, pero las muestras de quitosano Idebio hinchan

v

al menos un 20% ms que las muestras de Protasan. Fue observado que el
porcentaje de hinchamiento aumenta con la disminucin del pH. Se obtuvieron
muestras 100% porosas, con una microestructura de lminas paralelas porosas que
crecen direccionadas. Por ltimo los valores de MC obtenidos fueron desde los 18.000
a los 4.000 g/mol con una tendencia a disminuir al crecer el porcentaje de iniciador y
de entrecruzante.

vi

Para toda mi familia y amigos,
son mi mundo entero.
y para Atonella,
eres mi esperanza del futuro

vii

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar agradezco a quienes me dieron la vida y todo lo que tengo, mis
amados padres, Guillermo Hernndez y Liley Ojeda, miles gracias los amo
demasiado. Tambin le doy infinitas gracias a toda mi familia: a mis hermanas,
primos, tos, sobrinos, tanto Hernndez Carvajal como Ojeda Fung que de una forma
u otra me apoyaron durante todo el camino.
Por otra parta tanto a mi tutor industrial, Luis Rodrguez Lorenzo, como a mi tutor
acadmico, Karem Noris, que llevaron con xito esta investigacin y me prestaron
una ayuda de incalculable valor. Asimismo doy gracias a todo el grupo de
Biomateriales del CSIC, quienes siempre estuvieron dispuestos a ayudarme en todo.
Del mismo modo agradezco enormemente a Maria Luisa Arnal y Evis Penott por sus
aportes en conocimientos cientficos.
A la seora Paloma Montoro, no hubiera podido sobrevivir a Madrid sin ella. Y por
supuesto a mis queridas roomies (Daniela, Ines e Ina), quienes despejaron mi
estrs cuando senta que no poda continuar.
Por ltimo, pero no menos importante, a mis amigos (la familia que se elige)
quienes me apoyaron en todo momento y a los que quiero con toda mi alma. A los
nacionales: Alicia, Joselyn, Daniela Prez, Daniela Da Costa, Suhail, Alejandra,
Carlos, Yise, Nella la lista es infinita, todos saben que los aprecio mucho. Y a los
internacionales, que aun estando lejos se preocupan por m: Elena, Aida, Jorge,
Juan, Marzia Gracias a todos. Si a alguien olvido, pido mil disculpas.

viii

NDICE GENERAL

Pgina
RESUMEN ..................................................................................................................... iv
AGRADECIMIENTOS ................................................................................................ vii
INTRODUCCIN .......................................................................................................... 1
CAPTULO I: DESCRIPCIN DEL INSTITUTO ....................................................... 3
1.1. Sobre la Agencia Estatal Consejo Superior de Investigaciones Cientficas ... 3
1.2. Sobre el Instituto de Ciencia y Tecnologa de Polmeros ................................ 4
1.3. Sobre el grupo de Biomateriales ...................................................................... 5
CAPTULO II: MARCO TERICO ............................................................................... 7
2.1. Quitina y Quitosano .......................................................................................... 7
2.2. Propiedades del quitosano ................................................................................ 8
2.2.1. Cristalinidad ............................................................................................. 10
2.3. Copolimerizacin de Injerto ............................................................................ 10
2.3.1. Copolimerizacin con AMPS .................................................................... 12
2.4. Cartlago .......................................................................................................... 13
2.5. Geles polimricos ............................................................................................ 17
2.5.1. Comportamiento en estado hinchado ...................................................... 19
2.5.2. Geles sensibles al pH ............................................................................... 20
2.5.3. Tamao de la malla .................................................................................. 20
2.6. Andamios ......................................................................................................... 20
CAPTULO III: DISEO EXPERIMENTAL ............................................................. 24
3.1. Materiales ....................................................................................................... 24
3.2. Caracterizacin de los reactivos de partida ................................................... 25
3.3. Sntesis de copolmeros entrecruzados quitosano-AMPS .............................. 28
3.4. Mecanismo de Copolimerizacin de Injerto ................................................... 30
3.5. Porcentaje de Injerto (%G: Grafting Percentage) .......................................... 31
3.6. ndice de Hinchamiento (SI: Swelling Index) y degradacin ........................ 31

ix

3.8. Peso Molecular Entre Nudos (Mc) .................................................................. 33
3.9. Microscopa Electrnica de Barrido (SEM: Scanning Electron Microscopy) 35
CAPITULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIN ........................................................ 36
4.1. Caracterizacin de los quitosanos .................................................................. 36
4.1.1. Determinacin del grado de desacetilacin (DA: Deacetylation Degree) y
el grado de polimerizacin (DP: Polymerization Degree) .................................... 36
4.1.2. Espectroscopia Infrarroja de Transformada de Fourier ......................... 43
4.1.3. Difraccin de Rayos-X (DRX) ................................................................... 45
4.2. Caracterizacin del cido 2-acrilamido-2-metilpropano sulfnico (AMPS) .. 47
4.3. Mecanismo de la copolimerizacin de injerto ................................................ 51
4.4. Porcentaje de Injerto (%G: Grafting Percentage) .......................................... 55
4.5. ndice de Hinchamiento (SI: Swelling Index) ................................................ 59
4.6. Degradacin .................................................................................................... 62
4.7. Porosidad ......................................................................................................... 63
4.8. Peso molecular entre nudos (Mc) ................................................................... 69
CONCLUSIONES ........................................................................................................ 74
RECOMENDACIONES ............................................................................................... 76
REFERENCIAS ........................................................................................................... 77

x

ndice de Tablas

Pgina
Tabla 2.4.1.: Caractersticas de los distintos de tipos de cartlagos: hialino, elstico y
fibroso ............................................................................................................................ 16
Tabla 3.2.1.: Asignacin de los protones a cada pico del espectro RMN
1
H de
quitosanos clorados ...................................................................................................... 26
Tabla 3.3.1: Porcentaje de reactivos en funcin de la cantidad de quitosano ............ 29
Tabla 4.1.1.: Correspondencia de picos en cada espectro: estimacin y experimental
....................................................................................................................................... 42
Tabla 4.1.2.: Grado de desacetilacin y peso molecular de los quitosanos Protasan e
Idebio ............................................................................................................................. 42
Tabla 4.2.1.: Correspondencia de las seales con sus respectivos nodos para la
estimacin y el espectro experimental ......................................................................... 49
Tabla 4.8.1.: Peso molecular entre nudos terico, determinado mediante modelo
viscosimtrico (mtodo 1) y mediante modelo de Peppas y Merrill (mtodo 2) .......... 71
Tabla A.1. Porcentaje de azufre de las muestras de quitosano y sus copolmeros. .... 82
Tabla A.2. Porcentaje de injerto respecto al porcentaje de AMPS, iniciador (PS) y
entrecruzante (TPP) tanto para el quitosano PT como para el ID ............................. 83
Tabla A.3.: ndice de hinchamiento para las muestra de quitosano PT e ID con 10%
de AMPS (3 repeticiones de cada muestra). ................................................................ 84
Tabla A.4.: Porcentaje de prdida en peso para las muestras de quitosano ID y PT
con 10% de AMPS (3 repeticiones de cada muestra) ................................................... 87

xi

Tabla A.7.: Densidad aparente y densidad real para determinadas muestras de
quitosano PT e ID ......................................................................................................... 88
Tabla A.8.: Porosidad aparente en funcin del contenido de TPP y AMPS ................ 89
Tabla A.9.: Promedio y desviacin estndar del grosor de lmina, distancia entre
lminas, dimetro mayor y menor de los poros pequeos ........................................... 91
Tabla A.10.: Mdulo de almacenamiento para las diferentes muestras de quitosano
PT e ID .......................................................................................................................... 92
Tabla A.11.: Masa de la muestra seca despus de hinchar (mo), hinchada (ms) y del
polmero en estado relajado (mr), fraccin volumtrica del polmero hinchado (v2.s) y
en estado relajado (v2,r) ................................................................................................. 94
Tabla A.12.: Peso molecular entre nudos terico y determinado mediante los
mtodos 1 y 2, para muestras de quitosano ID y PT ................................................... 96
Tabla A.13.: Peso molecular entre nudos terico y determinado mediante el mtodo 2
en funcin del porcentaje de entrecruzante (TPP) e iniciador (PS) ............................ 97

xii

ndice de Figuras

Pgina
Figura 2.1.1.: Unidades repetitivas de quitina y quitosano .......................................... 7
Figura 2.3.1.: Representacin esquemtica de la copolimerizacin alternante, de
bloque y de injerto. ........................................................................................................ 11
Figura 2.3.2.: Unidad repetitiva de heparina y poli(AMPS) ....................................... 13
Figura 2.5.1.: Representacin esquemtica de la microestructura de un gel
polimrico: polmero ideal entrecruzado por final de cadena; gel entrecruzado por
final de cadena con cadenas colgantes y loops; polmero entrecruzado aleatoriamente
15
. .................................................................................................................................... 18
Figura 2.6.1.: Representacin del proceso de implantacin de una construccin
celular ............................................................................................................................ 21
Figura 3.1.1: Estructura qumica del tripolifosfto de sodio ...................................... 24
Figura 3.2.1.: Tpico espectro RMN
1
H de un quitosano clorado con un porcentaje de
desacetilacin de 85% ................................................................................................... 26
Figura 3.3.1.: Montaje realizado para la sntesis de los copolmeros entrecruzados . 30
Figura 4.1.1.: Espectro RMN
1
H de la solucin preparada a partir de quitosano PT
(Protasan) ...................................................................................................................... 37
1
H de la solucin preparada a partir del quitosano ID
(Idebio). .......................................................................................................................... 38
Figura 4.1.3.: Reaccin de Quitosano con cido Nitroso resultando como producto
Quitosa (1) ..................................................................................................................... 39
Figura 4.1.4.: Estimacin del espectro RMN
1
H del quitosano incluyendo las
correspondencias de cada pico con cada protn ........................................................... 40
1
H de la quitosa incluyendo las
correspondencias con cada protn ................................................................................ 41

xiii

Figura 4.1.7.: Patrones DRX del quitosano PT e ID .................................................... 45
Figura 4.1.8.: Patrones DRX de quitosano de PT, cangrejo de china (quitosano CCC),
ID y quitina purificada ................................................................................................. 46
Figura 4.2.1.: Espectro FTIR del AMPS ...................................................................... 47
1
H experimental del AMPS .......................................... 48
1
H del AMPS ........................................ 49
Figura 4.2.4.: Espectros FTIR del quitosano PT, AMPS y muestra SN4.01 (Menor
contenido de AMPS con mayor contenido de TPP) ...................................................... 50
Figura 4.2.5.: Espectros FTIR del quitosano ID, AMPS y muestra SN4.1 (Menor
contenido de AMPS y mayor contenido de TPP).......................................................... 51
Figura 4.3.1.: Representacin esquemtica de los mecanismos de copolimerizacin de
injerto del quitosano y el AMPS, empleando como iniciador Persulfato de Sodio (PS)
....................................................................................................................................... 52
Figura 4.3.2.: Estimacin del espectro RMN H
1
del quitosano copolimerizado con
AMPS con la unin del mismo mediante una apertura de anillo ............................... 53
Figura 4.3.3.: Estimacin de espectro RMN H
1
AMPS con la unin del mismo a travs de grupos amino ........................................... 54
Figura 4.3.4.: Espectro RMN H
1
experimental la muestra copolimerizada SN11.01
sin entrecruzante .......................................................................................................... 55
Figura 4.4.1.: Porcentaje de injerto en funcin del porcentaje de AMPS, porcentaje
de iniciador y porcentaje de entrecruzante tanto para el quitosano Idebio como para
el Protasan .................................................................................................................... 56
Figura 4.4.2.: Mapeo del elemento azufre en las muestras de quitosano Protasan e
Idebio con 10%, 20% y 30% de AMPS respectivamente .............................................. 58
Figura 4.4.3.: Mapeo del elemento fsforo de las muestras de quitosano Idebio con
10% de AMPS. ............................................................................................................... 59
Figura 4.5.1.: Curvas de hinchamiento para los el quitosano Protasan e Idebio
muestras con 10,20 y 30% de AMPS a pH 7,5 y 30% de AMPS a pH 4,0 ................... 60

xiv

Figura 4.5.2.: Esquema de protonacin del grupo amino del quitosano ..................... 61
Figura 4.6.1.: Prdida en peso de las muestras de con 10%, 20% y 30% de AMPS de
quitosano PT e ID ......................................................................................................... 62
Figura 4.7.1.: Valores de la porosidad aparente de acuerdo a la cantidad de AMPS y
TPP para los quitosanos PT e ID ................................................................................. 64
Figura 4.7.2.: Microfotografa de quitosano PT con 10% y 30% de AMPS, a 30X de
magnificacin ................................................................................................................ 65
Figura 4.7.3.: Fotomicrografa de las muestras con 10% de AMPS de quitosano PT y
quitosano ID, a 30X de magnificacin .......................................................................... 66
Figura 4.7.4.: Representacin esquemtica del arreglo estructural del quitosano en
un plano ......................................................................................................................... 67
Figura 4.7.5.: Representacin esquemtica del apilamiento de planos de quitosano.
....................................................................................................................................... 67
Figura 4.7.6.: Fotomicrografas de superficie radial y seccin transversal de la
muestra con 30% de AMPS de quitosano ID a 30x y 100x de magnificacin ............. 68
Figura 4.7.7.: Fotomicrografas de poros grandes y poros pequeos de muestras con
10% y 30% de AMPS de quitosano ID, a 100X de magnificacin ................................ 69
Figura 4.8.1.: DSC para el quitosano PT (muestra SN 11.01) y para el quitosano ID
(muestra SN11.1) .......................................................................................................... 70
Figura 4.8.2.: Peso molecular entre nudos (Mc) en funcin del porcentaje TPP e
iniciador ......................................................................................................................... 72
Figura A.1.: Medicin del grosor y el distanciamiento de las lminas de la muestra
SN1.1 con una magnificacin de X30. Todas las medidas en centmetros ................. 89
Figura A.2.: Medicin del dimetro mayor y menor de los poros grandes y pequeos
de las muestras SN1.1, SN5.1 y SN11.1. Todas las medidas en micrmetros ........... 90
Figura A.3.: Anlisis de las curvas termogravimtricas para la muestra SN1.01
hinchada y seca ............................................................................................................. 93

xv

Lista de Smbolos

NaOH Hidrxido de sodio.
Forma cristalina de la quitina y el quitosano, cadenas orientadas
paralelamente.
Forma cristalina de la quitina y el quitosano, cadenas orientadas
antiparalelamente.
Forma cristalina de la quitina y el quitosano, por cada cadena orientada
hacia abajo hay dos orientadas hacia arriba.
C Grados centgrados.
MC Peso molecular entre nudos.
G Mdulo de almacenamiento.
Tamao de malla o longitud de correlacin.
m Micrmetros.
g Gramos.
mol Moles.
mg Miligramos.
mL Mililitros.
D2O Agua deuterada.
L Microlitros.
M Molar.
DCl Deuterio cloruro.
NaNO2 Nitrito de sodio.
NaOD Hidrxido de sodio deuterado.
K1 Pico del espectro RMN
1
H de protn 1 de la quitosa.
H1D Pico del espectro RMN
1
H de protn 1 de las unidades GlcN.

xvi

H1A Pico del espectro RMN
1
H de protn 1 de las unidades GlcNAc.
K3 Pico del espectro RMN
1
H de protn 3 de la quitosa.
HDO Seal del solvente en el espectro RMN
1
H.
H2D Pico del espectro RMN
1
H de protn 2 de las unidades GlcN.
HAc Pico del espectro RMN
1
H de protn 3 del acetil de las unidades
GlcNAc.
NH2 Grupo amino.
Da Dalton.
%G Graft Percentage: Porcentaje de injerto.
%S Porcentaje de azufre.
mti Masa del polmero a cada determinado tiempo i de hinchamiento o
degradacin.
mt0 Masa inicial del polmero.
mh Masa del polmero hinchada a 7 das.
aparente Densidad aparente.
real Densidad real.
etanol Densidad del etanol.
Wa Peso de la muestra en aire.
Wfl Peso de la muestra en etanol.
Mr Peso molecular de la unidad repetitiva.
XTTP Fraccin molar del entrecruzante.
mm Milmetros.
cm Centmetros.
f Funcionalidad del entrecruzante.
R Constante universal de los gases ideales.
T Temperatura.

xvii

v2,s Fraccin volumtrica de polmero hinchado.
v2,r Fraccin volumtrica del polmero en estado relajado.
Pa Pascal.
K Grados absolutos Kelvin.
dis Densidad del disolvente.
ms Masa del polmero hinchado.
mr Masa del polmero en estado relajado.
mo Masa del polmero seco despus de hinchado.
v Volumen especfico del PBS.
cm
3
Centmetros cbicos.
V1 Volumen molar del PBS.
Parmetro de interaccin polmero-solvente de Flory-Huggins.
kV Kilovoltios.
ngulo de difraccin.
Grados.
S Azufre.
O Oxgeno.
N Nitrgeno.
H Hidrgeno.
C Carbono.
P Fsforo.
ppm Partes por milln.
s Segundos.
NH3
+
Grupos amino protonados.
min Mintos.

xviii

rad Radianes.

xix

Lista de Abreviaturas

AMPS cido 2-acrilamido-2-metilpropano sulfnico.
CSIC Consejo Superior de Investigaciones Cientficas.
JAE Junta para Ampliacin de Estudios e Investigaciones Cientficas.
ICTP Instituto de Ciencia y Tecnologa de Polmeros.
HEMPOL Grupo de Qumica Fsica de Materiales Polimricos Heterogneos.
FUPOL Grupo de Funcionalizacin de Polmeros.
FQMM Grupo de Fsico-Qumica y Modelizacin de Macromolculas.
GlcN Unidades desacetiladas de la cadena de quitina o quitosano.
GlcNAc Unidades acetiladas de la cadena de quitina o quitosano.
MEC Matriz extracelular.
GAGs Glicosaminoglicanos.
3D tres dimensiones.
PGA Poli-cido gliclico.
PLA Poli-cido lctico.
PLAGA Poli-cido gliclico/Poli-cido lctico.
CAD Computer Assisted Design: Diseo computacional asistido.
PT Protasan.
ID Idebio.
PS Persulfato de sodio.
TPP Tripolifosfto de sodio.
TEMED N, N, N 1, N-1-tetrametiletilendiamina.
PBS Phosphate Saline Buffer: Bufer de solucin salina de fosfato.
ASTM American Society for Testing and Materials: Sociedad Americana para
Ensayos y Materiales.

xx

DA Deacetylation Degree: Grado de desacetilacin.
DP Polymerization Degree: Grado de polimerizacin.
1
H NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Espectrocopa de
Resonancia Magntica Nuclear de Protn (RMN
1
H).
FTIR Fourier Transform Infrared Spectroscopy: Espectroscopa Infrarroja con
Transformada de Fourier.
DRX Difraccin de rayos-X.
DSC Differential Scanning Calorimetry: Calorimetra Diferencial de Barrido.
SEM Scanning Electron Microscopy: Microscopa Electrnica de Barrido.
EDS Energy Disperse X-Ray Spectroscopy: Espectroscopia de fluorescencia
de rayos-X de energa dispersa.
NH2 Grupos amino del quitosano.
Mu Muestra.
%P Porcentaje de prdida en peso.

1

INTRODUCCIN

El mal funcionamiento de tejidos y rganos en el cuerpo humano es uno de los
problemas ms frecuentes y devastadores en medicina. Las tcnicas teraputicas
actuales han logrado mejorar la calidad de vida pero estas se encuentran asociadas a
claras limitaciones incluida la disponibilidad del donador, infecciones, pobre
integracin y un potencial rechazo del implante. La medicina regenerativa ha
desarrollado terapias que ayudan a superar estas limitaciones y a encontrar
revolucionarias y poderosas terapias para el tratamiento de enfermedades de
tejidos, con la idea bsica de reparar o recrear tejidos u rganos con el propsito de
restaurar sus funciones. La manera mediante la cual se ha logrado esto es a travs
de la sntesis de emulsiones polimricas de hidrogeles que una vez formados se
pueden secar y obtener andamios porosos donde se pueden cultivar clulas, todo este
sistema se implanta en el cuerpo. Las clulas en el cultivo se adhieren, proliferan y
forman tejido al mismo tiempo que el andamio se degrada y es reabsorbido por el
cuerpo.
El diseo de estos andamios es un proceso complejo, debido a que todo el conjunto
debe ser biocompatible, bioabsorbible y poseer propiedades mecnicas similares a las
del tejido que va a reemplazar. Estas propiedades se obtienen mediante la adecuada
seleccin de los materiales de partida, as como de los mtodos de produccin.
La quitina es el polmero natural ms abundante en el planeta despus de la
celulosa, se encuentra en la concha de los camarones, en algunas algas e insectos. La
quitina se extrae de la concha del camarn mediante procesos de desmineralizacin.
El quitosano se obtiene a travs de la quitina por un mtodo de desacetilacin,
debido a que la quitina por si sola es insoluble, difcil de manipular y no es activa
biolgicamente. El quitosano posee un grado de cristalinidad, de desacetilacin y
como todo polmero un grado de polimerizacin que dictamina el comportamiento del
mismo. Ahora bien, el quitosano se emplea como cadena principal en
2

copolimerizaciones de injerto, aunque existen diferentes injertos uno de los ms
usados es el cido 2-acrilamido-2-metilpropano sulfnico (AMPS) que posee un grupo
inico que cuelga de la cadena principal. Debido a su mimetismo con la heparina el
AMPS inhibe la coagulacin lo que lo convierte en el componente complementario
para el quitosano ya que este no es hemocompatible, es decir, desencadena la
coagulacin por lo que por s solo no puede estar en contacto con la sangre. Adems
de copolimerizarse el conjunto quitosano-AMPS se entrecruza para obtener el
hidrogel, la cantidad de entrecruzante determinar el comportamiento en estado
hinchado de dicho gel, esto incluye el tamao de malla y su desempeo mecnico,
por lo tanto se debe tener especial cuidado en ello. El comportamiento mecnico de
los geles estar controlado en un alto grado por la microestructura de la red
polimrica. Por lo que la modificacin del porcentaje de entrecruzante e injerto,
modificar en cierto grado dicho comportamiento, la determinacin de estos
parmetros es entonces primordial en la sntesis de copolmeros. Del mismo modo la
porosidad de los andamios juega un rol fundamental en el comportamiento en estado
hinchado lo que, como se mencion con anterioridad, se traduce en comportamiento
mecnico.
Por otra parte, el cartlago es un tejido conectivo que est formado principalmente
por una matriz extracelular de colgeno y protenas que le confieren la resistencia
mecnica necesaria para soportar presiones altas (en cartlago articular: rodillas,
codos, muecas, etc.). Embebido en esta matriz se encuentran los condrocitos y los
condroblastos, estas son clulas capaces de crear y destruir el tejido cartilaginoso
respectivamente. Es posible realizar cultivos de condrocitos y condroblastos en
andamios porosos de quitosano con la finalidad de regenerar tejido cartilaginoso. El
objetivo de esta investigacin es por tanto, la preparacin de un andamio
tridimensional bioactivo que permita la regeneracin de cartlago sin la necesidad de
inducir nuevas lesiones en el organismo. As se pretende preparar copolmeros de
quitosano-AMPS y luego preparar andamios porosos con estos.

CAPTULO I
DESCRIPCIN DEL INSTITUTO

Considerado como el mayor instituto de investigacin cientfica en Espaa y el
tercero en Europa, la Agencia Estatal Consejo Superior de Investigaciones
Cientficas (CSIC), adjuntada al Ministerio de Economa y Competitividad de
Espaa, tiene como objetivo principal desarrollar y promover investigaciones en
beneficio del progreso cientfico y tecnolgico, por tanto est a disposicin para la
colaboracin con otras entidades tanto extranjeras como espaolas
1
.
1.1. Sobre la Agencia Estatal Consejo Superior de Investigaciones Cientficas
En 1907 es creada por Amalio Gimeno, ministro de Instruccin Pblica y Bellas
Artes, la Junta para Ampliacin de Estudios e Investigaciones Cientficas (JAE) lo
que por medio de ciertas reformas y cambios se convertira en 1939 en el Consejo
Superior de Investigaciones Cientficas. El CSIC cumple un rol primordial en la
poltica tecnolgica y cientfica de Espaa, debido a que comprende tanto la
investigacin bsica como la divulgacin al sector productivo. Adems abarca todos
los mbitos del conocimiento
1
:
Humanidades y Ciencias Sociales.
Biologa y Biomedicina.
Recursos Naturales.
Ciencias Agrarias.
Ciencia y Tecnologas Fsicas
Ciencia y Tecnologa de Materiales.
Ciencia y Tecnologa de Alimentos.
Ciencia y Tecnologas Qumicas
1
.
4

El presidente actual del CSIC es el doctor en Ciencias Fsicas Emilio Lora-Tamayo
DOcn, quien ha dirigido el Instituto desde enero de 2012
1
.
Las funciones principales del CSIC son las siguientes:
Investigacin cientfica y tcnica de carcter multidisciplinario.
Asesoramiento cientfico y tcnico.
Transferencia de resultados al sector empresarial.
Contribucin a la creacin de empresas de base tecnolgica.
Formacin de personal especializado.
Gestin de infraestructura y grandes instalaciones.
Fomento de la cultura de la Ciencia.
Representacin cientfica de Espaa en el mbito internacional
1
.
Los investigadores del CSIC han elaborado una gran red de relaciones
internacionales de la misma forma que como entidad ha mantenido relaciones
institucionales con entes y organismos de investigacin en casi todo el mundo, con
excepcin de frica donde slo mantienen relaciones con dos pases. Forman parte
del Espacio Europeo de Investigacin
1
.
El CSIC est formado por diversos institutos y centros, mixtos y propios que se
encuentran emplazados por toda Espaa. Dentro de estos institutos se encuentra el
Instituto de Ciencia y Tecnologa de Polmeros (ICTP)
1
.
1.2. Sobre el Instituto de Ciencia y Tecnologa de Polmeros
El Instituto de Ciencia y Tecnologa de Polmeros (ICTP) es un organismo pblico
de investigacin. Se encuentra localizado en el Centro de Qumica Orgnica Manuel
Lora-Tamao en Madrid. El ICTP tiene como principal objetivo realizar
investigacin en polmeros para el avance cientfico y tecnolgico en estos materiales
2
.
Un incremento en los aos 1945-47 en la utilizacin de los plsticos en Espaa y
con la visin de impulso en dicho sector obligaron al CSIC a la creacin de una
5

Seccin de Plsticos en 1947. Posteriormente en el ao 1952 se constituye como
Departamento y para 1967 es llamado Instituto de Plsticos y Caucho, tomando
como emplazamiento la sede actual. Es entonces en 1987 cuando finalmente es
nombrado Instituto de Ciencia y Tecnologa de Polmeros. Siendo su director en la
actualidad el Dr. Daniel Lpez Garca
2
.
El ICTP posee mltiples departamentos entre ellos:
Departamento de Fsica de Polmeros, Elastmeros y Aplicaciones
Energticas: con los grupos de Aplicaciones Energticas, Elastmeros y Fsica
de Polmeros.
Departamento de Nanomateriales Polimricos y Biomateriales: con los grupos
de Biomateriales y Nanomateriales Polimricos.
Departamento de Fsica de Polmeros: con los grupos Sistemas Polimricos
Nanoestructurados y Multicomponentes, Qumica-Fsica de Materiales
Polimricos Heterogneos (HEMPOL) y Nanohbridos y Polmeros
Interactivos.
Departamento de Qumica Macromolecular Aplicada: con los grupos de
Fotoqumica de Polmeros, Funcionalizacin de Polmeros (FUPOL) y
Policondensacin y Membranas Polimricas.
Departamento de Qumica y Propiedades de Materiales Polimricos: con los
grupos de Ingeniera Macromolecular, Ingeniera de Polmeros y Fisico-
Qumica y Modelizacin de Macromolculas (FQMM)
2
.
Esta investigacin fue realizada particularmente en el grupo de Biomateriales del
departamento de Nanomateriales Polimricos y Biomateriales.
1.3. Sobre el grupo de Biomateriales
El grupo de Biomateriales del ICTP, con 15 aos de antigedad, est centrado en la
creacin y perfeccionamiento de dispositivos biomdicos y bioactivos que otorguen
una contribucin positiva al estado de salud de pacientes, del mismo modo se enfoca
en la preparacin y diseo de sistemas polimricos con una accin teraputica
6

especfica. Dicha actividad es nombrada como Terapia con Polmeros y est
contemplada como uno de las corrientes ms modernas del desarrollo de la
nanomedicina
3
.
El trabajo del grupo es diverso, dirigido por el Dr. Julio San Romn, han abarcado
reas como: la liberacin controlada de frmacos, en el rea vascular con stents
coronarios, dispositivos para oftalmologa, membranas para regeneracin de tejido,
entre otros. Adems de obtener numerosas publicaciones en importantsimas
revistas cientficas, muchos de los dispositivos desarrollados han obtenido patentes y
han sido llevadas al mercado
3
.

CAPTULO II
MARCO TERICO

2.1. Quitina y Quitosano
La quitina es un elemento abundante en el exoesqueleto de los artrpodos, estos
son: crustceos, arcnidos, insectos, entre otros. Tambin se encuentra presente en
algunos hongos y algas, esto hace que la quitina despus de la celulosa sea la
sustancia orgnica ms abundante del planeta. La quitina es un polisacrido
conformado por un alto porcentaje de poli[-(1-4)-2-acetamida-2-desoxi-D-
glucopiranosa] (en adelante GlcNAc) y con un muy bajo porcentaje de poli[-(1-4)-2-
amino-2-desoxi-D-glucopiranosa] (en adelante GlcN) es denominado quitosano (Ver
figura 2.1.1)
4
.

Figura 2.1.1.: Unidades repetitivas de quitina y quitosano
4
.

Aunque la quitina posee propiedades de inters biolgico, debido a su insolubilidad
y, por ser inerte, adems de biolgicamente inactiva, es un biopolmero difcil de
manipular. Aunque, si bien la quitina no es citotxica, es decir, no es daina para
8

las clulas, no presenta interaccin con estas debido a que no est desacetilada. Por
tal razn, la quitina es sometida a un proceso del que se hablara a continuacin, con
la finalidad de desacetilar la mayor cantidad de unidades repetitivas posibles. Por
acuerdo tcito se considera quitosano si al menos el 50% del polmero se encuentra
desacetilado
4
.
El proceso mediante el cual se extrae la quitina de la fuente ms comn, es decir,
del exoesqueleto de los camarones, es a travs de un proceso de desmineralizacin
con cido clorhdrico y desproteinizacin con hidrxido de sodio. Se obtiene la quitina
y entonces pueda ser desacetilada al ser sometida a temperaturas superiores a 60C
en un medio alcalino muy concentrado. ste medio puede ser una solucin alcohlica
o acuosa de NaOH. Si se desea evitar la depolimerizacin de la quitina y la
generacin de especies reactivas se debe tener cuidado de proteger la reaccin del
oxgeno purgando con nitrgeno o aadiendo borohidrato de sodio.
4,5

2.2. Propiedades del quitosano
Biocompatibles: Se conoce que ambos, tanto la quitina como el quitosano, son
materiales altamente biocompatibles, debido a que provienen de fuentes
naturales y poseen baja toxicidad. Sin embargo, el efecto que causan
depender del material de partida y de los mtodos con los que se haya
obtenido dicho quitosano. Por ejemplo, es conocido que generalmente el
quitosano puede mantener clulas vivas e incluso funcionar como soporte de
ciertos tejidos. Pero dependiendo de su arreglo microestructural esta funcin
ser optima o no. Del mismo modo se sabe que el quitosano es citocompatible,
esto significa que las clulas o alguno de sus componentes poseen afinidad
hacia el mismo, de forma tal que las clulas al contacto con el quitosano
rpidamente se adhieren y pueden proliferar de manera apropiada. Esta
capacidad se encuentra asociada a la naturaleza catinica del quitosano, es
por ello que la quitina es menormente usada, ya que mientras mayor sea el
grado de desacetilacin mayor es la densidad de carga. Y como se mencion
con anterioridad la quitina posee 50% o un menor porcentaje de desacetilacin
9

por lo que posee una densidad de carga menor y una citocompatibilidad
reducida
4
.
Biodegradables: Esta propiedad es atractiva debido a que el quitosano puede
emplearse en aplicaciones biomdicas. Es conocido que la degradacin del
mismo es enzimtica, especficamente por la enzima lisozima. Esta enzima
hidroltica se encuentra en el mucus nasal, lgrimas y saliva, entre otros
lugares. El quitosano es degradado por sta enzima mediante hidrolisis del
mismo. Los productos de esta hidrlisis son oligosacridos que no son dainos
para el cuerpo humano y que son degradados fcilmente por enzimas. La
aplicacin especfica depende en sumo grado de la velocidad de degradacin
por lo que es un factor trascendente al momento de disear el biopolmero. Es
conocido que la quitina altamente desacetilada no es reconocida por la enzima
lizosima y por lo tanto se degrada lentamente, el quitosano parcialmente
desacetilado se degrada ms rpidamente. La biodegradabilidad est
ntimamente relacionada con la biocompatibilidad, debido a que la una alta
velocidad de degradacin puede ocasionar una respuesta inflamatoria severa
4
.
Hipocolesterolmicas: Debido a que interacciona con los lpidos impidiendo su
absorcin en el intestino, consumir quitosano ayuda a mantener un nivel bajo
de colesterol. De esta forma evita que crezcan placas arteriosclerticas o
ateromas, estos es la acumulacin de lpidos en las paredes de las arterias
4
.
Mucoadhesivas: El quitosano interacciona con la mucosidad estomacal, por lo
que puede emplearse para el transporte de frmacos, protenas, entre otras
molculas por medio de la mucosa. Una vez ingerido y debido a que es
susceptible a las variaciones intestinales, se disuelve en el pH cido del
estmago y tambin puede ser degradado por enzimas del colon, es usado para
liberacin de compuestos activos en colon, estmago u otras mucosas
4
.
Hemocompatibles: El quitosano y la quitina no son hemocompatibles. Esto es,
no pueden ser empleados para prtesis vasculares, es decir, no puede estar en
10

contacto directo con la sangre. La razn es que ambos desencadena el sistema
de complemento y el sistema de coagulacin, debido a que pueden absorber
protenas. El sistema de complemento es parte del sistema inmune y consiste
en una defensa contra los microorganismos que invaden el cuerpo, por otra
parte el sistema de coagulacin se encarga de dar una respuesta para evitar la
prdida de sangre cuando se origina una herida, as como de repararla. Tanto
el quitosano como la quitina al entrar en contacto con la sangre rpidamente
produce una repuesta hemosttica, esto significa que origina de inmediato la
coagulacin de la sangre incluso en condiciones anticoagulantes, en caso del
quitosano. Si bien la quitina posee una respuesta plaquetaria ms intensa, el
quitosano produce mayor acumulacin de glbulos rojos por lo que es mejor
coagulante. De esta manera se ha intentado modificar el quitosano o
combinarlo con otros polmeros que sean capaces de rechazar
electrostticamente las protenas y plaquetas que ocasionan la coagulacin,
esto sin afectar las propiedades anteriores
4,6
.
2.2.1. Cristalinidad
La quitina as como el quitosano poseen una estructura cristalina
considerablemente organizada, determinado a partir de los estudios de rayos X. Han
sido evidenciadas tres formas polimrficas , y . Dichas formas se diferencian por
la posicin de las cadenas dentro de las regiones cristalinas. Si bien la forma ms
comn es la -quitina en donde las cadenas se encuentran posicionadas de manera
antiparalela, las otras dos formas se encuentran presentes tambin en menor grado.
La -quitina posee las cadenas en posicin paralela y la -quitina cada dos cadenas
orientada hacia arriba, existe una cadena orientada hacia abajo. Adems de ser la
ms abundante, la forma parece ser la ms estable ya que de forma muy sencilla
se puede convertir a las otras dos formas mediante tratamientos especficos
4
.
2.3. Copolimerizacin de Injerto
Existen mltiples formas de modificar qumicamente el quitosano, tales como:
oligomerizacin, alquilacin, acilacin, cuaternizacin, hidroxialquilacin,
11

carboxialquilacin, tiolacin, sulfatacin, fosforilacin, modificaciones enzimticas y
copolimerizacin de injerto. Pero para efectos de esta investigacin, se explicar con
mayor detalle slo la copolimerizacin de injerto
4
.
Primeramente se debe comprender que un copolmero se produce por la
polimerizacin en cadena de dos monmeros diferentes. Estadsticamente cada
monmero puede organizarse en el espacio de forma diferente, de all que existan
distintos tipos de copolmeros. En los copolmeros al azar, cada monmero est
posicionado de forma aleatoria a lo largo de la cadena principal, mientras que en los
copolmeros alternantes a un monmero le sigue el otro y as sucesivamente. Para
los copolmeros de bloque, un grupo (bloque) del mismo monmero es sucedido por
un bloque o grupo del otro monmero a lo largo de la cadena principal. Por ltimo los
copolmeros de injerto estn conformados por un monmero en la cadena principal
mientras que el otro monmero parte de la cadena principal en ramificaciones
regulares (ver Figura 2.3.1)
7
.
La copolimerizacin de injerto resulta atractiva para la modificacin de las
propiedades tanto fsicas como qumicas de la quitina y en especial del quitosano, de
forma tal que se le puedan dar muchas ms aplicaciones. Las propiedades de este
copolmero dependern de las caractersticas de las cadenas, incluyendo el peso
molecular, el largo de las mimas y la cantidad
7
.

Figura 2.3.1.: Representacin esquemtica de la copolimerizacin alternante, de
bloque y de injerto.
12

Ahora bien, la iniciacin de esta copolimerizacin puede suceder mediante
mltiples mtodos. Entre estos se encuentra el uso de iones cerio, estos llevan a cabo
un mecanismo de apertura de anillo a 90C formndose un imina-radical que luego
se hidroliza y forma un aldehdo que por accin del medio cido se oxida y se obtiene
un radical acilo que puede iniciar la polimerizacin. En segundo lugar se encuentra
el reactivo de Fenton que emplea una sal acuosa de hierro y perxido de hidrgeno
para formar radicales hidroxilo que posteriormente generan el macroradical.
Tambin se debe mencionar la radiacin gama y por ltimo el uso de compuestos
redox. Este ltimo es el mtodo empleado en esta investigacin, con un iniciador de
Persulfato de Sodio, que forma un radical libre al extraer un hidrgeno de la cadena
de quitosano creando as el macroradical que posteriormente forman los copolmeros,
mientras que el azufre se reduce y el sodio se oxida. Debido a que el persulfato de
sodio es un compuesto inorgnico y es txico para el organismo, debe ser eliminado
por completo del copolmero si se desea emplear en alguna aplicacin donde debe
estar en contacto con clulas vivas
4,8
.
2.3.1. Copolimerizacin con AMPS
El AMPS es uno de los monmeros que puede ser copolimerizado por injerto va
redox. Siendo un monmero aninico que posee un grupo que es un cido fuerte, un
grupo sulfnico, el AMPS est usualmente ionizado en todo el intervalo de pHs
7
.
Tiene una cantidad bastante amplia de propiedades que lo han hecho atrayente en
el rea mdica. Los derivados del AMPS en determinadas ocasiones se le pueden
atribuir propiedades superabsorbentes, ya que dicho compuesto tiene una muy
buena capacidad de absorcin, por esta razn es ideal para la sntesis de hidrogeles.
Adems de ser un componente biocompatible su propiedad ms notoria es aquella
ligada a lo que le otorga sus grupos inicos, esto es una naturaleza sulfnica, esta le
brinda la particularidad de ser anticoagulante debido a su similitud a la heparina
(ver Figura 2.3.2). La heparina es una molcula que puede provenir de la mucosa
intestinal del cerdo, estas molculas son cadenas de diferentes tamaos de grupos
13

sulfatos y azcares. El efecto de esta en el organismo es potenciar en un factor de
mil la velocidad de asociacin de la glicoprotena encargada de detener la
coagulacin con el factor de coagulacin, el AMPS causa el mismo efecto pero en
menor grado
7,9
.

Figura 2.3.2.: Unidad repetitiva de heparina (derecha) y poli(AMPS) (izquierda)
10,11
.

Como se mencion anteriormente el quitosano desencadena la coagulacin al estar
en contacto con la sangre, es por ello que al combinarlo con el AMPS el cual inhibe la
coagulacin disminuye el efecto no hemocompatible del mismo.
En cuanto a las aplicaciones del AMPS fuera del mbito biomdico se encuentra la
formacin de complejos con polielectrolitos lo que lo hace atractivo como componente
activo en el tratamiento de aguas. Por su estabilidad mecnica, trmica e hidroltica
y su naturaleza hidroflica tambin se emplea en el mbito de ltex, adhesivos y
fibras acrlicas as como tambin en determinadas cremas y aceites para el cuidado
personal
7
.
2.4. Cartlago
Es un tejido de soporte, avascular y articular esqueltico que consiste en clulas en
una matriz extracelular (MEC) que puede estar o no mineralizada dependiendo del
tipo de cartlago. Dicha matriz es firme y slida pero tambin un poco maleable. El
14

cartlago es depositado por clulas productoras de cartlago, como los condroblastos y
condrocitos, y removido por condroclstos. Las clulas cartilaginosas estn
separadas unas de otras por matrices pericelulares y extracelulares y su composicin
es fundamental para la supervivencia de los condrocitos ya que no existe una red
vascular en el tejido. Al contrario de las clulas de los huesos, los condrocitos no
poseen procesos celulares
12,13
.
La MEC hidratada del cartlago vertebral est compuesta principalmente por
glicosaminoglicanos (GAGs), ciertos sulfatos de condroitinas y proteoglicanos. Los
GAGs se encuentran en grandes cantidades dentro de la MEC y facilita la difusin
de sustancias entre los vasos sanguneos del tejido conjuntivo prximo y los
condrocitos que se encuentra dentro de la matriz, de esta forma se puede sustentar
la viabilidad del tejido. Por otra parte los proteoglicanos soportan el peso, sobre todo
en aquellos puntos donde el movimiento es constante, por ejemplo las articulaciones
sinoviales
12,13
.
El colgeno es una protena extracelular que se organiza en forma de fibrillas que
poseen una alta resistencia tensil, por lo que es fundamental en los tejidos
conectivos como lo es el cartlago. Existen 20 tipos de colgeno segn la organizacin
de las 33 cadenas polipeptdicas que poseen los mamferos. En el tejido cartilaginoso
el colgeno mayoritario es colgeno tipo II
14
.
El cartlago resiste presin, tiene un alto contenido de fluido, es un tejido
anaerbico por lo que tiene un consumo de oxgeno bajo. En la etapa embrionaria de
los vertebrados el cartlago posee funciones de tejido endoesqueletico (cartlago
primario). Posteriormente se transforma en cartlago articular y su funcin es como
tejido articular en las uniones de los huesos endocondrales
12
.
Los tipos de tejido cartilaginoso se diferencian segn las caractersticas de la
matriz y son diferentes en lo referente a prestaciones mecnicas y aspecto
13
.
15

Hialino: En este tipo de cartlago las fibras presentes en la MEC son de
colgeno tipo II, tambin la matriz contiene proteoglicanos, GAG y protenas
multiadhesivas
13
.
Elstico: Adems de poseer el material extracelular del cartlago hialino
posee lminas y fibras elsticas
13
.
Fibroso: Posee gran cantidad de fibras de colgeno tipo I as como tambin el
material extracelular del hialino
13
.
En la tabla 2.4.1 se presenta la ubicacin, funcin y algunas otras caractersticas
de cada tipo de cartlago.
El cartlago articular que se encuentra en constante compresin y modificacin del
contenido de agua para soportar las cargas aplicadas progresivamente se desgasta,
los condrocitos reciben seales qumicas y elctricas de la MEC y proceden a formar
cartlago nuevo. Con el transcurso del tiempo tanto la matriz como los condrocitos no
son capaces ni de enviar ni de recibir seales por lo que la produccin de cartlago se
detiene. Por otra parte una vez ocasionada alguna lesin en el cartlago articular,
este no vuelve a crecer. Tambin existe la enfermedad articular denominada artrosis
que consiste en la disminucin de proteoglicanos y de la inhibicin de la produccin
de este y de colgeno tipo II por parte de los condrocitos lo que degenera en un dao
al tejido, esta enfermedad es ms comn en personas de avanzada edad
13
.

16

Tabla 2.4.1.: Caractersticas de los distintos de tipos de cartlagos: hialino, elstico
y fibroso
13
.
Caracterstica Cartlago hialino Cartlago elstico Cartlago fibroso

Ubicacin
Tejido esqueltico fetal, discos
epifisarios, superficie
articular, cartlagos costales,
cartlagos de las cavidades
nasales, laringe, anillos
traqueales, placas
cartilaginosas bronquiales
Pabelln auricular, conducto
auditivo externo, algunos
cartlagos larngeos
Discos intervertebrales, discos
articulares (articulaciones
esternoclavicular y
temporomandibular),
meniscos, articulacin de la
mueca, inserciones
tendinosas
Funcin
Resistente a la compresin,
provee amortiguacin,
superficie lisa y de baja
friccin para las
articulaciones, sostn
estructural en el aparato
respiratorio, constituye el
fundamento del desarrollo del
esqueleto fetal, la osificacin
endocondral y el crecimiento
de los huesos largos
Provee sostn flexible
Resiste la deformacin por
fuerzas externas
Tipos
celulares
Condroblastos, condrocitos Condroblastos, condrocitos Condrocitos, fibroblastos
Componentes
tpicos de la
matriz extra
celular
Fibrillas de colgeno de tipo
II, agrecano (proteoglicano
ms importante)
Fibrillas de colgeno de tipo
II y fibras elsticas,
agrecano
Fibras de colgeno de los tipos
I y II, versicano (proteoglicano
secretado por los fibroblastos)
Crecimiento Intersticial y por aposicin; muy limitado en los adultos
Reparacin Capacidad muy limitada; en general forma una cicatriz con generacin de cartlago fibroso

17

2.5. Geles polimricos
Los geles polimricos son redes entrecruzadas de polmeros que se comportan como
slidos viscoelsticos. Debido a que la red polimrica se encuentra entrecruzada, la
red del gel consiste en una cadena polimrica muy larga y ramificada que se
expande a lo largo del mismo. Aunque los geles pueden ser suaves y deformables
tambin pueden mantener su forma como los slidos. Dependiendo de la estructura
fsica de la red polimrica, los geles polimricos se pueden clasificar como fuertes,
dbiles y pseudo geles. Geles polimricos qumicamente entrecruzados son
considerados geles fuertes. Los entrecruzamientos son permanentes y no pueden ser
restituidos si se rompen. Geles dbiles contienen entrecruzamientos que pueden
separarse y restituirse como los geles coloidales
15
.
Las propiedades de los geles polimricos pueden controlarse mediante la
manipulacin de la microestructura del polmero y del lquido que lo rodea, si
hubiera alguno. La resistencia de un gel es generalmente proporcional a la densidad
de entrecruzamientos. Los geles ms rgidos poseen una mayor densidad de
entrecruzamientos. Un gel puede hacerse ms flexible aumentando el espacio entre
los entrecruzamientos o nodos, as como tambin diluyendo el gel en un lquido o
incrementando el peso molecular de la cadena polimrica que conecta los nodos, ste
ltimo es denominado peso molecular entre nudos y existen diferentes modelos
tericos para determinarlo
15
.
Alternativamente, pueden aadirse defectos a la red polimrica. Para un polmero
dado, un polmero ideal entrecruzado por final de cadena es aquel en el que todas las
cadenas polimricas se encuentran conectadas en cada final a un entrecruzante y
todos los entrecruzantes se encuentran enlazados completamente a la red
polimrica, dicho polmero tendr el mayor de los mdulos. Si existe un desbalance
entre el nmero de cadenas polimricas y entrecruzante, entonces los defectos se
introducen en la red como loops y finales de cadena colgantes, esto se traduce en
geles ms flexibles. Los geles formados por proceso aleatorios como irradiacin,
18

formarn redes con muchos defectos (ver Figura 2.5.1). As, para aplicaciones
determinadas, existen mltiples formas de ajustar las propiedades del gel polimrico
para optimizar su desempeo mediante el control de la microestructura del gel y las
condiciones de procesamiento
15
.

Figura 2.5.1.: Representacin esquemtica de la microestructura de un gel
polimrico: a) polmero ideal entrecruzado por final de cadena; b) gel entrecruzado
por final de cadena con cadenas colgantes (verdes) y loops (naranjas); c) polmero
entrecruzado aleatoriamente
15
.

La compleja estructura de los geles polimricos causa una respuesta del gel a
fuerzas externas que vara extensamente dependiendo de la escala de tiempo de la
aplicacin de la fuerza (viscoelstico). En pocas palabras, un gel es un conjunto de
polmeros. En una solucin diluida, las cadenas polimricas tienen un espectro de
tiempos de relajacin que definen que tan rpido un polmero puede relajarse a
partir de una deformacin. Las deformaciones estiran y alinean segmentos de
polmero, reduciendo el nmero de conformaciones posibles y por lo tanto reduce la
entropa del polmero. Para un gel polimrico, el peso molecular efectivo es infinito,
as como el tiempo de relajacin esto significa que la red nunca se relajara por
completo de una deformacin. Pero, al contrario de un slido elstico, los geles
polimricos pueden sufrir rearreglos internos y disipar energa lo que le confiere un
19

carcter viscoelstico. Esto es cierto especialmente para polmeros que poseen un
largo de cadena tal que pueden permitirse enredos moleculares consigo mismo
15
.
2.5.1. Comportamiento en estado hinchado
Debido a que los geles tienen aplicaciones biomdicas, en la mayora de los casos
dichos geles pasaran a estar sumergidos en agua o en fluidos biolgicos. Geles
polimricos hinchados en lquido son denominados hidrogeles. Es importante
mencionar que aparte de poseer comonomeros unidos por enlaces covalentes y
entrecruzamientos tambin pueden poseer puentes de hidrgeno e interacciones de
van der Waals entre las cadenas
16
.
Ahora bien el comportamiento fsico de los hidrogeles depende de su
comportamiento dinmico y en equilibrio en estado hinchado, desde su preparacin
deben de estar en contacto permanente con agua para que la reaccin tenga un buen
rendimiento. Una vez que se extrae el agua de dicho polmero mediante mtodos que
sern explicados ms adelante, ste xerogel (hidrogel ya seco) es colocado en agua o
en lquido biolgico. Entonces, las cadenas macromoleculares interaccionarn con las
molculas del solvente con las que comparten una relativamente buena
compatibilidad termodinmica. Finalmente, la red se expande hasta el estado
solvatado
16
.
La teora de Flory-Huggins puede ser usada para calcular las cantidades
termodinmicas relacionadas a este proceso mixto. Flory fue el creador de la
primera teora del hinchamiento de geles polimricos entrecruzados usando una
distribucin Gaussiana de las cadenas polimricas. Su modelo describe el grado en el
cual una red polimrica se rige por las fuerzas elsticas retractivas de las cadenas
polimricas y la compatibilidad termodinmica de las molculas del polmero y el
solvente. A partir de este modelo Peppas y Merrill desarrollaron un modelo que
considera los volmenes del polmero despus de entrecruzado (estado relajado),
hinchado y seco despus de hinchado, este modelo es al que se le denomina mtodo 2
en esta investigacin. Por otra parte existe otro modelo que considera medidas
20

viscoelsticas para determinar el peso molecular entre nudos, de esta manera se
puede determinar MC a partir de medidas experimentales del mdulo de
almacenamiento G
16
.
2.5.2. Geles sensibles al pH
Uno de los tipos de hidrogeles ms estudiados segn su respuesta fisiolgica, son
aquellos que responden a los cambios de pH. Estos hidrogeles son redes inicas
hinchadas que contienen cidos o bases como grupos colgantes, se debe recordar que
el AMPS posee un grupo cido colgante. En medio acuoso con pH apropiado y fuerza
inica, los grupos colgantes pueden ionizarse desarrollando cargas fijas en el gel.
Todos los materiales inicos exhiben sensibilidad al pH y fuerzas inicas. Las
fuerzas de hinchamiento desarrolladas en este sistema se incrementan con respecto
a los materiales no inicos. Este incremento en las fuerzas de hinchamiento se debe
a la localizacin de las cargas fijas de los grupos colgantes
16
.
2.5.3. Tamao de la malla
El transporte de soluto hacia adentro del hidrogel se asume que es llevado a cabo
primordialmente por las regiones llenas de agua delimitadas por las cadenas
polimricas. El tamao promedio de estos espacios es denominado tamao de malla
o longitud de correlacin (). De esta forma cualquier factor que reduzca este tamao
retardara la difusin de soluto hacia dentro del hidrogel. En general para un
polmero covalentemente entrecruzado, la difusin de soluto decrece con el aumento
de la densidad de entrecruzamientos y el aumento de tamao de soluto. Pero para
hidrogeles inicamente entrecruzados con pequeos cambios de pH el tamao de
malla cambiar significativamente y con esto la difusin
17
.
2.6. Andamios
La medicina regenerativa o ingeniera de tejidos desde sus orgenes ha crecido
rpidamente y ha atrado el inters de muchos cientficos y cirujanos alrededor del
mundo. Actualmente, la medicina regenerativa abarca diferentes estrategias para la
21

creacin de nuevo tejido incluyendo el uso de clonacin, de clulas aisladas, de
estructuras no celulares y de construcciones celulares. Dichas construcciones
consisten en un cultivo in vitro de clulas bajo condiciones de control preciso en un
material tridimensional poroso que acta como un andamio para el crecimiento
celular y la proliferacin. Una vez implantado en el cuerpo humano, el andamio es
eventualmente bioabsorbido y el espacio que ocupa es reemplazado por el nuevo
tejido producido por las clulas (ver Fiugra 2.6.1)
18
.

Figura 2.6.1.: Representacin del proceso de implantacin de una construccin
celular
18
.

Entonces se define como andamio a un soporte, vehculo surtidor o matriz que
facilita la migracin, fijacin y transporte de las clulas o molculas bioactivas
usadas para reemplazar, reparar o regenerar tejidos. Es importante mencionar que
los andamios de ltima generacin intentan ser tan biomimticos como sea posible,
en trminos de desempeo mecnico, morfologa 3D y qumica superficial, y son
diseados de acuerdo a estos lineamientos
18
.
Los andamios funcionales deben por lo menos seguir los siguientes requerimientos:
ser biocompatibles; tener propiedades mecnicas consistentes con las del tejido al
22

que van a reemplazar; ser bioreabsorbibles; degradarse a una velocidad igual a la
formacin del nuevo tejido; tener unas propiedades superficiales para permitir la
adhesin, proliferacin y diferenciacin celular as como para promover formacin de
matriz extracelular; y tener unas propiedades estructurales optimas en trminos de
tamao de poro, porosidad, interconectividad de poros, y permeabilidad de modo que
permitan la eficiente difusin de nutrientes y remuevan los desperdicios. Debido a
este ltimo requerimiento controlar el tamao de malla es fundamental
18
.
Todas estas propiedades dependern fundamentalmente del material empleado
para realizar el andamio y del mtodo de elaboracin, por lo que se debe tener
especial cuidado en estos dos aspectos. Si bien ya es conocido que el mtodo
empleado para sintetizar el hidrogel usado en esta investigacin es mediante
copolimerizacin de injerto con entrecruzante, el producto obtenido es un hidrogel
que se encuentra en solucin, existen diferentes mtodos para secar dicho hidrogel y
obtener el andamio poroso que se requiere
18
.
Usando la misma tecnologa empleada para la industria textil, en los inicios de la
ingeniera de tejidos se realizaban fibras de 10-15 m de polmeros como el PGA
(poli-cido gliclico) y PLA (poli-cido lctico) que conformaban tejidos muy porosos
(ms de 95%). Otra tcnica es la lixiviacin de partculas, en la cual una solucin
polimrica es colocada en un molde que contiene partculas de la dimensin de poro
deseada. Despus de la evaporacin del solvente, las partculas son lixiviadas por
inmersin en agua, se preparaba por este mtodo polmeros como PLA y PLAGA
(PLA/PGA). Una de los ms recientes mtodos de fabricacin es mediante tcnicas
computarizadas que involucran el diseo del modelo del andamio a travs de
sistemas CAD (Computer Assisted Design: Diseo computacional asistido), de esta
forma se obtiene la estructura precisa de cada poro, luego se construye el modelo
mediante impresin aditiva o impresin 3D. Aunque existen otros mtodos el ms
verstil y econmico es la liofilizacin o secado por congelacin, esta consiste en
congelar la solucin polimrica de forma tal que la estructura del lquido quede
fijada. El agua y/o solventes orgnicos subsiguientemente son extrados por
sublimacin, colocando la solucin congelada en vaco, y dejando un polmero con
23

una porosidad usualmente mayor a 90%. Las desventajas de este ltimo mtodo es
que consume tiempo y energa, y puede tardar varios das en secarse por completo
18
.
Los andamios de quitosano, han sido ampliamente investigados para el cultivo de
condrocitos, estos han respondido positivamente produciendo colgeno de tipo II y
glicosaminoglicanos, que como se mencion anteriormente son parte de la matriz
extracelular del cartlago hialino y no slo le otorgan a este las propiedades
mecnicas sino que funciona como receptor y transmisor de impulsos que activan su
regeneracin. De esta forma se ha logrado el crecimiento de tejido cartilaginoso
sobre andamios porosos de quitosano
19
.

CAPTULO III
DISEO EXPERIMENTAL

3.1. Materiales
Quitosanos clorados: Protasan UP CL 2013 (Novamatrix C.A.) e Idebio (Idebio
S.L.). En adelante PT e ID, respectivamente.
cido 2-Acrilamido-2-Metilpropano Sulfnico (Alfa Aesar): Este ser el
copolmero y en adelante se denominar AMPS. (Peso molecular: 207,25 g/mol
y 98% de pureza).
Persulfato de Sodio (Sigma-Aldrich Co): Se emplear como iniciador y se
mencionar como PS. (Peso molecular: 238,1 g/mol y 98% de pureza).
Tripolifosfato de Sodio (Sigma-Aldrich Co): Usado como entrecruzante y
nombrado como TPP. (Peso molecular: 367,864 g/mol y 85% de pureza).

Figura 3.1.1: Estructura qumica del tripolifosfto de sodio
7
.

N,N,N1,N 1-tetrametiletilendiamina (Acros Organics): Cumple la funcin de
acelerador y se abreviar como TEMED. (Peso molecular: 116,2 g/mol y 99%
de pureza).
25

Tapn fosfato salino (Phosphate Saline Buffer): PBS (pH 7,4 y pH 4,0).
3.2. Caracterizacin de los reactivos de partida
En primer lugar se determin el grado de desacetilacin (DA: Deacetylation
Degree) y el grado de polimerizacin (DP: Polymerization Degree) de ambos
quitosanos clorados, mediante la norma ASTM (American Society for Testing and
Materials: Sociedad Americana para Ensayos y Materiales) 2260-03: Determinig
Degree of Deacetylation in Chitosan Salts by Proton Nuclear Magnetic Resonance
(
1
H NMR) Spectroscopy (Determinacin del Grado de Desacetilacin de Sales de
Quitosano mediante Espectroscopia de Resonancia Magntica Nuclear de Protn
(RMN
1
H)).
Siguiendo el procedimiento indicado en dicha norma, se tom 33 mg de cada
quitosano, PT e ID. Posteriormente, cada uno, fueron disueltos en 3,3 mL de agua
deuterada (D2O) agitndose fuertemente hasta su completa disolucin. A
continuacin se aadi 250 L de una solucin 1M de deuterio cloruro (DCl) y se
agit, chequendose si el pH de cada solucin era menor a 2. Se agreg 100 L de
una solucin recin hecha de nitrito de sodio (NaNO2), con una concentracin de 10
mg/mL en D2O. Ambas muestras fueron almacenadas en la oscuridad durante
cuatro horas. Despus de esto empleando unas soluciones de 0,1M y 1M de
deuterxido de sodio (NaOD) se ajust el pH de ambas muestras entre 3,8 y 4,2.
Finalmente se transfiri 0,7 mL de cada muestra a un tubo de RMN
1
H para su
posterior anlisis, mediante un espectrmetro de resonancia magntica nuclear
Bruker Avance 3000. Se debe acotar que para otras sales de quitosano el
procedimiento es diferente, pero a efectos de esta investigacin no son necesarios.
Una vez obtenidos los espectros de cada muestra se obtiene el valor de la integral
(rea bajo la curva) de los siguientes picos
20
:
26

Figura 3.2.1.: Tpico espectro RMN
1
H de un quitosano clorado con un porcentaje de
desacetilacin de 85%
20
.

Los picos asignados por la anterior norma se describen de la siguiente forma:
Tabla 3.2.1.: Asignacin de los protones a cada pico del espectro RMN
1
H de
quitosanos clorados
20
.
Denominacin Protn
K1 1 de la quitosa
H1D 1 de las unidades GlcN
H1A 1 de las unidades GlcNAc
K3 3 de la quitosa
HDO Seal del solvente (D2O)
H2D 2 de las unidades GlcN
HAc 3 del acetil de las unidades GlcNAc
27

Una vez identificados los picos y calculadas sus integrales, se procede a la
determinacin del grado de desacetilacin y de polimerizacin empleando las
ecuaciones:

Ecuacin 3.2.1
20

Ecuacin 3.2.2
20

Donde A y D son:

(
Ecuacin 3.2.3
20

Ecuacin 3.2.4
20

Tambin se emple el software ChemDraw Ultra (Versin 12.0.2.1076) para
realizar las estimaciones de los espectros RMN
1
H con la finalidad de comparar con
los experimentales y contribuir a la diferenciacin de los picos especficos.
En segundo lugar se les realiz a ambos quitosanos Espectroscopia Infrarroja con
Transformada de Fourier (FTIR: Fourier Transform Infrared Spectroscopy)
empleando un espectrofotmetro Perkin-Elmer Spectrum One. Para el anlisis se
us una cantidad pequea de cada muestra de quitosano.
Asimismo se aplic difraccin de rayos-X (DRX) a cada quitosano, empleando un
difractmetro Bruker D8 Advance.
Por otra parte se analiz el AMPS con la finalidad de reflejar en un espectro FTIR
los grupos funcionales que podran existir cuando ste sea introducido a los
quitosanos. Del mismo modo se obtuvo un espectro RMN
1
H y su respectiva
estimacin mediante software.

28

3.3. Sntesis de copolmeros entrecruzados quitosano-AMPS
Para la realizacin de los copolmeros fue necesaria la preparacin de las siguientes
soluciones: una solucin de quitosano con 5 g de quitosano PT en 100 mL agua. Se
debe resaltar que el quitosano ID fue necesario diluirlo en cido actico. Se disolvi
10 g de quitosano ID en 800 mL de una solucin de cido actico (5,72%). Tambin
se prepar una solucin de AMPS con 20 g en 100 mL (1M) de agua. Asimismo una
solucin de PS con 5g en 100 mL de agua. Por ltimo una solucin de TPP de 1% o
5% (peso/volumen) en base a la concentracin de quitosano ms AMPS.
La reaccin se realiz bajo atmsfera de nitrgeno. Para ello se verti en un baln
de dos bocas de 100 mL las respectivas cantidades de quitosano, AMPS, PS, TEMED
y TPP (ver Figura 3.3.1). Primero se coloc el quitosano dejando burbujear nitrgeno
durante cinco minutos, luego se adicion el AMPS y con la ayuda de un agitador
magntico, a continuacin se aadi rpidamente el PS y el TEMED y finalmente el
TPP. Se complet los 100 mL de reaccin con agua ultra pura por lo que el TPP para
el quitosano PT fue disuelto en 100mL, mientras que para el quitosano ID fue
disuelto en 50mL. Los tiempos de reaccin fueron de 2 horas. Se coloc un tapn con
un globo cuya funcin es mantener la atmsfera de nitrgeno dentro del baln
durante toda la reaccin. A continuacin se presentan las concentraciones de los
reactivos de cada muestra.

29

Tabla 3.3.1: Porcentaje de reactivos en funcin de la cantidad de quitosano.
Quitosano AMPS PS/TEMED TPP Nombre Tiempo de
Dilisis
Peso (mg) Porcentaje
0,1
87% 10% 1% 1% SN1.01**
24 horas
82% 10% 1% 6% SN2.01*
85% 10% 2% 1% SN3.01
80% 10% 2% 6% SN4.01
77% 20% 1% 1% SN5.01
72% 20% 1% 6% SN6.01
75% 20% 2% 1% SN7.01
70% 20% 2% 6% SN8.01
67% 30% 1% 1% SN9.01
61% 30% 1% 7% SN10.01
63% 30% 3% 1% SN11.01
57% 30% 3% 7% SN12.01
1,0
87% 10% 1% 1% SN1.1
48 horas
82% 10% 1% 6% SN2.1
84% 10% 2% 1% SN3.1
80% 10% 2% 6% SN4.1
76% 20% 1% 1% SN5.1
72% 20% 1% 6% SN6.1
74% 20% 2% 1% SN7.1
69% 20% 2% 6% SN8.1
66% 30% 1% 1% SN9.1
61% 30% 1% 7% SN10.1
63% 30% 3% 1% SN11.1
58% 30% 3% 7% SN12.1
Quitosano PT
Quitosano ID

30

Figura 3.3.1.: Montaje realizado para la sntesis de los copolmeros entrecruzados.

Una vez finalizada la reaccin se realiz la dilisis de las muestras de hidrogeles
(cada muestra son 100 mL), colocando las mismas en membranas de dilisis
Spectrum Laboratories Inc con un tamao de poro de 3500 Da. Esto a su vez fue
sumergido en 1 litro de agua ultra pura en constante agitacin, las muestras con
0,1% de quitosano (quitosano PT) fueron dializadas por 24 horas mientras que las
muestras con 1% (quitosano ID) de quitosano se dializaron por 48 horas cambiando
el agua a 24 horas. Al finalizar la dilisis se procede a congelar la muestra y
colocarla en un liofilizador TELSTAR LyoQuest, usualmente hasta que se
encontrara totalmente seca, normalmente de 24 a 48 horas. Finalizado el liofilizado
se procedi a pesar cada muestra.
3.4. Mecanismo de Copolimerizacin de Injerto
Como ya se ha mencionado surgen dos mecanismos de copolimerizacin para el
sistema quitosano-AMPS por lo que para dilucidar cul de los dos ocurre realmente,
31

se obtuvieron las estimaciones de los espectros RMN
1
H as como tambin el
espectro experimental.
3.5. Porcentaje de Injerto (%G: Grafting Percentage)
El porcentaje de injerto puede ser determinado mediante el anlisis elemental de
cada muestra. Se emple un analizador elemental de carbono, hidrogeno, nitrgeno
y azufre LECO CHNS-932. As el porcentaje de injerto se puede calcular a partir del
contenido de azufre (%S), de la siguiente forma:

Ecuacin 3.5.1
Luego la fraccin de AMPS es:

Ecuacin 3.5.2
As el porcentaje de AMPS o el porcentaje de injerto es:

Ecuacin 3.5.3

3.6. ndice de Hinchamiento (SI: Swelling Index) y degradacin
Para realizar el hinchamiento de las muestras, se coloc por separado un pequeo
cubo de las siguientes muestras SN2.01, SN2.1 (ambas con 10% AMPS), SN6.01,
SN6.1 (ambas con 20% AMPS), SN10.01 Y SN10.1 (ambas con 30% AMPS), en una
rejilla metlica. Se pes el conjunto, rejilla y muestra, y una a la vez se sumergi en
PBS. Se pesaron a los 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90 y 120 segundos, llevando a cabo
tres repeticiones por cada muestra. Esto se realiz a pH 7,4 y para las muestras con
30% de AMPS a pH 4,0 se realizaron medidas a 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120, 180,
240, 300, 600, 1200, 1800, 3600 y 7200 (dos horas).
Se determina el SI mediante la siguiente ecuacin:
32

Ecuacin 3.6.1
Donde mti es la masa a cada determinado tiempo i y mt0 es la masa inicial.
Para evaluar la degradacin, las muestras permanecieron en las rejillas
sumergidas por siete semanas. Se midi el peso semanalmente. El pH se midi
primeramente a diario para determinar si exista un cambio, cuando el cambio fue
mayor a 0,2 decimales, se reemplaz la solucin de PBS.
La degradacin se midi en funcin del porcentaje de prdida en peso, calculndose
de siguiente forma:

Ecuacin 3.6.2
Donde mh es la masa de la muestra hinchada a los 7 das.
3.7. Porosidad
La porosidad se determina con la siguiente ecuacin:

Ecuacin 3.7.1
21

As que se debi determinar tanto la densidad aparente como la densidad real. La
densidad aparente se determina mediante la medicin de la masa de un trozo de
muestra en el aire (Wa) y luego sumergida en etanol (Wfl). Luego se obtiene la
densidad de la siguiente forma, estos valores fueron obtenidos por una balanza de
cuarzo arrojando el resultado directo de la densidad, se realizaron 4 repeticiones de
cada muestra para obtener as un promedio
21
:
Ecuacin 3.7.2
21

Por otra parte la densidad real se obtiene haciendo uso de un picnmetro
micromeritics AccuPyc 1330, las muestras se insertaron molidas al cubilete del
33

picnmetro. Dicho equipo realiza 10 mediciones sucesivas de la densidad empleando
helio y proporciona un promedio con su respectivo error.
3.8. Peso Molecular Entre Nudos (Mc)
Para determinar el peso molecular entre nudos terico se hizo uso de la siguiente
ecuacin:
Ecuacin 3.8.1
22

Donde Mr es el peso molecular de la unidad repetitiva y XTPP es la fraccin molar de
entrecruzante. Existen mltiples mtodos para determinar experimentalmente
dicho peso molecular. Pero para esta investigacin se emplearon dos principales
modelos. El modelo viscosimtrico y el modelo de Peppas y Merrill.
Para el modelo viscosimtrico (mtodo 1) se hizo uso de un remetro TA
INSTRUMENTS AR G2 con una geometra de plato con estras y trampa de
disolvente de 20 mm de aluminio. Primeramente se determin cual era el intervalo
viscoelstico lineal para as definir una frecuencia que garantizara dicha linealidad.
Se realiz entonces un ensayo a frecuencia constante para obtener el mdulo de
almacenamiento (G) de las muestras SN1.01, SN2.01, SN3.01, SN5.01, SN9.01,
SN10.01, SN11.01, SN1.1, SN2.1, SN3.1, SN5.1, SN9.1, SN10.1 y SN11.1. Las
muestras se cortaron en discos de 20 mm de dimetro aproximadamente y 1 cm de
espesor. Luego fueron sumergidas en PBS (pH 7,4) por 2 minutos. Una vez
hinchadas se colocaron en el remetro. Se hicieron 3 repeticiones de cada muestra.
Se siguieron las siguientes ecuaciones para determinar el peso molecular entre
nudos a partir del mdulo elstico:
Ecuacin 3.8.2
22

En dicha ecuacin f es la funcionalidad del entrecruzante (para el TPP es 5), es la
densidad real de la muestra, R la constante universal de los gases ideales (8314470
cm
3
Pa/molK) y T la temperatura de ensayo (20C=293K) Los valores dev2,s y v2,r se
34

denominan fraccin volumtrica del polmero hinchado y fraccin volumtrica del
polmero en estado relajado respectivamente. Estas fracciones se obtuvieron as:
]
Ecuacin 3.8.3
22

]
Ecuacin 3.8.4
22

Donde real y dis son la densidad real del polmero y la densidad del disolvente
(PBS considerado agua con una densidad de 1 g/cm
3
).Las masas ms, mr y mo son la
masa del polmero hinchado (en PBS), la masa del polmero en estado relajado y la
masa del polmero seco despus de hinchado respectivamente.
Se desea entonces conocer la temperatura a la cual se puede secar el polmero
hinchado de forma tal que no ocurra ningn cambio. De esta forma se realiza un
anlisis de calorimetra diferencial de barrido (DSC: Differential Scanning
Calorimetry) a una muestra con quitosano PT (SN11.01) y otra con quitosano ID
(SN11.1) en un PerkinElmer DSC 8500.
La medicin de las masas se realiz en un analizador termogravimtrico TA
Instruments TGA Q500. Conociendo la temperatura de a la cual se pueden secar las
muestras a partir del DSC, se aplic dicha temperatura (90C) por media hora a una
muestra sin hinchar, el peso final de esta corrida ser el peso mr. Luego se aplic la
misma temperatura por una hora a las muestras previamente hinchadas en PBS
(pH 7,5) por dos minutos, la masa inicial de dicha corrida ser ms y la masa final mo.
Finalmente se calcul el peso molecular entre nudos tambin mediante el modelo
de Peppas y Merrill (mtodo 2), se determina a partir de la siguiente ecuacin:
[(
]
Ecuacin 3.8.5
22

Siendo v el volumen especfico del PBS (considerado agua 1 cm
3
/g) y V1 es el
volumen molar del PBS (considerado agua 18 mol/cm
3
). es el parmetro de
35

interaccin polmero-solvente de Flory-Huggins y se determina de la siguiente
forma:

Ecuacin 3.8.6
22

3.9. Microscopa Electrnica de Barrido (SEM: Scanning Electron Microscopy)
Una pequea porcin de las muestras con 10 (SN1.01 y SN1.1), 20 (SN5.01 y
SN5.1) y 30% (SN11.01 y SN11.1) de AMPS, se tomaron para introducirlo en un
microscopio electrnico de barrido HITACHI SU8000 con un voltaje de aceleracin
de 0,5 kV. Se registraron imgenes a 30X y 100X as como tambin se realiz un
mapeo de fsforo, azufre, nitrgeno y oxgeno. Asimismo se llev a cabo un mapeo de
azufre mediante espectroscopia de fluorescencia de rayos-X de energa dispersa
(EDS: Energy Disperse X-Ray Spectroscopy).

CAPITULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIN

4.1. Caracterizacin de los quitosanos
4.1.1. Determinacin del grado de desacetilacin (DA: Deacetylation Degree)
y el grado de polimerizacin (DP: Polymerization Degree)
A continuacin se presentan los espectros obtenidos mediante Resonancia
Magntica Nuclear de Protn, RMN
1
H (
1
H NMR: Proton Magnetic Resonance
Spectroscopy) de ambos quitosanos empleados para la formulacin de andamios,
preparados segn la norma ASTM 2260-03 (American Society for Testing and
Materials: Sociedad Americana para Ensayos y Materiales) anteriormente
mencionada. Se debe indicar que esta tcnica se basa en las propiedades magnticas
de los protones contenidos en los tomos de hidrgeno, por lo que cada pico
corresponde al protn de un tomo de hidrogeno de alguna de las especies, dicha
tcnica es muy poderosa para determinar la estructura de compuesto orgnicos
23
.
37

1
H de la solucin preparada a partir de quitosano PT
(Protasan).

38

1
H de la solucin preparada a partir del quitosano ID
(Idebio).

Empleando las ecuaciones 3.2.1, 3.2.2, 3.2.3 y 3.2.4, se obtiene tanto el grado de
desacetilacin como el grado de polimerizacin. Se debe dejar claro que segn la
norma, este grado de polimerizacin corresponde a la cantidad de unidades
repetitivas en la cadena. Con el fin de explicar el origen de este valor, es necesario
realizar las estimaciones de RMN
1
H correspondientes a las molculas que, en
principio, deben encontrarse presentes en las soluciones preparadas
20
.
Ahora bien, segn esta norma para una correcta obtencin de los espectros las
cadenas deben poseer mucha movilidad por lo que el quitosano debe tener un bajo
grado de polimerizacin, por lo tanto debe ser depolimerizado, entonces se emplea
cido nitroso en agua deuterada para reducir las cadenas polimricas. Esta reaccin
39

es estequiomtrica con respecto a las unidades desacetiladas (unidades GlcN) y corta
la cadena antes de un monmero desacetilado quedando enlazadas las unidades
acetiladas, transformndose as en 2,5-anhidro-D-manosa (Quitosa), la reaccin
ocurre de la siguiente forma
20
.

Figura 4.1.3.: Reaccin de Quitosano con cido Nitroso resultando como producto
Quitosa (1)
24
.

De esta forma se han predicho los espectros de RMN
1
H tanto para la quitosa como
para el quitosano.
40

1
H del quitosano incluyendo las
correspondencias de cada pico con cada protn.
41

1
H de la quitosa incluyendo las
correspondencias con cada protn.

42

La correspondencia de los picos es la siguiente:
Tabla 4.1.1.: Correspondencia de picos en cada espectro: estimacin y
experimental.

Experimental
(PPM)
Pico Denominacin Estimacin (PPM) PT ID
1 K1 4.69 5.01 5.01
2 H1D 4.00 4.70 4.82
3 H1A 3.79-3.54 4.51 4.49
4 K3 4.51 4.37 4.37
5 HDO (solvente) - 3.83 3.84
6 H2D 2.80 3.09 3.11
7 HAc 1.84 1.99 1.99

Aunque los picos se encuentran ligeramente desplazados fue posible identificar
cada uno de ellos y encontrar la correspondencia con los protones de cada estrucutra.
Finalmente el grado de desacetilacin y el grado de polimerizacin obtenido para
ambos quitosanos (ver clculos en el apndice) es:
Tabla 4.1.2.: Grado de desacetilacin y peso molecular de los quitosanos Protasan e
Idebio.
Quitosano DA (%) PM (g/mol)
PT 82 1005
ID 78 4389

43

Las diferencias entre los picos experimentales y los reales pueden deberse a errores
comunes en perfiles de RMN
1
H como cambios de pH, productos de degradacin, etc
23
.
Un alto grado de desacetilacin le confiere al quitosano mayor hidrofilicidad en
medios cidos. Por lo que mientras mayor sea el grado de desacetilacin el quitosano
ser ms hidrfilo. Ahora bien debido a que, con un mayor grado de desacetilacin se
tendr una mayor cantidad de grupos NH2 (amino) que podrn reaccionar con el
AMPS, se puede predecir que con un DA mayor se obtendr un copolmero con
mayor porcentaje de injerto
4
.
Por otra parte, el grado de polimerizacin est vinculado al peso molecular de cada
quitosano, es decir, a la cantidad de unidades repetitivas en cada cadena. Debido a
que el PT posee un bajo DP se evidencian cadenas muy cortas lo que le confiere a
dicho quitosano una mayor solubilidad en agua, probablemente debido a que es un
oligmero. Seguramente esta sea una de las razones por la que el quitosano PT pudo
ser fcilmente disuelto en agua mientras que el quitosano ID fue necesario disolver
en cido actico de tal forma que pueda ocurrir una mayor protonacin del mismo.
Adems el quitosano PT posee un mayor DA por lo que es ms hidroflico esto
tambin contribuye a la solubilidad en agua
4,25
.
4.1.2. Espectroscopia Infrarroja de Transformada de Fourier
Una vez conocidos sus respectivos grados de desacetilacin, para confirmar la
presencia de las bandas caractersticas de la estructura qumica del quitosano fue
necesario realizar Espectroscopia Infrarroja de Transformada de Fourier (FTIR:
Fourier Transform Infrared Spectroscopy). Los espectros obtenidos se presentan a
continuacin.
44

Figura 4.1.6.: Espectro IR de los quitosanos PT e ID.

Se observa la presencia de las bandas 3253 y 2988 cm
-1
que corresponden al grupo
NH2. Las bandas 2882 y 2902 cm
-1
son asignadas al estiramiento C-H. Asimismo el
estiramiento de los enlaces C=O corresponden a la banda 1626 cm
-1
, del mismo modo
a la banda 1516 cm
-1
se le asigna la torsin de los grupos NH2. Pero estas bandas no
aparecen de forma notable en el espectro del quitosano ID, sin embargo son
consideradas como presentes. Finalmente el estiramiento simtrico de los enlaces C-
O corresponden a las bandas 1065 y 1066 cm
-1

26, 27
.
Todas estas bandas muestran la presencia de los grupos que conforman la
estructura del quitosano.

45

4.1.3. Difraccin de Rayos-X (DRX)
A ambos quitosanos se les realiz difraccin de rayos-x, de tal forma que se pueda
conocer la cristalinidad de cada uno.

Figura 4.1.7.: Patrones DRX del quitosano PT e ID.

Se puede apreciar que en el patrn del quitosano PT ste es mucho menos
cristalino que el quitosano ID. Algunas investigaciones han demostrado que
quitosanos con patrones similares provienen de una fuente diferente (ver Figura
4.1.8). As la quitina (Sigma Chemical Co.) empleada en dicha investigacin fue
purificada mediante cido clorhdrico y tratado con hidrxido de sodio acuoso para
remover las protenas, sta se denomina como quitina purificada, por otra parte el
quitosano comercial, proveniente de China, es denominado CCC
28
.
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0 10 20 30 40 50 60 70
2
Protasan Chitosan
Idebio Chitosan
46

Figura 4.1.8.: Patrones DRX de quitosano de PT, cangrejo de china (quitosano CCC),
ID y quitina purificada.

Se puede notar que el quitosano PT es similar al quitosano CCC por lo que se
presume que provienen de la misma fuente, aunque ste ltimo es menos cristalino
que el Protasan, ambos son quitosanos alfa. Por otra parte el quitosano ID es similar
a la quitina purificada, ambos fueron purificados y se puede suponer que de la
misma forma
28
.
Si bien se desconoce el proceso de preparacin de ambos quitosanos, otras
investigaciones indican que probablemente el proceso de desacetilacin de la quitina
causa la disminucin de la cristalinidad, y existe la posibilidad de que esta sea la
razn por la que el quitosano PT es mucho ms amorfo que el quitosano ID. Se
considera tambin el hecho de que ste ltimo est menos desacetilado, por lo que se
puede sugerir que el mtodo de desacetilacin fue menos agresivo que para el
quitosano PT
28,29
.
47

Al mismo tiempo el pico mximo de cada DRX se encuentra a 22,2 para el PT y
10,0 y 19,8 para el ID, el cual corresponde una estructura cristalina alfa
28
.
Las pruebas de solubilizacin demuestran que el quitosano PT se disuelve
fcilmente, por el contrario el quitosano ID no es fcilmente disuelto en agua. Esto
se debe seguramente al grado de cristalinidad que poseen ambos. Un polmero
amorfo, como es el PT, ser ms fcil de disolver ya que el solvente penetrar en las
zonas amorfas con mayor facilidad. En contraste, el quitosano ID, semicristalino, es
difcil de disolver, esto se debe principalmente al orden y empaquetamiento de los
tomos en la red cristalina que requiere de altas cantidades de energa para ser
disueltos
30,

31
.
4.2. Caracterizacin del cido 2-acrilamido-2-metilpropano sulfnico (AMPS)
De forma tal que se pueda asegurar la estructura qumica del compuesto (ver
Figura 2.3.2) y as asegurar la integracin del mismo con el quitosano se han
obtenido espectros FTIR y RMN
1
H del AMPS. Seguidamente se presenta el espectro
FTIR.

Figura 4.2.1.: Espectro FTIR del AMPS.
48

Las bandas 1372 cm
-1
(estiramiento de los enlaces S=O) y la banda 1027 cm
-1

(estiramiento de los enlaces S-O) correspondientes a cido sulfnico. La banda 2986
cm
-1
corresponde al estiramiento de los enlaces OH del cido sulfnico, as como
tambin las bandas 1667-1612 cm
-1
del estiramiento de los enlaces C=O y la banda
1549 cm
-1
de la flexin de los enlaces N-H. Todas las bandas son consistentes con la
estructura qumica del AMPS
26, 32
.
A continuacin se presentan los espectros RMN
1
H del AMPS tanto la estimacin
como el espectro experimental.

1
H experimental del AMPS.

49

1
H del AMPS.

De esta forma las correspondencias de las seales son las siguientes.
Tabla 4.2.1.: Correspondencia de las seales con sus respectivos nodos para la
estimacin y el espectro experimental.
Pico Estimacin Experimental
1 6,48 5,78
2 6,01 5,34
3 5,50 4,82
4 3,59 3,04
5 1,52 1,13

50

Conociendo esto se puede verificar entonces si el AMPS se est incorporando a la
estructura de los quitosanos. Para ello se hace una comparacin de los espectros
FTIR de las muestras, el quitosano y el AMPS.

Figura 4.2.4.: Espectros FTIR del quitosano PT, AMPS y muestra SN4.01 (Menor
contenido de AMPS con mayor contenido de TPP).
La banda 1027 cm
-1
(estiramiento de los enlaces S-O) corresponde al cido sulfnico
y es aadido al espectro de la muestra a 1036 cm
-1
. Las bandas 2986 y 1667 cm
-1

corresponden al estiramiento y flexin respectivamente, de los enlaces N-H del
grupo amida del AMPS, tambin se encuentra presente en el espectro de la muestra
a 2938 y 1650 cm
-1
respectivamente. Esto demuestra la adicin del AMPS a la
estructura del quitosano. La seal 1212 cm
-1
en el espectro de la muestra
corresponde a un xido de fosfina (P=O) que se puede adjudicar al entrecruzante
26
.
51

Figura 4.2.5.: Espectros FTIR del quitosano ID, AMPS y muestra SN4.1 (Menor
contenido de AMPS y mayor contenido de TPP).

Pueden notarse dos nuevas bandas que aparecen en el espectro del copolmero, la
banda 1543 y 1640 cm
-1
, el cual corresponde a la flexin de los enlaces N-H de la
amida primaria del AMPS. Asimismo el desplazamiento de la banda que
probablemente pertenece al estiramiento de los enlaces S-O, desde 1394 hasta 1407
cm
-1
, sugiere la adicin del AMPS. Si bien no se observa la seal del entrecruzante
se ha demostrado que se encuentra presente mediante otros estudios presentados
26
.
4.3. Mecanismo de la copolimerizacin de injerto
El mecanismo de copolimerizacin de injerto entre el quitosano y el AMPS puede
ocurrir de diferentes formas. Pero dos mecanismos resaltan dentro de la iniciacin
redox. El primero por medio del grupo amino del quitosano y el segundo a travs de
52

la apertura del anillo del mismo (ver Figura 4.3.1). La ltima requiere una mayor
energa y es ms comn que ocurra a partir de 40C. Sin embargo ste mecanismo
fue tomado en consideracin debido a que la temperatura ambiente durante las
reacciones no difera mucho de la mencionada anteriormente. La estructura final
depende del mecanismo que ocurri. As se realiz RMN
1
H a una muestra sin
entrecruzante (TPP: tripolifosfto de sodio) de tal forma que se pudiera dilucidar
cul de los dos mecanismos es el que ocurre realmente, debido a que dicho
compuesto forma enlaces con los grupos aminos del quitosano al igual que el AMPS.
Como se mencion con anterioridad mediante las estimaciones de RMN
1
H se puede
determinar la estructura de la muestra lo que permitira afirmar con seguridad cul
de los mecanismos es vlido para este caso
33
.

Figura 4.3.1.: Representacin esquemtica de los mecanismos de copolimerizacin de
injerto del quitosano y el AMPS, empleando como iniciador Persulfato de Sodio (PS).

53

A continuacin se presenta la estimacin para la estructura resultante de ocurrir
una apertura de anillo.

Figura 4.3.2.: Estimacin del espectro RMN H
1
AMPS con la unin del mismo mediante una apertura de anillo
33
.

Seguidamente se presenta la estimacin para la estructura resultante si ocurre la
unin por grupos amino.
54

Figura 4.3.3.: Estimacin de espectro RMN H
1
AMPS con la unin del mismo a travs de grupos amino
33
.

La diferenciacin radica en la presencia o ausencia de una seal a 5,3 ppm que
representa al protn uno en la estructura del quitosano (ver Figura 4.3.3).
55

Figura 4.3.4.: Espectro RMN H
1
experimental la muestra copolimerizada SN11.01
sin entrecruzante.

Ntese en la figura anterior que la seal aproximadamente a 5,2 ppm (4,9 ppm)
aparece en el espectro por lo que indudablemente el mecanismo que ocurre en la
copolimerizacin del quitosano y el AMPS es a travs de los grupos amino.
4.4. Porcentaje de Injerto (%G: Grafting Percentage)
Conociendo a travs del anlisis elemental de las muestras los porcentajes de
azufre en las mismas el porcentaje de injerto se determin mediante la ecuacin
3.5.3 (ver clculos en el apndice). Se puede graficar dicho parmetro segn el
contenido de AMPS, de iniciador (PS) y de entrecruzante (TPP).
56

Figura 4.4.1.: Porcentaje de injerto en funcin del porcentaje de AMPS (A),
porcentaje de iniciador (B) y porcentaje de entrecruzante (C) tanto para el quitosano
Idebio como para el Protasan.

Si se observa la figura 4.4.1 el quitosano PT generalmente posee un porcentaje de
injerto mayor que el quitosano ID. Como se mencion con anterioridad el quitosano
ID es mucho ms cristalino que el quitosano PT, por lo tanto, ser de ms fcil
acceso para el AMPS aquellas zonas amorfas que consiguientemente sern
mayormente reticuladas. En consecuencia el PT tendr una mayor porcin
reticulada mientras que, por el contrario, el ID tendr menos, lo que se traduce en
una mayor %G para el quitosano PT y un bajo %G para el quitosano ID. Es oportuno
acotar que valores cercanos al 100% de injerto podran estar relacionados a la
homopolimerizacin del AMPS, que puede ocurrir en lugar de la unin de este con el
quitosano, en este caso el AMPS puede formar un homopolmero y permanecer
dentro del gel contabilizndose en el porcentaje de injerto
30,31
.
57

Se puede observar en la figura 4.4.1 A, un incremento en la cantidad de AMPS
naturalmente resulta en un incremento en el porcentaje de injerto para ambos
quitosanos, ms AMPS se incorpora a la estructura del mismo
33
.
Por otra parte en la figura B el incremento de iniciador puede producir muchos
xidos que son productos de la reaccin entre el quitosano y ste, aun cuando la
reaccin se llev a cabo bajo atmosfera de nitrgeno es posible que haya quedado
burbujas de oxgeno atrapado en la solucin. Estos xidos no son capaces de iniciar
la copolimerizacin, as que el AMPS no puede enlazarse al quitosano en la misma
proporcin, probablemente esta sea la razn del descenso en el porcentaje de injerto
para el quitosano Protasan. En adicin al impedimento por los xidos, una vez
alcanzado el mximo de radicales libres en la cadena principal, el iniciador comienza
a surtir efecto en las cadenas secundarias, creando radicales libres en estas y
promoviendo la homopolimerizacin. Sin embargo para el quitosano Idebio se
observa un incremento para porcentajes altos de iniciador esto quiere decir que
efectivamente con el incremento de PS existe una mayor cantidad de radicales en la
cadena del quitosano, dicho efecto puede deberse a la efectiva neutralizacin del
medio, evitando as la presencia de xidos
34,35
.
Finalmente en la figura C el decaimiento inicial para ambos quitosanos (mucho
ms marcado para el quitosano Idebio) puede ser el resultado de la unin de los
grupos amino con el entrecruzante en lugar de los monmeros de AMPS; la cantidad
de TPP puede significar una preferencia por las uniones con ste en vez del AMPS.
El incremento del porcentaje de injerto despus, a altos porcentajes de
entrecruzante puede atribuirse a la bifuncionalidad del mismo. En algunas
ocasiones el TPP puede actuar como iniciador, es decir, tiene la capacidad de crear
radicales libres
33
.
Pero no solo es importante la cantidad de injerto que se introduce al sistema
tambin hay que considerar la distribucin de dicho injerto a lo largo de toda la
muestra. Por esta razn se realiz un mapeo de azufre mediante espectroscopia de
fluorescencia de rayos-X de energa dispersa (EDS: Energy Disperse X-Ray
58

Spectroscopy) (ver Figura 4.4.2), recurdese que el nico compuesto que aporta
azufre al sistema es el AMPS por lo que observando la distribucin de dicho
elemento se puede conocer la distribucin del injerto.

Figura 4.4.2.: Mapeo del elemento azufre en las muestras de quitosano Protasan
(izquierda) e Idebio (derecha) con 10%, 20% y 30% de AMPS respectivamente.
59

Se observa que el azufre, en rojo a la izquierda (PT) y azul a la derecha (ID), se
encuentra distribuido igualitariamente por toda la muestra, no existen
aglomeraciones y evidentemente la cantidad del mismo es mayor en funcin del
aumento de AMPS como se evidencia en la imagen anterior. Del mismo modo se
obtuvo el mapeo del fsforo (en rosado) lo que indicara la distribucin del
entrecruzante (ver Figura 4.4.3).

Figura 4.4.3.: Mapeo del elemento fsforo de las muestras de quitosano Idebio con
10% de AMPS.

Tambin se observa una distribucin homognea a lo largo de toda la imagen, sin
aglomerados ni espacios vacos.
4.5. ndice de Hinchamiento (SI: Swelling Index)
Se presentan las curvas de hinchamiento en tampn fosfato salino (PBS) del
quitosano ID y PT con 10, 20 y 30% de AMPS a pH 7,5. Asimismo se presentan las
curvas de hinchamiento para los mismos quitosanos con 30% de AMPS a pH 4,0.
60

Figura 4.5.1.: Curvas de hinchamiento para los el quitosano Protasan e Idebio
muestras con 10,20 y 30% de AMPS a pH 7,5 y 30% de AMPS a pH 4,0.

Se sabe que el quitosano posee una magnfica capacidad para absorber agua,
debido a su hidrofilicidad. Observando las curvas de cada polmero es obvio que con
el incremento de AMPS, el SI tambin aumenta. Esto se debe a dos factores: primero
que el AMPS es igualmente hidroflico y segundo el AMPS abre la estructura entre
las cadenas principales del quitosano, mayor contenido de injerto significa mayor
incremento en la capacidad de absorber PBS, para ambos quitosanos ocurre el
mismo efecto. El quitosano Idebio tiene un menor porcentaje de injerto en general
por ser ms cristalino (ver Tabla A.2 en el apndice). Los resultados sobre la
cristalinidad expresan que el ID es claramente semicristalino mientras que el
quitosano PT es amorfo, lo que se traduce en mayor facilidad por parte de la
molcula de agua para acceder a este polmero amorfo y producir un gel suelto.
61

Asimismo existen fuerzas inter e intramoleculares entre las cadenas de quitosano,
como puentes de hidrgeno y fuerzas de Van der Waals, que pueden debilitarse e
incluso romperse cuando el polmero se encuentra hinchado causando que el
quitosano ID (~41% el mayor SI) se hinche ms que el quitosano PT (~24% el mayor
SI)
29,36,37,38
.
El pH tiene influencia en el comportamiento de hinchamiento, esto se debe a dos
hechos. Primero a la protonacin de grupos amino como se muestra en la siguiente
figura:

Figura 4.5.2.: Esquema de protonacin del grupo amino del quitosano.

Segundo a las interacciones de ste medio cido con los enlaces inicos del
entrecruzante. Con valores cidos de pH, es decir, menores a 7, la protonacin de
estos grupos crece al acercarse a pHs cercanos a 1. Por tal razn el quitosano PT se
hincha mucho ms a un pH de 4,0 que a uno de 7,5. Adems el quitosano PT se
hincha mucho ms (~49% el mayor SI) que el quitosano ID (~28% el mayor SI). Esto
puede ser causado por tres factores, el quitosano ID tiene una menor cantidad de
grupos amino para ser protonados por poseer un menor DA as como tambin una
mayor cantidad de entrecruzante. El pKa del quitosano es 6,5 y el pKa del AMPS es
1,0. El pKa de un compuesto indica cuan fuerte o dbil es como cido, un gran pKa
significan una pequea constante de disociacin, es decir, un cido dbil o lo que es
lo mismo una base fuerte. Por el contrario un valor ligeramente positivo o muy
negativo de pKa se traduce en una constante de disociacin grande y en un cido
62

fuerte. Lo que significa que a pH 4,0 la mayora de los grupos amino en el quitosano
estn protonados (NH3
+
) y ningn grupo del AMPS puede estar protonado a dicho
pH, luego las fuerzas repulsivas entre las cargas positivas aumenta las distancias
intermoleculares produciendo una mayor capacidad de absorber lquido y por tanto
aumentando el SI. As que mayor contenido de AMPS resulta en mayor capacidad de
absorber agua, esa es la razn por la que el quitosano ID hincha mucho menos
porque posee menor cantidad de AMPS en su estructura. Finalmente tanto la
cantidad de AMPS como el porcentaje de hinchamiento se encuentra relacionado con
la cristalinidad, al encontrarse mucho ms reticulado el quitosano PT que el
quitosano ID como se mencion con anterioridad
39,40,41
.
4.6. Degradacin
Por otra parte se obtuvo la degradacin en PBS a pH7,5 de ambos quitosano hasta
49 das (7 semanas).

Figura 4.6.1.: Prdida en peso de las muestras de con 10%, 20% y 30% de AMPS de
quitosano PT (izquierda) e ID (derecha).

Se puede observar que aunque para ambos polmeros al incrementar el porcentaje
de AMPS la degradacin fue mayor, ninguna de las muestras degrad a un valor
ms alto que el definido por el Documento de Caracterizacin de Riegos publicado en
2009 por la Agencia de Proteccin Ambiental de los Estado Unidos. Segn este
63

documento el AMPS se degrada menos del 10% en 44 das. Se puede observar una
ligera ganancia de masa a los 14 das y luego una muy lenta prdida producto de los
injertos y del entrecruzamiento de las muestras, este ltimo componente no
presenta degradacin ya que est unido a las cadenas principales mediante enlaces
inicos que no se ven afectados sino a medios cidos. Se debe recordar que el
quitosano degrada fcilmente debido a los grupos aminos libres, esta es la razn por
la que el quitosano PT se degrada un poco ms ya que posee mayor grado de
desacetilacin lo que se traduce en una mayor cantidad de estos grupos aminos
4,39,42
.
Al menos el quitosano PT con 20 y 30% de degradacin tienen una prdida de masa
ms acelerada que las muestras de quitosano ID. Una vez ms esto es originado por
la naturaleza semicristalina del quitosano Idebio, que al formar un arreglo estable,
el romperlo con la finalidad de degradarlo ser un proceso ms lento que de ser un
arreglo completamente amorfo como el quitosano Protasan
30,31
.
Esta degradacin es importante debido a que una vez las clulas se diferencian y se
adhieren estas comienzan el proceso de proliferacin, tanto condroblastos y
condrocitos deben producir matriz extracelular nueva. Una vez esta se produzca el
copolmero de quitosano habr cumplido con su funcin y debe degradarse por
completo. El tiempo de formacin de tejido vara segn la edad, el gnero, la
alimentacin de la persona, entre otros muchos factores pero generalmente dicho
tejido se produce de 4 a 12 semanas por lo que la degradacin debe completarse
despus de este tiempo y nunca antes
13,43
.
4.7. Porosidad
Se evalu la porosidad en funcin de la cantidad de AMPS y TPP de las muestras
con quitosano PT e ID (ver clculos en el apndice).
64

Figura 4.7.1.: Valores de la porosidad aparente de acuerdo a la cantidad de AMPS
(izquierda) y TPP (derecha) para los quitosanos PT e ID.

En la figura 4.7.1 se observa que para un incremento de AMPS para el quitosano
ID la porosidad decrece, lo que es contradictorio ya que al haber un aumento de
AMPS se debera obtener una red mayormente reticulada y por lo tanto una mayor
porosidad. Sin embargo, este efecto que causa un detrimento en la porosidad puede
ser atribuido a la homopolimerizacin del AMPS en lugar de la copolimerizacin. Por
el contrario el quitosano PT presenta un incremento en la porosidad con el aumento
de AMPS, esto puede estar relacionado con la naturaleza ms amorfa de dicho
quitosano. Se debe mencionar que porosidades del 100% en adelante son errores en
la medida de la densidad aparente, pero pueden tomarse como vlidas para estudiar
el cambio de la misma con respecto al porcentaje de injerto
33
.
Adems el cambio de la porosidad con el contenido de entrecruzante, para el
quitosano PT, tiene un valor mximo de 93% a 6% de TPP, para mayores o menores
porcentajes de este ltimo la porosidad es menor. A bajas cantidades de
entrecruzante los injertos, es decir, el AMPS toma el lugar del TPP en la cadena
principal y su estructura es mucho ms grande por lo que ocasionar una mayor
separacin entre cadenas. Contrariamente una mayor concentracin de TPP causa
un grado ms alto de cadenas polimricas ramificadas y crea una red adicional, esto
produce un incremento en la densidad de entrecruzamientos por lo que los espacios
65

de la red se reducen. En contraste, el quitosano ID tiene una porosidad mnima de
83% a 6% de TPP, para menores o mayores porcentajes la porosidad es mayor, esto
tambin puede atribuirse a la semicristalinidad del mismo quitosano
44
.
Del mismo modo se realiz SEM a determinadas muestras en virtud de comparar
ciertos cambios. En la figura 4.7.2 se presentan las microfotografas del quitosano
Protasan con el mayor y menor porcentaje de AMPS.

Figura 4.7.2.: Microfotografa de quitosano PT con 10% (izquierda) y 30% (derecha)
de AMPS, a 30X de magnificacin.

Primordialmente se debe saber que la liofilizacin funciona desecando el material
que se encuentra disuelto en un solvente, es decir, todo el conjunto se congela y el
solvente pasa de estado lquido a estado gaseoso (sublima) dejando al material solido
con su estructura molecular intacta. Normalmente este proceso deja como resultado
lminas con poros que son causados por colapsos de pequea escala. En la imagen
anterior se observa claramente la presencia de lminas con algunos filamentos.
Dichos filamentos son mucho ms largos y notorios en la muestra con 30% de AMPS
que en la de 10% del mismo. Esto se puede atribuir a la cantidad de ramificaciones
que posee la muestra con mayor porcentaje de injerto, ya que estos incrementan los
espacios de la red polimrica. Ahora bien en las muestras sintetizadas a partir del
quitosano PT no se observaron poros en las lminas, al menos a 30x de
magnificacin. Pero siendo consecuente con los altos valores de porosidad del mismo
66

se puede asumir que existen poros muy pequeos que no pueden ser vistos a dicha
magnificacin
45
.
Por otra parte las fotomicrografas de la muestras con quitosano ID presentaron
una estructura laminar con abundantes poros en las mismas (ver Figura 4.6.3).

Figura 4.7.3.: Fotomicrografa de las muestras con 10% de AMPS de quitosano PT
(izquierda) y quitosano ID (derecha), a 30X de magnificacin.

Se puede notar que adems de presentar una estructura con poros, tambin se
observan lminas mucho ms largas y orientadas hacia el eje del contendor (ver
Figura 4.7.4). Con un grosor de aproximadamente 0,08 mm y una distancia entre
ella de 0,62 mm (ver mediciones en el apndice). La presencia de estas lminas
posiblemente se debe a que el quitosano ID es semicristalino, como se mencion con
anterioridad la dificil disolucin en medio acuoso es un caracterstica primordial que
puede ocasionar la presencia de cristales no disueltos en el medio por lo que al
momento de ser reticulados son slo las partes amorfas que pueden formar la red
quitosano-AMPS-TPP. El arreglo cristalino del quitosano consiste en ordenar sus
cadenas de forma antiparalela en un plano como se muestra en la figura 4.7.4
30,31,46
:
67

Figura 4.7.4.: Representacin esquemtica del arreglo estructural del quitosano en
un plano
46
.

Asimismo se apilan planos con este arreglo mediante puentes de hidrgeno como se
muestra en la figura a continuacin:

Figura 4.7.5.: Representacin esquemtica del apilamiento de planos de quitosano
46
.

68

De esta forma la estructura del quitosano resulta en forma de hojuelas o lminas
que estn unidas por puentes de hidrgeno. Estas lminas son las que se evidencian
en las fotomicrografas del quitosano ID, bloques cristalinos no reticulados unidos a
zonas amorfas que efectivamente reticularon
46
.

Figura 4.7.6.: Fotomicrografas de superficie radial (superior) y seccin transversal
(inferior) de la muestra con 30% de AMPS de quitosano ID a 30x (izquierda) y 100x
(derecha) de magnificacin.

Se puede diferenciar en la imagen anterior que las lminas estn alineadas en la
direccin longitudinal del recipiente donde las muestras estn contenidas. Siendo el
contendor un cilindro donde la extraccin del aire y del soluto sublimado ocurri por
la tapa superior del mismo, es lgico que las hojuelas o lminas se encuentren
orientadas en la direccin de extraccin del solvente
46
.
69

Del mismo modo se midieron los poros presentes. Dichos poros presentan del
mismo modo una orientacin en la direccin longitudinal de la muestra. Fueron
hallados dos tamaos de poro con forma ovalada, los grandes poros poseen tamaos
de dimetro mayor entre 900 y 600 m y dimetro menor entre 100 y 400m (ver
Figura 4.6.5). Mientras que los poros ms pequeos poseen un dimetro menor
alrededor de los 50 m y uno mayor de 100 m (ver Figura 4.6.5).

Figura 4.7.7.: Fotomicrografas de poros grandes (izquierda) y poros pequeos
(derecha) de muestras con 10% (izquierda) y 30% (derecha) de AMPS de quitosano
ID, a 100X de magnificacin.

Estos espaciamientos son particularmente importantes porque juegan un papel
primordial en la transferencia de masa, definen el tipo de clula, la proliferacin y la
produccin de matriz extracelular. Con mayores tamaos de red se incrementa el
contenido de colgeno mientras que mantiene constante el contenido de
glicosaminoglicanos (GAG). Los grandes tamaos de red se obtienen con poco
contenido de entrecruzante
19
.
4.8. Peso molecular entre nudos (Mc)
Primeramente se debe acotar que para realizar las medidas de dicho parmetro se
debe emplear termogravimetra por lo que es necesario conocer si la muestra
presenta algn cambio a temperaturas elevadas. De esta forma antes de realizar el
70

estudio de MC se realiz DSC (Differential Scanning Calorimetry: Calorimetra
Diferencial de Barrido) a una muestra de cada quitosano que se presenta
seguidamente.

Figura 4.8.1.: DSC para el quitosano PT (muestra SN 11.01 a la izquierda) y para el
quitosano ID (muestra SN11.1 a la derecha).

En la figura anterior se muestra la segunda corrida desde -10C hasta 130C a
10C/min debido a que la primera corrida no present ningn pico caracterstico. Se
observa que a 100C la muestra a partir de quitosano ID presenta un pico
endotrmico producto de la prdida de agua retenida por lo que se decidi realizar el
secado de las muestras a 90C por debajo de esta temperatura, ya que es
expresamente necesario que el contenido absorbido por el quitosano sea eliminado
de forma gradual
47
.
Una vez definido lo anterior se obtuvieron los siguientes resultados del peso
molecular entre nudos para cada muestra.

71

Tabla 4.8.1.: Peso molecular entre nudos terico, determinado mediante modelo
viscosimtrico (mtodo 1) y mediante modelo de Peppas y Merrill (mtodo 2).
Mc
(Terico)
Mc
(Mtodo 1)
Error
Mc
(Mtodo 2)
Error Muestra Quitosano
18557 1200000 400000 11100 200 SN1.01
Protasan
3779 390000 10000 2031 3 SN2.01
18958 1000000 600000 4800 30 SN3.01
18283 1400000 500000 3870 30 SN5.01
18060 560000 30000 3160 10 SN9.01
3679 250000 20000 5380 20 SN10.01
18455 800000 90000 4470 20 SN11.01
18557 510000 20000 4540 20 SN1.1
Idebio
3779 400000 100000 3040 10 SN2.1
18958 1500000 500000 4800 20 SN3.1
18283 1100000 600000 2640 10 SN5.1
18060 7000000 1000000 6000 10 SN9.1
3679 920000 80000 3160 10 SN10.1
18455 2300000 300000 4450 20 SN11.1

El peso molecular entre nudos no es ms que el peso molecular que existe desde un
punto de entrecruzamiento hasta el otro en la cadena principal, en este caso, en la
cadena de quitosano. Observando la tabla se puede concluir que el modelo
viscosimtrico (mtodo 1) arroja unos resultados muy alejados de los valores
tericos, segn estos resultados, el quitosano habra entrecruzado con distancias
muy altas entre s. Por otra parte la determinacin mediante el modelo de Peppas y
Merrill result en valores ms en concordancia con el valor terico. Ntese asimismo
que los valores son, en su mayora, menores a los valores tericos, esto podra
deberse a dos razones. Primero que el valor terico slo considera la cantidad de
entrecruzante, y el hidrogel sintetizado tambin posee un injerto de AMPS, lo que
contribuye al incremento de los nodos y por consiguiente a la disminucin de MC.
Segundo, tambin se deben considerar los enredos moleculares, por lo que es
razonable pensar que el nmero total de nodos como la suma de los enlaces qumicos
y los enredos fsicos, de esta forma habra una disminucin en el peso molecular
entre nodos
48,49
.
72

Dicho peso molecular juego un papel importante en las propiedades mecnicas de
los hidrogeles. Grandes valores de MC se traducen en bajos mdulos de compresin
mientras que pequeos valores del mismo aumentan dicho mdulo, ocurre lo mismo
con el esfuerzo ltimo. Esto quiere decir que al disminuir el MC se obtiene un
hidrogel mucho ms resistente, ms difcil de comprimir y ms difcil de fragmentar
mecnicamente. Otro factor importante que est determinado por el peso molecular
entre nodos es el tamao de malla, dicho tamao como ya se ha mencionado es
importante para la difusin de soluto y por lo tanto para el transporte de nutrientes
y material necesario para sustentar el tejido que se desea hacer crecer mediante el
cultivo. De esta forma se determina el cambio en dicha propiedad con respecto tanto
al porcentaje de injerto como al de entrecruzante (ver Figura 4.7.2)
17,19
.

Figura 4.8.2.: Peso molecular entre nudos (Mc) en funcin del porcentaje TPP
(izquierda) e iniciador (derecha).

En la figura 4.8.2 se evidencia otra vez el efecto de la cristalinidad del quitosano ID
en el peso molecular entre nudos. Sabiendo que el Mc est contemplado en las zonas
amorfas que han reticulado y siendo el quitosano PT casi completamente amorfo y el
ID semicristalino es lgico que dicho parmetro para ste ltimo quitosano sea, en
general, menor
30,31
.
Se puede observar tambin en la figura anterior que para el quitosano PT con el
aumento del porcentaje de iniciador el MC disminuye, esto quiere decir que existen
ms nudos en la red, es decir, uniones de AMPS con las cadenas de quitosano, esto
73

sigue el razonamiento anteriormente descrito al comprobar el porcentaje de injerto e
indica que con 1% de iniciador se obtiene un mayor tamao de red pero un menor
resistencia mecnica, lo primero es beneficioso para el transporte de nutrientes pero
al disminuir el desempeo mecnico pudiera no mimetizar de forma adecuada el
tejido cartilaginoso, con 2 y 3% de iniciador dicho parmetro disminuye lo que
aumentara la resistencia mecnica pero al disminuir el tamao de malla la difusin
de nutrientes ser menor, dicho efecto no es deseado. Para el quitosano ID el peso
molecular entre nudos no se ve modificado por la cantidad de iniciador presente en
el sistema, por lo tanto se puede asumir que 1% del mismo es suficiente para activar
todos los grupos amino de dicho quitosano
17,33
.
En referencia al entrecruzante, ste es posible que tenga un efecto potenciador
para disminuir el peso molecular entre nudos mucho ms marcado en el quitosano
Protasan que en el Idebio, esto parece ser lgico ya que el TPP crea nodos a lo largo
de la cadena principal, mientras mayor cantidad del mismo mayor cantidad de
nodos. Sin embargo con un alto porcentaje de entrecruzante el MC aumenta para el
quitosano PT, esto es posiblemente ocasionado por una cantidad de entrecruzante
disfuncional que est unindose a la cadena principal por un solo extremo. El
razonamiento seguira el mismo patrn, altos porcentajes de entrecruzante generan
disminucin de difusin de nutrientes y una mayor resistencia mecnica, por el
contrario poco entrecruzante disminuye la resistencia mecnica pero aumenta la
difusin de nutrientes
17,19
.

74

CONCLUSIONES

El AMPS se enlaza covalentemente por medio de los grupos amino de manera
efectiva y con una distribucin homognea a las redes polimricas de
quitosano Protasan e Idebio. Obtenindose de igual forma distintos
porcentajes de injerto que dependern del porcentaje mismo de AMPS, de
iniciador y de entrecruzante.
El entrecruzante (TPP) del mismo modo se enlaz inicamente de forma
efectiva y de manera homognea.
La cristalinidad y el peso molecular del quitosano tienen influencia directa en
la solubilidad de los mismos en medios acuosos, as como en la capacidad de
reticulado del mismo, lo que afectar en gran medida su degradacin,
comportamiento en estado hinchado, porosidad y peso molecular entre nudos.
La cristalinidad del quitosano depender directamente del origen de la
quitina y del mtodo de desacetilacin de la misma.
El mecanismo de la copolimerizacin de injerto mediante el iniciador redox
persulfato de sodio, es mediante los grupos amino libres del quitosano.
Tanto para el quitosano Idebio como para el quitosano Protasan el ndice de
hinchamiento aumentan en funcin del incremento de porcentaje de AMPS y
con la disminucin del pH.
El porcentaje de injerto aumenta con la disminucin de la cristalinidad. El
quitosano Idebio generalmente tiene un menor porcentaje de injerto que el
Protasan.
La degradacin del andamio en PBS con un pH de 7,5 es de menos del 10% en
7 semanas.
La velocidad de la degradacin resulta ligeramente menor para el quitosano
ID, debido a su naturaleza semicristalina.
75

El incremento en la porosidad se encuentra relacionada con el porcentaje de
injerto de forma inversamente proporcional para el quitosano Idebio y
proporcional para el quitosano Protasan. En cuanto al porcentaje de
entrecruzante a 6% el quitosano Protasan presenta un mximo de porcentaje
de injerto mientras que el Idebio refleja un mnimo.
El quitosano Protasan posee una mayor porosidad que el quitosano Idebio, el
primero por ser amorfo se encuentra mayormente reticulado.
Los andamios de quitosano Idebio contienen poros de mayor tamao que los
andamios de quitosano Protasan.
En los andamios de quitosano Protasan se observa una estructura de delgados
filamentos mientras que en los andamios de quitosano Idebio existen lminas
y poros que estn orientados hacia la misma direccin. La direccin
longitudinal del envase contenedor donde fueron liofilizados.
Las muestras de quitosano Idebio presentan una reaccin endotrmica a
100C, posiblemente producto de la evaporacin del agua retenida.
El modelo viscosimtrico para determinar el peso molecular entre nudos no se
ajusta a los valores tericos mientras que el modelo de Peppas y Merrill se
ajusta mucho mejor a estos valores. Posiblemente debido a algn error
cometido en la determinacin reolgica.
Con el incremento del porcentaje de iniciador disminuye el peso molecular
entre nudos con un efecto ms marcado para el quitosano Protasan ya que,
por ser amorfo, se encuentra mayormente reticulado. Este aumento, por tanto
incrementa la resistencia mecnica del andamio. Asimismo se reduce la
difusin de nutrientes de ste.
Mayoritariamente el aumentar el porcentaje de entrecruzante causa la
disminucin del peso molecular entre nudos, del mismo modo presenta un
efecto ms marcado el quitosano Protasan por ser amorfo. Esta disminucin
incrementa resistencia mecnica y reduce la difusin de nutrientes del
andamio.
76

RECOMENDACIONES

Realizar cultivos con clulas condrocticas de forma tal que se pueda evaluar
la respuesta al crecimiento de tejido con el tiempo, el peso molecular, el
porcentaje de injerto, de entrecruzante, el tamao de malla y la porosidad.
Llevar a cabo una evaluacin del comportamiento mecnico del andamio, por
medio de ensayos de compresin no confinado sumergido, con el fin de
comparar los valores deseados para la sustitucin de tejido cartilaginoso.
Determinar el peso molecular de los quitosanos mediante cromatografa de
permeacin de geles, de esta forma se puede determinar la cantidad de
unidades desacetiladas en el mismo.
Emplear diferentes entrecruzantes para evaluar el efecto de un entrecruzante
covalente sobre las propiedades mecnicas, la porosidad, respuesta biolgica,
etc.
Contemplar el uso de distintos iniciadores para evaluar el efecto en el
porcentaje de injerto.
Realizar mayores tiempos de degradacin, adems de hinchamiento con
lquidos simulados al cuerpo a diferentes condiciones de pH.
Llevar a cabo la determinacin del grado de cristalinidad de ambos quitosanos
as como la difraccin de rayos X (DRX) de los andamios, de esta forma se
puede determinar si realmente en el quitosano Idebio se han disuelto los
cristales para que estas zonas puedan ser reticuladas.
Realizar lavado a los andamios para extraer homopolmeros de AMPS que se
hayan podido formar en la sntesis.
77

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82

APNDICE A

La determinacin del grado de desacetilacin (DA) y de polimerizacin (DP) se
realiz de la siguiente forma empleando las ecuaciones 3.2.1, 3.2.2, 3.2.3 y 3.2.4:

Seguidamente se muestran los porcentajes de azufre obtenidos por microanlisis
para todas las muestras:
Tabla A.1. Porcentaje de azufre de las muestras de quitosano y sus copolmeros.
%S Muestra %S Muestra
0,00 Quitosano Protasan
puro
0,00 Quitosano
Idebio puro
0,30 SN1.01 0,91 SN1.1
1,16 SN2.01 0,36 SN2.1
1,50 SN3.01 0,95 SN3.1
1,20 SN4.01 0,56 SN4.1
1,92 SN5.01 1,34 SN5.1
2,47 SN6.01 0,76 SN6.1
1,97 SN7.01 1,39 SN7.1
1,77 SN8.01 1,25 SN8.1
1,98 SN9.01 2,15 SN9.1
2,63 SN10.01 2,09 SN10.1
1,99 SN11.01 2,08 SN11.1
1,24 SN12.01 2,00 SN12.1

Por otra parte se calcula el porcentaje de injerto empleando las ecuaciones 3.5.3 y
conociendo los porcentajes de azufre en cada muestra (ver tabla A.1) como se
muestra a continuacin por ejemplo para la muestra SN1.01:

83

De esta forma se promedian los resultados para cada porcentaje de AMPS, PS y
TPP. Estos se ilustran en la siguiente tabla.
Tabla A.2. Porcentaje de injerto respecto al porcentaje de AMPS, iniciador (PS) y
entrecruzante (TPP) tanto para el quitosano PT como para el ID.
Quitosano %AMPS %G %PS %G %TPP %G
PROTASAN
10 34 1 81 1 66
20 91 2 61 6 69
30 90 3 63 7 95
IDEBIO
10 20 1 49 1 57
20 39 2 33 6 22
30 92 3 89 7 89

Con respecto al ndice de hinchamiento ste se mide a partir de la masa inicial y de
las masas obtenidas para cada tiempo de medicin contenidas en las prximas
tablas.
84

Tabla A.3.: ndice de hinchamiento para las muestra de quitosano PT e ID con 10% de AMPS (3 repeticiones de cada
muestra).
PROTASAN

IDEBIO
10%AMPS, pH7,5
Mu 2.01A

2.01B

2.01C
Promedio Desviacin
Mu 2.1A

2.1B

2.1C
Promedio Desviacin
t (s) m (g) SI (%)

m (g) SI (%)

m (g) SI (%)

t (s) m (g) SI (%)

m (g) SI (%)

m (g) SI (%)
0 1,240 0,0

1,226 0,0

1,260 0,0 0 0

0 1,228 0,0

1,247 0,0

1,844 0,0 0 0
5 1,348 8,7

1,391 13,5

1,410 11,9 11 2

5 1,724 40,4

1,632 30,9

2,289 24,1 32 8
10 1,404 13,2

1,369 11,7

1,415 12,3 12 1

10 1,671 36,1

1,693 35,8

2,354 27,7 33 5
20 1,402 13,1

1,359 10,8

1,420 12,7 12 1

20 1,681 36,9

1,682 34,9

2,332 26,5 33 6
30 1,425 14,9

1,378 12,4

1,423 12,9 13 1

30 1,655 34,8

1,655 32,7

2,295 24,5 31 5
40 1,414 14,0

1,365 11,3

1,420 12,7 13 1

40 1,631 32,8

1,651 32,4

2,285 23,9 30 5
50 1,433 15,6

1,372 11,9

1,437 14,0 14 2

50 1,607 30,9

1,647 32,1

2,274 23,3 29 5
60 1,435 15,7

1,380 12,6

1,428 13,3 14 2

60 1,643 33,8

1,623 30,2

2,232 21,0 28 7
90 1,423 14,8

1,382 12,7

1,420 12,7 13 1

90 1,618 31,8

1,622 30,1

2,225 20,7 27 6
120 1,420 14,5

1,378 12,4

1,426 13,2 13 1

120 1,622 32,1

1,622 30,1

2,251 22,1 28 5

muestra).
PROTASAN IDEBIO
20%AMPS, pH7,5
Mu 6.01A

6.01B

6.01C
Promedio Desviacin
Mu 6.1A

6.1B

6.1C
Promedio Desviacin
t (s) m (g) SI (%)

m (g) SI (%)

m (g) SI (%)

t (s) m (g) SI (%)

m (g) SI (%)

m (g) SI (%)
0 1,236 0,0

1,236 0,0

1,242 0,0 0 0

6 1,277 0,0

1,230 0,0

1,263 0,0 0 0
5 1,386 12,1

1,347 9,0

1,391 12,0 11 2

5 1,540 20,6

1,649 34,1

1,791 41,8 30 10
10 1,403 13,5

1,391 12,5

1,459 17,5 15 3

10 1,801 41,0

1,729 40,6

1,804 42,8 41 1
20 1,424 15,2

1,400 13,3

1,512 21,7 17 4

20 1,816 42,2

1,717 39,6

1,766 39,8 41 1
30 1,416 14,6

1,420 14,9

1,501 20,9 17 4

30 1,861 45,7

1,636 33,0

1,784 41,3 40 6
40 1,410 14,1

1,420 14,9

1,488 19,8 16 3

40 1,807 41,5

1,596 29,8

1,768 40,0 37 6
50 1,415 14,5

1,417 14,6

1,482 19,3 16 3

50 1,783 39,6

1,63 32,5

1,761 39,4 37 4
60 1,410 14,1

1,433 15,9

1,494 20,3 17 3

60 1,720 34,7

1,598 29,9

1,702 34,8 33 3
90 1,424 15,2

1,463 18,4

1,490 20,0 18 2

90 1,743 36,5

1,594 29,6

1,703 34,8 34 4
120 1,436 16,2

1,442 16,7

1,487 19,7 18 2

120 1,755 37,4

1,596 29,8

1,705 35,0 34 4

85

muestra).
PROTASAN IDEBIO
30%AMPS, pH7,5
Mu 10.01A

10.01B

10.01C Mu 10.1A

10.1B

10.1C
t (s) m (g) SI (%)

m (g) SI (%)

m (g) SI (%) Promedio Desviacin

t (s) m (g) SI (%)

m (g) SI (%)

m (g) SI (%) Promedio Desviacin
0 1,214 0,0

1,827 0,0

1,213 0,0 0 0

0 1,246 0,0

1,250 0,0

1,301 0,0 0 0
5 1,500 23,6

2,169 18,7

1,423 17,3 20 3

5 1,697 36,2

1,622 29,8

1,506 15,8 30 10
10 1,545 27,3

2,206 20,7

1,481 22,1 23 3

10 1,752 40,6

1,769 41,5

1,714 31,7 38 5
20 1,543 27,1

2,197 20,3

1,471 21,3 23 4

20 1,709 37,2

1,765 41,2

1,817 39,7 39 2
30 1,570 29,3

2,216 21,3

1,465 20,8 24 5

30 1,680 34,8

1,726 38,1

1,789 37,5 37 2
40 1,547 27,4

2,230 22,1

1,485 22,4 24 3

40 1,646 32,1

1,685 34,8

1,742 33,9 34 1
50 1,536 26,5

2,204 20,6

1,498 23,5 24 3

50 1,671 34,1

1,700 36,0

1,740 33,7 35 1
60 1,543 27,1

2,193 20,0

1,475 21,6 23 4

60 1,650 32,4

1,716 37,3

1,734 33,3 34 3
90 1,540 26,9

2,184 19,5

1,482 22,2 23 4

90 1,656 32,9

1,764 41,1

1,727 32,7 36 5
120 1,540 26,9

2,195 20,1

1,468 21,0 23 4

120 1,672 34,2

1,734 38,7

1,744 34,1 36 3
86

El ndice de hinchamiento se determina mediante la ecuacin 3.6.1 por ejemplo
para la muestra SN2.01 repeticin A, para 5 segundos, como se muestra:

Luego se realiz un promedio para cada repeticin (A, B y C) de cada muestra con
su respectiva desviacin estndar.
De forma similar se determin el porcentaje en prdida en peso para evaluar la
degradacin. Se emple la ecuacin 3.6.2, la masa de cada tiempo y masa del
polmero hinchando a los 7 das a partir de la tabla A.4, A.5 y A.6. Por ejemplo para
la muestra SN 2.01 repeticin A, a 14 das de degradacin:

Tambin se determin el promedio de tres repeticiones (A, B y C) para cada
muestra, excepto para las muestras SN10.01 y SN10.1 debido a la limitacin de
rejillas para realizar el ensayo se realizaron slo dos repeticiones (A y B).
Ahora bien, la porosidad se determin mediante los valores de densidad aparente y
densidad real de la tabla A.7 y haciendo uso de la ecuacin 3.7.1 para la muestra
SN1.01:

De esta forma se obtienen los valores de porosidad aparente en funcin del
contenido de entrecruzante y AMPS que se muestran en la tabla A.8.

87

Tabla A.4.: Porcentaje de prdida en peso para las muestras de quitosano ID y PT con 10% de AMPS (3 repeticiones de
cada muestra).
PROTASAN (pH7,5)

IDEBIO (pH7,5)
10% AMPS
Mu 2.01A

2.01B

2.01C
Promedio Desviacin
Mu 2.1A

2.1B

2.1C
Promedio Desviacin
t (das) m (g) % P

m (g) % P

mn (g) % P

t (das) m (g) % P

m (g) % P

m (g) % P
0 1,212 79,6

1,827 87,4

1,234 82,6 83 4

0 1,250 81,1

1,228 82,6

1,273 83,0 82 1
7 1,522 100,0

2,090 100,0

1,494 100,0 100 0

7 1,541 100,0

1,487 100,0

1,534 100,0 100 0
14 1,520 99,9

2,228 106,6

1,465 98,1 102 5

14 1,597 103,6

1,574 105,9

1,579 102,9 104 2
21 1,528 100

2,206 105,6

1,454 97,3 101 4

21 1,537 99,7

1,569 105,5

1,572 102,5 103 3
28 1,505 98,9

2,187 104,6

1,458 97,6 100 4

28 1,507 97,8

1,53 102,9

1,542 100,5 100 3
35 1,493 98,1

2,170 103,8

1,449 97,0 100 4

35 1,479 96,0

1,492 100,3

1,511 98,5 98 2
42 1,481 97,3

2,148 102,8

1,441 96,5 99 3

42 1,477 95,8

1,481 99,6

1,498 97,7 98 2
49 1,449 95,2

2,135 102,2

1,419 95,0 97 4

49 1,472 95,5

1,480 99,5

1,498 97,7 98 2

cada muestra).
20% AMPS
Mu 6.01A

6.01B

6.01C
Promedio Desviacin
Mu 6.1A

6.1B

6.1C
Promedio Desviacin
t (das) m (g) % P

m (g) % P

m (g) % P

t (das) m (g) % P

m (g) % P

m (g) % P
0 1,259 81,3

1,233 79,3

1,211 78,9 80 1

0 1,251 84,0

1,259 83,1

1,841 88,6 85 3
7 1,549 100,0

1,554 100,0

1,535 100,0 100 0

7 1,49 100,0

1,515 100,0

2,079 100,0 100 0
14 1,548 99,9

1,563 100,6

1,545 100,7 100,4 0,4

14 1,555 104,4

1,531 101,1

2,186 105,1 104 2
21 1,519 98,1

1,528 98,3

1,509 98,3 98,2 0,1

21 1,523 102,2

1,531 101,1

2,124 102,2 101,8 0,7
28 1,509 97,4

1,463 94,1

1,452 94,6 95 2

28 1,512 101,5

1,523 100,5

2,078 100,0 100,7 0,8
35 1,506 97,2

1,456 93,7

1,4334 93,4 95 2

35 1,506 101,1

1,492 98,5

2,015 96,9 99 2
42 1,497 96,6

1,441 92,7

1,427 93,0 94 2

42 1,505 101,0

1,489 98,3

2,008 96,6 99 2
49 1,442 93,1

1,435 92,3

1,425 92,8 92,8 0,4

49 1,498 100,5

1,488 98,2

1,982 95,3 98 3

88

cada muestra).
30% AMPS
Mu 10.01A

10.01B

Promedio Desviacin

Mu 10.1A 10.1B

Promedio Desviacin t
(das)
m (g) % P

m (g) % P

t
(das)
m (g) % P

m (g) % P

0 1,239 80,3

1,229 78,5

79 1

0 1,270 78,7

1,247 79,1

78,9 0,3
7 1,543 100,0

1,565 100,0

100,0 0

7 1,613 100,0

1,576 100,0

100 0
14 1,527 99,0

1,543 98,6

98,8 0,3

14 1,622 100,6

1,633 103,6

102 2
21 1,512 98,0

1,462 93,4

96 3

21 1,607 99,6

1,566 99,4

99,5 0,2
28 1,500 97,2

1,446 92,4

95 3

28 1,588 98,5

1,549 98,3

98,4 0,1
35 1,463 94,8

1,409 90,0

92 3

35 1,548 96,0

1,541 97,8

97 1
42 1,432 92,8

1,408 90,0

91 2

42 1,544 95,7

1,535 97,4

97 1
49 1,426 92,4

1,403 89,6

91 2

49 1,488 92,3

1,485 94,2

93 1

Tabla A.7.: Densidad aparente y densidad real para determinadas muestras de quitosano PT e ID.
Quitosano Densidad aparente (g/cm3) Densidad Real (g/cm3)
PROTASAN
Repeticin/
Muestra
SN1.01 SN2.01 SN3.01 SN5.01 SN9.01 SN10.01 SN11.01
SN1.01 SN2.01 SN3.01 SN5.01 SN9.01 SN10.01 SN11.01
1 1,26 1,15 2,74 1,92 1,85 1,33 1,32
2 1,69 1,29 2,59 1,38 1,46 1,90 1,18
3 1,00 1,26 2,10 1,81 1,41 1,33 1,00
4 1,00 1,47 2,71 1,36 1,79 1,12 1,09
Promedio 1,2 1,3 2,5 1,6 1,6 1,4 1,1 1,65 1,39 1,59 1,62 1,52 1,62 1,53
Desviacin 0,3 0,1 0,3 0,3 0,2 0,3 0,1 0,02 0,01 0,04 0,03 0,02 0,05 0,02
IDEBIO
Repeticin/
Muestra
SN1.1 SN2.1 SN3.1 SN5.1 SN9.1 SN10.1 SN11.1
SN1.1 SN2.1 SN3.1 SN5.1 SN9.1 SN10.1 SN11.1
1 1,50 1,26 1,17 1,29 1,23 1,39 1,2
2 1,69 1,23 1,30 1,36 1,16 1,57 1,09
3 1,41 1,23 1,33 1,10 1,20 1,25 1,16
4 1,55 1,41 1,36 1,30 1,12 1,65 1,18
Promedio 1,5 1,28 1,29 1,3 1,18 1,5 1,16 1,70 1,54 1,84 1,59 1,55 1,54 1,69
Desviacin 0,1 0,09 0,08 0,1 0,05 0,2 0,05 0,03 0,03 0,04 0,02 0,02 0,01 0,03

89

Tabla A.8.: Porosidad aparente en funcin del contenido de TPP y AMPS.

A continuacin se presentan las mediciones tanto del grosor de las lminas como de
la distancia entre ellas y el tamao de los poros, mediante la ayuda del software
ImageJ.

Figura A.1.: Medicin del grosor y el distanciamiento de las lminas de la muestra
SN1.1 con una magnificacin de X30. Todas las medidas en centmetros.
Porosidad Aparente
TPP/AMPS Protasan Idebio
1% 75 91
6% 93 83
7% 88 95
10% 75 91
20% 100 79
30% 107 76
90

Figura A.2.: Medicin del dimetro mayor y menor de los poros grandes y pequeos
de las muestras SN1.1 (A y B), SN5.1 (C) y SN11.1 (D). Todas las medidas en
micrmetros.

Se obtuvieron los promedios y las desviaciones del grosor de las lminas, el
distanciamiento entre las lminas y el tamao de los poros pequeos. Se presentan
en la tabla A.9 a continuacin.

91

Tabla A.9.: Promedio y desviacin estndar del grosor de lmina, distancia entre
lminas, dimetro mayor y menor de los poros pequeos.
Medida
Grosor de lmina
(mm)
Dimetro mayor
(m)
Dimetro menor
(m)
Distancia entre
lminas (mm)
Entre lmina
1 0,102 163 67 0,565
I y II
2 0,089 100 55 0,584
3 0,072 63 40 0,614
4 0,059 100 35 0,652
5 0,06 120 60 0,665
6 0,074 102 51 0,641
II y III
7 0,076 149 63 0,572
8 0,093 117 59 0,621
9 0,101 93 52 0,650
10 0,096 107 47 0,588
11

0,536
III y IV
12

0,597
13

0,620
14

0,697
15

0,667
Promedio 0,08 110 50 0,62

Desviacin 0,02 30 10 0,04

Para determinar el peso molecular entre nudos es necesario determinar el mdulo
de almacenamiento promedio de las tres repeticiones que fueron hechas a cada
muestras de quitosano ID y PT. Seguidamente se muestra una tabla con dichos
promedios.
92

Tabla A.10.: Mdulo de almacenamiento para las diferentes muestras de quitosano PT e ID.

G' (Pa)

PROTASAN
Muestra SN1.01 SN2.01 SN3.01 SN5.01 SN9.01 SN10.01 SN11.01
Ang. Frecuecnia
(rad/s)/Repeticin
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
0,6283 1179 1858 1762 2290 2274 2197 770 1701 1277 560,6 1200 979 898 1835 1763 5902 5452 5753 1284 1597 1456
0,791 1219 2063 2051 2342 2331 2251 784 1786 1299 579 1242 1017 934 1888 1776 6026 5593 5854 1362 1660 1487
0,9958 1272 2262 2166 2386 2380 2299 798 1858 1317 596,4 1256 1053 956 1938 1816 6060 5644 5966 1431 1721 1542
1,254 1306 2407 2344 2427 2428 2342 810 1920 1336 612,8 1311 1087 981 1991 1854 6177 5783 6063 1501 1785 1598
1,578 1346 2490 2442 2464 2472 2383 824 1975 1356 628,9 1347 1122 1007 2042 1898 6220 5901 6159 1569 1852 1654
1,987 1374 2685 2577 2500 2518 2426 832 2027 1377 645,3 1380 1157 1033 2091 1938 6289 6007 6239 1641 1923 1711
2,501 1429 2766 2710 2537 2563 2465 854 2074 1388 660,4 1413 1190 964 2152 1982 6368 6117 6300 1714 1992 1768
3,149 1460 2878 2835 2575 2612 2508 867 2119 1416 677,2 1445 1228 1110 2211 2029 6442 6155 6411 1791 2070 1830
3,964 1484 2975 2932 2610 2662 2554 851 2172 1442 680,3 1480 1267 1142 2273 2078 6544 6304 6504 1872 2148 1902
4,991 1533 3127 3022 2658 2713 2604 884 2221 1445 713,8 1516 1305 1177 2347 2130 6669 6473 6585 1956 2233 1974
6,283 1598 3252 3136 2698 2771 2656 899 2271 1458 733 1556 1344 1218 2418 2185 6835 6526 6717 2045 2330 2055
7,91 1639 3395 3230 2748 2835 2716 920 2326 1493 747,9 1582 1389 1241 2495 2241 6964 6683 6804 2143 2422 2142
9,958 1697 3558 3335 2788 2890 2782 889 2372 1492 771,2 1619 1430 1283 2588 2313 6977 6800 6942 2246 2522 2238
12,54 1746 3720 3433 2836 2961 2849 817 2422 1502 793,1 1642 1474 1314 2686 2373 7136 6949 7095 2353 2634 2333
Promedio repeticin 1400 2800 2700 2600 2600 2500 800 2100 1400 700 1400 1200 1100 2200 2000 6500 6200 6400 1800 2100 1800
Desviacin 200 600 500 200 200 200 50 200 100 100 100 200 100 300 200 400 500 410 300 300 300
Promedio muestra 2300 2600 1400 1100 2100 6400 2000
Desviacin 800 60 700 400 100 200 200

IDEBIO
Muestra SN1.1 SN2.1 SN3.1 SN5.1 SN9.1 SN10.1 SN11.1
Ang. Frecuecnia
(rad/s)/Repeticin
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
0,6283 2302 2266 2351 1976 3032 2580 531 934 1016 1224 1118 435 271 348 270 1227 1300 1082 512 589 552,1
0,791 2346 2320 2396 1985 3097 2614 537 956 1037 1257 1132 447 271 354 273 1244 1328 1104 524 606 569,4
0,9958 2392 2364 2443 1996 3143 2649 544 971 1056 1286 1145 458 272 360 275 1260 1348 1107 535 618 584,3
1,254 2437 2409 2490 2008 3189 2683 551 1006 1078 1316 1162 467 273 364 279 1264 1363 1119 547 623 599,1
1,578 2481 2450 2539 2020 3228 2715 560 1023 1099 1348 1178 475 273 369 283 1272 1379 1137 558 645 611,2
1,987 2531 2499 2591 2037 3268 2750 568 1055 1123 1376 1196 483 273 371 287 1301 1398 1143 570 657 624,5
2,501 2582 2550 2646 2048 3314 2783 577 1073 1144 1406 1212 489 285 389 297 1314 1406 1172 581 668 637,5
3,149 2631 2602 2700 2062 3355 2818 588 1101 1172 1438 1227 511 277 379 291 1328 1414 1182 593 680 650,4
3,964 2682 2660 2758 2065 3401 2859 600 1131 1196 1470 1247 500 290 405 301 1346 1423 1192 603 697 667,8
4,991 2744 2714 2816 2098 3452 2893 607 1152 1223 1510 1271 517 282 399 292 1369 1447 1201 623 718 673,8
6,283 2805 2779 2878 2113 3500 2938 617 1190 1250 1539 1298 529 266 374 286 1370 1455 1221 624 719 683,9
7,91 2861 2849 2940 2150 3559 2987 627 1213 1284 1580 1323 530 255 368 278 1365 1480 1232 629 728 684,6
9,958 2928 2917 3005 2159 3622 3037 642 1248 1311 1614 1345 543 300 420

1403 1518 1252 619 716 675,5
12,54 2988 2992 3071 2194 3689 3092 616 1272 1341 1657 1373 567

454

1436 1513 1272 640 747 691,5
Promedio repeticin 2600 2600 2700 2100 3300 2800 600 1100 1200 1400 1200 500 300 400 300 1300 1400 1200 600 700 600
Desviacin 200 230 230 70 200 200 40 100 100 100 80 40 10 30 10 60 70 60 40 50 50
Promedio muestra 2630 2700 1000 1000 300 1300 600
Desviacin 60 600 300 500 60 100 60
93

Asimismo tambin son necesarias las masas del polmero hinchado, del polmero en
estado relajado y la masa del polmero seco despus de haber sido hinchado estas
masas se obtuvieron mediante el anlisis de las curvas termogravimtricas de las
muestras polmero hmedo y seco, empleando el software TA Instruments Universal
Analysis 2000 como se muestra siguientemente:

Figura A.3.: Anlisis de las curvas termogravimtricas para la muestra SN1.01
hinchada (superior) y seca (inferior).

94

Estos valores se resumen en la tabla A.11. As puede determinarse la fraccin
volumtrica del polmero hinchado (v2,s) y en estado relajado (v2,r) la ecuacin 3.9.3 y
3.9.4 respectivamente por ejemplo para la muestra SN1.01:

]

Tabla A.11.: Masa de la muestra seca despus de hinchar (mo), hinchada (ms) y del
polmero en estado relajado (mr), fraccin volumtrica del polmero hinchado (v2.s) y
en estado relajado (v2,r).
Quitosano mo (mg) ms (mg) mr (mg) v2,s v2,r Muestra
PROTASAN 0,7224 13,60 0,5596 0,390 1,93 0,630 SN1.01
0,9598 13,43 2,423 0,437 0,544 0,646 SN2.01
1,037 27,13 1,229 0,396 0,801 0,632 SN3.01
1,116 8,686 1,334 0,414 0,790 0,638 SN5.01
1,548 35,38 2,702 0,408 0,607 0,636 SN9.01
2,364 41,82 2,547 0,395 0,896 0,632 SN10.01
1,759 22,08 1,844 0,415 0,930 0,638 SN11.01
IDEBIO 1,801 39,98 2,682 0,382 0,642 0,627 SN1.1
2,761 37,51 4,683 0,412 0,613 0,637 SN2.1
2,088 18,27 2,849 0,381 0,671 0,627 SN3.1
2,336 23,73 5,230 0,411 0,532 0,637 SN5.1
2,68 28,74 2,331 0,416 1,30 0,639 SN9.1
2,343 39,68 4,026 0,408 0,608 0,636 SN10.1
3,074 54,95 4,469 0,385 0,654 0,628 SN11.1

El valor del parmetro de interaccin polmero solvente se calcul de la siguiente
forma, por ejemplo para la muestra SN1.01:

95

Conociendo las cantidades de todos los componentes de la reaccin y sus pesos
moleculares se puede determinar la fraccin molar de entrecruzante para cada
muestra y as se obtiene el peso molecular entre nudos terico. Es necesario el peso
molecular de la unidad repetitiva de ambos quitosanos. Debido a que el mismo posee
unidades desacetiladas como acetiladas se debe realizar un promedio de ambas
estructuras que involucra el grado de desacetilacin:

Ahora bien ya sabiendo los pesos moleculares se puede determinar la cantidad de
moles presentes de cada compuesto, por ejemplo para la muestra SN1.01:

La fraccin molar es, entonces:

96

As el MC terico para la muestra SN1.01 se determina empleando la ecuacin 3.9.1
as:

Por otra parte el peso molecular entre nudos mediante el mtodo viscosimtrico
(mtodo 1) se determin mediante la ecuacin 3.9.2, por ejemplo para la muestra
SN1.01:

Asimismo se determin el MC mediante el mtodo de Peppas y Merrill (mtodo 2)
con la ecuacin 3.9.3, por ejemplo tambin para la muestra SN1.01:

[(

]
(

)[

A continuacin se muestran los valores del peso molecular entre nudos terico y
mediante los mtodos 1 y 2 para las muestras de quitosanos ID y PT.
Tabla A.12.: Peso molecular entre nudos terico y determinado mediante los
mtodos 1 y 2, para muestras de quitosano ID y PT.
Mc (Terico) Mc (Mtodo 1) Mc (Mtodo 2) Muestra Quitosano
18560 1190000 11100 SN1.01
Protasan
3779 395000 2030 SN2.01
18960 1050000 4800 SN3.01
18280 1370000 3870 SN5.01
18060 562000 3160 SN9.01
3679 253000 5380 SN10.01
18460 795000 4480 SN11.01
18560 509000 4540 SN1.1
Idebio
3779 447000 3040 SN2.1
18960 1490000 4800 SN3.1
18280 1130000 2640 SN5.1
18060 6700000 6000 SN9.1
3679 922000 3160 SN10.1
18460 2260000 4450 SN11.1

97

Finalmente se presentan MC nterico y determinado mediante el mtodo 2 segn
el porcentaje de entrecruzante e iniciador.
Tabla A.13.: Peso molecular entre nudos terico y determinado mediante el mtodo
2 en funcin del porcentaje de entrecruzante (TPP) e iniciador (PS).
Mc
TPP/PS PT ID Terico
1% 11104 4543 18557
6% 2031 3042 3779
7% 5383 3155 3679
1% 11104 4543 18557
2% 4800 4798 18958
3% 4478 4448 18455

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