Revista Avanzada Cientfica Vol. 1 No.

3 Ao 1998

Aislamiento y caracterizacin de cepas de Bacillus spp. Productoras de
enzimas proteolticas para la produccin de hidrolizados de protenas.

Isolation and characterization of strains of Bacillus spp. Production of
proteolytic enzymes for the production of protein hydrolysates.


Manuel Prez Quintana
Universidad de Matanzas
Cuba

Grethel Milin Florido
Universidad de Matanzas
Cuba

Gilfredo Alfonso Gonzlez
Instituto de Ciencia Animal
Cuba

Roberto Gonzlez Castellanos
Universidad de Matanzas
Cuba

Ral Piad Barreras
Universidad de Matanzas
Cuba

Gerardo Ascunce del Sol.
Planta Productora de Conservas y Vegetales ``Libertad. Coln
Cuba


RESUMEN:
Fueron aisladas 100 cepas de Bacillus spp. productoras de proteasas, de ellas
se seleccion la ms eficiente por su halo de hidrlisis en medio agar nutriente-
casena. Se estudi el medio y las condiciones de cultivo sobre la produccin
de proteasas y su actividad con el fin de optimizar las condiciones de
produccin de la enzima. Para ello se utiliz un Diseo de experimento
factoriales y un Compuesto Central Rotativo; los resultados fueron tratados por
el mtodo matemtico de la Superficie de Respuesta. Se obtuvieron valores
ptimos de actividad de enzimtica 12 U Anson con el medio y las condiciones
de cultivo ptimas. El extracto enzimtico producido (ESS) bajo condiciones
ptimas fue probado para la produccin de hidrlizados de protenas de sangre
total bovina, con una razn de hidrlisis con valores entre 30 y 35%.

Revista Avanzada Cientfica Vol. 1 No. 3 Ao 1998
Palabras claves: Aislamiento, Bacillus spp., optimizacin, medio de cultivo,
hidrlisis enzimtica.

ABSTRACT:
In this work 100 Bacillus spp. strains to produce proteolytic enzymes were
isolated. The more efficient strain was selected by means of its hydrolysis halo
in agar nutrient casein. The medium and the culture conditions for producing the
proteolytic enzymes extract (ESS) under the best conditions were optimised.
For that reason a factorial desing combination (fraccionary factorial and central
composite desing) was utilized. The results were presented by a surface
response method. A optimal enzymatic activity of 12 U Anson in the EES was
ontained. The EES was used to make hydrolysis from bovine blood and a yield
of 30 to 35 % of hydrolysis degree was reached.
Key word: Isolation, Bacillus spp., optimization, culture medium, enzymatic
hydrolysis.

INTRODUCCIN:
Las enzimas constituyen un grupo de biomolculas de alta actividad cataltica y
especificidad de accin que han ido alcanzando un notable incremento
aplicativo en la industria manufacturera y procesadora, en particular la industria
alimenticia (knorr et al., 1985).
La utilizacin de las enzimas microbianas como sustitutas de las obtenidas a
partir de organismos superiores es una tendencia creciente a nivel mundial
(frost y Moss, 1987), dado el nmero de ventajas que presentan estas fuentes,
entre las que deben sealarse: Mayor facilidad de escalado de las
producciones y por tanto ms posibilidad de satisfacin de las demandas,
posibilidad de aumento de la productividad mediante mejoramiento de cepas,
mayor facilidad de cultivo en ambientes controlados y menor duracin de los
ciclos de produccin.
De estos biocatalizadores industriales, las proteasas representan el 59% del
total de las enzimas que ofrecen un mercado mundial valorado en ms de 500
millones de dlares anuales (Godfrey et al., 1987). Sus usos en la industria
alimenticia incluyen la manufactura de quesos, tenderizacin de carnes,
produccin de helados, cerveza, desarrollo de sabores y modificacin de la
viscoelasticidad del pan (Loffer, 1986). Igualmente son muy valoradas en la
produccin de detergentes para lavandera y como limpiadores de sistemas de
ultrafiltracin (Smith et al., 1986). Destaca adems su importancia clnica en la
produccin de hidrolizados de protenas para dietas nutricionales y
teraputicas (Adler-Nissen, 1986).
Las proteasas obtenidas a partir de bacterias del gnero Bacillus representan
las de mayor significado aplicativo en la biotecnologa mundial (Doi, 1991). De
ellas, resalta por su gran diversidad de utilizacin la subtilisina
(Subtilopeptidasa A.) (loffer, 1986; Smith et al., 1986 y Blinkousky et al., 1994),
serino-proteasa secretada durante una fase de su crecimiento por el B. subtilis
y otros microorganismos relacionados.
Esta proteasa se produce fundamentalmente a escala industrial para su

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utilizacin en formulaciones detersivas, en la manufactura de hidrolizados
proteicos a partir diferentes fuentes proteicas (Gutman et al., 1992).
Ha sido tradicional desarrollar los estudios para optimizar los procesos de
produccin de enzimas mediante la variante experimental un factor un tiempo.
Es de destacar que cuando se emplean estos protocolos no se tienen
presentes las interacciones entre variables independientes. Es por ello que en
la actualidad la tendencia sea tratar los problemas de las producciones
microbianas y los estudios bioqumicos en general, aplicando las tcnicas del
Diseo Estadstico de Experimento que se emplean en las especialidades de
Ciencias Tcnicas con los que es posible considerar estas interacciones.
Los hidrolizados enzimticos de protenas de alta calidad, por su parte, tienen
un amplio uso como componente teraputico y nutricionales en mltiples
organismos superiores registrando un gran incremento en los ltimos aos.
El presente trabajo tiene como objetivos:
Aislar y clasificar cepas productoras de proteasas.
Optimizar a nivel industrial el ESS a partir de la cepa seleccionada.
Utilizar el ESS para la produccin de hidrolizados proteicos a partir de sangre
bovina total.

MATERIALES Y MTODOS
Aislamiento de cepas de Bacillus sp productoras de enzimas proteolticas:
Fueron aisladas 100 cepas de bacterias pertenecientes al gnero Bacillus a
partir de muestras de leche entera y desechos colectados en la Planta
Productora de Conservas y Vegetales "Libertad"; Coln, Matanzas. Se
eliminaron todas las formas vegetativas de las muestras utilizadas para el
aislamiento por tratamiento trmico a 100 0C por un tiempo de 5 minutos.
Posteriormente se hicieron diluciones seriadas y se inocul 0.1 ml de
suspensin de esporas en placa petri que contena 20 ml de medio de cultivo
agar nutriente-casena pH 7.5. La incubacin se desarroll en una incubadora
elctrica SMIC a 40 0C de temperatura. Se midieron los halos de hidrlisis
sobre casena a las 12, 24, 36 y 48 horas.
Las cepas de mayor halo fueron purificadas mediante tcnica de agotamiento
en placas y conservadas en solucin salina estril ( Pelczar, 1979 ) en un
Banco de cepas perteneciente al Laboratorio de Biotecnologa de la
Universidad de Matanzas.
Medio y condiciones de cultivo: Se utiliz para el crecimiento microbiano y
produccin de enzima un medio de cultivo con los siguientes componentes
constantes: Na2HPO4 (MERK) y Peptona Bacteriolgica (LABIOFAM). Se
utilizaron como variables independientes para el diseo los componentes
mayoritarios siguientes: fuente de nitrgeno (autolizado de levadura forrajera);
fuente de carbono (mieles finales de la industria azucarera) y fuente de calcio
(cloruro de calcio MERK).
Fueron aadidos 100 mL de medio lquido en erlenmeyers de 1000 mL de
capacidad total. La esterilizacin se hizo en una autoclave vertical a 121 0C y
1.1 atmsfera de presin en un tiempo de 20 minutos. Las corridas
experimentales se desarrollaron en Zaranda Rotatoria INNOVA 1430.

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Con el objetivo de optimizar la temperatura de produccin de enzimas, la
misma fue variada en un rango de 10 a 50 0C a intervalos de 10 0C. Asimismo,
se estudio la influencia del pH del medio de cultivo sobre el mismo parmetro,
para ello se vari con el empleo de un buffer fosfato el pH entre valores de 3.0
hasta 9.0 a intervalos de 1.0 unidad.
Diseo experimental y tratamiento estadstico de los resultados. Se hizo un
diseo de experimento Compuesto Central Rotativo y Ortogonal (Lpez, 1987),
donde se seleccionaron como variables independientes: la fuente de nitrgeno,
la fuente de carbono y la fuente de calcio, con los niveles 20 y 60 g/litro para la
primera variable, 50 y 100 g/litro para la segunda y 1 y 2 g/litros para la tercera,
como variable de respuesta fue seleccionada la actividad proteoltica. Los
niveles incluidos en este experimento obedecen a consulta en la literatura
especializada (Frost 1987) y a la experiencia en el laboratorio.
El nmero de experimentos a realizar (Nexp.), para este tipo de Diseo se
determin segn la siguiente expresin (Planes, 1988) :
Nexp.= 2k x 2k x No.
Donde:
k = Nmero de variables independientes.
2k = Nmero de puntos estrellas del experimento.
No = Nmero de puntos en el centro del experimento. El valor de No depende
del nmero de variables independientes, Segn la literatura (Askhnazarova
1982) este valor para 3 variables es 2.
Nexp.= 23 + 2 (3) + 2
Nexp.=16 experimentos
Los resultados fueron procesados segn el metodo de la Superficie de
Respueta (Krzysztof, 1994).
Determinacin de la actividad enzimtica. Para la determinacin de la actividad
proteoltica se procedi segn tcnica analtica reportada por Anson, 1973,
utilizando hemoglobina bovina desnaturalizada como sustrato. Se consider
una unidad de Actividad proteoltica (U), la cantidad de protena hidrolizada en
un minuto por un mL de extracto enzimtico.
Obtencin del extracto enzimtico a nivel industrial: La produccin de este
extracto enzimtico se desarroll en una escala industrial, en un fermentador
Biolaffite de 1000 L de capacidad total.
Uso del extracto de enzimas proteolticas para la produccin de hidrolizados
enzimticos de sangre bovina: El ESS fue empleado para la produccin de
hidrolizados enzimticos de sangre total bovina. Para ello se uso la variante
tecnolgica de los laboratorios LABIOFAM S.A, sustituyendo la enzima papana
(proteasa de la Carica papaya) por el ESS.

RESULTADOS Y DISCUSIN:
A todas las cepas crecidas en medio agar nutriente caseina se les midi el halo
de hidrlisis a las 48 horas, de ellas se seleccioneron las cuatro de mejor
comportamiento para el estudio cintico en medio slido.
Halos de hidrlisis frente a casena de las 4 cepas de Bacillus sp de mejor
comportamiento seleccionadas:

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Se desarroll un estudio cintico de la capacidad de hidrolizar la casena de las
4 cepas con actividad proteoltica seleccionadas. Se midieron los valores de
halos a la 12, 24, 36 y 48 horas. En la tabla 1 se presentan los resultados de
estas 4 cepas de mejor comportamiento.

Tabla 1. Valores de halos de hidrlisis frente a la casena (mm) de las cuatro
cepas seleccionadas.

Cepa 12 horas S 24 horas S 36 horas S 48 horas S
E-25 3.30e 0.15 20.43c 2.45 25.50b 3.34 24.50b 3.77
E-44 6.78d 0.16 24.05b 2.08 27.00a 3.05 27.02a 4.03
E-18 3.90e 0.20 16.50d 2.25 21.80c 3.33 21.84c 4.24
E-03 3.05e 1.14 16.00d 2.54 20.25c 3.56 20.24c 3.98
a,b,c,d,e Medias con letras diferentes en los suprandices difieren a P<0.01
(Duncan, 1955).
Se observa un mayor halo de hidrlisis en las cepas E-25 y E-44, con 25.5 y
27,0 mm respectivamente a las 36 horas de incubacin, las que difieren
significativamente de las tres restantes para Duncan P>0.05%. Este resultado
se compara favorablemente con el que obtuvo Roy (1991), quien desarroll un
Programa donde aisl 100 cepas de Bacillus sp. productoras de proteasas. En
su trabajo encontr un mximo halo de hidrlisis frente a casena de 23.5 mm
al cabo de 40 horas a 38 0C.
Resultados obtenidos con el uso del diseo Compuesto Central Rotativo
Ortogonal. Segn el Diseo compuesto Central rotativo se hicieron 16
experimentos. Cada uno de estos experimentos se desarroll con rplicas la
variable respuesta medida fue la actividad proteoltica.
Los resultados fueron tratados por el mtodo de la Superficie de Respuesta.
Con este mtodo se representan los valores promedios de actividad enzimtica
(U) obtenidos cuando se ensayaron las diferentes experimentos. Se grafican
los resultados (contactar con el autor para enviar grficas), y se obtiene la
siguiente combinacin de variables independientes como ptima: miel final 80
g/l; autolizado de levaduras 40 g/l y cloruro de Aclcio 1.75 g/l con un valor de
actividad enzimtica de 96.69 U Anson.
Es de destacar que en 1993, Haltrich y colaboradores obtuvieron un incremento
de 330% en la produccin de xylanasa con una cepa salvaje de S. Commune,
mediante la optimizacin de la formulacin del medio y de las condiciones de
fermentacin, tanto a nivel de frascos agitados como en fermentadores de
banco y piloto, aplicando una combinacin de tcnicas de diseo de
experimento y superficie de respuesta. Esos resultados superon con creces a
los obtenidos por los medios tradicionales de optimizacin e incluso superiores
a los logrados con el uso de tcnicas de mejoramiento gentico de cepas
(Haltrich et al., 1993).
Por otra parte en un proceso para la produccin de enzimas por fermentacin
es necesario tener en cuenta el fenmeno de induccin y represin catablica
(Mandels et al. 1962). Muchas enzimas son producidas en cantidades, solo en
presencia de inductores especficos. Un ejemplo de estos componentes

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inductores es el autolizado de levaduras. En el presente trabajo se reportan
mayores niveles de actividad proteoltica cuando se utilizaron 60 g/litro de
autolizado de levadura en el medio de cultivo que cuando se emplearon 40
g/L. Este resultado coincide con lo reportes de Frost y Moss en 1993.
La represin catablica, por su parte, es el proceso donde la sntesis de la
enzima es suprimida por la presencia de fuentes de carbono fcilmente
metabolizables. La glucosa es el ms comn metabolito represor (Demain
1992), esta represin puede ser prevenida, con el diseo de medios de cultivo
carentes de estas fuentes de carbono.
La miel final, usada en este trabajo como fuente de carbono presenta altos
niveles de glucosa. Ello explica los resultados ms bajos en actividad
enzimtica cuando se incorporaron al medio de cultivo 100 g/L de esta materia
prima.
Estudio cintico de temperatura y pH. La temperatura ptima para la
produccin de la enzima por la cepa seleccionada se determin a los 40 0C
con un valor de actividad de 97.34 U
Vavrova, 1990 obtuvo una razn mayor en la sntesis de proteasa de Bacillus
megaterium a una temperatura de 28 0C, mientras que la mayor razn de
crecimiento especfico la anot a los 42 0C. Por su parte Frost, 1993 encontr
una mayor produccin de proteasas de una cepa Bacillus sp. a 40 0C,
mientras report una temperatura ptima para el crecimiento de esta misma
cepa a 38 0C, este resultados coincide con los reportados en este trabajo.
A pH 8.0 se obtuvieron los valores ms elevados de actividad por la cepa en
estudio con 97.43 U
Es de destacar que el crecimiento de las clulas microbianas esta muy
influenciado por el pH. En muchos casos, al igual que para la temperatura el pH
donde se obtiene la mayor razn de crecimiento especfico difiere del pH
ptimo para la sntesis de la enzima por la misma cepa.
Keay et al 1970, obtuvo un valor ptimo de actividad proteasa-serina a partir de
Bacillus licheniformis a un pH de 10.5, los mejores resultados de crecimiento
para esta especie los encontr a un pH de 8.5.
Aunstrup 1980, obtuvo resultados similares a los reportados en este trabajo,
investigando con una cepa de Bacillus sp, l report valores ptimo de
actividad a un pH de 8.0.

BIBLIOGRAFIA:
Adler-Nissen.J. "Enzimatyc Hydrolisis of Food Proteins" Elsevier Applied
Science. /New York/:104-271, (1986).
Anson, M. L. J. Physiol. 20, 1973.
Aunstrup, K. "Proteinase". Economic Microbiology, 5 : 48-114, 1980.
Blinkousky. A. M., Khmelnitsky,Y.L. and Dordick, S. "Organosoluble enzyme-
polymer complexes: A novel type of biocatalyst for nonaqueous media"
Biotechnol. Tech .8 (1): 33-38, (1994).
Chen, nK.-C., Lee, T.-C. y Houng, J. Y., "Search method for the optimal
medium for the production of lactase by Kluyveromices fragilis, Enzyme Microb.
Biotechnol. 14: 659-664, 1992.

Revista Avanzada Cientfica Vol. 1 No. 3 Ao 1998
Demain, A. L. "Catabolite regulation in industrial microbiology". In "
Overproduction of Microbial Products" (V. Krumphanzl, B. Sikyta, and Z.
Vanek, eds.). Landon, Academics Press, 1992.
Doi. H.R. "Proteolytic activities in bacillus" Curr.Opin.Biotech, 2:682-684.
(1991).
Duncan, D. B. "Multiple range and test. Biometrics 11: 1, 1975.
Frost, G.M. and Moss, D.A. "Production of Enzymes by Fermentation"
Biotechnology, 7:333, 1993.
Godfrey, T. R. "Introduction to industrial enzimology". New York, 1987.
Haltrich, D, Preiss, M. y Steiner W. Optimization of a culture medium for
increased xylanase production by a wild strain of Schizophyllum commune.
Enzyme Microb.Technol 15: 854-860, 1993.
Houng, J.-Y., Chen, K.- C y Hsu, W.-H. "Optimization of cultivation medium
composition for isoamylase production" Applied Microbiol.Biotechnol. 31: 61-64,
1989.
Keay, L., and Wildi, B. S. "Proteases of the genus Bacillus. II. Alkaline
proteases". Biotechnol. Bioeng. 12: 213, 1970.
Knorr. D. and Sinskey. A.J."Biotecnology in food production and processing"
Science, 229:1224, (1985).
Link, S.,., Zhong, L.-C., "Central composite experimental design in the
optimization of lignin peroxidase production in shake cultures by free and
inmobilized Phanerochaete chrysosporium. Bioprocess Eng. 6: 43-48, 1991.
Loffler, A. "Proteolytic enzymes: Sources and aplications". Food.
Technol.,40:63. (1986).
Lopez, P. R. " Diseo Estadstico de Experimentos". La Habana, Editorial
Cientfico-Tcnico, 1988.
Mandels,M., and Reese, E. T. " Induction of cellulase in Trichoderma viride as
influenced by carbon sources and metals". J. Bacteriol. 73: 269, 1962.
Roy H. D. 1991 " Proteolytic Activities in Bacillus". Biotechnology. 2 : 282-684,
1991. a
Sawicka-Zukowska, R.; Malonowska, J. Effect of pH, temperature and O2
concentration in medium on proteolytic enzyme production by Bacillus subtilis
40". Abh. Akad. wiss. DDR, Abt. Math. Naturwiss. Tech. (3n, Mikrob.
Enzymprod.):373-377, 1982.
Smith, K.E. and Bradley, R.L. "Activity of four anzyme-based cleaners for
ultrafiltrations systems against proteins in skim milk and whey". J. Dairy. Sac.
70:243, (1987).
Vanrova, M. and Chaloupka, J. "Temperature shiftup suppresses synthesis of
extracelular proteins in Bacillus megaterium". Curr. Microbiol. 12: 9, 1990.

Fecha de recepcin: 15/09/1998 Fecha de aprobado:: 21/11/1998