Вы находитесь на странице: 1из 39

Cromatografa

1


ROMATOGRAFI A



Qu es?


Para qu sirve?




La cromatografa es una tcnica en donde se lleva a cabo la separacin de
compuestos con el propsito de identificar, cuantificar o purificar cada uno de los
componentes de una mezcla de solutos, basndose en las velocidades con las que se
mueve cada soluto a travs de un medio poroso arrastrado por un solvente, una mezcla
de solventes o por gas
(13)
.

Cmo se divide la Cromatografa?

Existen diferentes divisiones en la prctica para la cromatografa como la de
adsorcin, reparto, intercambio inico, exclusin molecular, y por afinidad
(8, 10)
.

La cromatografa de adsorcin es la forma ms antigua de la cromatografa en
la cual se utiliza una fase estacionara slida y una fase mvil lquida o gaseosa. El
soluto puede adsorberse en la superficie de las partculas slidas. El equilibrio entre el
estrado adsorbido y la solucin es la causa de la separacin de las molculas del soluto.

La cromatografa de reparto es una tcnica en donde una fase estacionara
forma una pelcula delgada de la superficie de un soporte slido. El soluto se equilibra
entre este lquido estacionario y una fase mvil lquida o gaseosa.

La cromatografa de intercambio inico se basa en el equilibrio de los iones de
soluto entre el solvente y los sitios fijos cargados de la fase estacionara esta cuenta con
intercambiadores aninicos (grupos con carga positiva unidos covalentemente) los
cuales retienen a los aniones del soluto y con intercambiadores catinicos (grupos con
carga negativa) retienen a los cationes del soluto.

La cromatografa de exclusin molecular se denomina tambin cromatografa
de filtracin en gel, en esta tcnica las molculas se separan por su tamao se utiliza
mucho en la bioqumica para separar molculas grandes como protenas, carbohidratos e
incluso para separar polmeros y caracterizarlos.

C

Cromatografa

2
La cromatografa por afinidad es una tcnica muy selectiva se utilizan
interacciones altamente especficas entre un tipo de molculas de soluto y otras
molculas que se unen (inmovilizan) covalentemente a la fase estacionara.

La cromatografa de lquidos de alta resolucin se utiliza para separacin de
compuestos que no son lo suficientemente voltiles o no tienen bastante estabilidad
trmica para la cromatografa de gases. Se utilizan columnas empacadas grandes con
fase mvil suministrada por gravedad o por bombeo a baja y alta presin en esta ultima
se utilizan columnas pequeas que contienen un menor tamao de partcula de empaque
gel de slice o almina.

La cromatografa de gases se basa en que un lquido voltil o un soluto gaseoso
son arrastrados por una fase mvil gaseosa que circula sobre un lquido estacionario que
recubre un soporte slido o sobre una superficie slida absortiva.

Se describen a continuacin los principios de la cromatografa de gases y al finalizar se
explicaran los mismos para la cromatografa de lquidos.






























Cromatografa

3


CROMATOGRAF A DE GASES


La cromatografa de gases se utiliza para separar, identificar y cuantificar
cualquier material que contenga una presin de vapor apreciable (1 a 1000 mm Hg) a
una temperatura de operacin de la columna (medio de separacin) desde 70 C a
400 C
(12)
.

Se basa en la diferencia de velocidades de migracin de los componentes de una
mezcla entre dos fases; una estacionaria y una mvil (gas), de tal manera que cada
componente es selectivamente retenido por la fase estacionaria.

En esta cromatografa un soluto gaseoso (vapor de un lquido voltil) es
transportado por una fase mvil gaseosa.

De acuerdo al tipo de fases estacionaria se clasifica en dos:

La fase estacionara suele ser un lquido no voltil que recubre el interior de la
columna o un soporte slido de grano fino. Esta forma ms comn de cromatografa de
gases se llama cromatografa de reparto o de particin gas lquido.

En ocasiones se utilizan como fase estacionaria partculas slidas sobre las que
el soluto puede adsorberse.

En este caso la tcnica se denomina cromatografa de adsorcin gas slido.


Qu pasa dentro de un cromatgrafo de Gases?

1. Una muestra de lquido voltil es inyectada a travs de un septo de goma (un disco
delgado) en un puerto de inyeccin caliente, recubierto de vidrio o metal, donde se
vaporiza la muestra. La muestra gaseosa puede inyectarse con una jeringa de cierre
hermtico o a travs de una vlvula de muestreo de gas.

2. La muestra es arrastrada rpidamente hacia la columna del gas portador inerte (que
suele ser He, N2 o H2), que acta como fase mvil. Despus de pasar por la
columna que contiene la fase estacionara, los solutos son separados y fluyen por un
detector, cuya respuesta se visualiza en un registrador o una computadora.

3. No es necesario que la temperatura de la columna sea mayor que el punto de
ebullicin de todos los solutos. Slo debe ser lo bastante elevada para que cada
soluto tenga suficiente presin de vapor a fin de ser eluido en un tiempo razonable.

4. El detector se mantiene a mayor temperatura que la columna, de modo que en esta
todos los solutos estn en fase gaseosa. Los solutos que salen del cromatgrafo de
Cromatografa

4
gases pueden colectarse para su identificacin o enviarse directamente a un
espectrmetro de infrarrojo o de masas para el anlisis inmediato de cada pico
cromatogrfico.

5. Para colectar cantidades de soluto del orden de los microlitros, en el puerto de salida
del cromatgrafo se inserta en un tubo de vidrio en U, el fondo de ese tubo se enfra
con hielo seco o nitrgeno lquido para condensar el soluto.




Figura 1. Esquema de un Cromatgrafo de Gases.




Cules son las partes de un cromatgrafo de Gases?

En general las partes bsicas de un cromatgrafo de gases son:

1.- Gas de arrastre (Cilindro).
2. - Regulador de presin y vlvulas de control de flujo.
3.- Inyector ( Sistema de muestreo)
4. Horno de la Columna
5. - Columna.
6. - Detector
7. - Registrador





Cromatografa

5
GAS DE ARRASTRE
El Cromatgrafo de Gases emplea gas como fase mvil para este tipo de cromatografa,
las caractersticas que este gas debe reunir bsicamente son las siguientes:



Inerte con respecto a la muestra y a la fase estacionaria
Capaz de minimizar la difusin gaseosa.
De fcil disponibilidad y con un alto grado de pureza
Adecuado al tipo de detector que se emplea.


Sobre la base de esto los gases ms usados en cromatografa de Gases son el Helio,
Nitrgeno e Hidrgeno, ya que son inertes, tienen baja difusin gaseosa y se encuentran
fcilmente con altos grados de pureza como 99.999%, aunque tambin se usa la mezcla
Argn-metano (95-5%). La velocidad para un flujo ptimo se puede determinar
experimentalmente empleando la ecuacin de Van Deempter
(6, 14)
.


La velocidad de flujo ms eficiente, es el mnimo de la altura equivalente de un plato
terico, o bien, al mximo del nmero de platos
(2, 12)
.













Figura 2. Plano de Van Deempter para la seleccin de la velocidad de flujo ptimo
del gas de arrastre
(10)




REGULADOR
Un regulador de presin se emplea para uniformar la entrada del gas en la columna. Es
importante que el regulador sea el adecuado para cada tipo de gas y adems que sea
apropiado para gases de alta pureza.












AEPT
Velocidad de flujo
Cromatografa

6

SI STEMAS DE MUESTREO
Es el lugar donde se introduce la muestra al cromatgrafo de gases y en el cual la
muestra debe evaporarse de inmediato y combinarse con el gas de arrastre. Debido a la
composicin o estado de las muestras, estas pueden caracterizarse como:


Muestras lquidas.
Se emplea una jeringa con punta, se perfora con ella un septum.


Muestras gaseosas.
Se emplean vlvulas muestreadoras especiales con el empleo de circuitos muestreadores
de volmenes especficos, o bien con jeringas especiales de precisin.

Muestras slidas.
Se recurre a solventes o se emplean jeringas especiales en forma de esptulas.




SOLVENTES


Las caractersticas bsicas que un solvente debe tener para ser empleado en
cromatografa de gases son:

Un buen solvente absoluto para los componentes de la muestra, si la solubilidad es
baja, los componentes eluyen rpidamente y la separacin es pobre.

Ser un buen solvente diferencial para los componentes de la muestra.

No voltil, la presin de vapor 0.01 a 0.1 mide Hg a la temperatura de operacin
razonable para la vida de la columna.

Trmicamente estable, la inestabilidad puede ser promovida por el soporte con la
influencia de la temperatura.

Qumicamente inertecon respecto a la muestra.
(12)

COLUMNAS

Las columnas empacadas de acero inoxidable o vidrio tienen dimetros de 3 a 6
mm y de 1 a 5 m de longitud. La columna se llena con un soporte de grano fino
recubierto de un lquido no voltil como fase estacionaria, aunque el slido mismo
puede ser la fase estacionaria. Para trabajos preparativos, el espesor de la fase
Cromatografa

7
estacionaria se incrementa para dar ms cabida a la muestra y se prefieren las columnas
de mayor dimetro (figura 3).

Las columnas tubulares abiertas son mucho ms estrechas y pueden ser mucho
ms largas que las columnas empacadas. El diseo tubular abierto proporciona mayor
resolucin, menor tiempo de anlisis y mayor sensibilidad que las columnas empacadas,
pero con el se maneja una cantidad de muestra considerable menor. El aumento en la
resolucin se debe a que la longitud de la columna es mayor por lo cual aumenta el
nmero de platos tericos por unidad de longitud. El tiempo de anlisis se debe a que la
columna contiene mucho menos fase estacionaria que en el caso de la columna
empacada, de modo que se retiene menos a los solutos.
(7, 8, 11)



















Figura 3. Diferencia entre columna empacada y capilar.


El menor soluto de la fase estacionaria significa que la columna tubular abierta
puede aplicarse mucho menos muestra que a una columna empacada
(14)
.

La sensibilidad es una medida de la relacin seal-ruido del detector para una
concentracin dada de analito en la solucin inyectada. La sensibilidad que se obtiene
con una columna tubular abierta es mayor que la propia de una columna empacada,
debido a que
1) un gas ptimo para el funcionamiento del detector se agrega a la corriente de
la muestra al entrar al detector;
2) los contaminantes provenientes del septo se reduce por purga continua del
sistema de entrada;
3) se reduce el paso de fase estacionaria de la columna hacia el detector, porque
hay menos fase estacionaria;
Fase estacionaria
Silica Fundida
Capa de poliamida
Columna capilar dimetro interno 1/16 in
Fase estacionaria
Silica Fundida
Capa de poliamida
Columna capilar dimetro interno 1/16 in


Cromatografa

8
4) las fluctuaciones en el flujo del gas portador, que inducen fluctuaciones en la
respuesta del detector son amortiguadas por la considerable longitud de la
columna capilar.


SOPORTE SLIDO

Las columnas empacadas contienen un lquido no voltil depositado en
partculas finas de un soporte slido inerte. El soporte debe ser de un material
resistente en partculas pequeas en forma constante, con gran rea superficial. La
mayora de los soportes son de diatomita (tierra de diatomeas), consistente en los
esqueletos de slice de las algas microscpicas denominadas diatomeas. El soporte no
debe interactuar con los solutos, pero ningn soporte es del todo inerte. La silanizacin
con hexametildisilazina o diclorometilsilano ((CH
3
)
2
SiCl
2
) es una forma ampliamente
utilizada de reducir la interaccin de partculas de slice con solutos polares. Para
solutos muy reactivos el tefln puede ser un soporte til.
(8)

La uniformidad del tamao de partculas reduce el trmino de trayectorias
mltiples en la ecuacin de Van Deemter*, con lo cual tambin reduce la altura del
plato e incrementa la resolucin. El tamao reducido de la partcula reduce el tiempo
requerido para el equilibrio de los solutos, lo que mejora la eficiencia de loa columna.
Sin embargo menor tamao de partcula, ms presin se requiere para forzar la fase
mvil a travs de la columna.
(8)

El tamao de partcula de los soportes cromatogrficos se expresa como tamao de
malla, el cual se refiere al tamao de poro de tamices por los cuales las partculas de los
soportes cromatogrficos pasan o son retenidas.

Una partcula con tamao de malla 100/200 pasar por un tamiz nmero 100 pero no
por otro nmero 200. El nmero de tamiz se refiere a la cantidad de dos poros por
pulgada lineal de malla.
(8)

Hay 5 formas de Chromosorb A, G, P, W y T; los cuales son disponibles con o
sin tratamiento y en una variedad de rangos de malla. Chromosorb es una marca
registrada para soporte slido por Jhons Manville
. (8)




FASE ESTACIONARIA


Existe una variedad increble de fases lquidas disponibles para la cromatografa
de reparto gas-lquido. La eleccin de una fase lquida para un problema dado es
esencialmente emprica. S presentan a continuacin las diferentes clases de solutos que
son retenidas con frecuencia por cada fase lquida. Una variedad de fases lquidas puede
ser apropiada para resolver un problema dado de separacin.



Cromatografa

9

Tabla 1. Fases lquidas comunes para columnas cromatogrficas
(10)





Tabla 2. Fases lquidas comunes usadas en Cromatografa de Gases
(10)



SE 30 350 C mx.




APIEZON (Hidrocarburos mezclados) 275 300 C mx.

OV 17 (Metilfenilsilicona) 300 C mx.


CARBOWAX 20M 250 C mx.


Tetrahidroxietilendiamina EDTA 150 C





La cantidad de fase lquida utilizada se expresa como porcentaje en peso del
soporte lquido. Las cargas ms comunes estn en el intervalo de 2 a 10%. Por encima
del 30%, la eficiencia de la columna disminuye debido a que se forman algunas de fase
lquida. Abajo del 1% la superficie del soporte puede ser no cubierta por completo
(8)
.

I.- Baja Polaridad II.- Polaridad
intermedia
III.- Polares IV.- Muy polares
Hidrocarburos
saturados
teres Alcoholes Polihidroxialcoholes
Hidrocarburos
olefnicos
Cetonas cidos carboxlicos Aminoalcoholes
Hidrocarburos
aromticos
Aldehdos Fenoles Hidroxicidos
Halogenuros de
alquilo
steres Aminas primarias cidos poliprticos
Mercaptanos Aminas terciarias Oximas Polifenoles
Sulfuros Compuestos nitro (sin
tomos de hidrgeno
en o)
Compuestos nitro (sin
tomos de hidrgeno
en o)

CS2 Nitrilos (sin tomos de
H en o)
Nitrilos (sin tomos de
H en o)

(silicones)
CH
3
Si O Si O
CH
3
CH
3
CH
3 r

HO CH
2
CH
2
O H
n

Cromatografa

10
En general un gran porcentaje de fase lquida conduce a una mayor capacidad
para el soluto, tiempos de retencin mayores, y mayor separacin entre picos. Un
porcentaje ms bajo da por resultados anlisis ms rpidos y valores ms pequeos de
HETP.

En las columnas tubulares abiertas se utilizan fases lquidas similares, con
modificaciones que minimizan la descarga de fase lquida de la columna

En las columnas empacadas como en las tubulares abiertas se emplean varias
fases estacionarias slidas. La almina (Al
2
O
3
) es un material comn que puede separar
hidrocarburos en cromatografa de reparto gas-slido. Los tamices moleculares son una
notable fase slida ampliamente usada en cromatografa; son materiales inorgnicos o
polmeros orgnicos con grandes cavidades en las cuales pueden entrar molculas
pequeas que son parcialmente retenidas.
(8, 10)

Es posible separar entre si molculas pequeas como H
2
, O
2
, N
2
, CO
2
, y CH
4
.
Tambin pueden sacarse gases hacindolos pasar por trampas que contienen tamices
moleculares, porque estos retienen fuertemente el agua. Los tamices inorgnicos pueden
regenerarse (secarse) calentndolos a 300 C a vaco o a un chorro de N
2
.



EFI CI ENCIA DE LA COLUMNA


La eficiencia de la columna se mide por el nmero de platos tericos; al comparar la
eficiencia de las columnas, debemos ser especficos al solvente, soluto, temperatura,
velocidad de flujo y tamao de la muestra.

Cuando una sustancia entra a la columna junto con el gas de arrastre, se disolver en la
fase liquida hasta que se establezca un equilibrio, de acuerdo con los valores de la
concentracin en la fase estacionaria y en la fase m6vil. Durante el paso de la sustancia,
a lo largo de la columna, este equilibrio se rompe por efecto de transporte y debe
restablecerse consecutivamente. Desde el punto de vista terico, es conveniente
considerar este proceso en varios pasos discontinuos de equilibrio; es como si
dividiramos la columna en un nmero de secciones iguales entre si; en cada una de
estas secciones, el equilibrio vapor-liquido debe restablecerse. Se ha denominado a
cada una de estas secciones "Plato Terico"
(2)
El valor del nmero de platos tericos puede obtenerse de un cromatograma, a partir de
la expresin siguiente:
N = 16 ( x/y)
2

donde "x" es el tiempo de retencin del componente y "y" es la amplitud de la base, por
lo que, se tiene:
N =16 ( tr/wb)
2

El nmero efectivo de platos tericos para una columna equivale a:

N
ef
=16 Ctlr/wb )
2

donde: tr = tr - tm
Cromatografa

11
A partir del nmero de platos y conociendo la longitud de la columna, podemos
encontrar el valor de la altura equivalente de un plato terico (HETP).

HETP =L/N

donde: "L" es la longitud de la columna cromatogrfica, usualmente en cm.
(12, 13)



EFICIENCIA DEL SOLVENTE

La eficiencia del solvente est relacionada con los siguientes cuatro aspectos.

1. Fuerzas de interaccin y coeficiente de particin.

a) Orientacin o fuerzas keesom: Fuerzas resultantes de la interaccin entre dos dipolos
permanentes. El enlace de hidrgeno es un tipo importante de fuerza de orientacin,
que particularmente se encuentra en cromatografa de gases.

b) Dipolo inducido o fuerzas Debye: Fuerzas resultantes de la interaccin entre el dipolo
permanente de una molcula y el dipolo inducido de una molcula vecina. Estas fuerzas
son generalmente pequeas.

c) Dispersin o Fuerzas no-polares (London): Fuerzas acumuladas de las variaciones
sincronizadas en los dipolos instantneos de l interaccin de las especies.

d) Fuerzas de interaccin especfica: resultado de fuerzas de los enlaces qumicos,
formacin de complejos entre el soluto y el solvente.
(10)


2. Eficiencia del solvente y temperatura.

La eficiencia del solvente se mide por la retencin relativa (o) de 2 componentes
















Figura 4. Retencin relativa para 2 compuestos.
Inyeccin T
o
T
1
T
2

x
2

x
1

x
1

x
2

Cromatografa

12

Retencin relativa:

o= x
2
/x1 si o=1, no hay separacin

o es la relacin de los tiempos de retencin corregidos o coeficientes de particin para 2
picos. La retencin relativa difiere del factor de separacin (F.S), donde SF es relacin
de los tiempos de retencin sin corregir. Ver figura 4.
(10)

1
2
1
2
tr
tr
x
x
SF = =


3. Resolucin (R).

La separacin real de dos picos consecutivos se mide por la resolucin, R es una medida
de las eficiencias de la columna y el solvente. Ver figura 5.
(10)

Figura 5. Medidas para obtener la resolucin de dos picos


2 1
2
w w
d
R
+
= o bien
|
|
.
|

\
|
+

=
2 1
1 2
2
w w
tr tr
R

El valor de la resolucin R depender de que tan bien definidos estn los picos. R=1
Significa que los picos estn separados al 98% o sea que el 2% de los picos estn
traslapados, R=1.5 significa que los picos estn completamente separados (99.7%
separados).


4. Nmero de platos para una separacin requerida

J.H. Punell desarroll una ecuacin para determinar el nmero de platos requeridos, as
como la longitud de la columna requerida, la expresin es la siguiente:

2
2
2
2
2
'
'
1
16
|
|
.
|

\
| +
|
.
|

\
|

=
k
L k
R N
req
o
o

donde
k
2
es el factor de capacidad para el segundo pico (pico ms retenido), el factor de
capacidad k, tambin puede definirse como el tiempo que pasa un compuesto en la fase
liquida de la fase estacionaria.
Cromatografa

13

tm
tr
k
2
2
'
' =
o
t
tr
k
'
' =
donde
K es el Factor de capacidad
L es la longitud
orig
reg
orig req
N
N
L L =

.
(10)

DETECTORES


El detector cromatogrfico es un recurso con el cual se identifica y mide la cantidad
de componentes separados por el gas portador.


Una de las clasificaciones digamos clsica de los detectores se divide en:


- integrales
- diferenciales.


Detector integral.

Es aquel que da una respuesta proporcional a la masa total del componente en la zona
eluda. Cuando el gas portador pasa a travs del detector, el registrador muestra una
lnea recta (lnea base), cuando un componente pasa a travs de la zona, la pluma del
registrador se mueve a travs de la carta por una distancia proporcional a la masa total
del componente en la zona.

El cromatograma que produce un detector integral consiste en una serie de etapas que
corresponden a cada componente (figura 6).
(10, 11)






T
1
T
2
Tiempo
Figura 6. Cromatograma integral.
R
E
S
P
U
E
S
T
A

Cromatografa

14

Detector diferencial.

Es aquel que da una respuesta proporcional a la concentracin o a la masa de velocidad
de flujo del componente eludo. El ejemplo de un detector que responde a la
concentracin es el de conductividad trmica, el detector de ionizacin de flama (FID)
es un ejemplo de un detector que responde a la masa de la velocidad de flujo.


El cromatograma que se obtiene con un detector diferencial consiste en una serie de
picos, cada uno de los cuales corresponde a un componente diferente (figura 7). El rea
bajo el pico es proporcional a la masa del componente. .
(10, 11)
















CARACTERISTICAS PARA UN DETECTOR


Los detectores cromatogrficos difieren uno de otros en su principio de operacin, por
lo que resulta difcil compararlos; sin embargo, presentan ciertas caractersticas que son
indicativas para la utilidad del detector, estas caractersticas son:

1. Selectividad.
La selectividad de un detector depende del principio de operacin. Un detector de
conductividad trmica responde al cambio en la conductividad trmica entre la muestra
y el gas de arrastre, la conductividad trmica es proporcional al peso molecular, para el
componente.

2. Sensitividad o detectabilidad.
Para los detectores que responden a la concentracin, la sensitividad es la respuesta del
detector en milivolts por unidad de concentracin de la muestra.

3. Respuesta.
La respuesta de un detector es la Cantidad de una seal generada para una cantidad de
muestra dada.
4. Ruido y mnima cantidad detectable.
Figura 7. Cromatograma de un detector diferencial
(11)

mV

Cromatografa

15
Es la seal elctrica de salida de un detector, la cual se puede incrementar a un valor
deseado por medio de una amplificacin electrnica. De esta forma, el ruido elctrico y
la sensitividad del detector, se pueden agrandar como se desee. La mnima cantidad
detectable es la cantidad para una respuesta del detector igual a dos veces el nivel de
ruido.

5. Rango lineal.
La exactitud de un anlisis cuantitativo, depende de la relacin lineal entre la
concentracin y la respuesta del detector; podemos definirla como la relacin de
concentracin grande o pequea con la cual el detector es lineal.
.
(10)
Los ms comunes detectores empleados en cromatografa de Gases.

- Conductividad trmica TCD
- Ionizacin de Flama FID
- Captura de electrones ECD
- Fotomtrico de flama FPD
- Termoinico especfico TSD
- Det. de Hall de conductividad electroltica HECD
- Espectrmetro de masas MS



Detector de Conductividad Trmica (TCD).

Este detector consiste en una serie de filamentos montados coaxialmente en uno o dos
cilindros metlicos; los filamentos se calientan por medio de una corriente elctrica,
alcanzando una temperatura deseada. Para los detectores de un cilindro metlico, al
pasar el gas de arrastre por l, la temperatura del filamento depender de la naturaleza
del gas de arrastre y de su flujo; al introducir una sustancia diferente al gas de arrastre,
la temperatura del alambre variar si la sustancia introducida tiene un valor de
conductividad trmica diferente al del gas de arrastre.

Para los detectores compuestos de dos cilindros metlicos, se hace pasar gas de
arrastre por uno de ellos, en tanto que, por el otro, se hace pasar el gas de arrastre y la
muestra, por lo que se tendrn dos temperaturas diferentes para los dos filamentos;
como un cambio en la temperatura produce un cambio en la resistencia elctrica del
filamento, tendremos dos resistencias diferentes; por consiguiente, el cambio de
resistencia del segundo filamento, con relacin al primero, se puede registrar haciendo
que los filamentos formen parte de un puente Wheatstone. Como la variacin de la
resistencia es debida a la presencia de la muestra, el registro ser proporcional a la
cantidad de sustancia que pasa por el detector.

Los detectores de conductividad trmica se denominan a veces detectores universales,
ya que tienen respuesta para todas las substancias con excepcin del gas de arrastre, los
anlisis que se realizan son generalmente no destructivos, tienen menor sensibilidad que
los detectores de ionizaci6n. Su respuesta es dependiendo de la concentracin de la
muestra en el gas de arrastre.
(13, 14)
Cromatografa

16
Los parmetros ms importantes en la operacin de un detector de conductividad
trmica son:

a) Corriente del filamento;
b) Temperatura del bloque del detector (distinta a la temperatura del filamento en s);
c) muestra;
d) Gas de arrastre

La tabla 3 nos proporciona los valores de conductividad trmica para algunas molculas
(en unidades c.g.s. y a 0C), la conductividad trmica disminuye al incrementar el peso
molecular.
Tabla 3 . Conductividad Trmica
(10)
Gas x 10
5
a 0C Peso molecular
Hidrgeno 41.6 2
Helio 34.8 4
Metano 7.2 16
Nitrgeno 5.8 28
Argn 5.1 40
Pentano 3.1 72
Hexano 3.0 86

Detector de I onizacin de Flama (FI D)

El detector de ionizaci6n de flama es el detector ms importante en
cromatografa, su respuesta es para casi todos los compuestos orgnicos, tiene una
sensitividad relativamente alta y tiene un amplio rango de respuesta lineal. El FID
permite anlisis rutinarios de compuestos en el rango de nanogramos (10
-9
g).

El mecanismo de la produccin de ionizaci6n en el FID consiste en la
combustin de la muestra orgnica a una temperatura alta producto de una flama de
H
2
/aire. La flama del FID es un ejemplo clsico de una difusin de flama; el efluente de
la columna se mezcla con el H
2
y se propaga hacia el centro de un quemador, el aire se
suministra alrededor de la periferia del quemador. El H
2
y el aire se mezclan por un
proceso de difusin de tal manera que, por medio de un encendido elctrico se produce
una flama cuya temperatura es del orden de 2000C.

La reaccin qumica ocurre en la flama del FID en la conversin de H
2
y 0
2
a
vapor de agua, cuando un compuesto orgnico se quema en la flama se generan iones
positivos y negativos; los iones positivos son colectados sobre un electrodo colector
produciendo una corriente elctrica en proporcin a la cantidad de materia quemada.
Esta corriente se amplifica por un electrmetro, el cual produce una seal de salida
capaz de graficar.
(10, 12, 13)


Selectividad del FID: El detector responde a la mayora de los compuestos con la
excepcin de los que se enlistan en la figura 8.


Cromatografa

17
He 0
2
SO
2
CO SiHC1
3

Ar N
2
NO C0
2
SiCl
4

Kr CS
2
N
2
O H
2
0 SiF
4

Ne COS NO
2
HCHO
Xe H
2
S NH
3
HCOOH
Figura 8. Compuestos que dan un mnimo o no dan respuesta al FID.
(10)

Respuesta del FI D contra la velocidad de flujo

La respuesta del detector depende de la seleccin apropiada de las velocidades de flujo
para los gases que requiere para su operacin (gas acarreador, hidrgeno y, aire). En
general, una buena sensitividad y estabilidad se pueden obtener con una velocidad de
flujo para: 30 ml/min de gas acarreador, 30 ml/min de H
2
y 300 ml/min de aire.

La Figura 9muestra la afinidad entre la sensitividad del detector y la velocidad de Flujo
para el H
2
, usando un flujo de 30 ml/min de gas portador ), un flujo de 300 ml/min de
aire. La mayor respuesta del detector para propano se alcanza con un flujo de 30
ml/min de H
2
.
0.02
0.015
0.01
15 20 25 30 35 40 45
Flujo de H
2
(ml/min)

Figura 9. Sensitividad del FID contra el flujo de H
2
.
(10)

Como se muestra tambin en la Figura 10 la velocidad de flujo del aire afecta la
sensitividad del detector, por lo general, una velocidad de flujo de 300 ml/min es
satisfactoria para obtener una buena respuesta.




0 100 200 300 400 500
Flujo de aire (ml/min)

Figura 10. Sensitividad del FID contra el flujo de Aire.
(10)

Sensitividad
(Cal/g)
Sensitividad
Cromatografa

18




Detector de Captura de electrones (ECD)


Responde a compuestos que contienen grupos funcionales electronegativos

Su aplicacin ms comn es para halgenos. Tambin responde al antraceno,
cetoesteroides, nitrobencenos y fenoles; fumaratos, oxalatos, cetonas conjugadas
. (12)

Una descripcin de su funcionamiento se observa en la figura 11.













Figura 11. Diagrama de bloques del funcionamiento de un detector de captura de
electrones




Detector Fotomtrico de Flama. FPD


Este detector contiene un detector de flama, que realiza su misma funcin y despus
pasa a travs de un filtro que lleva la muestra a su estado elemental.
La ventaja de este detector es que pueden hacerse anlisis rpidos de compuestos de
azufre y fsforo atmico.
Se emplea bsicamente en la industria petroqumica.
(12)










63
Ni
Gas de
arrastre
Iones
Grupo
electronegativo
Corriente de fondo estable a travs de los electrodos
de la celda
Disminucin de la
corriente de la celda
Cromatografa

19

Termoinico especfico TSD


Trabaja mediante una seal de quimiluminiscencia, es especfico para compuestos que
contienen nitrgeno y fsforo.
Es ~500 veces ms sensible a especies orgnicas que contienen P que el FID.
Es ~50 veces ms sensible a especies orgnicas que contiene N que el FID.
Suprime la respuesta a carbn por 3 4 ordenes de magnitud.
Una esfera de cermica ( Sulfato de Rubidio) calentada 600-1000C suministra E para
la oxidacin, cuya superficie acta como catalizador para formar iones selectivos de N y
P, mientras que provee condiciones pobres para la formacin de iones de C.
(12)




Cromatografa

20

CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA
RESOLUCIN (HPLC)


Tradicionalmente la cromatografa de lquidos (HPLC), se realiza en las tcnicas de fase
normal y fase reversa o fase inversa, aunque existen tambin tcnicas como la
cromatografa de particin de intercambio inico o de apareamiento inico y
Cromatografa de afinidad. Se explican a continuacin brevemente.


CROMATOGRAF A DE ADSORCI N EN FASE NORMAL

En este tipo de tcnica, los compuestos son retenidos por la fase estacionaria sobre la
cul stos son adsorbidos. La fuerza de interaccin de la molcula con la superficie
activa de la fase estacionaria determina el tiempo que tardar la molcula en atravesar la
columna. Las fases estacionarias y mviles ms utilizadas en cromatografa de
adsorcin en fase normal son las siguientes:

Fase estacionaria Fase mvil
SiO
2
Hexano
SiO
2
-(CH
2
)n-NH
2
Heptano
SiO
2
- (CH
2
)n-CH
2
O-CH
3
O Metanol

(10)


CROMATOGRAF A DE ADSORCI N EN FASE I NVERSA

En la cromatografa de adsorcin en fase inversa (RPC), la retencin de los
componentes de una mezcla se lleva a cabo, por medio de fenmenos de adsorcin de
stos a la superficie de la fase estacionaria. La diferencia con la cromatografa de
adsorcin en fase normal, radica en las polaridades invertidas de las fases estacionaria y
mviles (ver figura 12), es decir el sistema de fase reversa consiste en una fase
estacionaria apolar y una fase mvil polar. La fase estacionaria est conformada por
silicatos de estructura porosa sobre las cuales se encuentran unidas qumicamente
cadenas hidrocarbonadas. Las fases ms utilizadas son las cadenas de n-octil (RP
8
) y n-
octadecil (RP
18
). Las fases estacionarias y mviles ms comunes son:


Fase estacionaria Fase mvil

SiO
2
- (CH
2
) 17-CH
3
Metanol/Agua
SiO
2
- (CH
2
) 17 CH
3
Acetonitrilo/Agua


.
(10)
Cromatografa

21

En RPC el porcentaje de agua en la fase mvil tiene una enorme influencia, puesto que
un aumento del 10% de agua en la fase mvil puede duplicar el factor de retencin.
De esta manera se puede modificar la retencin de los componentes haciendo variar la
polaridad de la mezcla eluyente. .
(11)






















Figura 12. Diferencia entre cromatografa de fase normal y de fase inversa




CROMATOGRAF A DE PARTI CI N



En la cromatografa de particin lquido lquido, la fase estacionaria es un fluido, es
decir el soporte poroso de slice se encuentra recubierto de una delgada pelcula de
disolvente. En este sistema es requerido que la fase mvil sea inmiscible con la fase
estacionaria. La separacin de la mezcla se debe a la diferencia de solubilidad de los
compuestos a analizar en la fase mvil o estacionaria. Aqu se aplica el coeficiente de
particin de NERNST. Si una sustancia se disuelve ms fcilmente en la fase
estacionaria, tendr una retencin mayor que una sustancia soluble en la fase mvil e
insoluble en la fase estacionaria. La cromatografa de particin puede realizarse tanto en
fase normal como en fase inversa.
(10, 11)


Polaridad
media
Sup. polar
de la fase
estacionaria
Sup. apolar
de la fase
estacionaria
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
Eluyente
apolar
Eluyente
polar
Polar
Apolar
Polaridad
media
Sup. polar
de la fase
estacionaria
Sup. apolar
de la fase
estacionaria
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
Eluyente
apolar
Eluyente
polar
Polar
Apolar
Sup. polar
de la fase
estacionaria
Sup. apolar
de la fase
estacionaria
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
Eluyente
apolar
Eluyente
polar
Polar
Apolar
Fase normal Fase inversa
Cromatografa

22

CROMATOGRAF A DE I NTERCAMBI O INI CO O DE APAREAMI ENTO
I NI CO

Esta se utiliza para separar molculas cargadas. La separacin se debe a diferencias en
los equilibrios electrostticos entre la fase estacionaria cuya carga es inversa a la de la
fase mvil.

La fase estacionaria consiste en una resina o un slido generalmente poroso cuya
superficie est recubierta de grupos ionizados o ionizables. Los iones que aseguran la
electroneutralidad de la estructura son mviles e intercambiables con los de la fase
mvil en contacto con el intercambiador. Los intercambiadores ms utilizados son
resinas polimricas, las cuales normalmente son geles y slices intercambiadores de
iones. La retencin de un compuesto de carga opuesta depender de la fuerza de dicha
carga. El apareamiento inico es una asociacin entre el in problema y un contra-in.
(agente de apareamiento de carga opuesta aadido a la fase mvil). Ion y contra-ion
forman un complejo neutro hidrfobo, el cual es adsorbido sobre la resina. La retencin
se efecta por medio de un mecanismo de intercambio inico y de adsorcin.
(10, 11)



CROMATOGRAF A DE AFI NI DAD

La cromatografa de afinidad es una variante de la cromatografa de adsorcin y se
realiza preferentemente para purificar, aislar, concentrar compuestos y para el anlisis
de molculas bioqumicamente activas.

El sistema de fases est compuesto de una fase estacionaria modificada qumicamente y
de una fase mvil acuosa. Este fenmeno cromatogrfico se apoya en el equilibrio de
intercambio entre los ligandos de la fase estacionaria y la biomolcula complementaria.

(10, 11)




Cules son las partes de un cromatgrafo de Lquidos?




Figura 16. Esquema de un cromatgrafo de lquidos.










Figura 13 . esquema de un cromatgrafo de lquidos
Cromatografa

23



1. Reservorio de disolventes (fase mvil)
2. Bomba
3. Inyector y Filtros
4. Luv
5. Columna (fase estacionaria)
6. Detector
7. Registrador




Disolventes para cromatografa de lquidos

Los disolventes empleados para la cromatografa de lquidos deben reunir ciertas
caractersticas, la calidad de pureza debe ser grado HPLC, ser transparentes al detector
usualmente al UV, la viscosidad debe ser mnima, limpios en el anlisis al IR, y la
miscibilidad a la fase estacionaria es de considerarse si no queremos tapar la columna.

Adems deben considerarse los siguientes parmetros ya que todos estos
influyen en la separacin cromotogrfica y en el caso de la toxicidad, es importante
considerar la cantidad de disolventes con que se trabaja y la cantidad de residuos que se
generaran:

(10, 11)


1) Estabilidad (se debe asegurar que el sistema cromatogrfico sea lo ms estable
posible para hacerlo ms repetible y reproducible)
2) Polaridad (es uno de los factores que influyen en la separacin cromatogrfica.
3) Inflamabilidad. (por la seguridad en el trabajo)
4) Efectos de mezcla (que la solubilidad de todos los analitos sea optima en el
disolvente y que la mezcla sea estable, no toxica)
5) Compatibilidad con la columna empleada




Columnas para cromatografa de lquidos


La Columna
Es el espacio fsico donde se produce la separacin fsicamente debe reunir ciertas
caractersticas bsicas:
1) resistente: debe resistir altas presiones
2)Qumicamente estable.


Cromatografa

24
Usualmente las columnas estn empacadas con una base de slica o de un polmero
poroso con las caractersticas listadas en la Tabla 4:


Tabla 4. Caractersticas de soportes para columnas de HPLC

Empaque Base slica Base polimrica
pH de trabajo De 1 a 7 De 1 a 10
Caractersticas + comunes,
+ econmicas, mejor
resolucin
+ delicadas,
+ caras,
- resolucin
mejor estabilidad a pH bsicos.

(10, 11)


Dado que los anlisis en HPLC son ms comunes en la industria farmacutica,
qumica y alimentria, las columnas ms usadas son las de tipo analtico. Con
dimensiones aproximada a 25cm de longitud por 4.6 cm de dimetro interno, son
columnas empacadas con partculas esfricas de 5 a 10 m, en aos recientes el
dimetro interno ha disminuido,, el empaque de las columnas se elabora ms esfrico y
pequeo, pero deben emplearse precolumnas de para asegurar la vida media de las
columnas y eficientar la repetibilidad y reproducibilidad delos resultados.

El empaque de las columnas es usualmente un tipo de silica gel, la cual contiene grupos
silanol (Si-O-H) estos grupos son muy polares por lo que son sustituidos por ligandos
C18 C8 tpicamente.
(11)
















Figura 14. Slica gel muestra el grupo silanol y una sustitucin qumica por un grupo
no polar.
(11)




Alguna de las fases con las que son sustituidos estos silanoles son listadas en la tabla 5:




Cromatografa

25

Tabla 5. Fases para cromatografa de lquidos
. (11)


Amino, NH3
O Si
R
R
(CH2)3 NH2

Octilo C8
O Si
R
R
(CH2)
7
CH3

Butilo, C4
O Si
R
R
(CH2)
3
CH3

ODS C18
O Si
R
R
(CH
2
)
17
CH
3

Ciano, CN, Nitrilo
O Si
R
R
(CH
2
)
3
CN

Fenilo
O Si
R
R
(CH
2
)
3

Hexilo C6

SAX
Si
R
R
(CH2)3
O
N
+
CH3
CH3
CH3CL
-

Metilo, C1
Si
CH3
CH3
CH3
O

SCX
Si
R
R
(CH2)3 SO3H
O
-
+

(10)



Eleccin de la columna.


Al analizar una muestra, despus de resolver el problema de la extraccin de los analitos
elegidos de la matriz compleja que representa la muestra como tal, el siguiente
problema es la eleccin de la columna, esto puede resolverse empleando la siguiente
tabla adems hay mtodos desarrollados por qumicos analticos especializados que
pueden consultarse en el rea de aplicaciones de los catlogos de la EPA, ATSDR, o de
los proveedores de los equipos.






Si
R
R
(CH2)5CH3
O
Cromatografa

26

Tabla 6. Gua para seleccin de fase y tipo de cromatografa
. (10)





















Muestra
problema
Peso
molecular
uma
Solubilidad Carcter Tipo de
cromatografa
Fase estacionaria de la
columna



















PM<2000








Soluble en
agua
No inico Fase reversa injertada RP8, RP18, CN,
RP8E, RP18E
Intercambio de
ligandos,
carbohidratos
Poliespher CHPB
CHCA, CHNA





Inico
Fase reversa, control
de ines
RP8, RP18, CN,
RP8E, RP18E
Fase reversa,
polimrica
Poliespher C18
Fase reversa
apareamiento inico
RP selectiva B, RP8,
RP18
Exclusin inica
cidos orgnicos
Poliespher OAKC,
OAHY, AAAC
Cromatografa inica,
mineral, cidos,
aminas
ICAN anions
ICCA cationes
Soluble en THF Permeacin en gel,
molculas pequeas
Lichrogel PSI, PS4,
PS20



Soluble en
disolventes
orgnicos

Soluble en Hexano
Fase normal,
adsorcin
Si 60, Si 100
Fase normal injertada CN, Dioles, NH
2

Soluble en metanol
y metanol/agua
Fase inversa injertada CN, NH
2
, C8, C18





PM>2000




Soluble en agua

Fase inversa injertada
RP8, RP18, 60
selectiva B, 100,
300, RP8 y RP8E
Permeacin en gel
medio acuoso
Lichrospher diol
100, 300, 1000,
4000A
Intercambio inico Polyspher PEI
Polyspher CM
2

Interaccin hidrofoba Polyspher butyl
Soluble en disolventes orgnicos

Permeacin en gel Serie Lichrogel



Detectores ms comunes para LC

En la cromatografa de lquidos de alta resolucin no existe un detector universal como
tal, casi siempre es necesario seleccionar un detector con base en el problema que se
quiere resolver, eventualmente se requiere de dos o ms detectores esto se debe a que la
fase mvil es un lquido de tal forma que los detectores estn limitados en sensibilidad y
selectividad.


Los detectores ms comunes en HPLC son los siguientes:
Cromatografa

27

Detector Tipo Selectividad Sensibilidad
ndice de refraccin Universal Ninguna 10g/mL
UV/VIS Selectivo Dobles enlaces y aromticos 1ng
Fluorescencia Selectivo Poliaromticos 10pg/mL
Infrarrojo Selectivo Molculas con = 0 5 a 10ng/mL
Electroqumico Selectivo Especies oxidables
Masas (acoplado) Universal Ines caractersticos ppb

(10, 11)



Detectores Fotomtricos

El detector ms usado para HPLC es el ultravioleta, su costo de operacin es
relativamente bajo, tiene alta sensibilidad e insensibilidad a cambios de temperatura,
velocidad de flujo y composicin de la fase mvil. Entre los compuesto que absorben en
la regin de ultravioleta, se incluyen todas las que tienen dobles enlaces y los
compuestos con electrones no enlazados y no compartidos como olefinas, y todos los
aromticos, los que tienen un grupo carbonilo, tiocarbonilo, nitroso y azo. Para emplear
este detector el disolvente de la fase mvil debe no interferir con absorbancia en esta
regin del espectro.


Detector de Fluorescencia

Bsicamente este detector mide la luz emitida, mas que la absorbida, ciertas molculas
reemiten la luz que absorben (luz UV) en forma de baja energa y altas longitudes de
onda, mismas que pueden ser utilizadas como una medida de la concentracin del
analito en cuestin. Es muy usado para determinar pureza ya que muchos Hidrocarburos
aromticos policclicos (HPAs) son fluorescentes. La ventaja es que solo se genera una
seal cuando un compuesto fluorescente llega al detector. La significativa sensitividad
de este detector a fomentado el desarrollo de pre-columnas y pos-columnas que
realizan una derivacin de compuesto que no son fluorescentes en compuestos que si
son fluorescentes para que el llegar al detector genere una seal y aumentar la capacidad
de la tcnica.


Detector infrarrojo

Gracias a la presencia de diversos grupos funcionales en los compuestos analizados el
detector de infrarrojo es muy til. Sin embargo solo pocos disolventes son transparentes
en la porcin ms til de esta regin del espectro, algunos de estos son tetracloro
metano (CCl
4
), triclorometano (CHCl
3
), sulfuro de carbono (CS
2
), mismos que son
infrecuentes en las separaciones cromatogrficas.




Cromatografa

28
Detector electroqumico

Los electrodos empleados en este tipo de detectores suelen contaminarse
frecuentemente, por lo que se desarrollaron sistemas de autolimpieza automticos. Este
tipo de detector es sensible a compuestos que pueden oxidarse o reducirse rpidamente
como fenoles, mercaptanos, aminas, compuestos nitro aromticos, halogenados,
aldehdos, cetonas y especialmente benzidinas. La eleccin correcta del potencial
aplicado a los electrodos realza los lmites de selectividad y sensibilidad del anlisis.


Detector de masas ( acoplamiento de cromatografa de lquidos con espectrometra de
masas).
Con la espectrometra de masas, la qumica analtica tuvo un nuevo auge, ya que es una
de las herramientas ms poderosas para la identificacin de compuestos, los
espectrmetros de masas son relativamente fciles de acoplar a los cromatgrafos de
gases, l acople a un cromatgrafo de lquidos requiere de una interfase especializada.
Existen las interfases de rayo particulado muy usadas en anlisis estructurales y la
interfase de termospray (para anlisis cuantitativos). Con un rayo de partculas se
pueden generar espectros de masas de compuestos conocidos y desconocidos as como
por ionizacin qumica.


(10, 11)







Cromatografa

29
TERMINOS Y CONCEPTOS BASICOS DE LA CROMATOGRAFIA.

Figura 15. Cromatograma para un pico resuelto
(10)


Tiempo de retencin

t
r
= Tiempo de retencin absoluto (min.)
t
m
= Tiempo muerto o tiempo de retencin de un componente retenido (min.)
t
r
= Tiempo de retencin corregido o relativo (min.)

t
r
= t
r
t
m

w
b
= Ancho del pico medido desde la base (cm)
w
h
= Ancho del pico medido a la mitad de la altura (cm)
h = Altura total del pico (cm)
L = Longitud de la columna (cm)
N = Nmero de platos tericos
2
h
r
2
w
t
5.54 16
|
|
.
|

\
|
=
|
|
.
|

\
|
=
b
r
w
t
N
Plato terico

HETP o H = Altura equivalente de plato terico
m
t
L
HEPT H = =
u = Velocidad lineal promedio (cm/s)
m
t
L
u =
o = Retencin relativa de dos picos adyacentes selectividad
1
2
r
r
t
t
'
'
= o
R = Resolucin de dos picos adyacentes
Cromatografa

30
2 1 2 1
1 2
2
2
w w
d
w w
t t
R
b b
r r
+
=
|
|
.
|

\
|

=

K = Relacin coeficiente de particin
m
m r
m
r
t
t t
t
t
k

=
'
=
Ecuacin de Purnell
N = Nmero de platos tericos requeridos
2
2
1
2
1
16
|
.
|

\
|
+
|
.
|

\
|

= =
k
k R
HEPT
L
N
r
o
o

L
r
= Longitud requerida

(1, 2, 3, 4, 10, 11)



DEFINICIONES


Lnea base. Es la lnea dibujada por el registrador en ausencia de muestra.

Punto de inyeccin. Es el momento en el que se introduce la muestra al sistema
cromatogrfico.

Tiempo muerto (t
m
). Tiempo que tarda un compuesto que no es retenido por la
columna, desde el punto de inyeccin hasta su paso por el detector.

Tiempo de retencin (t
r
). Tiempo que transcurre desde la inyeccin de la muestra,
hasta el punto mximo del pico correspondiente a determinado compuesto de la mezcla.

Tiempo de retencin corregido (t
r
). Equivale al tiempo de retencin., menos el
tiempo muerto del compuesto que no es retenido por la columna.

Altura del pico (h). Es la distancia perpendicular, desde la lnea base a la mxima
deflecci6n del pico.

Amplitud de la base (w
b
). Es la distancia entre las intersecciones de las tangentes a los
puntos de inflexin con la lnea base.

Amplitud a la mitad de la altura (w
h
). Distancia entre las tangentes del pico a la
mitad de su altura.

La resolucin de los picos cromatogrficos est relacionada con 2 factores: la
eficiencia de la columna y la eficiencia del solvente.

Adsorbente. Fase estacionaria para cromatografa gas slido.

Cromatografa

31
Derivacin. Reaccin qumica que se hace con la muestra con reactivos especficos,
para dar termo estabilizacin y volatilidad, facilitando la separacin y la deteccin de
algunos compuestos.

Eficiencia. Grado de ensanchamiento del pico, separacin efectiva de picos adyacentes.
Se expresa como nmero de platos tericos (n) requeridos para tener una separacin
aceptable y tambin como altura equivalente de plato terico (HETP).

Integracin. Medicin del rea bajo la curva (pico) en un cromatograma.
Relacin de Particin (k). - Es la relacin existente entre la cantidad de muestra en la
fase mvil.

Retencin relativa de dos picos adyacentes (o). Proporcionalidad de las relaciones de
particulacin de os componentes de una muestra. Tambin conocida como selectividad.

Salinalizacin. En la sustitucin de los hidrgenos activos en una molcula orgnica
con grupos trimetilsilil (TMS) para incrementar la volatilidad y su estabilidad trmica.
Se utiliza tambin para hacer inertes los sitios activos de algunos solventes

Ecuacin de Van Deemter*. Se refiere a la eficiencia relacionada con el flujo de fase
mvil, expresndola como:

H = A + B /u + C u
donde:
A. Expresa la contribucin de la difusin de Eddy al ancho del pico, esto es
independiente del flujo del gas y es proporcional al dimetro promedio de la partcula y
a las irregularidades del empaque.

B. Expresa la contribucin a la difusin molecular en el ancho del pico, la magnitud del
termino es inversamente proporcional al flujo y directamente proporcional a las
tortuosidades de los canales del sistema.

C. Expresa la contribucin a la resistencia en la transferencia de masa, en el ancho del
pico y es directamente proporcional al flujo y al cuadrado del espesor de la pelcula de
la fase lquida e inversamente proporcional a la difusin en la fase lquida.
(1, 2, 3, 4, 10, 11)



.










Cromatografa

32


CROMATOGRAFA DE GASES Y LQUIDOS
MTODOS DE CUANTIFICACIN



Anlisis cualitativo
Se basa en la diferencia de velocidades de migracin de los componentes de una
mezcla entre dos fases; una estacionaria y una mvil (gas), de tal manera que cada
componente es selectivamente retenido por la fase estacionaria y eluye a un cierto
tiempo (tiempo de retencin), dependiendo del programa empleado para su anlisis.

Anlisis cuantitativo
El auge creciente de la cromatografa durante las ltimas cuatro dcadas se debe
en parte a su rapidez, simplicidad, relativamente bajo costo, y a su gran aplicabilidad
como herramienta de separacin. Su uso se ha extendido tanto porque puede tambin
proporcionar informacin cuantitativa acerca de las especies separadas. Por lo tanto
debemos tener en cuenta los aspectos cuantitativos aplicados a todos los tipos de
cromatografa.

La cromatografa en columna cuantitativa se basa en la comparacin de la altura,
o del rea, del pico del analito con la de uno o ms estndares. En cromatografa plana,
el rea cubierta por las especies separadas sirve como parmetro analtico. Si se
controlan las condiciones adecuadamente, esos parmetros varan linealmente con la
concentracin.

Existen diversos mtodos de cuantificacin en cromatografa los cuales se
describen brevemente a continuacin.


Mtodo del % de rea

- Todos los componentes deben ser registrados.
- El factor respuesta para todos es el mismo.
- % de rea.
Cromatografa

33
El porcentaje de rea se obtiene mediante la frmula
100 %
1
=

n
i
i
A
A
A

Donde
A representa el rea bajo la curva de cada uno de los componentes i


*PICO No. Tr (min.) AREA % DE AREA
1 2.71 85,000 37.6931
2 3.48 72,000 31.9283
3 4.23 43,200 19.1570
4 5.78 25,305 11.2215
TOTAL 225,505 100
*Datos de la muestra


Mtodo del % de Normalizacin.

- Todos los componentes deben ser registrados.
- El factor respuesta para cada componente de la muestra es diferente.
- Se emplea un estndar de cada uno de los componentes de la muestra para
determinar el factor de respuesta.

*PICO No. Tr (min.) AREA % DE AREA
1 2.71 85,000 37.6931
2 3.48 72,000 31.9283
3 4.23 43,200 19.1570
4 5.78 25,305 11.2215
TOTAL 225,505 100
*Datos de la muestra
En este caso se conoce la identidad de todos los componentes mediante su tiempo de
retencin al correr estndares con las mismas condiciones cromatogrficas y la misma
concentracin por lo que se puede obtener una tabla como la siguiente:

Datos de la muestra estndar
*PICO No. tr (min.) AREA CONC (mg)
1 2.71 50.000 15
2 (ref) 3.48 70.000 15
3 4.23 80.000 15
4 5.78 65.000 15

Para homogenizar la respuesta de cada uno de los componentes de la mezcla se debe calcular
el factor de respuesta de cada uno de los analitos que aparecen en la muestra. Este factor ser
multiplicado por el rea que corresponde a su analito con lo que se puede obtener una
respuesta corregida matemticamente similar en todos los casos.


Cmo se calcula el factor de respuesta?
.
Factor de Respuesta (FR)
FR
i
= | C
i
| x | A
ref
|
A
i
C
ref

ref = estndar de referencia.
i = Analito
C = Concentracin
A = Area

Cromatografa

34


FR
1
= __15 x 70.000 = 1.4 FR
1
=1.4
50.000 15

FR
2
= __15 x 70.000 = 1.0 FR
2
=1.0
70.000 15

FR
3
= __15 x 70.000 =0.875 FR
3
=0.875
80.000 15

FR
4
= __15 x 70.000 = 1.076 FR
4
=1.076
65.000 15

Ya obtenido el factor de respuesta se aplica la siguiente formula para obtener el
porciento de normalizacin (% N).


% N = Ai x FR i x 100

n
i=1
Ai x FR i



CALCULOS

% N
1
= _______________(85.000) (1.4)_____________
(85.000) (1.4) + (72.000) (1) + (43.200) (0.875) + (23.305) (1.076)

% N
1
= _________119.000_______
119,000+72,000+37,800+ 25,076.18

% N
2
= (72.000) (1) x 100
253,876.18


%N
3
= (43,200) (0.875) x 100
253,876.18


%N
4
= (23,305) (1.076) X 100
253,876.18

%N
T
=99.9998


Mtodo del Estndar Externo.

Se debe inyectar primero la mezcla en el cromatgrafo con cantidades conocidas de
cada uno de sus componentes de inters y determinar el factor de respuesta de cada componente.
La relacin de la cantidad de estndar con la respuesta (usualmente el rea del pico) es conocida
como factor de calibracin para ese componente particular.

% N
1
= 46.8732

%N
2
= 28.3602
% N
3
= 14.8891
%N
4
= 9.8773
Cromatografa

35
Cuando se analiza una mezcla de concentracin desconocida, la cantidad de cada
componente es obtenida multiplicando
- El factor de respuesta para todos es calculado.
- Se inyecta siempre la misma cantidad.

Hacer cromatograma problema y las reas halladas dividirlas por el factor de respuesta.

Calibracin y Patrones

El mtodo ms sencillo para el anlisis cromatogrfico cuantitativo implica la
preparacin de una serie de disoluciones de patrn de composicin a la de la muestra. A
continuacin se obtienen los cromatogramas de los patrones y se representan las alturas o reas
de pico en funcin de la concentracin. La representacin de los datos debera originar una
lnea recta que pasara por el origen de coordenadas; los anlisis se basan en esta grfica. Para
una mayor exactitud es necesario una estandarizacin frecuente.


Datos de la muestra. i=1
*PICO No. tr (min.) AREA % DE AREA
1 2.71 85,000 37.6931
2 3.48 72,000 31.9283
3 4.23 43,200 19.1570
4 5.78 25,305 11.2215
TOTAL 225,505 100
*Datos de la muestra


Datos de la muestra estndar
*PICO No. tr (min.) AREA CONC (mg)
1 2.71 50.000 15
2 (ref) 3.48 70.000 15
3 4.23 80.000 15
4 5.78 65.000 15



Cmo obtener el factor de calibracin?.


Factor de Calibracin (FC)
ci
ci
i
A
C
FC =


FC
1
= 15 mg = 3.000x 10
-4
FC
1

= 3.000x 10
4

50,000

FC
2
= 15 mg = 2.142 x10
-4
FC
2
= 2.142 x10
-4
70,000


Cromatografa

36
FC
3
= 15mg = 1.875 x 10
-4
FC
3
= 1.875 x 10
-4

80,000


FC
4
= 15 mg = 2.307 x 10
-4
FC
4
= 2.307 x 10
-4

65,000


Al conocer Fc
i
se puede aplicar la formula siguiente para obtener la cantidad del componente
(cx)

Cx
i
= ( A C
i
) ( F C
i
)


CALCULOS

C
1
= (85,000) (3.000x 10
-4
) = 25.5 mg C
1
= 25.5 mg

C
2
= (72,000) (2.142 x10
-4
) = 15.4 mg C
2
= 15.4 mg

C
3
= (43,200) (1.875 x 10
-4
) = 8.1 mg C
3
= 8.1 mg

C
4
= ( 25,305) (2.307 x 10
-4
)= 5.8 mg C
4
= 5.8 mg


Al utilizar este mtodo, la fuente ms importante de error en los anlisis es normalmente
la incertidumbre en el volumen de la muestra; ocasionalmente la velocidad de inyeccin de la
muestra es tambin un factor a considerar.

A menudo, las muestras son pequeas (aproximadamente 1 microlitro) y la
incertidumbre asociada con la inyeccin de un volumen reproducible de ese tamao con una
microjeringa puede significar un cierto porcentaje relativo, tal vez de varias unidades.



EXACTITUD DEL VOLUMEN INYECTADO (FV)


IS
im
V
V
FV =

V
im
= Volumen inyectado de muestra
V
is
= Volumen inyectado de estndar.


Entonces:
I
V I
FV
FC AC
i
Cx
) )( (
=




Cromatografa

37
El mtodo del estndar interno.


En cromatografa cuantitativa la mayor precisin se consigue por el uso de patrones
internos debido a que se evitan las incertidumbres que se introducen en la inyeccin de
la muestra. En este procedimiento, el estndar interno elegido debe reunir las siguientes
caractersticas:

- Proporcionar un pico bien resuelto

- Aparecer en el cromatograma en la mitad del mismo.
- No debe encontrarse en la muestra
- Su composicin debe ser similar a la de los componentes de la mezcla
- En caso de haber muchos picos en el cromatograma se pueden emplear ms de 2
estndares internos.

1-. Se realiza un cromatograma patrn con todas las sustancias y el estndar interno con
cantidades conocidas. Se calcula el factor de respuesta de cada uno de los analitos con
respecto al estndar interno.


2-. Realizar el cromatograma problema con una cantidad de estndar interno conocida.
- (hacer 3 inyecciones y promediar)


3.- En caso de que el sistema no sea conocido se elabora una curva de calibracin
incluyendo al estndar interno, con el fin de evaluar la linearidad del sistema.


4.- Conociendo:
rea del analito (A
i
),
l rea del estndar interno (A
ref
), y
el factor de repuesta de ambos (FR
ref
=1), as como la concentracin del estndar
interno realizar el siguiente clculo para conocer la concentracin de i.


( )
ref
i i ref
i
A
Fr A C
C

=


(1, 2, 3, 4, 7, 10, 11, 13, 14)









Cromatografa

38





Referencias



1. Cailleux A., Turcant A., Premel-Cabic, Allain P., Identification and
Quantitation of Neutral and Basic Drugs in Blood by Gas Chromatography and
Mass Spectrometry. Journal of Chromatographic Science, Vol. 19 pp- 163-176.
May 1981.
2. Commission on Analytical Nomenclature. Recommendations on nomenclature
for chromatography. Pure Appl. Chem. Vol 37 pp. 445-53 (1974).
3. Eurachem group. The Fitness for Prurpose of Analytical Methods. A Laboratory
Gude to Method Validation and Related Topics. First Internet Version December
1998. http://www.eurachem.ul.pt/guides/valid.pdf
4. Citac (The cooperation on International Traceability in Analytical Chemistry)
and Eurachem groups (A Focus for Analytical Chemistry in Europe). Guide to
Quality un Analytical Chemistry. An Aid to Accreditation. Edition 2002
5. Jenennings Walter, Mehran Mehrzad F. Sample Injection in Gas
Chromatography. Journal of Chromatographic Science, Vol. pp. 24 34-39
January 1986.
6. Jordan J.H., Haynes H.I. Hall G.A. A simple Method for Preparing Gas-Liquid
Calibration Blends. Technical Note. Journal of Chromatographic Science, Vol.
24 pp. 462-463 January 1986.
7. Smith Roger and Marton Aurl. Classification and characterization of liquid
chromatography stationary phases. Part I: Descriptive Terminology. IUPAC
Recommendations 1997. Pure Appl. Chem, Vol 69 No. 7 pp. 1475-1480. 1997.
8. Ottenstein Daniel M. The Cromatographic Support in Gas Chromatography.
Journal of Chromatographic Science, Vol. 11 pp.136- 144 January 1986.
9. Thomas Q.V., Stork J.R, Lammrrt S.L. The Cromatographic and GC/MS
Analysis of Organic Priority Pollulants in Water. Journal of Chromatographic
Science, Vol. 18 pp. 583-593 November 1980.
10. Vazquez, Mora, Basterrechea. Diplomado en Instrumentacin analtica. Segunda
promocin. Facultad de Qumica. Parte I y II.1998.
11. Waters. Seminario de Seleccin de columnas. 2002.
12. Wenzel B.E. Gas Chromatographic Equipment V. Journal of Chromatographic
Science, Vol. 28 pp. 133-153. March 1990.
13. Zweig and J. Sherma. CRC Handbook of Chromatography, Vol. 1 y 2
14. Manual Prctico de Cromatografa de Gases. Perkin Elmer.1990.







Cromatografa

39



ndice de Figuras
Figura Pagina









ndice de tablas
Tabla Pagina
1 Fases liquidas comunes para columnas cromatograficas 9
2 Fases liquidas comunes usadas en cromatografa de gases 9
3 Conductividad Trmica 16
4 Caractersticas de soportes para columnas de HPLC 24
5 Fases para cromatografa de liquidos 25
6 Guia para seleccin de fase y tipo de cromatografia 26






1 Esquema De Un Cromatgrafo De Gases

4
2 Plano de Van Deempter para la seleccin de la velocidad de flujo
ptimo del gas de arrastre
(12)

5
3 Diferencia entre columna empacada y capilar. 7
4 Retencin relativa para 2 compuestos 11
5 Medidas para obtener la resolucin de dos picos 12
6 Cromatograma integral 13
7 Cromatograma de un detector diferencial 14
8 Compuestos que dan un mnimo o no dan respuesta al FID 17
9 Sensitividad del FID contra el flujo de H
2
17
10 Sensitividad del FID contra el flujo de Aire 17
11 Diagrama de bloques del funcionamiento de un detector de captura de
electrones
18
12 Diferencia entre cromatografa de fase normal y de fase inversa 21
13 Esquema de un cromatgrafo de Lquidos. 22
14 Slica gel mestra el grupo silanol y una sustitucin qumica por un
grupo no polar
24
15 Romatograma para un pico resuelto 29