CUANTIFICACION DEL RNAm CCR5 EN LOS LINFOCITOS Y MACROFAGOS DE LOS HUMANOS POR:

TIEMPO REAL DE TRANSCRIPTASA REVERSA.

ENSAYO DE PCR (REACCION EN CADENA DE POLIMERASA.9

Division de enfermedades infeccionas e inmunolgicas, Joseph Stokes, Jr., instituto de investigacin,
Hospital de nios de filadelfia, departamento de pediatras, universidad de Pensilvania colegio de
medicina, filadelfia, Pensilvania 19104

CCR5, es un receptor B-quimiocina (o quimioquina), juega un importante rol en la infeccin por
el virus de la inmunodeficiencia humana, en las clulas inmunes de los humanos, ya que es un
correceptor de VIH para la entrada dentro de los macrfagos. Nosotros hemos aplicado
recientemente una PCR de la transcriptasa inversa en tiempo real(RT-PCR), ENSAYO SOBRE LA
CUANTIFICACION DE ccr5 del RNAm en las clulas inmunes de la sangre en los humanos. El
ensayo de la PCR EN TIEMPO REAL RT-PCR tiene una sensibilidad de 100 copias de RNAm, con un
rango de dinmica de deteccin entre 10^2 y 10^6 copias del RNAm CCR5 transcriptos por
reaccin. El ensayo es altamente reproducible, con un coeficiente de ensayo de variacin del
ciclo de umbral menos de 2.07%, Cuando se utiliza para la cuantificacin de RNAm CCR5 en los
macrfagos derivados de monocitos humanos (MDM) y linfocitos sanguneos perifricos (PBL),
el ensayo tiene la precisin y reproducibilidad. MDM(macrfagos derivados de monocitos)
expresa niveles ms altos de ARNm de CCR5 que los niveles en PBL(linfocitos sanguneos
perifericos). Por lo tanto, este ensayo tiene el potencial y una amplia aplicacin para la
investigacin de la funcin de CCR5 en las enfermedades inflamatorias y las infecciones virales,
incluyendo la enfermedad del VIH.

Hay dos familias principales de receptores de quimioquinas: receptores de quimiocinas CC
(CCR) y receptores de quimioquinas CXC. CCR5 es un CCR de quimiocinas, incluyendo
macrfagos protenas en inflamacin 1 y 1 y RANTES. La expresin y regulacin de CCR5
en clulas inmunes humanas no slo estn implicados en enfermedades inflamatorias,
pero tambin implicados en las infecciones virales tales como el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH). CCR5 es un co-receptor principal para la entrada del VIH
en los macrfagos (2). Los individuos con delecin homocigtica del gen de la 32 pb en el
gen CCR5 son altamente resistentes a la infeccin por VIH (1, 5, 9, 12). Por lo tanto, la
medicin precisa de la expresin de ARNm de CCR5 en clulas inmunes humanas es
esencial para los estudios sobre la funcin celular y molecular de la sealizacin de CCR5
en la inflamacin y la infeccin por VIH.
Aunque en la transcriptasa inversa PCR (RT-PCR) y / o ensayos de RT-PCR competitivo se
han utilizado para determinar semicuantitativamente transcripciones de ARNm de CCR5,
que no slo son laborioso-unidades organizativas y consume mucho tiempo, pero tambin
causan variacin y-taminacin debido a post-PCR manipulacin. Desde amplificacin PCR
es un ensayo exponencial, un cambio muy pequeo en la eficiencia de amplificacin
produce una diferencia dramtica en la cantidad de productos finales (11). El seguimiento
de todo el proceso de la PCR (en tiempo real) en lugar de simplemente el extremo
producto (como en PCR competitiva RT-PCR ) da como resultado una cuantificacin
precisa. Y es ms importante an la PCR en tiempo real que utiliza ambos pares de
cebadores y una sonda (como la baliza molecular [MB]) aumenta significativamente la
especificidad del ensayo. Los MB utilizados para la construccin de sondas es crtico para
la deteccin en tiempo real de los eventos de hibridacin de cidos nucleicos (14). MB es
una molcula de cido nucleico de una sola hebra que posee una estructura de tallo-
bucle. Los estudios realizados por nuestro grupo y otros han empleado con xito MB para
una variedad de aplicaciones de la PCR en tiempo real (3, 7, 10, 13-16).}
En el presente estudio, se describe un tiempo real de ensayo simple, sensible, rpido y
reproducible RT-PCR que utiliza ambos cebadores y la sonda (MB) para la cuantificacin de
los niveles de ARNm de CCR5 en los macrfagos humanos derivados de los monocitos de
la sangre (MDM) y linfocitos de sangre perifrica (PBL).

MATERIALES Y MTODOS
Las clulas inmunes humanas. Se obtuvo sangre perifrica de tres donantes adultos sanos
reclutados de nuestros trabajadores del hospital. Las muestras de sangre fueron
identificadas como VIH tipo 1 anticuerpos negativos mediante pruebas annimas por
ensayo inmuno-nosorbent ligado a enzimas (Coulter Immunology, Hialeah, FL). Se obtuvo
el consentimiento informado, y la Junta de Investigacin Institucional de nuestra
institucin aprob este estudio. Se obtuvo sangre y se utiliza dentro de 4 h. Siguiendo los
monocitos de flebotoma se purificaron de acuerdo con las tcnicas descritas
anteriormente (4). En resumen, la sangre heparinizada se separ por centrifugacin sobre
medio de separacin de linfocitos (Oreganon Teknika, Durham, NC) a 400 a 500 g durante
45 min. a continuacin, se recogieron las clulas mononucleares de sangre perifrica
(PBMC). Una parte de PBMC se utiliz como el estndar de ARN para la gliceraldehdo-3-
fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) en tiempo real: RT-PCR. La otra porcin de PBMC fue
incubada por medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), (Gibco, Grand Island, NY)
en un matraz recubierto con gelatina al 2% durante 45 min a 37 C. El PBL no adherente
fue entonces retirado de los frascos y se lav tres veces con solucin salina tamponada
con fosfato(phosphate-buffered saline). Los monocitos se separaron por EDTA y se
sembraron en placas de cultivo de 48 pocillos a una densidad de 0,5 106 clulas / pocillo
en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene suero de ternera fetal al
10%. El perodo de tiempo total en la cultura de MDM fue de 7 a 10 das. Estas clulas
inmunes (MDM y PBL) se sometieron entonces a tiempo real RT-PCR para determinar
CCR5 y GAPDH: la expresin del ARNm como se describe a continuacin. El ensayo de
lisado de amebocitos de limulus demostr que todos los medios y los reactivos fueron
endotoxinas libres.

FIG 1. Ubicacin y orientacin (flechas) de los cebadores y la sonda (MB) para el tiempo
real de ensayo RT-PCR de CCR5 mRNA. La amplificacin de la PCR producto tiene un
tamao de 189 pb, y la secuencia de la sonda se encuentra rio abajo de la ^(smbolo de
energia)32 eliminacin tal como se indica.

Preparacin de CCR5 ARN estndar. Se utiliz un plsmido (pCCR5) como molde para
sintetizar el CCR5 estndar de ARN por transcripcin in vitro. El pCCR5 se obtuvo de los
Institutos Nacionales de Salud (NIH) SIDA Re-search y Programa de reactivos de
referencia. Las bacterias transformadas que contienen pCCR5 se cultivaron en medio
Luria-Bertani caldo complementado con 100 g de ampicilina / ml, y a continuacin, el
plsmido se purific con el sistema de purificacin de ADN Wizard Plus Miniprep
(Promega, Madison, WI). El pCCR5 Plas-mediados purificado se linealiz por digestin con
XbaI y transcribe en ARN especfico de CCR5 con el kit MEGAshortscript (Ambion, Austin,
TX). La solucin CCR5 RNA resultante se trat con DNasa libre de RNasa I para eliminar la
plantilla de ADN pCCR5 residual. A continuacin, el CCR5 ARN se purific por ex-traccin y
el alcohol precipitacin de fenol-cloroformo como se inform anteriormente (6, 8). La
concentracin de ARN purificado CCR5 se determin con un espectrofotmetro. Los
nmeros de copias del transcrito de ARN se calcularon sobre la base de la concentracin y
el peso molecular de la transcripcin de RNA de CCR5. Diluciones decimales seriadas de
cantidades conocidas de las transcripciones de ARN CCR5 se usaron como estndares para
cuantificar los niveles de ARNm de CCR5 en las clulas inmunes humanas por tiempo real
RT-PCR.

Preparacin del estndar de ARN total de GAPDH en tiempo real RT-PCR. Para el control
de la integridad del ARN y normalizar mRNA de CCR5 nmero de copias en MDM y PBL,
GAPDH tambin se amplific por tiempo real RT-PCR. Desde GAPDH es un gen de
mantenimiento, se utiliz ARN total extrado de la agrupada PBMC para generar una curva
estndar GAPDH por tiempo real de RT-PCR para cuantificar los niveles de mRNA GAPDH.
El ARN total se extrajo a partir de PBMC agrupado (4 clulas 107) de los tres donantes
mediante el uso de Tri-reactivo (Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio), y la
concentracin de ARN total se midi con un espectrofotmetro. Diluciones seriadas de
cantidades conocidas de RNA total, que van desde 8 a 1.000 ng, se utilizaron como
estndares para cuantificar los niveles de GAPDH mRNA en MDM y PBL por tiempo real de
RT-PCR (como se describe ms adelante). Estos ARN tambin fueron utilizados para
experimentos intraensayo e interensayo.

Diseo de MB y cebadores. Los cebadores de PCR y MB se disearon basndose en la
secuencia del gen de CCR5 (GenBank adhesin no. AF011539) utilizando el software
Primer Express (PE Biosystems) y se sintetizaron por Integrated DNA Technologies, Inc.
(Coralville, Iowa). El par de cebadores de CCR5-arriba-CCR5-abajo fue diseado para
amplificar especficamente un fragmento de 189 pb del gen CCR5 (Fig. 1). Sus posiciones y
secuencias fueron los siguientes: CCR5-up, 5-CAAAA AGAAGGTCTTCATTACACC-3 (posicin,
512-535); CCR5-down, 5-CCT GTGCCTCTTCTTCTCATTTCG-3 (posicin, 677-700). El
MB(sonda) para CCR5 se encuentra entre el CCR5-arriba-CCR5-abajo y su secuencia fue 5-
FAM-GCGAGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGGTCCTCGC-DABCYL-3 (fig. 1)
Para el control de la integridad y la cantidad de ARN utilizado para el tiempo real de RT-
PCR, el ARNm de un gen de mantenimiento, GAPDH, se amplific. Los cebadores para
GAPDH eran 5-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3 (sentido) y 5-GTT
GCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3 (antisentido). La secuencia de tallo (subrayada en la
secuencia MB) se selecciona de tal manera que no se complementar las secuencias dentro
de la regin del bucle. La longitud de la MB se dise de tal manera que la temperatura de
recocido fue ligeramente mayor que la de los cebadores de PCR. El MB se marc en el
extremo 5 con 6-carboxifluorescena (FAM) y en el extremo 3 con extintor 4 - (4-
dimethylaminophenylaso) cido benzoico (DABCYL). Los cebadores y MB se
resuspendieron en tampn Tris-EDTA y se almacenaron a 30 C. La extraccin de RNA.
ARN total fue extrado de PBMC, MDM y PBL mediante el uso de Tri-reactivo (Molecular
Research Center) segn las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, el ARN total
fue extrado por un solo paso, guanidinium extraccin thiocya-nate-fenol-cloroformo.
Despus de centrifugacin a 13.000 g durante 15 min, material de fase acuosa que
contiene ARN se precipit en isopropanol. ARN precipitados se lavaron una vez en etanol
al 75% y se resuspendieron en 50 micro litros (muL) de agua libre de RNasa.

PCR en tiempo real. El sistema de deteccin de secuencias ABI Prism 7000 (ABI 7000 SDS:
duodecilsulfato sodico) se utiliz para el anlisis de PCR en tiempo real. Condiciones de
ciclacin trmica fueron diseados como sigue: desnaturalizacin inicial a 95 C durante
10 min seguido de 40 a 45 ciclos de 95 C durante 15 s y 60 C durante 1 min. Mediciones
fluorescentes se registraron durante cada etapa de recocido. Al final de cada ejecucin de
PCR, los datos se analizaron automticamente por el sistema y se obtuvieron grficas de
amplificacin.
Para cada PCR, se aadi 2microlitros de molde de ADNc a 48 microlitros de mezcla
maestra de PCR (5 litros micros de 1 x BUFFER DE LISIS II DE PCR, 5 mM de MgCl2, 250
microM de concentraciones de trifosfatos de desoxinuclesidos, 400 concentraciones nM
de cada cebador, 1,5 U de AmpliTaq Gold ADN polimerasa, 400 nM concentraciones de
MB y 24,7 de agua). El tampn(BUFFER DE PCR) de PCR contena 5-carboxi-X-rodamina
(500 nM) como el colorante de referencia para la normalizacin de las reacciones. Las
posibles fluctuaciones en las seales de 5-carboxi-X-rhoda minas se utilizan para corregir
la seal de muestra. Las mezclas maestras fueron recin preparadas para cada uno de los
ensayos de PCR en tiempo real. Para generar un RNA de CCR5 curva estndar para
cuantificar ARNm de CCR5 en clulas inmunes humanas, cantidades conocidas de ARN
estndar de CCR5 eran 10 veces diluy en serie y luego amplificado en la misma placa en
condiciones idnticas. La cantidad de ARNm de CCR5 en las muestras se calcula
automticamente por la ABI 7000 SDS sobre la base de los datos obtenidos a partir de la
curva estndar. Todas las reacciones de amplificacin se realizaron por duplicado, y el
promedio de nmero de copias de los duplicados son pre-sentados en este informe, a
menos que se especifique lo contrario. Para el control de la integridad del ARN y
normalizar los niveles de ARNm de CCR5 en MDM y PBL, GAPDH ARN aislado de MDM y
PBL se amplific por tiempo real RT-PCR con SYBR verde brillante mezcla maestra QPCR
(Stratagene, La Jolla, CA) con la ABI 7000 SDS. Para cada PCR, se aadieron los duplicados
de 2 micro litros de molde de ADNc a 48 microlitros de la mezcla maestra QPCR que
contena 200 nM de cada uno de los dos cebadores y la mezcla se amplific. Las
condiciones del ciclo fueron las mismas que para el CCR5, excepto la amplificacin
continu durante 40 ciclos. Se utiliz la mezcla maestra segn las instrucciones de
Stratagene. Para generar una curva estndar de ARN total con cebadores GAPDH,
conocido cantidades de estndar de ARN total extrado de agrupado de PBMC se
diluyeron en serie (que van desde 8 a 1.000 ng) y se amplific durante 40 ciclos. Las
muestras de MDM y PBL fueron amplificados en la misma placa con el estndar GADPH en
condiciones idnticas. La cantidad (en nanogramos) de ARN total en las muestras se
calcul tambin de forma automtica por la ABI 7000 SDS sobre la base de los datos
obtenidos a partir de la curva estndar de ARN total. Todas las reacciones de amplificacin
se realizaron por duplicado, y una cantidad de ARN promedio (en nanogramos) de los
duplicados se utiliz para normalizar los niveles de ARNm de CCR5 en MDM y PBL. Para
cuantificar los niveles de ARNm de CCR5, los ARNm de CCR5 nmero de copias en MDM y
muestras de PBL se dividieron por la cantidad de ARN total (en nanogramos) determinado
por el tiempo real de RT-PCR de GAPDH en la misma muestra y luego se multiplicaron por
1000 para convertir las unidades a CCR5 mRNA nmero de copias por microgramo de ARN
total. Por lo tanto, los niveles de ARNm de CCR5 en estas clulas se expresan como el
nmero de copias medio de CCR5 mRNA por microgramo de ARN total. Para estudiar el
rango dinmico, la precisin y reproducibilidad, 10 veces diluciones en serie del ARN
estndar de CCR5, que van desde 102 hasta 106 copias, se amplific y se utiliz como una
curva estndar en cada ensayo.
RESULTADOS

Sensibilidad del tiempo real de RT-PCR. La sensibilidad del tiempo real de RT-PCR se
determina mediante el uso de una serie de dilucin (0, 10, 102, 103, 104, 105, y 106
copias) de la norma de CCR5 ARN. El tiempo real de RT-PCR puede detectar CCR5 mRNA
nmero de copias tan bajas como 10 molculas con la tasa de deteccin de tan slo el
50% (5 de 10 repeticiones de 10 copias CCR5 mRNA aadido en la reaccin de
transcripcin inversa) (datos no mostrados). La tasa de deteccin, sin embargo, fue de
100% en CCR5 mRNA copia nmeros de 102 y superiores (10 de 10 repeticiones). El lmite
de deteccin, por lo tanto, fue de 102 molculas de ARN por reaccin. Un resultado
representativo se muestra en la figura. 2.
La figura. 2. En tiempo real la sensibilidad de
RT-PCR y anlisis de linealidad con el estndar
de CCR5 ARN derivado de pCCR5. Diluciones
serie de diez veces de la norma de ARN a partir
102 a 106 molculas por reaccin fueron
amplificados por la PCR en tiempo real. (A)
Curva estndar de diluciones seriadas de ARN
estndar de CCR5 con un coeficiente de
correlacin (R2) de 0,9976. (B) Grfico de
amplificacin de diluciones seriadas del ARN
estndar CCR5 que muestra el rango de
deteccin dinmica de 5 rdenes de magnitud
102-106 molculas. Una lectura de cambio en la
fluorescencia (Rn) como una funcin de los
nmeros de ciclo se demostr para un rango de
nmeros de copias de entrada conocida de la
transcripcin de RNA de CCR5. La sensibilidad
de deteccin fue de 100 copias de mRNA de
CCR5 por PCR.




Linealidad, rango de cuantificacin y precisin. Amplificacin de la norma ARN de CCR5 a
diferentes concentraciones mostr linealidad en un rango de 5 rdenes de magnitud (Fig.
2), y el coeficiente de correlacin (R ^ 2) era 0,9976. para determinar entre los ensayos
que se realizaron por separado (2 a 3 das de diferencia), 10 veces diluciones erial del
CCR5 ARN satandard (que oscila entre 10 ^ 2-10 ^ 6 ejemplares) fueron amplificados por
tiempo real de RT-PCR en cinco separada experimentos. Los coeficientes de variacin (CV)
de ciclo umbral intra-ensayo los valores (Ct) oscilaban entre 0,1 y 2,07% (tabla 1), y
vavriation intersassay es comparable a la de la variacin intra-ensayo (Tabla 2).





Linealidad y precisin de GAPDH en tiempo real de RT-PCR. La linealidad y precisin del
tiempo real de RT-PCR de GAPDH se evalu mediante la amplificacin de ARN total diluido
en serie de PBMC, que van desde 8 a 1000 ng por reaccin, como se describi
anteriormente. Para la precisin intra-ensayo, una cantidad conocida diluido en serie de
ARN total se amplific con cuatro repeticiones en la misma placa. Como se muestra en la
Tabla 3, la PCR en tiempo real de GAPDH tiene una excelente precisin intra-ensayo, con
un CV de 0,44-0,68%.

Para examinar la precisin del interensayo del tiempo real de RT-PCR de GAPDH, se realiz
el ensayo con las mismas muestras de cinco veces en diferentes fechas. Para cada
amplificacin, una alcuota de estndar de ARN total se diluy y se amplific por
duplicado. Como se muestra en la Tabla 4, los datos de cada ensayo fueron altamente
reproducibles. Una de las curvas de nivel de representacin y parcelas de eficiencia de
amplificacin se muestra en la figura. 3. La linealidad y la eficiencia eran excelentes como
se determina por el coeficiente de correlacin (R2=1.0) y por la ecuacin de la curva
estndar (y= 3.4064x 25.675).

Cuantificacin de ARNm de CCR5 en MDM y PBL. Dado que las clulas inmunes humanas
son las principales clulas que expresan CCR5, el mayor correceptor para la entrada del
VIH en los macrfagos, se analiz la aplicabilidad de tiempo real RT-PCR para
cuantificacin de la de CCR5 mRNA en MDM y PBL aislados de la sangre perifrica de
adultos. Para comparar los niveles de ARNm de CCR5 en MDM y PBL del mismo donante,
el ARN total de la MDM y PBL obtuvo a partir de 3 donantes fue amplificado por CCR5 en
tiempo real de RT-PCR y cuantificado como se ha descrito anteriormente. Los niveles de
mRNA de CCR5 se expresaron como CCR5 mRNA copias por microgramo de ARN total. La
reproducibilidad del ensayo con cuatro repeticiones era excelente, con una variacin de
menos de 10%. Como era de esperar, MDM expresa niveles ms altos de ARNm de CCR5
que se PBL aislados del mismo donante (Tabla 5).

DISCUSIN

La capacidad de controlar el progreso en tiempo real del proceso de amplificacin
revoluciona por completo la cuantificacin basada en PCR de ADN y ARN. En la PCR en
tiempo real, las reacciones se caracterizan por el punto en el tiempo durante un ciclo
cuando se detecta la amplificacin de un producto de PCR de primera en lugar de la
cantidad de producto de PCR acumulada al final de todo el proceso de PCR. La CT se
define como el nmero de ciclo fraccional al que la fluorescencia pasa el umbral fijo.
Cuanto mayor sea el nmero de copias a partir de la diana de cido nucleico, se observa
que cuanto antes un aumento significativo de la fluorescencia, y menor el valor de CT es.
PCR en tiempo real permite la CT que se observ cuando la amplificacin por PCR se
encuentra todava en la fase exponencial. Por lo tanto, el CT es una medida fiable del
nmero de copias a partir de ARNm en un proceso de amplificacin por PCR en tiempo
real.
Desde CCR5 en tiempo real de RT-PCR tiene un rango de deteccin dinmico amplio (102 a
106 copias por reaccin), no hay necesidad de diluir o concentrar muestras, que era uno
de los problemas encontrados en la competitiva cuantificacin de RT-PCR (8). Puesto que
no hay necesidad de correr los productos amplificados por PCR en gel de agarosa despus
de la en tiempo real de RT-PCR, este ensayo no solo elimina el procesamiento posterior a
la PCR, pero tambin evita la variacin y la contaminacin causada por la manipulacin
posterior a la PCR. Adems, los costes asociados con el uso de este sistema son similares a
los de la RT-PCR convencional, ya que este sistema permite el procesamiento de mltiples
muestras con tiempo de trabajo mnima y no hay necesidad de ejecutar una electroforesis
en gel de agarosa.
En este estudio, hemos utilizado con xito el tiempo real de ensayo de RT-PCR para la
cuantificacin de los niveles de ARNm de CCR5 en clulas inmunes de la sangre humana.
Este ensayo era altamente especfica, ya que el ensayo utiliza dos cebadores especficos y
una sonda (MB) para amplificar el ARNm de CCR5. El tiempo real de RT-PCR de CCR5 fue
tambin un ensayo altamente sensible con un amplio rango de deteccin y una excelente
reproducibilidad (fig. 2; las Tablas 1 y 2). El uso de tiempo real el ensayo de PCR CCR5, que
mostr que MDM tena mayores niveles de transcripciones de ARNm de CCR5 hizo PBL
(Tabla 5). Nuestros datos han demostrado que en tiempo real de CCR5 RT-PCR es precisa,
sensible, y altamente reproducible. Por lo tanto, este ensayo tiene una amplia aplicacin
en los estudios sobre la funcin molecular de CCR5 sig-Naling en la inflamacin y las
infecciones virales, incluyendo el VIH.
AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH DA 112.815 y 16.200 W.-ZH y NIH
subvenciones MH 49981, AA 13547, U01 AI 32921 y U01 AI 41089 a SDD