P r o c . N a t i . A c a d . S c i .

US A
V o l . 9 1 , p p . 5 8 4 3 - 5 8 4 7 , J u n e 1 9 9 4
M e d i c a l S c i e n c e s
M o l e c u l a r b a s i s f o r H b l o o d g r o u p d e f i c i e n c y i n Bo mb a y ( O h ) a n d
p a r a - Bo mb a y i n d i v i d u a l s
( A BO b l o o d g r o u p / S e c r e t o r b l o o d g r o u p / o l i g o s a c c h a r i d e b i o s y n t h e s i s / f u c o s y l t r a n s f e r a s e / s u r f a c e a n t i g e n )
RO BERT J . K EL L Y * , L IN DA K . ERN S T* , RO BERT D. L A RS EN t , J A N E G . BRY A N T$ , J UDY S . RO BIN S O N ,
A N D J O HN B. L O WE* t
* Ho w a r d Hu g h e s M e d i c a l In s t i t u t e a n d t De p a r t me n t o f P a t h o l o g y , Un i v e r s i t y o f M i c h i g a n , M e d i c a l S c i e n c e Re s e a r c h Bu i l d i n g I, Ro o m 3 5 1 0 , 1 1 5 0 We s t
M e d i c a l C e n t e r Dr i v e , A n n A r b o r , M I 4 8 1 0 9 - 0 6 5 0 ; A me r i c a n Re d C r o s s Re f e r e n c e L a b o r a t o r y , 2 4 2 5 P a r k Ro a d , C h a r l o t t e , N C 2 8 2 0 3 ; a n d t Un i v e r s i t y
o f
K e n t u c k y
Bl o o d Ba n k , Ro o m HA 6 2 8 , Un i v e r s i t y o f K e n t u c k y M e d i c a l C e n t e r , 8 0 0 Ro s e S t r e e t , L e x i n g t o n , K Y 4 0 5 3 6
C o mmu n i c a t e d b y Ro b e r t L . Hi l l , De c e mb e r 9 , 1 9 9 3
A BS TRA C T Th e p e n u l t i ma t e s t e p i n t h e b i o s y n t h e s i s o f
t h e h u ma n A BO b l o o d g r o u p o l i g o s a c c h a r i d e a n t i g e n s i s c a t -
a l y z e d b y a - ( 1 , 2 ) - f u c o s y l t r a n s f e r a s e ( s ) ( G DP - L - f u c o s e : f l D-
g a l a c t o s i d e 2 - a - L - f u c o s y l t r a n s f e r a s e , EC 2 . 4 . 1 . 6 9 ) , w h o s e e x -
p r e s s i o n i s d e t e r mi n e d b y t h e H a n d S e c r e t o r ( S E) b l o o d g r o u p
l o c i ( a l s o k n o w n a s FUTI a n d FUT2 , r e s p e c t i v e l y ) . Th e s e
e n z y me s c o n s t r u c t Fu c a l - ) 2 G a l h 3 - l i n k a g e s , k n o w n a s H
d e t e r mi n a n t s , w h i c h a r e e s s e n t i a l p r e c u r s o r s t o t h e A a n d B
a n t i g e n s . Er y t h r o c y t e s f r o m i n d i v i d u a l s w i t h t h e r a r e Bo mb a y
a n d p a r a - Bo mb a y b l o o d g r o u p p h e n o t y p e s a r e d e f i c i e n t i n H
d e t e r mi n a n t s , a n d t h u s A a n d B d e t e r mi n a n t s , a s a c o n s e -
q u e n c e o f a p p a r e n t h o mo z y g o s i t y f o r n u l l a l l e l e s a t t h e Hl o c u s .
We r e p o r t a mo l e c u l a r a n a l y s i s o f a h u ma n a - ( 1 , 2 ) -
f u c o s y l t r a n s f e r a s e g e n e , t h o u g h t t o c o r r e s p o n d t o t h e H b l o o d
g r o u p l o c u s , i n a Bo mb a y p e d i g r e e a n d a p a r a - Bo mb a y p e d i -
g r e e . We f i n d i n a c t i v a t i n g p o i n t mu t a t i o n s i n t h e c o d i n g r e g i o n s
o f b o t h a l l e l e s o f t h i s g e n e i n e a c h H- d e f i c i e n t i n d i v i d u a l . Th e s e
r e s u l t s d e f i n e t h e mo l e c u l a r b a s i s f o r H b l o o d g r o u p a n t i g e n
d e f i c i e n c y i n Bo mb a y a n d p a r a - Bo mb a y p h e n o t y p e s , p r o v i d e
c o mp e l l i n g e v i d e n c e t h a t t h i s g e n e r e p r e s e n t s t h e h u ma n H
b l o o d g r o u p l o c u s , a n d s t r o n g l y s u p p o r t a h y p o t h e s i s t h a t t h e
H a n d S E l o c i r e p r e s e n t d i s t i n c t a - ( 1 , 2 ) - f u c o s y l t r a n s f e r a s e
g e n e s . C a n d i d a t e s e q u e n c e s f o r t h e h u ma n S E l o c u s a r e
i d e n t i f i e d b y l o w - s t r i n g e n c y S o u t h e r n b l o t h y b r i d i z a t i o n a n a l -
y s e s , u s i n g a p r o b e d e r i v e d f r o m t h e H a - ( 1 , 2 ) - f u c o s y l t r a n s -
f e r a s e g e n e .
Th e a n t i g e n s d e t e r mi n e d b y t h e h u ma n A BO b l o o d g r o u p
l o c u s a r e o l i g o s a c c h a r i d e mo l e c u l e s c o n s t r u c t e d b y t h e s e -
q u e n t i a l a c t i o n o f s p e c i f i c g l y c o s y l t r a n s f e r a s e s . Th e f i n a l s t e p
i n t h i s p a t h w a y i s c a t a l y z e d b y a l l e l i c g l y c o s y l t r a n s f e r a s e s
e n c o d e d b y t h e A BO l o c u s . Th e s e e n z y me s r e q u i r e a p r e -
c u r s o r o l i g o s a c c h a r i d e s u b s t r a t e ( Fu c a l
- *
2 G a l f - ) k n o w n a s
t h e H b l o o d g r o u p a n t i g e n , c o n s t r u c t e d b y a - ( 1 , 2 ) - f u c o s y l -
t r a n s f e r a s e ( s ) [ a ( 1 , 2 ) FTs ; G DP - L - f u c o s e : 4 3 D- g a l a c t o s i d e
2 - a - L - f u c o s y l t r a n s f e r a s e , EC 2 . 4 . 1 . 6 9 ] . G e n e t i c a n d b i o -
c h e mi c a l o b s e r v a t i o n s a r e c o n s i s t e n t w i t h a h y p o t h e s i s t h a t
t h e H a n d S e c r e t o r ( S E) b l o o d g r o u p l o c i ( a l s o k n o w n a s
FUTI a n d FUT2 , r e s p e c t i v e l y ) c o r r e s p o n d t o d i s t i n c t
a ( 1 , 2 ) FT g e n e s w i t h t i s s u e - s p e c i f i c e x p r e s s i o n p a t t e r n s a n d
c l o s e g e n e t i c l i n k a g e o n c h r o mo s o me 1 9 ( 1 - 6 ) . Un d e r t h i s
t w o - l o c u s mo d e l ( 2 ) , t h e h u ma n H b l o o d g r o u p l o c u s d e t e r -
mi n e s e x p r e s s i o n o f t h e H a n t i g e n ( a s w e l l a s A a n d / o r B
a n t i g e n s ) i n t h e e r y t h r o i d l i n e a g e , w h e r e a s t h e S E l o c u s
c o n t r o l s H e x p r e s s i o n ( a n d t h u s A o r B a n t i g e n e x p r e s s i o n )
i n a v a r i e t y o f s e c r e t o r y e p i t h e l i a a n d i n s a l i v a ( Ta b l e 1 ) .
N e a r l y a l l h u ma n s ma i n t a i n a t l e a s t o n e f u n c t i o n a l H a l l e l e
( 1 ) . Ro u g h l y 8 0 % o f t h e s e ( S e c r e t o r s ) a l s o ma i n t a i n a t l e a s t
o n e f u n c t i o n a l S E a l l e l e , w h e r e a s t h e r e ma i n d e r ( n o n -
Ta b l e 1 . P h e n o t y p e s a n d p r e d i c t e d g e n o t y p e s a t t h e h u ma n H
a n d S E b l o o d g r o u p l o c i ( s e e r e f . 2 )
P h e n o t y p e
S e c r e t o r y
Tr i v i a l n a me Er y t h r o i d e p i t h e l i a G e n o t y p e
S e c r e t o r H p o s i t i v e H p o s i t i v e H/ H, S E/ -
N o n - S e c r e t o r H p o s i t i v e H n e g a t i v e H/ H, s e / s e
p a r a - Bo mb a y
( h / h S e c r e t o r ) H n e g a t i v e H p o s i t i v e h / h , S E/ -
Bo mb a y
( h / h n o n - S e c r e t o r ) H n e g a t i v e H n e g a t i v e h / h , s e / s e
S e c r e t o r s ) a r e h o mo z y g o u s f o r n u l l a l l e l e s a t t h e S E l o c u s .
In d i v i d u a l s o f t h e r a r e O h ( Bo mb a y ) p h e n o t y p e ( 1 , 7 ) l a c k H
d e t e r mi n a n t s i n a l l t i s s u e s a n d a r e t h o u g h t t o b e h o mo z y g o u s
f o r n u l l a l l e l e s a t b o t h l o c i ( Ta b l e 1 ) ( 2 ) . O t h e r r a r e i n d i v i d -
u a l s , o f t h e p a r a - Bo mb a y p h e n o t y p e ( 1 , 8 ) , s y n t h e s i z e H
d e t e r mi n a n t s i n t h e i r s e c r e t o r y e p i t h e l i a b u t n o t i n t h e
e r y t h r o i d l i n e a g e ( 1 ) . Th e s e p e r s o n s a r e b e l i e v e d t o b e
h o mo z y g o u s f o r n u l l a l l e l e s a t t h e H l o c u s ( 1 , 2 ) b u t a p p a r -
e n t l y h a v e a t l e a s t o n e f u n c t i o n a l S E a l l e l e .
Th e b a s i s f o r n u l l a l l e l e s a t t h e s e l o c i h a s n o t b e e n d e f i n e d ,
n o r h a s t h e t w o - l o c u s h y p o t h e s i s b e e n c o n f i r me d a t t h e
mo l e c u l a r l e v e l . We h a v e p r e v i o u s l y i s o l a t e d a h u ma n
a ( 1 , 2 ) FT c DN A w h o s e c o g n a t e e n z y me i s k i n e t i c a l l y s i mi l a r
t o t h a t o f t h e H a ( 1 , 2 ) FT a n d w h o s e c h r o mo s o ma l l o c a t i o n
( n u mb e r 1 9 ) i s s y n t e n i c t o t h e H b l o o d g r o u p l o c u s ( 9 ) . To
c o n f i r m t h e h y p o t h e s i s t h a t t h i s c DN A c o r r e s p o n d s t o t h e H
l o c u s , a n d t o i d e n t i f y t h e mo l e c u l a r b a s i s f o r d e f i c i e n c y o f H
d e t e r mi n a n t s i n p r e s u me d h / h i n d i v i d u a l s , w e d e t e r mi n e d t h e
g e n o mi c s t r u c t u r e a n d s e q u e n c e o f a w i l d - t y p e a l l e l e a n d
c o mp a r e d i t t o a l l e l e s t a k e n f r o m H- d e f i c i e n t i n d i v i d u a l s .
In a c t i v a t i n g p o i n t mu t a t i o n s w e r e i d e n t i f i e d w i t h i n t h e c o d i n g
p o r t i o n s o f e a c h s u c h a l l e l e , i n c l u d i n g a l l e l e s i n i n d i v i d u a l s
w i t h w i l d - t y p e S E l o c u s - d e t e r mi n e d H a n t i g e n e x p r e s s i o n .
Th e s e r e s u l t s y i e l d a mo l e c u l a r e x p l a n a t i o n f o r A BH b l o o d
g r o u p d e f i c i e n c y i n Bo mb a y a n d p a r a - Bo mb a y i n d i v i d u a l s ,
p r o v i d e g e n e t i c s u p p o r t f o r a s s i g n me n t o f t h i s a ( l , 2 ) FT g e n e
t o t h e H l o c u s , a n d i n d i c a t e t h a t t h e S E l o c u s r e p r e s e n t s a n
a ( 1 , 2 ) FT g e n e d i s t i n c t f r o m t h e H l o c u s .
M A TERIA L S A N D M ETHO DS
C l o n i n g o f a ( 1 , 2 ) FT A l l e l e s . G e n o mi c DN A s e q u e n c e s
c o r r e s p o n d i n g t o a p r e v i o u s l y d e s c r i b e d h u ma n a ( 1 , 2 ) FT
c DN A [ p C DM 7 - a ( 1 , 2 ) FT; r e f . 9 ] w e r e i s o l a t e d f r o m p h a g e
g e n o mi c DN A l i b r a r i e s p r e p a r e d f r o m l e u k o c y t e DN A i s o -
l a t e d f r o m a n H- p o s i t i v e i n d i v i d u a l a n d f r o m a n H- d e f i c i e n t
A b b r e v i a t i o n : a ( 1 , 2 ) FT, a - ( 1 , 2 ) - f u c o s y l t r a n s f e r a s e .
$ To w h o m r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .
5 8 4 3
Th e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g e
p a y me n t . Th i s a r t i c l e mu s t t h e r e f o r e b e h e r e b y ma r k e d " a d v e r t i s e me n t "
i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U. S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .
5 8 4 4 M e d i c a l S c i e n c e s : K e l l y e t a l .
i n d i v i d u a l ( X ; Bo mb a y p h e n o t y p e ) ( 1 0 ) . L i b r a r i e s w e r e
s c r e e n e d b y p l a q u e h y b r i d i z a t i o n ( 1 1 ) u s i n g a 1 . 2 - k b Hi n f l
f r a g me n t i s o l a t e d f r o m t h e i n s e r t i n p C DM 7 - a ( 1 , 2 ) FT ( 9 ) .
A d j a c e n t Ec o RI f r a g me n t s o f 2 . 7 a n d 6 . 5 k b f r o m a s i n g l e
p h a g e w e r e s u b c l o n e d i n t o t h e u n i q u e Ec o RI s i t e i n t h e v e c t o r
p WE1 5 ( S t r a t a g e n e ) . Bo t h s t r a n d s o f t h e s e f r a g me n t s w e r e
s e q u e n c e d b y u s i n g o l i g o n u c l e o t i d e p r i me r s c o r r e s p o n d i n g t o
t h e i n s e r t s e q u e n c e .
Th e c o d i n g s e q u e n c e s o f t h e t w o a l l e l e s ( Y 1 a n d Y 2 ) f r o m
a p a r a - Bo mb a y i n d i v i d u a l w e r e g e n e r a t e d w i t h t h e P C R ( 1 1 ) ,
u s i n g p r i me r p a i r s f l a n k i n g t h e mu t a t i o n i n Y 2 ( Fi g . 1 ) . O n e
p a i r o f t h e s e p r i me r s a mp l i f i e s a s e q u e n c e b e t w e e n a p o s i t i o n
w i t h i n t h e i n t r o n a t a l o c a t i o n 1 8 7 - 1 5 7 n t 5 ' t o t h e A o f t h e
i n i t i a t i o n c o d o n ( G C G C A A G C TTC TC A IC C C Ti A A A C .
C TA G G A C TC A G G C TC T) a n d a t n t 1 0 3 5 - 1 0 6 5 w i t h i n t h e
c o d i n g s e q u e n c e ( t a k i n g t h e A r e s i d u e o f t h e i n i t i a t i o n c o d o n
a s n t 1 , n u mb e r e d a s i n r e f . 9 ; G C G C TC TA G A E[ C A T-
TA A TG C C C A C C C A C TC G G G C A G ) a t a s i t e 3 ' t o t h e Y 2
mu t a t i o n . Th e o t h e r p r i me r p a i r a mp l i f i e s a s e q u e n c e b e -
t w e e n n t 6 5 7 a n d 6 8 5 o f t h e c o d i n g s e q u e n c e ( 5 ' t o t h e Y 2
mu t a t i o n ; G C G C A A G C TTG C G C C G TG G G G A C TA TC TG -
C A G G TTA TG C C ) a n d b e t w e e n n t 1 1 3 5 a n d 1 1 6 6 w i t h i n t h e
3 ' u n t r a n s l a t e d r e g i o n ( G C G C TC TA G A C A G G C C TC T-
G A A G C C A C G TA C TG C TG G C TC ) . G e n o mi c DN A w a s
s u b j e c t e d t o 3 0 c y c l e s o f a mp l i f i c a t i o n ( d e n a t u r a t i o n a t 9 4 TC
a
1 k b
e x o n 1 i n t r o n
5
'
u t
f o r 1 . 5 mi n ; a n n e a l i n g / e x t e n s i o n f o r 2 . 5 mi n a t 7 2 0 C ) . Fr a g -
me n t s g e n e r a t e d w i t h t h e s e p r i me r p a i r s w e r e s u b c l o n e d i n t o
p TZ1 9 R ( P h a r ma c i a L K B) . C l o n e s c o r r e s p o n d i n g t o a l l e l e
Y ,
a n d t o a l l e l e Y 2 w e r e d i s t i n g u i s h e d b y d i g e s t i o n w i t h Bs t N I
( c l e a v e s Y 2 , n o t w i l d t y p e o r Y 1 , a t t h i s p o s i t i o n ) . M u l t i p l e
c l o n e s c o r r e s p o n d i n g t o e a c h a l l e l e w e r e s e q u e n c e d t o d i s -
t i n g u i s h P C R e r r o r s f r o m a c t u a l s e q u e n c e p o l y mo r p h i s ms .
Th e s e a n a l y s e s i d e n t i f i e d t h e mu t a t i o n i n t h e Y 1 a l l e l e c o r -
r e s p o n d i n g t o a mi n o a c i d r e s i d u e 1 6 4 a n d i n d i c a t e d t h a t t h e
Y 1 a n d Y 2 c o d i n g r e g i o n s a r e o t h e r w i s e i d e n t i c a l t o t h e
w i l d - t y p e c o d i n g r e g i o n .
Ex p r e s s i o n V e c t o r C o n s t r u c t i o n a n d A n a l y s i s . Ex p r e s s i o n
v e c t o r s c o n t a i n i n g s i n g l e o r mu l t i p l e mu t a t i o n s w e r e a s s e m-
b l e d w i t h r e s t r i c t i o n f r a g me n t e x c h a n g e p r o c e d u r e s ( 1 1 ) ,
u s i n g r e s t r i c t i o n s i t e s i n t h e 6 . 5 - k b Ec o RI f r a g me n t t h a t
e n c o mp a s s e s t h e t w o a ( 1 , 2 ) FT e x o n s ( Fi g . 1 ) , c l o n e d i n t o t h e
Ec o RI s i t e o f v e c t o r p WE1 5 ( 1 2 ) . De t a i l s o f v e c t o r c o n s t r u c -
t i o n s a r e a v a i l a b l e f r o m t h e a u t h o r s . C O S - 1 c e l l s w e r e
t r a n s f e c t e d b y a DEA E- d e x t r a n p r o c e d u r e ( 1 1 ) . A c o n t r o l
v e c t o r ( p C DM 7 - C A T) e n c o d i n g c h l o r a mp h e n i c o l a c e t y l -
t r a n s f e r a s e [ d e r i v e d f r o m p S V 2 - C A T ( 1 1 ) a n d p C DM 7 ( 9 ) ]
w a s c o t r a n s f e c t e d t o a l l o w n o r ma l i z a t i o n f o r t r a n s f e c t i o n
e f f i c i e n c y . C e l l e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d 7 2 h r a f t e r t r a n s f e c -
t i o n ( 9 ) a n d w e r e u s e d i n a ( 1 , 2 ) FT a c t i v i t y a s s a y s ( 1 2 )
p e r f o r me d i n d u p l i c a t e u n d e r l i n e a r r e a c t i o n c o n d i t i o n s .
e x o n 2
c o d i n g r e g i o n
:
X .
1 .
y
K X
(
' 7 ~ '
r -
- o L-
Bo mb a y
X 1 w i l d - t y p e . . . t t t t t t t t a a g a c a g . . .
Bo mb a y . . . t t t t t t t t o a a g a c a g . . .
X 2 w i l d - t y p e . . . . t g c t g g g a t t a c a g g . . .
Bo mb a y . . . t g c t g g g g t t a c a g g . . .
X 3 w i l d - t y p e
Bo mb a y
. . . g c c t c a g t g c a t t t g . . .
. . . g c c t c a g g g c a t t t g . . .
Bs t N I
X 4 w i l d - t y p e . . . G C T G C C TA C C TG G C T . . .
* - - A A
Y 3 1 6 L
A . . .
A / u l
Bo mb a y . . . G C T G C C TA C C TG G C T
. . . A A S t o p
p a r a - Bo mb a y
A Iu l
Y 1 w i l d - t y p e . . . C TG A A G C TC TC T G G C . . .
* - - L K
L 1 6 4 S
G . . .
p a r a - Bo mb a y . . . C TG A A G C A C TC T G G C . . .
. . . L K H S G . . .
Bs t N I
Y 2 w i l d - t y p e . . . A C C TC C C A G G G C G A T . . .
* T S Q 2 7 6 G D . . .
Bf a l
p a r a - Bo mb a y . . . A C C TC C J A G G G C G A T . . .
. . . T S S t o p . . .
X 5 w i l d - t y p e . . . g t t g g c c g g g a t g g t . . .
Bo mb a y . . . g t t g g c c a g g a t g g t . . .
X 6 w i l d - t y p e . . . t t t t t t t a a t t a t t t . . .
Bo mb a y . . . t t t t t t t t a a t t a t t t . . .
FIG . 1 . S t r u c t u r e o f w i l d - t y p e a n d mu t a n t a ( 1 , 2 ) FT a l l e l e s . ( a ) S c a l e a n d l i n e a r ma p o f t h e g e n e . C o d i n g p o r t i o n o f e x o n 2 i s d e n o t e d b y
t h e s o l i d a r e a . N o n c o d i n g p o r t i o n s o f e x o n s 1 a n d 2 a r e s h a d e d . P o s i t i o n s o f DN A s e q u e n c e d i f f e r e n c e s b e t w e e n a w i l d - t y p e a l l e l e a n d a l l e l e s
i s o l a t e d f r o m H- d e f i c i e n t i n d i v i d u a l s ( X 1 - X 6 , Bo mb a y ; Y 1 a n d Y 2 , p a r a - Bo mb a y ) a r e i n d i c a t e d a b o v e t h e s c h e ma t i c . Re g i o n i n d i c a t e d b y A b e l o w
t h e ma p c o r r e s p o n d s t o t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n s i t e . DN A s e q u e n c e o f t h i s a r e a i s . . . t c c t c c c a a g c C C TC G C TG C C A G TC C G G A C A G G C T-
G G C G G A G G G G A G G G C C TG C C G G G C C G G A TA G C C G G A C G C C TG G C G T. . . , w h e r e u n d e r l i n e d n u c l e o t i d e s r e p r e s e n t t h e f i r s t 9 b a s e s
o f t h e h u ma n a ( 1 , 2 ) FT c DN A ( 9 ) . P r i me r - e x t e n s i o n a n a l y s e s ( d a t a n o t s h o w n ) d e f i n e t h e g e n e ' s t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n s i t e ( b o l d f a c e C ) i n a
c e l l l i n e ( A 4 3 1 ) t h a t e x p r e s s e s t h i s g e n e ( 9 , 1 2 ) . Re g i o n i n d i c a t e d b y B c o r r e s p o n d s t o t h e 5 ' s p l i c e j u n c t i o n b e t w e e n e x o n I a n d t h e i n t r o n
( . . . A G C A G C TC G G g t a a g t g g . . . . ; i n t r o n i c s e q u e n c e i n l o w e r c a s e l e t t e r s ) . u t , Un t r a n s l a t e d r e g i o n . Re g i o n i n d i c a t e d b y C i n t h e s c h e ma t i c
c o r r e s p o n d s t o t h e 3 ' s p l i c e j u n c t i o n b e t w e e n t h e i n t r o n ( l o w e r c a s e l e t t e r s ) a n d e x o n 2 ( u p p e r c a s e l e t t e r s ) ( . . . c a g l g c a t t t g c t a a t t c g c c t t t c c t c -
c c c t g c a g C C A TG TG G C TC . . . . ) . Un d e r l i n e d t r e s i d u e i n t h i s s e q u e n c e c o r r e s p o n d s t o mu t a t i o n X 3 ( s e e b ) . Un d e r l i n e d A TG r e s i d u e s
c o r r e s p o n d t o t h e e n z y me ' s i n i t i a t o r me t h i o n i n e c o d o n ( 9 ) . Re s t r i c t i o n s i t e s u s e d t o c r e a t e c h i me r i c a ( 1 , 2 ) FT v e c t o r s ( s e e Fi g . 2 ) , a n d t h e Ec o RI
a n d Dr a I s i t e s u s e d i n Fi g . 5 , a r e s h o w n b e l o w . ( b ) S e q u e n c e d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e w i l d - t y p e a l l e l e a n d t h e H- d e f i c i e n t a l l e l e s . N u c l e o t i d e
s e q u e n c e , p r e d i c t e d a mi n o a c i d s e q u e n c e , a n d a mi n o a c i d n u mb e r a r e s h o w n f o r e a c h s e q u e n c e d i f f e r e n c e . N u c l e o t i d e s e q u e n c e d i f f e r e n c e s
i n H- d e f i c i e n t a l l e l e s a r e u n d e r l i n e d . S e q u e n c e d i f f e r e n c e s ( X 1 - X 6 ) i d e n t i f i e d i n t h e Bo mb a y p r o p o s i t u s X a r e a t l e f t ( Bo mb a y ) . P o l y mo r p h i c
Bs t N I a n d A l u I s i t e s c o r r e s p o n d i n g t o t h e X 4 a l l e l e a r e o v e r l i n e d . S e q u e n c e d i f f e r e n c e s ( Y 1 a n d Y 2 ) i d e n t i f i e d i n t h e p a r a - Bo mb a y i n d i v i d u a l
Y a r e s h o w n a t r i g h t ( p a r a - Bo mb a y ) . P o l y mo r p h i c A l u I, Bs t N I, a n d Bf a I s i t e s c o r r e s p o n d i n g t o t h e
Y , a n d Y 2 a l l e l e s a r e o v e r l i n e d .
I0
A B
b
. . . . . . . . . . . .
P r o c . N a t l . A c a d S c i . US A 9 1
( 1 9 9 4 )
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 9 1 ( 1 9 9 4 ) 5 8 4 5
Ex t r a c t s w e r e a l s o s u b j e c t e d t o c h l o r a mp h e n i c o l a c e t y l t r a n s -
f e r a s e a c t i v i t y a s s a y s ( 1 1 ) .
P e d i g r e e A n a l y s e s . H a n d L e w i s b l o o d g r o u p p h e n o t y p e s o f
e a c h i n d i v i d u a l w e r e d e t e r mi n e d b y s t a n d a r d b l o o d t y p i n g
p r o c e d u r e s ( 1 3 ) . Fo r P C R a n a l y s e s , g e n o mi c DN A w a s
p r e p a r e d f r o m p e r i p h e r a l b l o o d ( 1 1 ) , o r f r o m f r e s h l y p l u c k e d
h a i r s ( 1 4 ) , a n d w a s u s e d a s P C R t e mp l a t e u n d e r t h e r e a c t i o n
c o n d i t i o n s d e s c r i b e d a b o v e . P C R p r i me r s u s e d t o s a mp l e t h e
X 4 a n d Y 2 p o s i t i o n s ( G C G C A A G C TTG C G C C G TG G G G A C -
TA TC TG C A G G TTA TG C C a n d G C G C TC TA G A Q Tf J - Q
C A TTA A TG C C C A C C C A C TC G G G C A G ) c o r r e s p o n d t o
p o s i t i o n s 6 5 7 - 6 8 6 a n d 1 0 3 5 - 1 0 6 5 , r e s p e c t i v e l y , o f t h e
a 1 , 2 ) FT
c DN A
( 9 ) . Th i r t y
n u c l e o t i d e s o f e a c h
p r i me r ( u n -
d e r l i n e d ) a r e d e r i v e d f r o m t h e c DN A s e q u e n c e . Te n f l a n k i n g
n u c l e o t i d e s i n c l u d e a r e s t r i c t i o n s i t e ( L i n d I, A A G C TT;
X b a I, TC TA G A ) . Th e Y 1 p o s i t i o n w a s a n a l y z e d u s i n g n e s t e d
P C R p r i me r s . Th e o u t e r mo s t p a i r c o r r e s p o n d s t o p o s i t i o n s
3 3 5 - 3 6 4 ( TC C TG C C TG C C A TG C A TG C C G C C C TG G C C C )
a n d 6 5 7 - 6 8 6 ( G G C A TA A C C TG C A G A TA G TC C C C A C G -
G C G C ) o f t h e a ( 1 , 2 ) FT c DN A ( 9 ) . Th e i n n e r p a i r c o r r e -
s p o n d s t o p o s i t i o n s 3 6 6 - 3 9 5 ( G G TA TTC C G C A TC A C C C T-
G C C C G TG C TG G C ) a n d 6 2 6 - 6 5 5 ( C G TG G A C G C C G A -
C A A A G G TG C G C G G G C G G T) .
P C R p r o d u c t s w e r e t h e n s u b j e c t e d t o r e s t r i c t i o n e n d o n u -
c l e a s e d i g e s t i o n a n d a c r y l a mi d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( s e e Fi g s .
3 a n d 4 ) . P r o d u c t s e n c o mp a s s i n g t h e Y 1 p o s i t i o n w e r e a l s o
f i x e d t o n y l o n h y b r i d i z a t i o n me mb r a n e s a n d p r o b e d w i t h
3 2 P - l a b e l e d ( 1 1 ) a l l e l e - s p e c i f i c o l i g o n u c l e o t i d e s ( 1 5 ) ( w i l d -
t y p e p r o b e , C TG A A G C TC TC TG G C ; Y 1 - s p e c i f i c p r o b e , C T-
G A A G C A C TC TG G C ) ( s e e Fi g . 4 ) . Fi l t e r s w e r e h y b r i d i z e d a t
3 7 0 C i n 5 x s t a n d a r d s a l i n e p h o s p h a t e / EDTA ( S S P E) / 5 x
De n h a r d t ' s s o l u t i o n / 0 . 5 % S DS / 0 . 1 mg o f s h e a r e d s a l mo n
s p e r m DN A p e r ml , r i n s e d i n 2 x S S P E/ 0 . 1 % S DS a t r o o m
t e mp e r a t u r e , w a s h e d f o r 1 0 mi n a t 4 2 0 C i n 2 x S S P E/ 0 . 1 %
S DS , a n d s u b j e c t e d t o a u t o r a d i o g r a p h y .
RES UL TS
To i d e n t i f y DN A s e q u e n c e d i f f e r e n c e s t h a t mi g h t i n a c t i v a t e
t h e a ( 1 , 2 ) FT g e n e i n Bo mb a y i n d i v i d u a l s , w e s e q u e n c e d = 6 . 5
k b o f g e n o mi c DN A e n c o mp a s s i n g a w i l d - t y p e a l l e l e a n d t h e
c o r r e s p o n d i n g 6 . 5 - k b r e g i o n i n a Bo mb a y a l l e l e ( Fi g . 1 ) . Th e
Bo mb a y a l l e l e ( i n d i v i d u a l X i n Fi g . 1 ) d i f f e r s f r o m t h e
w i l d - t y p e a l l e l e a t s i x p o s i t i o n s . Th r e e o f t h e s e s i n g l e n u c l e -
o t i d e d i f f e r e n c e s a r e i n t h e g e n e ' s s i n g l e i n t e r v e n i n g s e q u e n c e
( X 1 , X 2 , X 3 ) , o n e i s w i t h i n t h e c o d i n g r e g i o n ( X 4 ) , a n d t w o a r e
i n t h e 3 ' u n t r a n s l a t e d r e g i o n ( X 5 , X 6 ) . Th e s e q u e n c e d i f f e r -
e n c e i n t h e c o d i n g r e g i o n ( X 4 ) i s a n o n s e n s e mu t a t i o n t h a t
c r e a t e s a t e r mi n a t i o n c o d o n c o r r e s p o n d i n g t o a mi n o a c i d 3 1 6
o f t h e w i l d - t y p e a ( 1 , 2 ) FT ( Ty r - 3 1 6
- -
t e r ) . Th i s s e q u e n c e
a l t e r a t i o n p r e d i c t s a mu t a n t p o l y p e p t i d e t h a t i s mi s s i n g t h e 5 0
C - t e r mi n a l a mi n o a c i d s o f t h e w i l d - t y p e e n z y me .
A N o n s e n s e M u t a t i o n In a c t i v a t e s t h e a ( 1 , 2 ) FT G e n e i n a
Bo mb a y In d i v i d u a l . To c o n f i r m t h a t t h e Ty r - 3 1 6
- * t e r
mu t a t i o n i n a c t i v a t e s t h i s a l l e l e , t h i s DN A s e q u e n c e d i f f e r -
e n c e a n d e a c h o f t h e o t h e r s w e r e mo v e d i n t o t h e w i l d - t y p e
s e q u e n c e b a c k g r o u n d a n d t e s t e d f o r f u n c t i o n b y t r a n s f e c t i o n
i n t o a n a ( 1 , 2 ) FT- d e f i c i e n t ma mma l i a n h o s t ( C O S - 1 c e l l s ; r e f .
9 ) ( Fi g . 2 ) . Th e w i l d - t y p e c o n s t r u c t ( p l a s mi d p HHH; Fi g . 2 )
e n c o d e s a s u b s t a n t i a l a mo u n t o f a ( 1 , 2 ) FT a c t i v i t y , w h e r e a s
t h e Bo mb a y c o n s t r u c t ( p l a s mi d p BBB) g e n e r a t e s n o e n z y me
a c t i v i t y . In t r o d u c t i o n o f t h e Ty r - 3 1 6
- -
t e r mu t a t i o n i n t o t h e
w i l d - t y p e b a c k g r o u n d c o mp l e t e l y i n a c t i v a t e s t h e w i l d - t y p e
g e n e ( p l a s mi d p HBH) . By c o n t r a s t , v e c t o r s c o n t a i n i n g e a c h
o f t h e o t h e r DN A s e q u e n c e d i f f e r e n c e s i n t h e Bo mb a y a l l e l e
e x p r e s s n o r ma l l e v e l s o f a ( 1 , 2 ) FT a c t i v i t y i n t r a n s f e c t e d c e l l s
( p l a s mi d s p BHH a n d p HHB) . C o r r e c t i o n o f t h e Ty r - 3 1 6
t e r mu t a t i o n i n t h e Bo mb a y a l l e l e ( p l a s mi d p BHB) f u l l y
r e s t o r e s e n z y me a c t i v i t y . Th e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e
Ty r - 3 1 6
- + t e r mu t a t i o n i s r e s p o n s i b l e f o r i n a c t i v i t y o f t h i s
a l l e l e i n t h e Bo mb a y i n d i v i d u a l a n d i n d i c a t e t h a t t h e o t h e r
V EC TO R
p W
p
V F I1 E-
p i r 1 P s
p ; , B H
p ; J . ) BH
C Q O N S TRUC I . 2 1 F! A C TIV ITY
. % - " . - " , - "
- : :
F
^
Il
3 - 1 1 _ 7 t -
- 3 a - - - - - - - . : < N - ; 3 I- - - Z- -
FIG . 2 . Fu n c t i o n a l a n a l y s i s o f a ( 1 , 2 ) Fr a l l e l e s i s o l a t e d f r o m
w i l d - t y p e a n d H- d e f i c i e n t i n d i v i d u a l s . Ex p r e s s i o n v e c t o r s c o n t a i n ,
s i n g l y o r i n c o mb i n a t i o n , t h e DN A s e q u e n c e d i f f e r e n c e s a s s o c i a t e d
w i t h t h e H- d e f i c i e n t p h e n o t y p e ( p l a s mi d s p BBB, p BHB, p HBH,
p BHH, p e % - B1 , a n d
p p a a - BD)
o n a w i l d - t y p e s e q u e n c e b a c k g r o u n d
( p l a s mi d HHH) . P o i n t mu t a t i o n s a r e i n d i c a t e d a b o v e e a c h v e c t o r
d i a g r a m. S i n g l e l i n e s i n d i c a t e i n t r o n i c o r f l a n k i n g s e q u e n c e . S t i p p l e d
b o x e s c o r r e s p o n d t o t h e 5 ' n o n c o d i n g e x o n a n d 3 ' u n t r a n s l a t e d
r e g i o n . S o l i d b o x d e n o t e s c o d i n g s e q u e n c e . O p e n a r e a s w i t h i n t h e
s o l i d b o x c o r r e s p o n d t o r e g i o n s o f t h e p r o t e i n p r e d i c t e d t o b e
t r u n c a t e d b y n o n s e n s e mu t a t i o n s ( v e c t o r s p BBB, p HBH, a n d
p p , -
B2 ) . Ea c h v e c t o r , o r a c o n t r o l p l a s mi d ( p WE1 5 ) , w a s t r a n s f e c t e d i n t o
C O S - 1 c e l l s , a n d e x t r a c t s f r o m t h e t r a n s f e c t e d c e l l s w e r e s u b j e c t e d
t o a ( 1 , 2 ) FT a c t i v i t y d e t e r mi n a t i o n s . a ( 1 , 2 ) FT a c t i v i t y l e v e l s a r e
me a n v a l u e s S EM d e t e r mi n e d f o r a t l e a s t t h r e e i n d e p e n d e n t
t r a n s f e c t i o n s , e a c h n o r ma l i z e d f o r t r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y a s d e -
s c r i b e d .
DN A s e q u e n c e d i f f e r e n c e s r e p r e s e n t f u n c t i o n a l l y n e u t r a l
DN A s e q u e n c e p o l y mo r p h i s ms .
Th e Bo mb a y P r o p o s i t u s Is Ho mo z y g o u s f o r t h e N o n s e n s e
M u t a t i o n . Be c a u s e o f t h e r a r i t y o f t h e r e c e s s i v e Bo mb a y
p h e n o t y p e ( 1 ) , a n d b e c a u s e c o n s a n g u i n i t y i s n o t u n c o mmo n
i n Bo mb a y p e d i g r e e s ( 1 , 1 6 ) , w e s o u g h t t o d e t e r mi n e w h e t h e r
i n d i v i d u a l X w a s h o mo z y g o u s f o r t h e Ty r - 3 1 6
- -
t e r mu t a -
t i o n . Th i s s e q u e n c e d i f f e r e n c e y i e l d s r e s t r i c t i o n s i t e c l e a v a g e
p o l y mo r p h i s ms f o r Bs t N I ( c l e a v e s t h e w i l d - t y p e a l l e l e ) a n d
A l u I ( c l e a v e s t h e Bo mb a y a l l e l e ) ( Fi g . 1 ) . A l l e l e a s s i g n me n t
a t t h i s p o s i t i o n w a s t h e r e f o r e a c c o mp l i s h e d b y r e s t r i c t i o n
a n a l y s i s o f t h e c o r r e s p o n d i n g s e g me n t o f t h e c o d i n g r e g i o n
g e n e r a t e d b y t h e P C R ( Fi g . 3 ) . Th e s e a n a l y s e s i n d i c a t e t h a t
t h e p r o p o s i t u s i s h o mo z y g o u s f o r t h e Ty r - 3 1 6
- -
t e r mu t a t i o n
a s a r e s u l t o f i n h e r i t i n g t h e c o r r e s p o n d i n g DN A s e q u e n c e
a l t e r a t i o n f r o m e a c h h e t e r o z y g o u s p a r e n t ( Fi g . 3 ) . Ea c h o f h i s
l i v i n g s i b l i n g s i s n o t e r y t h r o i d H d e f i c i e n t a n d i s e i t h e r
h e t e r o z y g o u s f o r t h i s a l l e l e o r i s h o mo z y g o u s f o r t h e w i l d -
t y p e a l l e l e ( Fi g . 3 ) . Th i s i s a r a r e a l l e l e i n t h e g e n e r a l
p o p u l a t i o n , s i n c e t h i s DN A s e q u e n c e a l t e r a t i o n w a s n o t
d e t e c t e d i n a n a n a l y s i s o f > 1 0 0 a l l e l e s f r o m u n r e l a t e d H- p o s -
i t i v e i n d i v i d u a l s ( d a t a n o t s h o w n ) . Th e s e d a t a i n d i c a t e t h a t
t h e Ty r - 3 1 6
- -
t e r mu t a t i o n i s r e s p o n s i b l e f o r t h e H- d e f i c i e n t
p h e n o t y p e o f t h e p r o p o s i t u s . Wh e n c o n s i d e r e d t o g e t h e r w i t h
e n z y me k i n e t i c d a t a a n d c h r o mo s o ma l l o c a l i z a t i o n r e s u l t s ,
t h e d a t a a l s o s t r o n g l y s u p p o r t t h e h y p o t h e s i s t h a t t h i s g e n e
c o r r e s p o n d s t o t h e h u ma n H b l o o d g r o u p l o c u s ( 9 ) .
N o n s e n s e a n d M i s s e n s e M u t a t i o n s In a c t i v a t e t h e a ( 1 , 2 ) FT
G e n e i n p a r a - Bo mb a y In d i v i d u a l s . A s a d i r e c t t e s t o f t h e
h y p o t h e s i s t h a t t h e Ha n d S E l o c i a r e d i s t i n c t a ( 1 , 2 ) FT g e n e s ,
a n d t o f u r t h e r s u p p o r t t h e a s s i g n me n t o f t h i s g e n e t o t h e H
l o c u s , w e e x a mi n e d b o t h a l l e l e s o f t h i s g e n e i n a S e c r e t o r -
p o s i t i v e , e r y t h r o i d H- d e f i c i e n t i n d i v i d u a l [ p a r a - Bo mb a y p h e -
n o t y p e ( 1 , 2 , 8 ) ; i n d i v i d u a l Y i n Fi g . 1 ] . We f o u n d t h a t t h e
c o d i n g r e g i o n o f e a c h a l l e l e i n t h i s p a r a - Bo mb a y p e r s o n
c o n t a i n s a s i n g l e b a s e s e q u e n c e a l t e r a t i o n r e l a t i v e t o c o r r e -
s p o n d i n g p o s i t i o n s i n t h e w i l d - t y p e s e q u e n c e ( Fi g . 1 ) . O n e
M e d i c a l S c i e n c e s :
K e l l y
e t a l .
5 8 4 6 M e d i c a l S c i e n c e s : K e l l y e t a l .
a
Un d i g e s t e d 4 0 9
Bs t N I d i g e s t i o n Wi l d t y p e 1 7 0 1 2 3 2 4 ^ 9 2
( B) Bo mb a y 1 7 0 T[ 1 A U: 9 2
A l u l d i g e s t i o n Wi l d t y p e _ 4 0 9
( A ) Bo mb a y L 1 4 Z7 1
Un d i g e s t e d
b
4 0 9
Bs t N I Wi l d t y p e 1 7 0 1 2 3 2 4 9 2 A / l h
( B) p Bo mb a y 2 9 3 2 4
9 2 A
Bf a l Wi l d t y p e 4 0 9
( F) p Bo mb a y 7 ) 0 J 2 3 9
C
J n d i g e s i e c 2 9 0
Wi l d t v o e 6 4 - 6 5 4 1 1 4 : 5 2
p Bo mb a v 6 4 6 1 6 8 5 2
a
Bc
Ti c
H H h A HI h H h u h HH H H h H: . i h H. - H t i . : h H h HJ F
- S e l s e S e i s e S e l s e S e - s e s e S e ! s e S e s e - - e
6 0 3
3 1 0
-
2 8 1
2 7 1
2 3 4
t 9 4
1 1 8
6 0 3
3 1 0
2 8 1
2 7 1
7 2 3 4
1 9 4
- 1 1 8 7 2
FIG . 3 . A n a l y s i s o f t h e X 4 mu t a t i o n i n a Bo mb a y p e d i g r e e ( 1 0 ) . ( a )
A l l e l e - s p e c i f i c r e s t r i c t i o n s i t e p o l y mo r p h i s ms a t t h e X 4 p o s i t i o n . Th e
s i n g l e b a s e c h a n g e ( C
- -
G ) c o r r e s p o n d i n g t o t h e X 4 Bo mb a y a l l e l e
( i n d i c a t e d b y * ) d e s t r o y s a Bs t N I r e s t r i c t i o n s i t e a n d c r e a t e s a n A l u I s i t e
( s e e Fi g . l b ) . P C R w a s u s e d t o a mp l i f y 4 0 9 b p o f t h e a ( 1 , 2 ) FT g e n e
e n c o mp a s s i n g t h i s p o s i t i o n ( t o p ) , u s i n g p r i me r s ( i n d i c a t e d b y a r r o w s )
d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . Bs t N I c l e a v a g e o f t h i s s e g me n t
( mi d d l e , l a b e l e d B) f r o m t h e w i l d - t y p e a l l e l e y i e l d s 1 2 3 - a n d 2 4 - b p
f r a g me n t s , w h e r e a s a s i n g l e d i a g n o s t i c Bs t N I- r e s i s t a n t 1 4 7 - b p f r a g me n t
i s o b t a i n e d w i t h t h e X 4 Bo mb a y a l l e l e ( s h a d e d ) . C o n v e r s e l y , A l u I
d i g e s t i o n ( b o t t o m, l a b e l e d A ) o f t h e P C R f r a g me n t g e n e r a t e d f r o m t h e
X 4 Bo mb a y a l l e l e y i e l d s 2 9 2 - a n d 1 1 7 - b p f r a g me n t s ( s h a d e d ) , w h e r e a s
t h e 4 0 9 - b p s e g me n t f r o m t h e w i l d - t y p e a l l e l e i s n o t c l e a v e d b y A l u I. ( b )
A n a l y s i s o f a l l e l e - s p e c i f i c r e s t r i c t i o n s i t e p o l y mo r p h i s ms . G e n o mi c
DN A w a s s u b j e c t e d t o P C R a mp l i f i c a t i o n a n d r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e
c l e a v a g e a s o u t l i n e d i n a . C l o n e d DN A s e g me n t s c o n t a i n i n g w i l d - t y p e
s e q u e n c e ( Hc ) o r t h e X 4 mu t a t i o n ( Bc ) s e r v e d a s c o n t r o l t e mp l a t e s . P C R
f r a g me n t s w e r e d i g e s t e d w i t h e i t h e r Bs t N I ( l a n e s B) o r A l u I ( l a n e s A )
a n d w e r e f r a c t i o n a t e d b y a c r y l a mi d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . M o l e c u l a r s i z e
s t a n d a r d s ( b p ) a r e i n l a n e M . S o l i d s y mb o l s w i t h i n t h e p e d i g r e e d e n o t e
a n i n d i v i d u a l w i t h t h e Bo mb a y p h e n o t y p e . Bo mb a y p r o p o s i t u s i s
i n d i c a t e d b y a n a r r o w . O p e n s y mb o l s d e n o t e a n i n d i v i d u a l w i t h H- p o s -
i t i v e e r y t h r o c y t e s . H l o c u s g e n o t y p e s u n d e r e a c h s y mb o l a r e i n f e r r e d
f r o m t h e i n d i v i d u a l ' s e r y t h r o c y t e H a n t i g e n s t a t u s a n d r e s t r i c t i o n
f r a g me n t p a t t e r n s . G e n o t y p e s a t t h e S E l o c u s a r e i n f e r r e d f r o m e a c h
i n d i v i d u a l ' s L e w i s b l o o d g r o u p p h e n o t y p e ( 1 ) a n d / o r w i t h c o n s i d e r -
a t i o n f o r t h e S e c r e t o r s t a t u s o f t h e p a r e n t s a n d s i b l i n g s . Da s h i n d i c a t e s
t h a t t h e s t a t u s o f o n e a l l e l e a t t h e S E l o c u s i s n o t k n o w n .
a l l e l e c o n t a i n s a mi s s e n s e mu t a t i o n a t c o d o n 1 6 4 t h a t p r e d i c t s
t h e s u b s t i t u t i o n o f a h i s t i d i n e r e s i d u e f o r t h e w i l d - t y p e l e u c i n e
r e s i d u e a t t h i s p o s i t i o n ( Y 1 ; L e u - 1 6 4
- -
Hi s ) . Th e o t h e r a l l e l e
c o n t a i n s a t e r mi n a t i o n c o d o n a t a p o s i t i o n c o r r e s p o n d i n g t o
a mi n o a c i d r e s i d u e 2 7 6 ( Y 2 ; G l n - 2 7 6 - *
t e r ) a n d p r e d i c t s a
p r o t e i n 9 0 a mi n o a c i d s s h o r t e r t h a n t h e w i l d - t y p e e n z y me .
Bo t h mu t a n t a l l e l e s y i e l d u n d e t e c t a b l e a ( 1 , 2 ) FT a c t i v i t y
w h e n t e s t e d b y t r a n s f e c t i o n ( Fi g . 2 ) .
In h e r i t a n c e o f t h e s e a l l e l e s w a s e x a mi n e d i n t h i s p a r a -
Bo mb a y p e d i g r e e , u s i n g r e s t r i c t i o n s i t e c l e a v a g e p o l y mo r -
p h i s ms f o r Bs t N I, Bf a I, a n d A l u I ( s e e Fi g . 1 ) a n d b y
a l l e l e - s p e c i f i c o l i g o n u c l e o t i d e h y b r i d i z a t i o n a n a l y s i s o f t h e
Y 1 a l l e l e . Th e s e a n a l y s e s d e mo n s t r a t e t h a t t h e p a r a - Bo mb a y
s i b l i n g o f t h e p r o p o s i t u s i s a l s o a c o mp o u n d h e t e r o z y g o t e f o r
t h e Y 1 a n d Y 2 a l l e l e s ( Fi g . 4 ) . A l l o t h e r f a mi l y me mb e r s
e x a mi n e d a r e n o t e r y t h r o i d H d e f i c i e n t a n d a r e e i t h e r h e t -
e r o z y g o u s f o r o n e o f t h e t w o mu t a n t a l l e l e s ( p a r e n t s a n d
c h i l d r e n o f t h e p a r a - Bo mb a y i n d i v i d u a l s ) o r ma i n t a i n t h e
w i l d - t y p e s e q u e n c e a t b o t h p o s i t i o n s ( o t h e r s i b l i n g s ) . Ta k e n
t o g e t h e r w i t h t h e r e s u l t s f r o m t h e Bo mb a y a l l e l e s , t h e s e d a t a
i n d i c a t e t h a t i n a c t i v a t i n g p o i n t mu t a t i o n s w i t h i n t h e c o d i n g
s e q u e n c e o f t h i s a ( 1 , 2 ) FT g e n e a r e r e s p o n s i b l e f o r H b l o o d
- 1 9 4
- 1 1 8
7 2
* *
W W W
* * * * * * Wi l d t y p e
* * * ee * * p i o mb a v
FIG . 4 . A n a l y s i s o f Y 1 a n d Y 2 mu t a t i o n s i n a p a r a - Bo mb a y p e d i g r e e
( 8 ) . ( a ) A l l e l e - s p e c i f i c r e s t r i c t i o n s i t e p o l y mo r p h i s ms a t p o s i t i o n 8 2 6
( Y 2 ) . Th e s i n g l e b a s e c h a n g e ( C
- *
T) i n a l l e l e Y 2 i n t h e p a r a - Bo mb a y
p e r s o n ( i n d i c a t e d b y * ) d e s t r o y s a Bs t N I r e s t r i c t i o n s i t e a n d c r e a t e s a
Bf a I s i t e ( s e e Fi g . l b ) . P C R w a s u s e d t o a mp l i f y 4 0 9 b p o f t h e a ( 1 , 2 ) FT
g e n e e n c o mp a s s i n g t h i s p o s i t i o n ( t o p ) , u s i n g p r i me r s ( i n d i c a t e d b y
a r r o w s ) d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . Bs t N I c l e a v a g e o f t h i s
s e g me n t ( mi d d l e , l a b e l e d B) f r o m t h e w i l d - t y p e a l l e l e y i e l d s d i a g n o s t i c
1 7 0 - a n d 1 2 3 - b p Bs t N I f r a g me n t s , w h e r e a s a s i n g l e d i a g n o s t i c Bs t N I-
r e s i s t a n t 2 9 3 - b p f r a g me n t ( s h a d e d ) i s o b t a i n e d w i t h t h e Y 2 a l l e l e i n t h e
p a r a - Bo mb a y i n d i v i d u a l . C o n v e r s e l y , Bf a I d i g e s t i o n ( b o t t o m, l a b e l e d
F) o f t h e P C R f r a g me n t f r o m t h e Y 2 a l l e l e y i e l d s f r a g me n t s t h a t a r e 1 7 0
a n d 2 3 9 b p l o n g ( s h a d e d ) , w h e r e a s t h e 4 0 9 - b p s e g me n t f r o m t h e
w i l d - t y p e a l l e l e i s n o t c l e a v e d b y Bf a I. ( b ) A l l e l e - s p e c i f i c r e s t r i c t i o n s i t e
p o l y mo r p h i s m a t p o s i t i o n 4 9 1 ( Y 1 ) . Th e s i n g l e n u c l e o t i d e c h a n g e ( T
A ) a t p o s i t i o n 4 9 1 ( i n d i c a t e d b y * ) i n a l l e l e Y 1 o f t h e p a r a - Bo mb a y
p e r s o n d e s t r o y s a n A l u I s i t e ( s e e Fi g . l b ) . P C R p r i me r s f l a n k i n g t h i s s i t e
g e n e r a t e a 2 9 0 - b p w i l d - t y p e f r a g me n t t h a t y i e l d s d i a g n o s t i c 5 4 - a n d
1 1 4 - b p A l u I f i r g me n t s . A b s e n c e o f t h e A l u I s i t e a t t h i s p o s i t i o n i n t h e
Y 1 a l l e l e y i e l d s a d i a g n o s t i c 1 6 8 - b p f r a g me n t ( s h a d e d ) . ( c ) A n a l y s i s o f
a l l e l e - s p e c i f i c s e q u e n c e p o l y mo r p h i s ms . Th e p a r a - Bo mb a y p r o p o s i t u s
i s i n d i c a t e d b y a n a r r o w ; b o t h p a r a - Bo mb a y i n d i v i d u a l s a r e i n d i c a t e d b y
s o l i d s y mb o l s . Th e r e s t o f t h e p e d i g r e e i s l a b e l e d a s i n Fi g . 3 . P C R
f r a g me n t s s h o w n i n a a n d b w e r e g e n e r a t e d b y u s i n g g e n o mi c DN A
f r o m f a mi l y me mb e r s o r b y u s i n g c l o n e d DN A s e g me n t s c o n t a i n mi n g
w i l d - t y p e s e q u e n c e ( Hc ) o r t h e mu t a t i o n s i n t h e p a r a - Bo mb a y i n d i v i d -
u a l s ( p Bc ; a l l e l e Y 2 i n t o p g e l ; a l l e l e Y 1 i n b o t t o m g e l ) . P C R f r a g me n t s
w e r e d i g e s t e d w i t h Bs t N I ( l a n e s B) o r Bf a I ( l a n e s F) ( t o p g e l ) , o r A l u
I ( l a n e s A ) ( b o t t o m g e l ) a n d w e r e f r a c t i o n a t e d b y a c r y l a mi d e g e l
e l e c t r o p h o r e s i s . M o l e c u l a r s i z e s t a n d a r d s ( b p ) a r e i n l a n e M . A l t e r n a -
t i v e l y , f o r a l l e l e - s p e c i f i c o l i g o n u c l e o t i d e a n a l y s i s o f t h e Y j p o s i t i o n ,
P C R p r o d u c t s d i a g r a mme d i n b w e r e g e n e r a t e d f o r e a c h i n d i v i d u a l a n d
f o r c o n t r o l t e mp l a t e s ( p Bc , Y 1 a l l e l e ; Hc , w i l d - t y p e a l l e l e ) . Th e s e
f r a g me n t s w e r e t h e n p r o b e d w i t h a r a d i o l a b e l e d o l i g o n u c l e o t i d e s p e c i f i c
f o r e i t h e r t h e w i l d - t y p e s e q u e n c e a t t h e Y 1 p o s i t i o n ( Wi l d t y p e ) o r f o r
t h e mu t a n t Y 1 s e q u e n c e ( p Bo mb a y ) .
g r o u p a n t i g e n d e f i c i e n c y i n t h e s e Bo mb a y a n d p a r a - Bo mb a y
i n d i v i d u a l s a n d t h u s p r o v i d e g e n e t i c s u p p o r t f o r b i o c h e mi c a l
a
b
h ! h l i HH
s e - g es e Is e s e : s e
R A R A R A
* Hc Bc M
S h / h H/ h H/ h H/ h H/ h H h
s e / s e S e / s e s e / s e S e / s e S e ' s e s e -
RA RA RA RA RA BA BA RA
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 9 1
( 1 9 9 4 )
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 9 1 ( 1 9 9 4 ) 5 8 4 7
E D
- 1 3 . 3
- 6 . 2
- 4 . 3
FIG . 5 . Hu ma n DN A s e q u e n c e s t h a t c r o s s - h y b r i d i z e w i t h t h e H
a ( 1 , 2 ) FT c o d i n g r e g i o n . Hu ma n g e n o mi c DN A w a s d i g e s t e d w i t h
Ec o RI ( l a n e E) o r Dr a I ( l a n e D) ( s e e Fi g . l a ) a n d s u b j e c t e d t o
S o u t h e r n b l o t a n a l y s i s ( 1 1 ) u s i n g t h e c o d i n g r e g i o n o f t h e a ( 1 , 2 ) FT
c DN A a s a p r o b e ( 9 ) . Hy b r i d i z a t i o n w a s d o n e a t 4 2 TC , w i t h a f i n a l
w a s h a t 6 5 TC i n 2 x s t a n d a r d s a l i n e c i t r a t e / 0 . 2 % S DS . M o l e c u l a r s i z e
s t a n d a r d s ( k b ) a r e i n d i c a t e d o n t h e r i g h t .
( 9 , 1 2 ) a n d c h r o mo s o ma l l o c a l i z a t i o n ( 9 ) d a t a , i n d i c a t i n g t h a t
t h i s g e n e c o r r e s p o n d s t o t h e h u ma n H b l o o d g r o u p l o c u s .
Th e H a ( 1 , 2 ) FT G e n e Id e n t i f e s C a n d i d a t e s f o r t h e Hu ma n
S E L o c u s . S i n c e t h e t w o p a r a - Bo mb a y i n d i v i d u a l s ma i n t a i n a
f u n c t i o n a l S E- d e t e r mi n e d a ( 1 , 2 ) FT, b u t n o t a n H- e n c o d e d
a ( 1 , 2 ) FT, i t c a n b e c o n c l u d e d t h a t t h e S E l o c u s mu s t t h e r e -
f o r e c o r r e s p o n d t o a n a ( 1 , 2 ) FT g e n e d i s t i n c t f r o m t h e o n e
e x a mi n e d h e r e . Th e s e r e s u l t s p r o v i d e a d d i t i o n a l s u p p o r t f o r
g e n e t i c ( 2 ) a n d b i o c h e mi c a l ( 3 - 5 ) d a t a i n d i c a t i n g t h a t t h e
h u ma n H a n d S E b l o o d g r o u p l o c i c o r r e s p o n d t o d i s t i n c t
a ( 1 , 2 ) FT g e n e s . In d e e d , w h e n u s e d i n S o u t h e r n b l o t a n a l y -
s e s , t h e c o d i n g p o r t i o n o f t h e H g e n e i d e n t i f i e s c r o s s -
h y b r i d i z i n g h u ma n DN A s e q u e n c e s d i s t i n c t f r o m t h o s e c o r -
r e s p o n d i n g t o t h e Ha ( 1 , 2 ) FT g e n e ( Fi g . 5 ) . By a n a l o g y t o t h e
s t r u c t u r a l l y r e l a t e d f a mi l y o f h u ma n a - ( 1 , 3 ) - f u c o s y l t r a n s -
f e r a s e g e n e s ( 1 7 ) , s u c h s e q u e n c e s r e p r e s e n t c a n d i d a t e s f o r
a n o t h e r a ( 1 , 2 ) FT g e n e t h a t ma y c o r r e s p o n d t o t h e S E l o c u s .
DIS C US S IO N
Bo mb a y a n d p a r a - Bo mb a y i n d i v i d u a l s d i s p l a y n o a p p a r e n t
d e l e t e r i o u s p h e n o t y p e ( 1 ) e x c e p t i n c i r c u ms t a n c e s r e q u i r i n g
b l o o d t r a n s f u s i o n , w h e r e i n t h e y a r e c r o s s - ma t c h i n c o mp a t i -
b l e w i t h a l l d o n o r s e x c e p t o t h e r H- d e f i c i e n t i n d i v i d u a l s ( 1 ) .
S i n c e t h e c o d i n g s e q u e n c e mu t a t i o n s i d e n t i f i e d h e r e y i e l d
n o n f u n c t i o n a l a ( 1 , 2 ) FTs , i t f o l l o w s t h a t t h e f u c o s y l t r a n s -
f e r a s e a c t i v i t y e n c o d e d b y t h e H g e n e i s n o t e s s e n t i a l i n
h u ma n s [ b a r r i n g p r o c e s s e s t h a t s u p p r e s s n o n s e n s e c o d o n s
( 1 8 ) o r o t h e r RN A e d i t i n g e v e n t s ( 1 9 ) ] . G i v e n t h e h i g h
f r e q u e n c y o f n o n - S e c r e t o r i n d i v i d u a l s ( = 2 0 % o f C a u c a s i a n s ;
r e f . 1 ) , t h e a ( 1 , 2 ) FT e n c o d e d b y t h e S E l o c u s i s a p p a r e n t l y
a l s o n o t e s s e n t i a l ( a t l e a s t i n t h e a d u l t h u ma n ) , a l t h o u g h a
d e f i n i t i o n o f t h e mo l e c u l a r b a s i s f o r n u l l a l l e l e s a t t h i s l o c u s
mu s t a w a i t t h e i s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h i s g e n e .
Th e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t a n y e v o l u t i o n a r y c o n -
s t r a i n t s t h a t ma y h a v e o n c e s e l e c t e d f o r f u n c t i o n a l a l l e l e s a t
t h e s e a ( 1 , 2 ) FT l o c i h a v e s i n c e c e a s e d t o b e o p e r a t i v e i n a d u l t
h u ma n s . It r e ma i n s p o s s i b l e , h o w e v e r , t h a t r e l a t e d l o c i
ma i n t a i n c o mp e n s a t i n g f u n c t i o n a l r e d u n d a n c y s u f f i c i e n t t o
s u s t a i n a n o r ma l p h e n o t y p e . In d e e d , b y a n a l o g y t o t h e f a mi l y
o f h u ma n a - ( 1 , 3 ) - f u c o s y l t r a n s f e r a s e g e n e s ( 1 7 ) , i t r e ma i n s
p o s s i b l e t h a t o t h e r a ( 1 , 2 ) FTs ( 2 0 ) , e n c o d e d b y a s y e t u n -
c l o n e d g e n e s , ma y f u l f i l l o n e o r mo r e e s s e n t i a l r o l e s . M o r e -
o v e r , s u c h r o l e s ( l i k e e mb r y o i mp l a n t a t i o n i n t h e mo u s e ; r e f .
2 1 ) ma y b e o p e r a t i v e i n t i s s u e s , o r a t d e v e l o p me n t a l s t a g e s ,
n o t y e t e x a mi n e d i n Ho mo s a p i e n s . A l t e r n a t i v e l y , t h e f u n c -
t i o n s ma i n t a i n e d b y t e r mi n a l a ( 1 , 2 ) f u c o s e l i n k a g e s ma y b e
a c c o mp l i s h e d b y o t h e r t e r mi n a l s u g a r mo i e t i e s t h a t a r e , i n
t u r n , e n c o d e d b y n o n p o l y mo r p h i c g l y c o s y l t r a n s f e r a s e s ( d i s -
c u s s e d i n r e f . 2 2 ) . Th e s e i s s u e s a r e n o t i d i o s y n c r a t i c t o t h e
a ( 1 , 2 ) FTs . N u l l a l l e l e s a r e r a t h e r c o mmo n w i t h i n o t h e r
g l y c o s y l t r a n s f e r a s e g e n e s ( t h e A BO , L e w i s , P , a n d S d a b l o o d
g r o u p s y s t e ms , f o r e x a mp l e ; s e e r e f . 1 ) a n d i n s o me i n s t a n c e s
h a v e b e e n s h o w n t o c o r r e s p o n d t o i n a c t i v a t i n g c o d i n g s e -
q u e n c e mu t a t i o n s ( 2 3 ) . Ex p e r i me n t a l t e s t s o f h y p o t h e s e s
c o n c e r n i n g a f u n c t i o n ( s ) o f t h e s e a n d o t h e r ma mma l i a n
g l y c o s y l t r a n s f e r a s e s , a n d t h e i r c o g n a t e o l i g o s a c c h a r i d e p r o d -
u c t s , s h o u l d b e f a c i l i t a t e d w i t h t h e u s e o f c l o n e d g l y c o s y l -
t r a n s f e r a s e g e n e s i n c o n j u n c t i o n w i t h t r a n s g e n i c a n d g e n e
d i s r u p t i o n t e c h n o l o g i e s ( 2 4 ) .
We t h a n k M s . J o b e r t a We l l s a n d Dr s . Da v i d G i n s b u r g , C r a i g
Th o mp s o n , Ra f a e l O r i o l , J o h n J u d d , a n d P e t e r Is s i t f o r h e l p w i t h t h i s
w o r k . Th i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y N a t i o n a l In s t i t u t e s o f He a l t h
G r a n t RO 1 HL 4 8 8 5 9 . J . B. L . i s a n A s s o c i a t e In v e s t i g a t o r o f t h e
Ho w a r d Hu g h e s M e d i c a l In s t i t u t e .
1 . Wa t k i n s , W. M . ( 1 9 8 0 ) A d v . Hu m. G e n e t . 1 0 , 1 - 1 1 6 .
2 . O r i o l , R. , Da n i l o v s , J . & Ha w k i n s , B. R. ( 1 9 8 1 ) A m. J . Hu m.
G e n e t . 3 3 , 4 2 1 - 4 3 1 .
3 . L e P e n d u , J . , C a r t r o n , J . P . , L e mi e u x , R. U. & O r i o l , R. ( 1 9 8 5 )
A m. J . Hu m. G e n e t . 3 7 , 7 4 9 - 7 6 0 .
4 . K u ma z a k i , T. & Y o s h i d a , A . ( 1 9 8 4 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A
8 1 , 4 1 9 3 - 4 1 9 7 .
5 . S a r n e s t o , A . , K o h l i n , T. , Th u r i n , J . & Bl a s z c z y k - Th u r i n , M .
( 1 9 9 0 ) J . Bi o l . C h e m. 2 6 5 , 1 5 0 6 7 - 1 5 0 7 5 .
6 . Re g e , V . P . , P a i n t e r , T. J . , Wa t k i n s , W. M . & M o r g a n ,
W. T. J . ( 1 9 6 4 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 0 3 , 3 6 0 - 3 6 3 .
7 . Bh e n d e , Y . M . , De s h p a n d e , C . K . , Bh a t i a , H. M . , S a n g e r , R. ,
Ra c e , R. R. , M o r g a n , W. T. J . & Wa t k i n s , W. M . ( 1 9 5 2 ) L a n -
c e t i , 9 0 3 - 9 0 4 .
8 . S o l o mo n , J . M . , Wa g g o n e r , R. & L e y s h o n , W. C . ( 1 9 6 5 ) Bl o o d
2 5 , 4 7 0 - 4 8 5 .
9 . L a r s e n , R. D. , Er n s t , L . K . , N a i r , R. P . & L o w e , J . B. ( 1 9 9 0 )
P r o c . N a t I. A c a d . S c i . US A 8 7 , 6 6 7 4 - 6 6 7 8 .
1 0 . Br y a n t , J . G . , L l o y d , B. , Da v i s , J . & S h a f e r , A . W. ( 1 9 7 4 )
Tr a n s f u s i o n 1 4 , A 5 0 6 ( a b s t r . ) .
1 1 . A u s u b e l , J . & Fr e d e r i c k , M . , e d s . ( 1 9 8 7 ) M o l e c u l a r Bi o l o g y :
L a b o r a t o r y M a n u a l s ( Wi l e y , N e w Y o r k ) , V o l s . 1 a n d 2 .
1 2 . Ra j a n , V . P . , L a r s e n , R. D. , A j me r a , S . , Er n s t , L . K . & L o w e ,
J . B. ( 1 9 8 9 ) J . Bi o l . C h e m. 2 6 4 , 1 1 1 5 8 - 1 1 1 6 7 .
1 3 . Wa l k e r , R. H. , e d . ( 1 9 9 0 ) A me r i c a n A s s o c i a t i o n o f Bl o o d
Ba n k s Te c h n i c a l M a n u a l ( A m. A s s o c . o f Bl o o d Ba n k s , A r l i n g -
t o n , V A ) .
1 4 . Hi g u c h i , R. , v o n Be r o l d i n g e n , C . H. , S e n s a b a u g h , G . F. &
Er l i c h , H. A . ( 1 9 8 8 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 3 2 , 5 4 3 - 5 4 6 .
1 5 . Ro t h , M . S . , A n t i n , J . H. , Bi n g h a m, E. L . & G i n s b u r g , D.
( 1 9 9 0 ) Tr a n s p l a n t a t i o n 4 9 , 7 1 4 - 7 2 0 .
1 6 . Bh a t i a , H. M . & S a t h e , M . S . ( 1 9 7 4 ) V o x S a n g . 2 7 , 5 2 4 - 5 3 2 .
1 7 . We s t o n , B. W. , S mi t h , P . L . , K e l l y , R. J . & L o w e , J . B. ( 1 9 9 2 )
J . Bi o l . C h e m. 2 6 7 , 2 4 5 7 5 - 2 4 5 8 4 .
1 8 . C h a n , L . ( 1 9 9 3 ) Bi o e s s a y s 1 5 , 3 3 - 4 1 .
1 9 . K o h l e r , M . , Bu r n a s h e v , N . , S a k ma n n , B. & S e e b u r g , P . H.
( 1 9 9 3 ) N e u r o n 1 0 , 4 9 1 - 5 0 0 .
2 0 . Bl a s z c z y k - Th u r i n , M . , S a r n e s t o , A . , Th u r i n , J . , Hi n d s g a u l , 0 .
& K o p r o w s k i , H. ( 1 9 8 8 ) Bi o c h e m. Bi o p h y s . Re s . C o mmu n .
1 5 1 , 1 0 0 - 1 0 8 .
2 1 . L i n d e n b e r g , S . , S u n d b e r g , K . , K i mb e r , S . J . & L u n d b l a d , A .
( 1 9 8 8 ) J . Re p r o d . Fe r t i l . 8 3 , 1 4 9 - 1 5 8 .
2 2 . K u k o w s k a - L a t a l l o , J . F. , L a r s e n , R. D. , Ra j a n , V . P . & L o w e ,
J . B. ( 1 9 9 0 ) G e n e s De v . 4 , 1 2 8 8 - 1 3 0 3 .
2 3 . Y a ma mo t o , F. - I. , C l a u s e n , H. , Wh i t e , T. , M a r k e n , J . &
Ha k o mo r i , S . - I. ( 1 9 9 0 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 4 5 , 2 2 9 - 2 3 3 .
2 4 . K o l l e r , B. H. & S mi t h i e s , 0 . ( 1 9 9 2 ) A n n u . Re v . Immu n o l . 1 0 ,
7 0 5 - 7 3 0 .
M e d i c a l S c i e n c e s :
K e l l y
e t a l .