Introduccin

El ratn y hmster despus del hombre, es el mamfero que tiene el mapa gentico ms
completo y fue el segundo genoma mamfero completamente secuenciado (ver ms
adelante). Por otro lado, las tcnicas de mapeo, los programas de computacin y las bases
de datos estn enormemente desarrolladas en esta especie. Las cualidades que hacen del
ratn la especie modelo para el desarrollo de mapas genticos son: (i) Tienen un tiempo
generacional muy corto y son muy prolficos, lo que permite criar miles de ratones
hbridos F1, F2 o N2. (ii) Es una especie en la cual se pueden llevar a cabo cruzas inter-
especficas. (iii) Existe una cantidad enorme de lneas genticamente definidas, como las
consanguneas y congnicas, adems de miles de mutaciones y un gran nmero de
rearreglos cromosmicos disponibles.
Por todo lo mencionado, tomaremos al mapa gentico del ratn y sus mtodos de
desarrollo como gua (con reservas) para todos los animales de laboratorio.
Como ya se vio, el ratn de laboratorio estndar tiene un cariotipo de 40 cromosomas
(19 autosmicos ms el par sexual). Los cromosomas murinos son difciles de diferenciar
en los preparados citogenticos porque, contrariamente a los humanos, son todos
acrocntricos y muestran una graduacin continua en el tamao. Los cromosomas
autosmicos se numeran del 1 al 19, en orden decreciente de longitud.
Segn las estimaciones ms recientes, el genoma murino contendra entre 30.000 y
35.000 genes, de los cuales un tercio ya ha sido identificado, gracias a la existencia de
mutaciones y a los trabajos de gentica molecular. Es interesante resaltar que la mayora
de las mutaciones descubiertas por criadores de ratones identifican, en general, un
locus nuevo ms que nuevos alelos de un locus ya conocido. En este contexto, si
consideramos los recientes resultados provenientes de las experiencias en noqueo de
genes, es probable que la mayora de las mutaciones que ocurren en el genoma del ratn
sean indetectables, por ser incompatibles con el desarrollo normal del embrin, o por no
causar efectos fenotpicamente obvios. Considerando que un gran nmero de genes del
ratn espera ser descubierto, la existencia de un mapa gentico de alta resolucin y alta
densidad facilitara enormemente esa tarea. Como veremos en detalle ms adelante, un
mapa de alta resolucin se logra analizando un gran nmero de ratones (meiosis) y un
mapa de alta densidad se obtiene por medio del uso de muchos marcadores polimrficos.


Hbridos de Clulas Somticas
Para esta tcnica se utilizan clulas hbridas (viables) derivadas de la fusin in vitro de
clulas somticas de especies diferentes de mamferos. Aunque se desconoce la razn, se
observa que los cromosomas que se van perdiendo en las clulas hbridas pertenecen
exclusivamente a uno de los conjuntos parentales. Por ejemplo, los hbridos
humano/roedor tienden a perder (a travs de los sucesivos cultivos y en forma
preferencial) los cromosomas humanos y quedarse con una mayora de cromosomas de
roedor. Debido a esto, es posible derivar un panel de clulas hbridas que representen
cada cromosoma humano en forma nica, sobre un conjunto de cromosomas de roedor.
Por lo tanto, todos los genes de origen roedor son retenidos (y se expresan normalmente),
mientras que slo los genes presentes en el nico cromosoma humano que qued
retenido en ese hbrido podrn ser localizados por medio del usode sondas moleculares o
el anlisis de expresin. De esta manera, detectando patrones de presencia o ausencia de
marcadores (o expresin de genes) y correlacionando con los cromosomas presentes en el
hbrido, se puede asignar un gen humano a un cromosoma en particular.
Los hbridos de clulas somticas humano/ ratn, con un complemento limitado de
cromosomas humanos (intactos), han sido muy usados para localizar genes humanos en
los ltimos 20 aos, a pesar de ser muy inestables. Tambin existen hbridos similares
segregando cromosomas de ratn, pero no han sido muy utilizados porque es en general
ms fcil y rpido usar el ADN derivado de cruzas de animales. Adems, contrariamente a
los cromosomas humanos, son raros los hbridos de clulas somticas del ratn con
deleciones o translocaciones, lo que complica la asignacin sub-cromosmica de genes
por este mtodo
Hbridos de Radiacin (HR)
Otra tcnica desarrollada para obtener mapas de alta resolucin en humanos son los
paneles de hbridos de radiacin (Radiation Hybrid RH), enfoque descripto por Goss y
Harris en
1975. Las dos grandes ventajas de este sistema son que pueden mapearse marcadores o
genes no polimrficos (ya que se evala slo la presencia o ausencia de un marcador) y
que se logra una resolucin mayor que con los mapas de ligamiento, constituyendo un
puente entre stos y los mapas fsicos. Estos paneles de clulas hbridas se construyen a
partir de clulas donantes (de la especie a ser mapeada) que han sido irradiadas
letalmente (ya sea con rayos
g o X) para causar la fragmentacin de sus cromosomas (por roturas de doble cadena). Las
clulas as irradiadas son fusionadas con lneas celulares receptoras deficientes para un
marcador de seleccin, como ser la timidina quinasa (TK) o la hipoxantina fosforibosil
transferasa
(HPRT). Usando condiciones de seleccin con medios apropiados, sobrevivirn slo
aquellas clulas que contengan, por lo menos, algn fragmento cromosmico proveniente
de las clulas dadoras. Por ejemplo, para el mapeo de genes humanos se utiliz siempre
un fondo de clulas receptoras de roedor, en particular de ratn o hmster chino
(Cricetulus griseus). Muchas de las lneas de clulas hbridas obtenidas por este mtodo
retienen cantidades detectables del ADN donante (normalmente entre 20 y 30% del
genoma). Por lo tanto, estas clulas hbridas, obtenidas por las tcnicas clsicas de fusin
celular, contienen slo un pequeo segmento del genoma donante (irradiado)
incorporado en los cromosomas de la especie receptora (no irradiada).
El concepto terico es que aquellos loci que se encuentran muy prximos unos de otros
sern retenidos en el mismo fragmento cromosmico despus de la irradiacin. Esta
caracterstica es similar al principio de ligamiento gentico que hemos visto en los mapas
meiticos.
Como en los paneles de ADN obtenidos con cruzas de animales, la informacin de los
paneles
HR es acumulativa y puede proveer datos para el ordenamiento (de alta resolucin) de
regiones no polimrficas o no separables por los mapas de ligamiento.
En 1998 se puso a disponibilidad de la comunidad cientfica un panel HR del ratn, el
primero en su momento para un organismo modelo. Su nombre es T31 y fue creado por
Linda McCarthy y sus colaboradores usando fragmentos de cromosomas de ratn (de una
lnea de clulas embrionarias de la cepa 129) retenidos en cromosomas de hmster chino
(provenientes de una lnea de fibroblastos TK), totalizando 104 lneas celulares. La
informacin ms actualizada sobre este panel y las secuencias que se encuentran
localizadas se puede obtener en The Jackson Laboratory T31 Mouse Radiation Hybrid
Database (http://www.jax.org/resources/documents/cmdata/rhmap/).

Desde el ao 1999, la rata posee tambin su panel HR (T55), en el cuan se han localizado
ms de 5.000 marcadores genticos. Los paneles HR ratn/hmster y rata/hmster se
encuentran disponibles comercialmente a travs de la empresa Research Genetics Inc.
(http://www.resgen.com/products/MRH.php3#info).

Cuando se evala un marcador (por Southern blot, FISH o PCR), el patrn de presencia (+)
o ausencia () a travs del panel, define el emplazamiento del mismo: aquellos
marcadores con el mismo patrn de + y estarn localizados en el mismo bin o
posicin. Estos estudios se conocen como patrones de retencin de marcadores y nos
ayudan a determinar la ubicacin de un gen o marcador. En estos casos, la unidad
utilizada para medir la distancia en el mapa es el Ray o el centiRay (cR). Debido a que la
dosis de rayos X tiene gran influencia sobre esta medida, es necesario aclararlo de la
siguiente manera: un cR3000 indica una frecuencia de rotura del 1% entre dos loci dados
luego de una exposicin a 3.000 rads de radiacin X. Como esta distancia entre
marcadores puede tener poca significacin para un mapa gentico, ser necesario
convertirla a distancias de mapas fsicos (en kb o Mb). Por ejemplo, en el panel T55 de la
rata un cR3000 es equivalente a una distancia fsica de 106 kb.
La evaluacin estadstica de los resultados debe hacerse con programas de computacin
especiales, como RHMAPPER (http://www-
genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/rhmapper/).
El mapa ms reciente del ratn basado en hbridos de radiacin (panel T31) fue publicado
en la revista Nature Genetics en el ao 2001. Este mapa contiene 11.109 genes
(incluyendo genes expresados slo en embriones y neonatos) que fueron emplazados con
respecto a un mapa de referencia conteniendo alrededor de 2000 marcadores genticos,
e incluye 3.658 genes homlogos con secuencias humanas (genes ortlogos). Uno de los
aspectos ms notables que surge del anlisis de este mapa es la distribucin irregular de
genes a lo largo de los cromosomas; por ejemplo, existe un exceso de genes en los
cromosomas 11 y 19 y un dficit en los cromosomas 18 y X.

Figura 6.4. Hbridos de radiacin. Diagrama esquemtico mostrando la construccin de clones de hbridos de radiacin (HR) a
partir de clulas donantes con un nico cromosoma humano (hbrido mono-cromosmico) y clulas receptoras de hmster Chino. La
seleccin de clulas donde hubo fusin se realiza por medio del uso de genes de seleccin como la timidina kinasa. Cada clon (abajo)
presenta una coleccin diferente (al azar) de fragmentos del cromosoma humano original. Los 6 loci hipotticos (A a F) se marcan
como + (presencia) o - (ausencia), dando una idea del ordenamiento en el cromosoma original.

BIBLIOGRAFIA
http://www.resgen.com/products/MRH.php3#info
http://www.jax.org/resources/documents/cmdata/rhmap/
http://www.poirot.cl/documents/HERRAMIENTAS%20SOLDADORAS/17_ERSA%20HYBRID.pdf