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Prof. Valmir F.

Juliano
QUI624
INTRODUO AOS MTODOS
CROMATOGRFICOS
Classificao dos mtodos analticos
CLSSICOS E INSTRUMENTAIS
Baseados em propriedades
fsicas (qumicas em alguns casos )
Chamados de mtodos
de via mida
Gravimetria
Volumetria Eletroanaltico
Propriedades
eltricas
Espectromtrico
Propriedades
pticas
Cromatogrfico
Propriedades
mistas*
*Separao: interaes fsico-qumicas.
Identificao/quantificao: propriedades pticas ou eltricas.
Histrico
Cromatografia
Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903),
botnico russo: Separao de misturas de pigmentos
vegetais em colunas recheadas com adsorventes slidos e
solventes variados. ter de
petrleo
CaCO
3
mistura de
pigmentos
pigmentos
separados
1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)
Definio - Princpio Bsico

Cromatografia um mtodo fsico-qumico de
separao de misturas, identificao e
quantificao de seus componentes.
A separao depende da interao dos componentes da
mistura com a fase mvel e com a fase estacionria.
A interao dos componentes da mistura com estas duas fases
influenciada por diferentes foras intermoleculares,
incluindo inica, dipolar, apolar, e especficos efeitos de
afinidade e solubilidade.
A identificao se d mediante a comparao da
interao de padres com as fases estacionrias.
A quantificao feita tambm pela comparao com
padres de concentraes conhecidas, atravs de
curvas analticas.
Cromatografia
Classificao das tcnicas cromatogrficas

De acordo com o sistema cromatogrfico

Em Coluna
Cromatografia Lquida
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Supercrtica

Planar
Centrfuga (Chromatotron)
Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Cromatografia em Papel (CP)
Cromatografia
Classificao das tcnicas cromatogrficas

De acordo com a fase mvel

Utilizao de Gs
Cromatografia Gasosa (CG)
Cromatografia Gasosa de Alta Resoluo (CGAR)

Utilizao de Lquido
Cromatografia Lquida Clssica (CLC)
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)

Utilizao de Gs Pressurizado
Cromatografia Supercrtica (CSC)
Cromatografia
Classificao das tcnicas cromatogrficas

De acordo com a Fase Estacionria

Lquida
Slida
Quimicamente Ligadas

De acordo com o modo de separao

Por Adsoro
Por Partio
Por Troca Inica
Por Afinidade
Cromatografia
Classificao das tcnicas cromatogrficas
Cromatografia
Tcnica Planar Coluna
FM
FE
Lquido
Lq Sl
Gs Lquido
Lq Sl
CP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CE
Excluso
Fase
Ligada
Troca
Inica
Sl Lq
Afinidade
Tipo de
cromato-
grafia
Analogia
O processo cromatogrfico pode ser comparado a um grupo
de abelhas e moscas sobrevoando uma certa regio.
Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as
moscas e abelhas.
Cromatografia
Fase estacionria Analitos
Analogia

Para uma mesma mistura, a simples troca da fase
estacionria pode ser suficiente para alterar completamente
a ordem de eluio de componentes da mistura.
Cromatografia
Fase estacionria Analitos
Cromatografia
Princpio Bsico
Separao de misturas por interao diferencial dos seus
componentes com uma FASE ESTACIONRIA (lquido ou
slido) e uma FASE MVEL (lquido ou gs).
Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se at fazer em casa!
Fase estacionria lquida suportada na celulose.
Fase mvel
Separao
Cromatografia
A cromatografia em papel (CP) uma tcnica de partio, utiliza dois lquidos
(lquido-lquido) sendo um fixado em um suporte slido (papel de filtro). Um bom
exemplo a separao da tinta verde. Com o processo de cromatografia possvel
verificar que a cor verde uma mistura de tintura azul e amarela.
Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se at fazer em casa!
Cromatografia
Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, bem
simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na
separao e identificao de compostos polares hidrossolveis.
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Teve incio em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas comeou a ser
largamente utilizada na ddaca de 1960. O processo de separao est
fundamentado, principalmente, no fenmeno de adsoro. Entretanto com fases
estacionrias tratadas pode ocorrer tambm por partio ou troca inica.
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Termos e parmetros tcnicos
Cromatografia
solvente
mancha
f
S
S
R
s
a
R
a
f

s
b
R
b
f

s
c
R
c
f

c
b
a
s
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
FASES ESTACIONRIAS
Slica (SiO
2
)
Alumina (Al
2
O
3
)
Celulose
Poliamida
Ativao de 30 a 60 min
de 105 a 110
o
C
Ativao de 10 min
a 105
o
C
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
ANLISE QUALITATIVA
- Comparao com valores de R
f
tabelados

- Comparao com padro eludo em conjunto

- Extrao e aplicao de mtodos instrumentais
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
A B
Aps
Eluio
Amostra no contm a espcie B
Amostra pode conter a espcie A
Para se certificar da presena,
eluir em outros solventes
Concluses:
Amostra
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Solvente 1 Solvente 2
Cromatografia
Bi-dimensional
Cromatografia planar
Cromatografia
Chromatotron uma
cromatografia de camada
fina preparativa acelerada
centrifugamente. Pode
substituir pequenas colunas e
HPLC.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
PROCESSOS DE SEPARAO
Excluso



Adsoro


Partio



Troca Inica

Afinidade
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
ADSORO
- Fase Mvel Lq. ou Gs
- Fase Estacionria Slida
Processos de
Adsoro/Dessoro
Ligaes de hidrognio;
Foras de Van der Waals
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Diferena entre Absoro e Adsoro
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
ADSORO
Fase Estacionria Slida:
Polar
Aumento da Atividade
-CO
2
H > -OH > -NH
2
>
-SH > -CHO > -C=O >
-CO
2
R > -OCH
3
> -CH=CH-
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Hexano < ter de Petrleo < Ciclohexano <
Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno <
Diclorometano < Clorofrmio < ter Etlico <
Acetato de Etila < Acetona < Etanol <
Metanol < cido Actico
SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente
A funo das fases mveis na cromatografia por adsoro
tem sentido amplo:
a) Funo solvente
Solubilizar os componentes
Ter baixo ponto de ebulio
b) Funo eluente
Conduzir os componentes da mistura pela coluna
Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE)
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Usos:
a) Laboratrios de qumica orgnica separar e purificar
reagentes e materiais obtidos em sntese.
b) Laboratrios de produtos naturais escala preparativa
e analtica.
c) Laboratrios de anlises clnicas separao de
esterides de urina ou de sangue, etc.
ADSORO
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
PARTIO
Fase Mvel Gasosa
Fase Estacionria Lquida
Processos de Solubilidade
O processo de partio
intrafacial e a volta de cada
componente para a fase mvel
depende da sua volatilidade.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
PARTIO
Fase Mvel Lquida
Fase Estacionria Lquida
Processos de Solubilidade
O processo de partio
intrafacial e a volta de cada
componente para a fase mvel
depende da sua solubilidade.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
TROCA INICA
Fase Mvel Lquida
Fase Estacionria Slida
Processos de Troca Inica
Adsoro reversvel e
diferencial dos ons da fase
mvel pelo grupo trocador
da matriz
Por volta de 1935 comearam a ser fabricadas resinas de troca inica
orgnicas, muito eficientes, passando a constituir um meio qumico de
extraordinrio valor em processos analticos.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Maior Interao
ons de alta carga
ons de menor tamanho
TROCA INICA
Resinas Catinicas
e Aninicas
FE altamente carregada
F
l
u
x
o

d
a

F
M

A diferena de afinidade entre
os ons da FM pode ser
controlada por pH e fora inica
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
O ajuste do pH proporciona a separao das duas protenas
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
EXCLUSO
Fase Mvel Lquida
Fase Estacionria em Gel
Enquanto as partculas menores penetram nas
cavidades, as maiores vo sendo eludas
contornando as estruturas moleculares da FE.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
EXCLUSO
A propriedade que distingue a cromatografia de excluso,
introduzida por volta de 1960, de outros tipos de
cromatografia que o recheio (FE) um gel no carregado
constitudo de macromolculas que tm ligaes cruzadas,
com afinidade pelos solventes, mas que neles so insolveis.
- Separao de tamanhos especficos
- Separao de polmeros e protenas
- Determinao de Massa Molar
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
EXCLUSO
Caractersticas
desejveis para os Gis
-Inrcia Qumica:
No pode haver uma interao
qumica entre a matriz e o soluto.
-Estabilidade:
O gel deve suportar uso contnuo
quanto mantido em condies
brandas de temperatura e pH.
-Baixo teor de ons:
Grupos carregados interferem no
processo de separao.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
EXCLUSO
Tipos de Gis
Dextrano (Sephadex)
Poliacrilamida
gar e Agarose
F
l
u
x
o

d
a

F
M

Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Fase Mvel Lquida
Fase Estacionria Slida
Propriedades
Biolgicas e
Funcionais
AFINIDADE
Cromatografia
Teoria Bsica
SOLUTO
FASE
ESTACIONRIA
FASE
MVEL

Sem
importncia
na CG, mas
com grande
importncia
na CLAE
Teoria Bsica
Cromatografia
Coluna cromatogrfica: srie de estgios independentes onde acontece o
equilbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionria e na fase
mvel:


FM
FE
C
A
A
K
K
C
= Constante de Distribuio
[A]
FE
= concentrao do analito na FE
[A]
FM
= concentrao do analito na FM
Ocorre um quase-equilbrio entre o analito
sorvido na FE e dissolvido na FM.
MENOR RETENO !!!
Volatilidade
[A]
FM

Afinidade pela FE [A]
FE

Quantificao da eficincia
Cromatografia
Supondo a coluna cromatogrfica como uma srie de estgios separados
onde ocorre o equilbrio entre o analito, a FE e a FM:
Cada estgio de equilbrio
chamado de PRATO TERICO
O nmero de pratos tericos
de uma coluna (N) pode ser
calculado por:
Coluna mais
eficiente
t
R

w
b

N
Quantificao da eficincia
Cromatografia
ALTURA EQUIVALENTE A UM
PRATO TERICO (H)
Tamanho de cada estgio de
equilbrio
Valores de H para colunas capilares e empacotadas so prximos, mas
como L para capilares MUITO maior tipicamente elas so mais
eficientes
(L = comprimento da coluna)
Valores tpicos de H e N:
d
C
d
f H N
0,10 0,25 0,081 370370
0,25 0,25 0,156 192308
0,32 0,32 0,200 150000
0,32 0,50 0,228 131579
0,32 1,00 0,294 102041
0,32 5,00 0,435 68966
0,53 1,00 0,426 70423
0,53 5,00 0,683 43924
2,16 10% 0,549 3643
2,16 5% 0,500 4000
Capilares, L = 30 m
Empacotadas, L = 2 m
d
c
= dimetro da coluna em mm
d
f
= espessura da fase estacionria em mm
Cromatografia em fase gasosa
Fase estacionria
Fase mvel
Separao
Cromatografia
Deteco
Cromatografia em fase gasosa
Cromatografia
Coluna: contendo a
fase estacionria
est submetida
temperaturas
controladas
Fase mvel:
gs inerte
Detector:
submetido
temperatura
controlada
Injetor: submetido
temperatura
controlada
Cromatografia Gasosa
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser
separadas por CG ?
Misturas cujos constituintes sejam
VOLTEIS (=evaporveis)
para uma substncia qualquer poder ser arrastada por um fluxo de
um gs ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gs.
DE FORMA GERAL:
CG aplicvel para separao e anlise de misturas cujos
constituintes tenham PONTOS DE EBULIO de at 300
o
C e que
sejam termicamente estveis.
Requisitos - Gs de arraste (FM)
INERTE: No deve reagir com a amostra, nem
com a fase estacionria ou superfcies do
instrumento.
PURO: Deve ser isento de impurezas que
possam degradar a fase estacionria.
Impurezas tpicas em
gases e seus efeitos:
oxida / hidrolisa algumas FE
incompatveis com DCE
H
2
O, O
2
hidrocarbonetos

rudo no sinal de DIC
Cromatografia Gasosa
Requisitos - Gs de arraste (FM)
CUSTO: Gases de
altssima pureza
podem ser muito
caros.
COMPATVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda
um gs de arraste especfico para melhor funcionamento.
Seleo de Gases de
Arraste em Funo
do Detector:
He , H
2
DCT

DIC

N
2
, H
2

DCE

N
2
(SS), Ar + 5% CH
4

C
U
S
T
O

PUREZA
A
B
C
A = 99,995 % (4.5)
B = 99,999 % (5.0)
C = 99,9999 % (6.0)
Cromatografia Gasosa
Injetor
Os dispositivos para injeo (INJETORES ou
VAPORIZADORES) devem prover meios de introduo
INSTANTNEA da amostra na coluna cromatogrfica
Injeo instantnea:
Injeo lenta:
t = 0
t = x
t = 0
t = x
Cromatografia Gasosa
Injetor on column
1
2
3
4
1 - Septo (silicone)

2 - Alimentao de gs de
arraste)

3 - Bloco metlico aquecido

4 - Ponta da coluna
cromatogrfica
Cromatografia Gasosa
Injetor on column
1 2 3
1 - Ponta da agulha
da microsseringa
introduzida no incio
da coluna.
2 - Amostra injetada
e vaporizada
instantaneamente no
incio da coluna.
3 - Plug de vapor
de amostra forado
pelo gs de arraste a
fluir pela coluna.
Cromatografia Gasosa
Parmetros de injeo
Cromatografia Gasosa
TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente
elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem
decomposio.
Regra Geral: T
inj
= 50
o
C acima da temperatura de ebulio do
componente menos voltil.
VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado
fsico da amostra.
COLUNA
Amostras
Gasosas
Amostras
Lquidas
empacotada
= 3,2 mm (
1
/
4
)
0,1 mL ... 50 mL 0,2 mL ... 20 mL
capilar
= 0,25 mm
1 mL ... 100 mL 0,01 mL ... 3 mL
Slidos:
convencionalmente
se dissolve em um
solvente adequado e
injeta-se a soluo
Cromatografia Gasosa
LQUIDOS: Capacidades tpicas: 1 mL, 5 mL e 10 mL
mbolo
corpo (pirex)
agulha (inox 316)
Microsseringa de
10 m L:
Microsseringa de 1 m L
(seo ampliada):
corpo
guia
mbolo (fio de ao
soldado ao guia)
agulha
Microsseringas para injeo
Cromatografia Gasosa
Colunas
EMPACOTADA
= 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
Recheada com slido pulverizado
(FE slida ou FE lquida
depositada sobre as partculas do
recheio)
CAPILAR
= 0,1 a 0,5 mm
L = 5 m a 100 m
Paredes internas recobertas com
um filme fino (frao de mm) de
FE lquida ou slida
Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna
Alm da interao com a FE, o tempo que um analito demora
para percorrer a coluna depende de sua PRESSO DE
VAPOR (p
0
).
p
0
= f
Estrutura qumica do analito
Temperatura da coluna
Temperatura
da
coluna
Presso
de
vapor
Velocidade
de
migrao
ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE
(MENOR RETENO)
Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna
A
U
M
E
N
T
O

D
A


T
E
M
P
E
R
A
T
U
R
A

D
A

C
O
L
U
N
A

CONTROLE CONFIVEL
DA TEMPERATURA DA
COLUNA ESSENCIAL
PARA OBTER BOA
SEPARAO EM CG
Cromatografia Gasosa
Programao linear de temperatura
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito
diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:
T
COL

BAIXA:
- Componentes mais volteis so
separados
- Componentes menos volteis
demoram a eluir, saindo como
picos mal definidos
T
COL
ALTA:
- Componentes mais volteis no
so separados
- Componentes menos volteis
eluem mais rapidamente
Cromatografia Gasosa
Programao linear de temperatura
A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separao:
Consegue-se boa
separao dos
componentes da
amostra em menor
tempo
TEMPO
T
E
M
P
E
R
A
T
U
R
A

t
INI
t
FIM

T
INI

T
FIM

R
T
INI
- Temperatura Inicial
T
FIM
- Temperatura Final
t
INI
- Tempo Isotrmico Inicial
t
FIM
- Tempo Final do Programa
R - Velocidade de Aquecimento
Cromatografia Gasosa
Programao linear de
temperatura


a) Isotrmico a 45 C;
b) isotrmico a 145 C;
c) programado de 30 C a 180 C
Cromatografia Gasosa
Programao linear de temperatura
VARIAES DE VAZO
DO GS DE ARRASTE: A
viscosidade de um gs
aumenta com a temperatura.
viscosidade vazo
DERIVA (DRIFT) NA
LINHA DE BASE: Devido ao
aumento de volatilizao de
FE lquida
Possveis problemas associados PLT:
Cromatografia Gasosa
Fase Estacionria
REGRA GERAL: a FE deve ter caractersticas tanto quanto possvel
prximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromtico ...)
FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os
componentes da amostra.
FE Seletiva:
separao adequada dos constituintes
da amostra
FE pouco Seletiva:
m resoluo mesmo com coluna de
boa eficincia
Cromatografia Gasosa
Fase estacionria slida
O fenmeno fsico-qumico responsvel pela interao
analito + FE slida a ADSORO
A adsoro ocorre na
interface entre o gs de
arraste e a FE slida
Slidos com grandes reas superficiais
(partculas finas, poros)
Solutos polares
Slidos com grande nmero de stios
ativos (hidroxilas, pares de eltrons...)
ADSORO
Cromatografia Gasosa
Fase estacionria lquida
O fenmeno fsico-qumico responsvel pela interao
analito + FE lquida a ABSORO
A absoro ocorre no interior
do filme de FE lquida
(fenmeno INTRAfacial)
Filmes espessos de FE lquida
Grande superfcie lquida exposta ao gs
de arraste
Interao forte entre a FE lquida e o
analito (grande solubilidade)
ABSORO
Cromatografia Gasosa
Fase estacionria quirais
As propriedades fsico-qumicas dos ismeros ticos so
MUITO SIMILARES FE convencionais no interagem
diferencialmente com os ismeros ticos.
FRMACOS - Em muitos frmacos apenas um dos ismeros ticos
tm atividade farmacolgica.
PRODUTOS BIOLGICOS - Distino entre produtos de
origem sinttica e natural (natural = normalmente substncias
oticamente puras; sinttico = muitas vezes so misturas racmicas).
Cromatografia Gasosa
Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eludo, gerando sinal
quando da passagem de substncias que no o gs de arraste.
Caractersticas ideais:
1. Alta sensibilidade: 10
-8
a 10
-15
g de soluto/s.
2. Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3. Resposta linear para solutos que se estenda por vrias
ordens de grandeza.
4. Faixa de temperatura desde a ambiente at pelo menos
400 C.
5. Tempo de resposta curto e independente da vazo.
6. Alta confiabilidade e facilidade de uso.
7. Similaridade de resposta para todos os solutos.
8. No destrutivo.
Cromatografia Gasosa
Detectores
Grfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA
Idealmente: cada substncia separada aparece como um PICO no cromatograma.
REGISTRO
DE
SINAL
ANALGICO
Registradores XY
DIGITAL
Integradores
Computadores
Cromatografia Gasosa
Detectores
UNIVERSAIS:
Geram sinal para
qualquer
substncia eluda.
SELETIVOS:
Detectam apenas
substncias
com determinada
propriedade
fsico-qumica.
ESPECFICOS:
Detectam
substncias que
possuam
determinado
elemento
ou grupo funcional
em suas
estruturas
DCT DCE DNP
Cromatografia Gasosa
Detectores - Funcionamento
DETECTOR POR CAPTURA DE ELTRONS (DCE OU ECD):
Supresso de corrente causada pela absoro de eltrons por
eluatos altamente eletroflicos.
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA (DCT OU
TCD): Variao da condutividade trmica do gs de arraste.
DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA (DIC OU FID):
ons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de
H
2
+ ar.
DETECTOR TERMOINICOS (DNP OU NPD): Modificao
do DIC. Os eluatos queimados na chama H
2
+ ar passam por
uma superfcie de silicato de rubdio onde se formam ons de
molculas com N e P.
Cromatografia Gasosa
Detectores Limites de deteco
DETECTOR POR CAPTURA DE ELTRONS (DCE OU ECD):
Seletivo. Responde muito bem a halogenetos orgnicos, aldedos
conjugados, nitrilas, nitratos e organometlicos. Sensibilidade: 0,01
a 1 pg com linearidade at ng. (10
4
)
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA (DCT OU
TCD): Universal. Observa-se para qualquer substncia eluda.
Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade at dezenas de mg (10
4
).
DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA (DIC OU FID):
Quase-universal. Detecta qualquer substncia que contenha
ligaes C-H. No responde a gases nobres, H
2
, O
2
, N
2
, CX
4
, SiX
4

(X=halognio), CO, CO
2
, CS
2
, H
2
O, NO, N
2
O, NO
2
, NH
3
.
Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade at mg (10
7
10
8
).
DETECTOR TERMOINICO (DNP OU NPD): Especfico.
Responde a compostos orgnicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg
(P) e 0,4 a 10 pg (N) com linearidade at ng. (10
3
- 10
5
)
Cromatografia Gasosa
Detectores Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Especfico. Um dos
detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa o
espectrmetro de massas. Observa-se para qualquer substncia
eluda um sinal, mesmo que complexo, no espectrmetro de massa.
seletivo ou especfico quando monitora-se um fragmento de
determinada razo m/z.
Deteco
TIC
Universal
Similar a DCT
SIM
Seletivo
Maior Sensibilidade
Cromatografia Gasosa
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Especfico.
TEMPO
C
O
N
T
A
G
E
N
S

MASSA / CARGA
C
O
N
T
A
G
E
N
S

Cromatograma de ons totais:
TIM ou TIC
Em cada posio do
cromatograma tem-se
um espectro de massa.
Detectores Espectrometria de massas
Cromatografia Gasosa
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Especfico.
TEMPO
C
O
N
T
A
G
E
N
S

Cromatograma de ons
selecionados: SIM
Em cada posio do
cromatograma tem-se
o sinal somente da m/z
selecionada.
MASSA / CARGA
C
O
N
T
A
G
E
N
S

Oferece a vantagem
de registrar
somente o sinal do
constituinte de
interesse, sendo
cego para os
demais.
Detectores Espectrometria de massas
Cromatografia Gasosa
CG-EM (GC-MS): Interface CG-EM.
CG EM
Vcuo
Separador Molecular
O gs de arraste leve
(He) difunde mais
rapidamente que o analito
e tende a ser drenado
para o vcuo.
Cmara
de Ionizao
Coluna
Capilar
Interface Capilar Direta
Com colunas capilares a
vazo baixa de gs de
arraste pode ser drenada
pelo sistema de vcuo.
Detectores Espectrometria de massas
Cromatografia Gasosa
Anlise qualitativa
t
R

t
M

t
R
= t
R
- t
M

TEMPO
S
I
N
A
L

O parmetro diretamente mensurvel de reteno de um analito o
TEMPO DE RETENO AJUSTADO, t
R
:
t
R
= Tempo de Reteno (tempo
decorrido entre a injeo e o pice
do pico cromatogrfico)
t
M
= Tempo de Reteno do
Composto No-Retido (tempo
mnimo para um composto que no
interaja com a FE atravesse a
coluna)
t
R
= Tempo de Reteno Ajustado
(tempo mdio que as molculas do
analito passam sorvidas na FE)
Cromatografia Gasosa
Anlise qualitativa
Coluna HP-Innowax (PEG altamente polar): 30 m x 0,25 mm x 0,25 mm
Detector FID: 250 C
Injetor com diviso de fluxo 1:25: 250 C
Volume injetado: 1 mL
Como se explica esta
ordem de eluio?
Mistura de benzeno, n-propanona,
n-propanol, n-butanol, isobutanol e
n-pentanol.
1. A n-propanona elui primeiro
devido sua maior volatilidade.
2. O benzeno em segundo devido
sua natureza apolar (menor e).
3. Para os demais compostos,
cujas diferenas de polaridade
no so elevadas, a volatilidade
se torna o principal parmetro
que define a ordem de eluio.
Cromatografia Gasosa
Anlise quantitativa
TEMPO
S
I
N
A
L

O parmetro diretamente relacionado quantidade de analito :

Altura da banda cromatogrfica: no recomendado, pois
a banda necessita ser perfeitamente simtrica.
rea da banda cromatogrfica.
Altura
rea
Cromatografia Gasosa
Anlise quantitativa
tempo
Concentrao

r
e
a

amostra
Cromatografia Gasosa
Anlise quantitativa
MASSA

R
E
A

A partir de certo
ponto o sinal no
aumenta mais
linearmente
O fim da zona de linearidade pode
ser detectado quando a razo
(rea / Massa) diverge em mais de
5 % da inclinao da reta na
regio linear:
MASSA

R
E
A

/


M
A
S
S
A

0,95 S
1,05 S
Cromatografia Gasosa
tempo
amostra
Concentrao Adicionada

r
e
a

concentrao
na amostra
Anlise quantitativa
Cromatografia em fase lquida
Cromatografia Lquida
Cromatografia Lquida - CLAE
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser
separadas por CLAE ?
Lquidos e slidos, inicos ou covalentes com massa molar
de 32 at 4000000.
para uma substncia qualquer poder ser arrastada por um lquido
ela deve dissolver-se nesse lquido.
DE FORMA GERAL:
CL aplicvel para separao e anlise de misturas cujos
constituintes sejam solveis na FM. No h limitao de
volatilidade ou de estabilidade trmica.
Cromatografia Lquida
Tipos e
Aplicaes da
Cromatografia
Lquida
Insolvel em gua Solvel em gua
Aumento de polaridade
Polar no inico
Apolar Inico
M
a
s
s
a

m
o
l
e
c
u
l
a
r

10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
Troca
inica
Partio
Partio
em fase
reversa
Partio
em fase
normal
Excluso
Permeao
em gel
Filtrao
em gel
Adsoro
Componentes tpicos - CLAE
Cromatografia Lquida
Cromatografia Lquida
Esquema de um equipamento para CLAE
Cromatografia Lquida
Requisitos dos sistemas de bombeamento
1 Gerao de presses at 6.000 psi
2 Sada com ausncia de pulsos
3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min
4 Controle e reprodutibilidade de fluxo de
0,5% ou melhor
5 Componentes resistentes corroso
Bomba recproca (tambm so chamadas de
bombas de pisto ou de diafragma)
Cromatografia Lquida
Suportam presses de at 7.000 psi
Volumes tpicos: 5 a 500 mL
Microamostragem: 0,5 a 5 mL
Sistemas de injeo de amostras
Eluio isocrtica:
Quando a separao feita utilizando um nico solvente de
composio constante.

Eluio com gradiente:
So utilizados dois ou trs sistemas de solventes que
diferem bastante entre si em polaridade.
Depois que a eluio comea, a razo entre os solventes
variada de modo programado, de forma contnua ou em
passos.
Cromatografia Lquida
A eluio com gradiente produz efeitos similares aos
produzidos pela programao de temperatura na CG.
Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a
polaridade requerida na separao.
Fase mvel para CLAE
Cromatografia Lquida
Eluio com gradiente
Coluna C
18
, 5 mm, fase reversa
Detector fluorescncia:
excit. 334 nm emis. 425 nm
Cromatografia Lquida
Colunas para CLAE
As colunas geralmente so
construdas de ao inox, embora
tubos de vidro com paredes
resistentes sejam encontrados
ocasionalmente. No entanto, estes
ltimos so restritos a presses
mais baixas do que 600 psi.
Existem comercialmente centenas de colunas
empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na fase
estacionria. Preos variam de 200 a 500 dlares.
Cromatografia Lquida
Colunas para CLAE
Pr-coluna
Remoo de material particulado
Contaminantes do solvente
Contaminantes da amostra
Saturar a FM com a FE
Aumenta a vida til da coluna
COLUNAS TPICAS
Material: ao inox
Comprimento: 10 a 30 cm
Dimetro: 4 a 10 mm
FE: Partculas de 5 a 10 mm
Eficincia: 40 mil a 60 mil
pratos/metro
Cromatografia Lquida
Separao isocrtica de alta velocidade
1 p-xileno
2- anisol
3- acetato de benzila
4- dioctil-ftalato
5- dipentil-ftalato
6- dibutil-ftalato
7- dipropil-ftalato
8- dietil-ftalato
- 4 cm de comprimento
- 0,4 cm d.i.
- FE: spherisorb 3 mm
Coluna de alta
velocidade e
alta eficincia
FM: 4,1% EtAc em n-Hexano
100.000 pratos/metro
Pelicular:
Consiste de leitos de polmero ou vidro no-poroso,
esfrico, com dimetros tpicos da ordem de 30 a 40 mm,
recoberto com uma camada fina e porosa de:
Slica
Alumina
Resina de poliestireno-divinil-benzeno
Resina trocadora de ons
Partcula porosa:
Consiste de micropartculas porosas com dimetros de 3
a 10 mm. As partculas so constitudas dos mesmos
materiais do recobrimento pelicular.
Cromatografia Lquida
Basicamente so dois tipos de FE:
Fase estacionria para CLAE
Cromatografia Lquida
Detectores
As caractersticas desejveis para os detectores
para CLAE no so diferentes daquelas para CG.
Existem dois tipos de detectores:
Propriedades universais (ndice de refrao, densidade ou
constante dieltrica).
Propriedades do soluto (absorbncia, fluorescncia, etc).

Caractersticas ideais:
1.Alta sensibilidade: 10
-8
a 10
-15
g de soluto/s.
2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3.Resposta linear para solutos que se estenda por vrias ordens de
grandeza.
4.Tempo de resposta curto e independente da vazo.
5.Alta confiabilidade e facilidade de uso.
6.Similaridade de resposta para todos os solutos.
7.No destrutivo.
8.Volume interno mnimo e compatvel com a vazo e com a presso.
Cromatografia Lquida
Detectores
Absorbncia
UV/Vis S: 10
-9
g/mL FL: 10
5
IV
Fluorescncia S: 10
-9
a 10
-12
g/mL FL: 10
3
ndice de refrao (universal)
S: 10
-7
g/mL FL: 10
4
Cromatografia Lquida
Detectores
Eletroqumicos: existem vrios tipos disponveis atualmente.
Embora no sejam to explorados quanto os detectores
pticos, eles apresentam algumas vantagens como alta
sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade.
Amperomtricos
Coulomtricos
Condutomtricos S: 10
-8
g/mL FL: 10
4
Polarogrficos S: 10
-12
g/mL FL: 10
6
Cromatografia Lquida
Detectores
Espectrometria de massa - universal
Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrmetro de massa
potencializa a tcnica de separao e quantificao
Um grande problema o descompasso entre os volumes relativamente
grandes de solventes na CL e os requisitos de vcuo na EM.
Interface CL-EM
Cromatografia Lquida
Detectores
Espectrometria de massa
TEMPO
C
O
N
T
A
G
E
N
S

MASSA / CARGA
C
O
N
T
A
G
E
N
S

TEMPO
C
O
N
T
A
G
E
N
S

MASSA / CARGA
C
O
N
T
A
G
E
N
S

TIC
SIM
Cromatografia Lquida
Tipos de CLAE
Ao contrrio da CG, onde a FM se comporta como
um gs ideal e no contribui para o processo de
separao, a FM lquida da CLAE interage tanto
quanto a FE com os componentes da amostra.

Isto torna o desenvolvimento dos mtodos em
CLAE um tanto mais complexo que na CG.
Cromatografia Lquida
Tipos de CLAE
PARTIO: lquido-lquido e fase ligada. A diferena entre
elas consiste em como a FE mantida nas partculas do
suporte do empacotamento Adsoro e ligao qumica.
Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase
reversa.
Fase normal: FE de natureza fortemente polar (ex. gua)
FM apolar (ex. hexano ou ter isoproplico)
O componente menos polar eludo primeiro por ser o
mais solvel na fase mvel.
Fase reversa: FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos)
FM polar (ex. gua, metanol ou acetonitrila)
O componente mais polar aparece primeiro e o aumento
da polaridade da fase mvel aumenta o tempo de eluio.
Cromatografia Lquida
Tipos de CLAE
provvel que de toda a CLAE esteja baseada na fase
reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses
recobrimentos uma cadeia C
8
(n-octil) ou C
18
(n-octadecil)
Cromatografia Lquida
Tipos de CLAE
Campo Misturas tpicas
Farmacutico Antibiticos, sedativos, esterides,
analgsicos
Bioqumico Aminocidos, protenas, carboidratos, lipdios
Produtos alimentcios Adoantes artificiais, antioxidantes,
aflatoxinas, aditivos
Produtos qumicos Aromticos condensados, surfactantes,
propelentes, corantes industriais
Poluentes Pesticidas, herbicidas, fenis, PCB (bifenilas
policloradas)
Qumica forense Drogas txicas, venenos, lcool no sangue,
narcticos
Clnica mdica cidos de blis, metablitos de drogas,
extratos de urina, estrgenos
Cromatografia Lquida
Tipos de CLAE
ADSORO: lquido-slido. FE slica ou alumina. a forma
clssica da CL introduzida no incio do sculo 20. Sofreu
adaptaes e tornou-se o mais importante dos mtodos de
HPLC.
TROCA INICA: lquido-slido. FE resina com capacidade
de troca inica.
EXCLUSO: lquido-gel. FE gel. Um material polimrico,
hidrofbicos ou hidroflicos, com muitas ligaes cruzadas,
so capazes de promover a separao de acordo com os
tamanhos das molculas EXCLUSO DE TAMANHO. Se o
material reticulado for uma resina de troca inica, tem-se a
cromatografia de EXCLUSO DE ONS.
Para refletir e responder:
Duas substncias diferentes com a mesma concentrao
apresentaro a mesma rea sob suas bandas cromatogrficas?

Cromatografia
Para um mesmo analito, a rea ou altura aumentam
com o aumento da concentrao. A rea sob a banda
cromatogrfica de duas substncias diferentes
depender da resposta do detector para aquele tipo
de substncia, independentemente do tipo de
detector utilizado.
Para refletir e responder:
A CG pode ser usada indistintamente para qualquer tipo de
analito?

A CL til quando a CG no pode ser usada. Quais so os
casos em que isto ocorre?
Cromatografia
F I M