CAMARA DE NEUBAUER

I. OBJETIVOS:

Aprender a utilizar la cmara Neubauer, y similares para el recuento
de levaduras.

II. FUNDAMENTO:
CAMARA DE NEUBAUER
La Cmara de Neubauer es un instrumento utilizado en medicina y
biologa para realizar el recuento de clulas en un medio lquido, que
puede ser un cultivo celular, sangre, orina, lquido cefalorraqudeo,
liquido sinovial, etc.

Esta cmara de contaje est adaptada al microscopio de campo claro o
al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos que tiene dos
zonas ligeramente deprimidas y que en el fondo de las cuales se ha
marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula de dimensiones
conocidas. Se cubre la cmara con un cubrecmaras que se adhiere por
simple tensin superficial.

Luego se introduce el lquido a contar, al que generalmente se ha
sometido a una dilucin previa con un diluyente, por capilaridad entre la
cmara y el cubrecmara; puesto que tiene dos zonas esto permite
hacer dos recuentos simultneamente. Para contar las clulas se
observa el retculo al microscopio con el aumento adecuado y se
cuentan las clulas.
Con base en la cantidad de clulas contadas, conociendo el volumen de
lquido que admite el campo del retculo, se calcula la concentracin de
clulas por unidad de volumen de la muestra lquida inicial.
La frmula de valoracin del nmero de clulas (vlida universalmente)
es la siguiente: Partculas por l= (partculas contadas)/(superficie
contada (mm)profundidad de la cmara(mm) dilucin)
Recuento de eritrocitos: ejemplo
Observe que en la grilla de la cmara de Neubauer las reas de
recuento de eritrocitos y linfocitos son diferentes. Los glbulos rojos
se cuentan en las reas coloreadas de rojo, mientras que los glbulos
blancos se cuentan en las reas coloreadas de azul. Ten en cuenta que
la grilla central tiene 25 cuadrados de 1mm x 1mm de rea y 0.10 mm
de profundidad. El factor de dilucin es por tanto de 1:200. Convierte
el nmero de glbulos rojos contados en 5 cuadrados a n glbulos
rojos/l. (1 l (micro litro) = 1 mm3)



La imagen de abajo simula el campo que est viendo al microscopio con
un objetivo de 45x. Solo es visible el centro de la grilla. Intenta
verificar esto al ir moviendo el campo de derecha-izquierda y de
arriba-abajo, como si de una pletina de microscopio se tratase. Cuenta
los glbulos rojos en los cinco cuadrados mencionados anteriormente y
determina el recuento de eritrocitos como se ha descrito
anteriormente.

Muy importante: Cuando un eritrocito se sita en mitad de las lneas
superior y/o de la izquierda, entonces es contabilizado. Pero no se
contabiliza cuando se sita en mitad de las lneas inferior y/o de la
derecha.
El rango normal de recuento de glbulos rojos es el siguiente;
Mujeres:3.9-5.6millones/l
Hombres: 4.5-6.5 millones/l






TCNICAS DE CONTAJE CELULAR

Una suspensin celular se caracteriza por presentar un nmero de
partculas microscpicas dispersas en un fluido. Habitualmente ser
necesario determinar tanto la densidad de las clulas en la suspensin
como el porcentaje de stas que son viables.

Para determinar la densidad de las clulas se emplean diferentes
tcnicas, desde la relativamente simple cmara de contaje celular de la
que existen numerosas variantes, entre ellas la que empleamos (cmara
de Neubauer), hasta equipos automticos de

Contaje celular como el "CellCoulter" de la empresa.

El principio del contador celular se basa en la medida de los cambios en
la resistencia elctrica que se producen cuando una partcula no
conductora en suspensin en un electrolito atraviesa un pequeo
orificio. Como se puede ver en el esquema, una pequea abertura entre
los electrodos es la zona sensible a travs de la que pasan las
partculas que se encuentran en suspensin. Cuando una partcula
atraviesa el orificio desplaza su propio volumen de electrolito. El
volumen desplazado es medido como un pulso de voltaje. La altura de
cada pulso es proporcional al volumen de la partcula. Controlando la
cantidad de la suspensin que circula a travs del orificio es posible
contar y medir el tamao de las partculas. Es posible contar y medir
varios miles de partculas por segundo, independientemente de su
forma, color y densidad.
En la unidad de citometria de flujo y microscopia con focal de los
servicios cientficos- tcnicos de la universidad de Barcelona se
dispone de contadores celulares.Sin embargo, es posible determinar la
densidad celular empleando mtodos ms sencillos. Nos basta con una
cmara de contaje celular, por ej. La cmara de Neubauer, y un
microscopio. Una cmara de contaje celular es un dispositivo en el que
se coloca una muestra de la suspensin a medir. El dispositivo presenta
unas seales que determinan un volumen conocido (x micro litros). Al
contar bajo el microscopio el nmero de partculas presentes en ese
volumen se puede determinar la densidad de partculas en la suspensin
de origen.


La cmara de Neubauer es una cmara de contaje adaptada al
microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un
portaobjetos con una depresin en el centro, en el fondo de la cual se
ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula como la que se
ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre
dos lneas consecutivas de 0.25 mm. As pues el rea sombreada y
marcada L corresponde a 1 milmetro cuadrado. La depresin central
del cubreobjetos est hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de
forma que cuando se cubre con un cubreobjetos ste dista de la
superficie marcada 0.1 milmetro, y el volumen comprendido entre la
superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milmetro cbico, es decir 0.1
micro litro.
Si contamos las cuatro reas sombreadas (L) observando un total de x
clulas entre las cuatro reas, la concentracin en la suspensin celular
ser:

Concentracin en la suspensin (clulas / mL) = 10000 (x/4)



En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones
marcadas como L y que en el microscopio se ven como una cuadrcula de
16 pequeos cuadrados de 0.25 milmetros de lado. Esta imagen ha sido
tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases.
Existen numerosos modelos de cmaras de contaje celular adaptadas a
su uso en microscopa. En la imagen puedes observar una cmara de
Neubauer doble, como las que usas en el laboratorio de prcticas.
Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes mtodos. El
ms comn es el de tincin con azul tripn. El azul tripn es un coloide
que se introduce en el interior de las clulas que presentan roturas en
la membrana. As pues las clulas que aparecen en la imagen,
claramente de color azul, son consideradas no viables. Asimilar clulas
blancas, por exclusin, a clulas viables es un error pues por este
mtodo se sobrevalora la viabilidad de las clulas en la suspensin,
determinando como inviables slo aquellas con la membrana rota.
Existen otros mtodos de determinacin de la viabilidad celular como
el ms preciso de la tincin con ioduro de propidio.
1. se aseptiza el dedo con alcohol y luego se seca al aire o con
algodn. Se coge entre el pulgar y el ndice y se hace una puncin
rpida y penetrante a travs de la piel de la punta del dedo con
una lanceta estril.




2. Se desecha la primera gota de sangre y se aspira la siguiente con
la pipeta de dilucin perfectamente limpia y seca hasta la seal 1
o 0.5 (tambin puede utilizarse la pipeta de hemoglobina, de 20
microlitros). Hay que evitar la entrada de burbujas de aire,
pudiendo ayudarnos de un papel de filtro para conseguir el
enrasado.

3. A continuacin se toma con la pipeta lquido de Hayem, isotnico
con la sangre, hasta la seal 1; as, la sangre queda diluida al 1/10,
si tomamos sangre hasta la seal 1, o al 1/20 si tomamos hasta
0.5. Esto es as porque el volumen de la bola de la pipeta es 100
veces superior al del capilar de la misma. (Si hemos utilizado la
pipeta de hemoglobina podemos diluir su contenido en 2 o 4 ml de
lquido de Hayem para obtener diluciones 1/100 o 1/200).




4. Se adapta un cubreobjetos sobre una cmara cuenta glbulos
limpia y seca y se coloca una gota en uno de los lados del cubre;
esta gota penetra por capilaridad y rellena el retculo de la misma.


5. Una vez preparada la cmara se coloca sobre la platina del
microscopio dejndose unos minutos en reposo para que
sedimenten los glbulos. Disponemos el condensador bajo y luz
dbil; enfocamos primero con el objetivo dbil seco y luego se
cambia al fuerte seco para proceder al recuento, que se lleva a
cabo en los cuadrados pequeos del retculo marcado en color
rojo. Finalizado el recuento se procede a la limpieza de la pipeta
con actico 1:3, agua destilada y alcohol-ter sucesivamente.
7. El volumen de sangre en el cual se han contado las clulas resulta
de multiplicar la profundidad de la cmara por el factor de
dilucin, la superficie de los cuadrados y el nmero de cuadrados

contadosCon cmara de NEUBAUER: Superficie de 1 cuadrado
grande (1/20 mm de lado):

Volumen de un cuadrado grande (1/10 mm de profundidad):

Si contamos "a" glbulos rojos en "n" cuadrados pequeos, el nmero
de glbulos por cuadrado ser a/n.
Si en un volumen 1/4000 mm3 hay a/n glbulos rojos, en 1 mm3 habr
X. Luego:


Siendo X el nmero de glbulos rojos existentes por cada mm3 de
sangre diluida.
Si la sangre se diluy a 1/100 o 1/200, habr que multiplicar el valor X
por 100 o 200 respectivamente, con lo cual obtendremos un nuevo
valor, Y, que representa el nmero de glbulos rojos existentes por
cada mm3 de sangre (sin diluir).



Se utilizan para calcular, mediante el uso del microscopio, el nmero de
partculas (leucocitos, hemates, bacterias) por unidad de voluimen de
un lquido.
La cmara est constituida por una placa base de vidrio especial
pareciso a un porta, su parte central se encuentra separada de los
extremos por unas ranuras. en ella se encuentran las cuadrculas de
recuento. La frmula de contaje es: partculas/mm3= partculas
contadas.
Clases de cmaras:
Neubauerimproved: Es el ms utilizado (9 cuadros grandes, cada 1
de 1 mm2.)
Neubauer: La diferencia es el cuadro grande central.
Thoma: Se utiliza solo para el recuento de eritrocitos.
Fuchs-Rosenthal: Se utiliza habitualmente para recuento de
clulas en lquidos orgnicos (LCR, Lquido sinovial)

III. EQUIPOS Y MATERIALES:
cmara de Neubauer.
Micropipeta.
Tubos de ensayo.
Alcohol de 96.
Vaso precipitado 50 ml.
Cubreobjetos.



IV. PROCEDIMIENTO:
Conteo en cmara de Neubauer: Esta cmara se utiliza para conteo
celular.

1. Limpie la cmara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol.



2. Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordado
quebrada.

3. Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cmara en forma vertical,
esta debe quedarcentrada.


4. Proceda a llenar la cmara. Este paso es muy importante y
definitivo en la distribucin de las clulas .Es recomendable llenar
la con micropipeta pequea.
5. Con la pipeta se coloca ya que la cmara se llena con una gota. El

llenado debe ser continuo en un solo intento.

6. La cmara no puede quedar seca esto se detecta porque en las
esquinas del recuadro de llenado se ven porciones secas.
Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cmara es de lquido
abundante en las terminaciones del recuadro.

7. Conteo: Llvela cmara a el microscopio y enfoque el cuadro de
conteo con el ocular de 4X.Observar lo siguiente.



8. Si las clulas que va a contar son pequeas como son las levaduras,
bacterias, etc., ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular
de 10X. Se visualizar de la siguiente manera:

9. En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se
cuentan las clulas presentes en 5 campos, generalmente se
cuentan los cuadros de las esquinas y el central, lo que garantiza

un conteo aleatorio.
10. Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza
cada uno

11. De los campos y con ayuda de el carro del microscopio se desplaza
la cuadricula hasta contar en todos los cuadros. El conteo en estos
campos de la cmara se conoce como AP (altopoder). Con el lente de
40X cada cuadro se ve de la siguiente manera:




12. Las clulas se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se
recomienda realizar el conteo siguiendo las flechas para evitar
que se cuenten las clulas dos veces o que no se cuenten
.Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres lneas que
delimitan el cuadro, que son fundamentales en el momento del
conteo ya que definen cuales clulas son contables o cuales estn
fuera del campo de conteo .Las clulas que no tocan la segunda
lnea son contables, si la toca no estn encima de ella no se
incluyen .Grficamente se puede apreciar la forma correcta de
conteo. Las clulas que tiene una X son las que no se deben
contar.




13. Despus de contar las clulas se procede a calcular al nmero de
clulas por unidad de volumen. Para esto se utiliza el rea de cada
cuadro, el espacio ocupado por el lquido en el que estn las clulas
que es el mismo espacio que hay entre la cuadricula de la cmara y la
laminilla de cuarzo.
14. Se promedia el nmero de esporas de la cmara de arriba con la
de abajo, se multiplica por el factor de dilucin y por un factor
Figua la 10
6
si se cont el cuadro central o 10
4
si se contaron los
cuadros de los extremos, obteniendo el valor X.

Si 1 ml del preinoculo X esporas

Interrogante Esporas a inocular (Ej.:1*10
8
esporas)


Luego, este valor se multiplica por la cantidad de mililitros de medio en
el que va a Desarrollarse el microorganismo.

V. CONCLUSIONES:

Pudimos repasar y conocer mejor esta tcnica y sobre todo la
importancia de conocer bien los procedimientos y de estudiarlos y
comprenderlos correctamente, no solo a la hora de calificar la
materia, sino para poder ponerlos en prctica y tener un
conocimiento general acerca de la sangre, lo cual es la finalidad de
la capacitacin de laboratorista clnico-hematologa, formar
ntegramente alumnos capaces de realizar este tipo de anlisis.
VI. BIBLIOGRAFA:
http://members.tripod.com/~Biorreactores/Definicion.htm
http://2l2m-laboratoristaclinico.blogspot.com/2009/04/camara-de-
neubauer.html
2l2m-laboratoristaclinico.blogspot.com/.../camara-de-neuba
























III PRACTICA DE BIOTECNOLOGIA DE ALIMENTOS
TEMA: USOS DE LA CAMARA NEUBAUER
OBJETIVO
Aprender a utilizar la cmara Neubauer , y similares para el recuento de
levaduras.
FUNDAMENTO TEORICO
Adems del recuento de levaduras en placa el mtodo de recuento con la
cmara Neubauer es bastante til. Para realizar un buen recuento, es
necesario teir la muestra para distinguir las clulas viables vivas de las

muertas . Las muertas son las que se tien. Los colorantes que se pueden
utilizar son : azul de tripn, azul de metileno o rodamina.
La cmara consta de un campo central o fondo de la cmara donde estn
grabadas dos cuadrculas de recuento, que estn separadas una de otra por
una ranura. El fondo de la cmara del campo central es de 0,1 mm ms bajo
esto es la profundidad de la cmara.
PROCEDIMIENTO
Preparacin de la muestra:
Lavar la cmara y el cubre con agua destilada y alcohol de 96%.
Secar bien con papel suave.
Poner el cubreobjetos encima de la cmara.
Homogenizar removiendo bien el cultivo en donde residen las levaduras.
Tomar con pipeta una muestra.
Poner la punta de la pipeta en una de las dos ranuras de la cmara y por
capilaridad, las levaduras se distribuirn en la cmara.
Si se crea una cmara de aire repetir la operacin desde el principio.
Fijar la cmara de recuento en la platina del microscopio para realizar la
observacin microscpica.
Esperar unos minutos antes de contar para que las levaduras se depositen
en la cmara.
Preparativos del microscopio:

El enfoque del microscopio se empieza con el objetivo de menor aumento
que posteriormente pasaremos a uno de ms. Se centra el objetivo del
microscopio a ojo en el centro terico de la cruz de la cmara, luego se
coloca el objetivo lo ms cerca posible del cubreobjetos pero sin tocarlo y
posteriormente se ir alejndolo hasta que la imagen sea la ms clara y
ntida posible. Se aconseja trabajar a 400 aumentos.
Para contabilizar las levaduras totales se aconseja siempre hacer la media
de levaduras contenidas en varios grupos de cuadros.
Las cmaras tienen 400 cuadrados tiles.
RESULTADOS
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA





































UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
Escuela de Ing. De Industrias Alimentarias

Alumno
Arenaza Mamani, Fredy
(2006-29251)
Chuctaya navarro, David
(1993- )
Docente
MGR. Amelia Castro Gamero

Materia
BIOTECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

(Practica)
Tipo de trabajo
Informe 01 :CAMARA DE NEUBAUER

Ao acadmico

Quinto ao