Citogentica

Prtica 1
SUMRIO
- Tcnicas para obteno de cromossomas
- Tcnicas especficas de marcao cromossmica
- Estudos de genotoxicidade ambiental: pesquisa de
instabilidade cromossmica



interfase profase
metafase anafase
telofase citocinese
Diviso celular - mitose
Os cromossomas obtm-se a partir de clulas em diviso, bloqueadas
especificamente em metafase
Tcnicas de obteno de cromosomas
para determinao do caritipo
Material
Clulas em diviso espontnea - brnquias ou gnadas
(mtodo direto)


Clulas em cultura linfcitos/eritrcitos do sangue perifrico
(mtodo indireto)
Tcnica direta para obteno de cromossomas
em bivalves
Etapas da tcnica direta
1. Tratamento com colchicina
A colchicina interfere com o fuso acromtico por ligao aos dmeros de
tubulina, levando sua despolimerizao. No permite que os cromossomas se
disponham em placa equatorial . Bloqueio das clulas em metafase.
Metafase normal
metafase bloqueada
Colocar os animais numa soluo de colchicina
a 0,005% , durante 6-12 h.
Quanto mais tempo maior o n de metafases e
mais condensados os cromossomas
Etapas da tcnica direta
1. Tratamento com colchicina
Aclimatar os animais em gua do
mar filtrada, com arejamento e
com alimento disponvel
(microalgas), durante 2 semanas
Etapas da tcnica direta
2. Disseo das brnquias 3. Fragmentao das brnquias
Nota: quanto mais fragmentadas as
brnquias melhor, para uma maior
penetrao do soluto hipotnico nas
metafases bloqueadas
Tratamento com soluo hipotnica (em gua do mar diluda)
durante 40min
Etapas da tcnica direta
4. Tratamento dos fragmentos com soluto hipotnico
Maior espalhamento dos cromossomas, evitando o problema da sobreposio
Fixao com Carnoy:
etanol /cido actico glacial,
na proporo de 3:1

Etapas da tcnica direta
5. Fixao dos fragmentos 6. Dissociao dos fragmentos
desagregao em cido
actico a 60%
6. Preparao do esfregao
Deixar cair algumas gotas da suspenso;
Aspirar a suspenso para formar crculos
concntricos
Observao em ampliao
100x; contagem dos
cromossomas em 20
metafases
Colorao com Giemsa
10. Seleo de microfotografia, organizao dos cromossomas
Etapas da tcnica direta
8. Colorao do esfregao 9. Observao ao microscpio tico
Tcnica indireta para obteno de cromossomas
em peixes
1. Colheita do sangue perifrico
Etapas da tcnica indireta
Notas importantes:
- Desinfeo local com lcool
- colheita em tubo de heparina, estril
2. Cultura das clulas sanguneas
Linfcitos
Etapas da tcnica indireta
Amostra:
- sangue perifrico: separao dos linfcitos e dos eritrcitos
Meio de cultura:
- meio de cultura + antibiticos
- fitohemaglutinina (agente mitognico, estimulante de linfcitos T)
Condies de cultura:
- incubao temperatura ambiente (19
-
25
0
C )
- durao de 4 a 5 dias
Eritrcitos
4. Tratamento com soluto hipotnico
5. Fixao
3. Tratamento com colchicina
Etapas da tcnica indireta
5h antes de terminar o tempo de incubao,
adicionar ao meio colchicina concentrao
de 40g/ml
Tratamento com soluto hipotnico durante 15
minutos com KCl 0.075M
Fixao e lavagens com Carnoy
(metanol: cido actico 3:1)
Etapas da tcnica indireta
6. Preparao do esfregao
- espalhamento da suspenso de clulas
fixadas sobre uma lmina de vidro
7. Colorao
Observao em ampliao
100x; contagem dos
cromossomas em 20
metafases
8. Observao ao microscpio tico
Colorao com Giemsa
10- Recorte e organizao ou anlise de imagem (cariotipador)

Etapas da tcnica indireta
1- ordem decrescente de tamanho
2 -posio do centrmero
3- posio de certas caractersticas (ex: NORs)
De acordo com regras internacionais,
estabelecido o caritipo de cada espcie
Critrios normalmente utilizados
para organizao do caritipo
Vieira - 2n=38
Tilpia - 2n=42
Tcnicas de marcao cromossmica


- Tcnicas de marcao cromossmica por
citogentica convencional

- Tcnicas de marcao cromossmica por
citogentica molecular

Bandas Q
(coradas com mostarda de quinacrina)
Bandas G
(tratamento proteoltico com tripsina)
Tcnicas de bandeamento diferencial
Tcnicas de marcao cromossmica por citogentica convencional
Bandas G
2n= 48, XY
Caritipo do manatim
Caritipo da enguia
2n = 36
Caritipo da vieira
2n=20
Tcnicas de marcao cromossmica por citogentica convencional
G R
Tcnicas de marcao cromossmica por citogentica convencional
Bandas G vs Bandas R
Banda Mltiplos genes
Caritipo da Baleia
Tcnicas de marcao cromossmica por citogentica convencional
Bandas G
(resoluo de 300-400 bandas)
Bandas G de alta resoluo
(resoluo de 700-850 bandas)
Marcao de cromossomas em prometafase
Tcnicas de marcao cromossmica por citogentica convencional
Bandas C
(marcao da heterocromatina
centromrica)
Tcnicas de bandeamento seletivo
- Centrmeros
- Regies dos organizadores
nucleolares (NORs)
-Telmeros
Tcnicas de marcao cromossmica por citogentica convencional
Marcao NOR
NOR
NOR
Tcnicas de marcao cromossmica por citogentica convencional
Bandas T
(marcao das regies telomricas)
(marcao das regies telomricas por
hibridizao in situ)
Tcnicas de marcao cromossmica por citogentica convencional
Tcnica de FISH

Baseia-se no uso de sondas,
isto , sequncias de DNA
ligadas a fluorocromos que por
sua vez se ligam a sequncias
de DNA que lhe so
complementares.
Tipo de sondas
Painting de cromossomas inteiros
Sequncia especfica:
gene de fuso BCR/ABL
Tcnicas de marcao cromossmica por citogentica molecular
FISH aplicado a clulas em interfase (IFISH)
- desnaturao dos
cromossomas em
lmina
- desnaturao
da sonda
- coloca-se a sonda
desnaturada nos
cromossomas, j
desnaturados
- hibridao
durante a
noite
- deteco
- observao ao
microscpio
Tcnica de FISH (resumo)
(observao em cmara escura)
Tcnicas de marcao cromossmica por citogentica molecular
Comparative genomic hybridization (CGH) SKY or spectral FISH
Multicolor FISH
Tcnicas de marcao cromossmica por citogentica molecular
CGH arrays
N de clulas a observar num estudo citogentico
Estabelecimento do caritipo por citogentica convencional:
- observao de 20 metafases marcadas com bandas.
-organizao do caritipo em 3-5 metafases.

Deteo de mosaicismo:
- contagem de 15 metafases para despiste de 20% de mosaicismo.
- contagem de 30 metafases para despiste de 10% de mosaicismo.
- contagem de 60 metafases para despiste de 5% de mosaicismo.

Deteo de alteraes por citogentica molecular:
- observao de 20 metafases para pesquisa de alteraes por FISH.
- observao de 100 ncleos para pesquisa de alteraes por FISH em interfase.

Pesquisa de instabilidade cromossmica aneuploidia e aberraes cromossmicas:
- observao de 100 metafases para pesquisa de aneuploidias, quebras e rearranjos
cromossmicos. Comparao com 100 metafases de um controlo.
IC ambiental: avaliao de risco
atravs de testes citogenticos
Situaes de risco
Pesquisa de instabilidade cromossmica (IC)
-Biomarcadores de dose

- Biomarcadores de efeito genotxico

- viabilidade celular
-efeito a nvel de DNA
- efeito a nvel cromossmico
Parmetros de instabilidade cromossmica:
-alteraes numricas
-excesso de trocas intercromatdicas
-alteraes estruturais
-quebras e rearranjos
Biomarcadores de dano gentico
Comparao de qualquer destes parmetros com um controlo
- Determinao do ndice mittico (viabilidade)

- Por citogentica:
n de metafases / 100 clulas


- Por citometria de fluxo:
Contagem de clulas em G0G1, S e G2M

Parmetros de instabilidade cromossmica
Pesquisa de aneuploidias

- Em metafases:
- Contagem de cromossomas
- Em interfases:
- Microncleos (MN)

MN
Parmetros
de instabilidade cromossmica
Pesquisa de trocas entre cromatdios irmos (SCE)

SCE
Parmetros
de instabilidade cromossmica
1 ciclo de replicao com BrdU incorporada metafase seguinte
2 ciclo de replicao com BrdU incorporada metafase seguinte
Fundamento da tcnica de marcao das SCE
Parmetros
de instabilidade cromossmica
Pesquisa de aberraes cromossmicas (AC) estruturais

- Em metafase:
- quebras (cromossmicas e cromatdicas)
- rearranjos tri e tetra-radiais
- cromossomas dicntricos e em anel

AC
Parmetros
de instabilidade cromossmica
Clulas com elevado ndice de instabilidade cromossmica
metafase pulverizada
Figuras tri e
tetraradiais
Cromossoma em
anel e cromossoma
dicntrico
com bandas
sem bandas
Parmetros de instabilidade cromossmica
Parmetros de avaliao de instabilidade cromossmica (quebras):
- % clulas aberrantes (com quebras) (n=100)
- n quebras / clula (mdia de 100)