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Este documento describe la técnica de placas hemolíticas de Jerne para cuantificar las células formadoras de anticuerpos. Explica que esta técnica permite contar el número de células que producen anticuerpos específicos contra un antígeno de eritrocito al suspender las células en un agar que contenga dicho antígeno, permitiendo la detección de las células individuales a través de la lisis de los eritrocitos por la acción del complemento.
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15362507 Cuantificacion de Las Celulas Formadoras de Anticuerpo Mediante La Tecnica de Jerne
Este documento describe la técnica de placas hemolíticas de Jerne para cuantificar las células formadoras de anticuerpos. Explica que esta técnica permite contar el número de células que producen anticuerpos específicos contra un antígeno de eritrocito al suspender las células en un agar que contenga dicho antígeno, permitiendo la detección de las células individuales a través de la lisis de los eritrocitos por la acción del complemento.
Este documento describe la técnica de placas hemolíticas de Jerne para cuantificar las células formadoras de anticuerpos. Explica que esta técnica permite contar el número de células que producen anticuerpos específicos contra un antígeno de eritrocito al suspender las células en un agar que contenga dicho antígeno, permitiendo la detección de las células individuales a través de la lisis de los eritrocitos por la acción del complemento.
Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Facultad de Estudios Superiores Zaragoza Laboratorio de Inmunologa L-121 Prez Prez Jos Manuel ____________ Prez Sevilla Alma Beatriz ____________ Equipo 3, Grupo 2802
rganos linfoides
Los rganos linfoides se clasifican como primarios o secundarios, en funcin de su participacin en los procesos de diferenciacin, maduracin y especializacin de las clulas linfoides.
Primarios: en ellos las clulas linfoides (linfocitos), adquieren el grado de diferenciacin y maduracin que requieren para el adecuado desempeo de sus funciones inmunolgicas. Los rganos son: medula sea en mamferos bolsa de Fabricio en aves timo en ambos
Secundario: es el sitio de concentracin de clulas linfoides, ocurren las interacciones entre las clulas y los antgenos que dan origen a las repuestas inmunitarias. Estos rganos son: bazo ganglios linfticos placa de Peye ganglios linfticos mesentricos tejido linfoide asociado a los bronquios
El bazo
Localizado en la regin supramesoclica del abdomen, detrs del estomago, envuelto por una capsula fibrosa de la que se desprenden tuberculas que dividen parcialmente y sostiene al parnquima esplnico. La masa esplnica consta de una porcin conocida como pulpa blanca, donde se concentran las clulas linfoides, y una porcin llamada pulpa roja, donde se encuentran las otras clulas de la sangre.
Pulpa Roja: destruye a los eritrocitos viejos y que han perdido funciones Pulpa Blanca: se encuentran los linfocitos T y los linfocitos B, que se activan en presencia de antgenos.
La funcin del bazo es participacin en repuesta inmunitaria, rgano de filtracin sangunea y es donde se retienen y destruyen la mayora de las clulas circulante envejecidas
Inmunidad Inmunidad es un trmino que describe el estado de tener suficientes defensas biolgicas para evitar la infeccin, enfermedad, u otra invasin biolgica no deseada. La inmunidad involucra tanto a componentes especficos y no especficos. Los componentes no especficos actan como barreras o como eliminadores de patgenos para detener la infeccin por microorganismos antes de que puedan causar la enfermedad. Otros componentes del sistema inmunolgico se adaptan ellos mismos a cada nueva enfermedad encontrada y son capaces de generar inmunidad especfica contra el germen patgeno. La inmunidad adaptativa o especfica a menudo se subdivide en dos grandes tipos dependiendo de cmo se introdujo la inmunidad. Pueden subdividirse an ms, dependiendo de la cantidad de tiempo que dura la proteccin. La inmunidad pasiva es a corto plazo, y normalmente dura slo unos pocos meses, mientras la proteccin va inmunidad activa dura ms tiempo, y es a veces de por vida. Una subdivisin ms de la inmunidad adaptativa se caracteriza por las clulas involucradas; la inmunidad humoral es el aspecto de la inmunidad que es mediado por anticuerpos secretados, mientras que la proteccin proporcionada por inmunidad celular involucra slo linfocitos T. La inmunidad humoral es activa cuando el organismo genera sus propios anticuerpos, y pasiva cuando los anticuerpos son transferidos entre individuos. Asimismo, la inmunidad celular es activa cuando las clulas T propias del organismo son estimuladas y pasiva cuando las clulas T vienen de otro organismo
La inmunidad humoral se caracteriza por la produccin de Ig o Ac (anticuerpos) que se dividen en diversas clases: IgG, IgM,IgA, IgE e IgD. La inmunidad celular se caracteriza por la produccin de linfocitos T sensibilizados especficamente hacia un Ag (antgeno).
Se entiende por inmunidad activa el proceso mediante el cual los organismos producen sus propios anticuerpos o linfocitos T sensibilizados, generndose, por lo tanto memoria inmunolgica.
Inmunidad activa
Respuesta inducida una vez producido el contacto con Ag Respuesta inmune formada por anticuerpos y linfocitos T Confiere resistencia a largo plazo (produccin Ab) Lenta progresin de la resistencia y la necesidad de contacto prolongado con el antgeno
La inmunidad pasiva es aquella en la que reciben un anticuerpo o linfocitos preformados en otro organismo.
Inmunidad
Respuesta basada en anticuerpos ya existentes en otro hospedero transmitidos de forma natural a travs de la placenta o a travs del calostro forma de proteccin rpida, pero de corta duracin
Inmunidad Innata
Respuesta no especifica Respuesta rpida, inmediata Mediada por clulas :macrfagos, neutrofilos, basofilos Mediada componentes humorales: complemento citocinas, IL Sin memoria inmunolgica
Inmunidad adaptativa
Respuesta especifica contra patgenos y antgenos Tiempo de demora para una respuesta maxima Mediada por celulas :Linfocitos T y B Mediada por componentes:Complemento Conduce a Memoria
Respuesta inmune celular
La primera fase de la inmunidad celular es el reconocimiento de antgenos extraos dentro del organismo por clulas B a travs de su receptor de membrana. Sin embargo, a pesar de la interaccin con antgeno, la clula B no se activa hasta ser estimulada por una lnea de linfocitos T llamados linfocitos T cooperadores. Esa unin, clula B: linfocito cooperador, estimula la expansin clonal y diferenciacin de los linfocitos B, los cuales:
Secretan anticuerpos primeramente de tipo IgM Cambian de isotipo, bien sea IgG, IgA o IgE, dependiendo del estmulo adecuado Maduran a anticuerpos de alta afinidad por el antgeno inicial Remanentes de la lnea producida permanecern como linfocito B de memoria.
La respuesta de anticuerpos en contra de los antgenos no proteicos (lpidos, polisacridos) no requieren la participacin de linfocitos T cooperadores, por lo que son llamados Antgenos T- Independientes. Las clulas que producen los anticuerpos son clulas plasmticas, un tipo especial de linfocito B que se especializa en la produccin de un anticuerpo particular y especfico.
Respuesta humoral primaria
La cantidad de anticuerpo secretado por clulas plasmticas y la clonacin de estas mismas clulas la primera vez que entra en contacto el receptor con el antgeno encuentran su mximo aproximadamente a los 7 das de la primera infeccin (5-10 das). Habitualmente, la respuesta mxima de anticuerpos son del isotipo IgM, por encima de IgG, inducida por todo tipo de inmungeno. La dosis necesaria para la inmunizacin generalmente debe ser relativamente alta, ptimamente con la presencia de adyuvantes para los antgenos proteicos.
Respuesta humoral secundaria
Una infeccin repetida por un mismo antgeno activa los linfocitos de memoria creados como consecuencia de la respuesta humoral primaria. La respuesta, entonces, se inicia ms rpidamente, al cabo de unos 3 das. Por su parte, la respuesta mxima de anticuerpos es mayor, con una intensidad de 100 a 1000 veces la respuesta primaria, y es principalmente del isotipo IgG (en ciertas situaciones de los isotipos IgA e IgE). Tambin dura ms tiempo, haciendo que su declive sea ms lento. Es una respuesta inducida por antgenos proteicos y slo son requeridas bajas dosis de antgenos infectantes, sin necesidad de adyuvantes.
Respuesta humoral primaria vs. Secundaria Respuesta primaria Respuesta secundaria Dura 5-10 das para instalarse Habitualmente 3 das para instalarse Respuesta mxima de anticuerpos menor Respuesta mxima de anticuerpos mayor Generalmente IgM > IgG Aumento relativo de IgG y de IgA e IgE en ciertos casos Menor afinidad media por anticuerpos Afinidad madurada y mayor por anticuerpos Inducida por cualquier inmungeno Inducida slo por antgenos proteicos Dosis de inmunizacin relativamente alta Inducida por baja dosis de antgenos Adyuvantes requeridos ptimamente Adyuvantes no necesarios usualmente
Reacciones de hemolisis.
El complemento (C) fija los complejos Antgeno (Ag)-Anticuerpo (Ac) (Ag-Ac) y forma un complejo Ag-Ac-C y si Ag es una clula, se produce lisis. Si la clula es un eritrocito, se libera la hemoglobina despus de la lisis. Este fenmeno se conoce como hemolisis. Midiendo la cantidad de hemoglobina liberada, se consigue una expresin de la amplitud de la hemolisis, y, por lo tanto, de una cantidad de complejo Ag-Ac. Las placas hemolticas fueron desarrolladas por Niels Jerne, en 1963. Esta prueba es para el estudio de las bases celulares de la reaccin inmune, lo que la reaccin de precipitacin cuantitativa es la inmunoquimica. El mtodo de placas hemolticas da la idea del nmero de clulas formadoras de anticuerpo en una poblacin. Estas clulas se denominan clulas formadoras de palca (CFP). El principio de la prueba consiste en que si las clulas productoras de anticuerpos contra un antgeno de eritrocito se suspenden en una capa de agar que contengan los antgenos de eritrocito, el anticuerpo secretado por una clula se difundir a travs del agar, reaccionara con los eritrocitos, y formara un complejo localizado, antgeno-anticuerpo. Cuando se aade complemento a la capa de eritrocito-linfocito, solo aquellos eritrocitos que han reaccionado con el anticuerpo se fijarn el complemento y se consumara su lisis, estos producen zonas localizadas de hemolisis. Estas zonas locales reciben el nombre de placas por que se parecen a las que produce un bacterifago.
Los linfocitos obtenidos del animal sensibilizado y una suspensin de clulas indicadoras (GRC), se mezclan y se distribuye en un medio semislido (agarosa). Los GR pueden ser el antgeno o pueden estar sensibilizados con el antgeno que se est investigando. Con la adicin de complemento, los GR se lisan y en las placas se hacen visible un halo de hemolisis alrededor de cada linfocito B capaz de producir anticuerpos. Los CFP se cuantifican como placas por bazo, placas por cultivo o placas por 106 clulas probadas. El mtodo da una medida cuantitativa de las clulas productoras de anticuerpo contra un antgeno.
Las placas que se obtienen directamente, representan principalmente clulas que producen IgM, pues este anticuerpo tiene una alta eficiencia hemoltica. Para demostrar clulas que sintetizan IgG, es necesario favorecer la unin del complemento al complejo eritrocito- anticuerpo IgG, aadiendo antes suero anti-IgG de conejo; esta tcnica constituye la llamada de (placas indirectas) y se utiliza para identificar distintas clulas, que fabriquen anticuerpos pertenecientes a diferentes subclases, suponiendo que se posea los antisueros de conejo apropiados. Este mtodo es de amplia aplicacin, al ser posible recubrir la superficie del eritrocito con multiplicidad de antgenos como el polisacrido de neumococo, o uniendo grupos haptnicos a la superficie del eritrocito.
La tcnica tiene diferentes usos, uno de ellos es demostrar, en forma experimental, la sensibilizacin previa de una animal frente a un antgeno, estudiando in-vitro la capacidad de los linfocitos B para producir anticuerpos, y analizando el fenomeno de la interaccion celular requerida tanto durante la presentacaion del antigeno como en el proceso de activacion de la clula B por la clula T.
Modificaciones de la tcnica de Jerne
Se han realizado diversas modificaciones a la tcnica original de Jerne, entre las que se encuentran las siguientes:
Golub, Mishell y Dutton: Esta modificacin emplea toxoide de difteria, con la finalidad de obtener una mayor cantidad de anticuerpos.
Schwartz Braun: Es una prueba con bacterina, emplea E.coli muertas por calor. Se lleva a cabo con clulas del bazo + E. col viva + agar+MEM. Se le adiciona complemento y permite
Nossal, Warner y Lewis: Inmuniza a conejo con Salmonella typhi; emplea Clulas de ganglios linfticos, Sangra al conejo a los 5 das y un segundo conejo a los 21 das Observa una primera respuesta que es IgM (respuesta primaria) y IgG (respuesta secundaria).
Cunningham y Szemberg: Emplea portaobjetos en lugar de placas, no utiliza azarosa. Emplea clulas+GRG+MEM.
Referencias:
Bellanti A.J. Inmunologa. 3 Ed. Mxico: Panamericana, 1986: 188-192. Goldsby R. A. et al. Inmunologa. 5 Ed. Mxico: Mac Graw Hill, 1992: 154-155. Rojas E. O. Inmunologa de memoria.2 Ed. Mxico: Panamericana, 2001:162-163. Stites P.D. inmunologa humana y bsica. Mxico: Panamericana, 1994: 351-352.
Es evidente que la penetracin de sustancias extraas en el organismo, en forma natural o inducida, ya sean bacterias o sustancias qumicas de naturaleza proteica, estimulan el desarrollo de otras sustancias, los anticuerpos, que reacciona con la sustancia estimulante o antgena.
Los hematies de oveja y otros se han utilizado no solo en ensayos directos si no tambin como portadores de numerosos antgenos capaces de fijarse qumicamente a su superficie La tcnica de placa de Jerner ha tenido buena aceptacin para determinar el desarrollo de clulas productoras de anticuerpo en el bazo de un ratn durante la induccin de una respuesta inmune, la tcnica presenta ventajas de detectar pequeos nmeros de clulas productoras de anticuerpo, entre poblaciones de gran tamao. Mishell y Dutton han aplicado una tcnica que se basa en los linfocitos de la sangre perifrica para medir la produccin in vitro de anticuerpos para eritrocitos de oveja Los rganos linfoides se clasifican de la siguiente forma:
La funcin de los rganos primarios es nica e imprescindible; mientras que de los secundarios redundante y prescindible.
Los rganos secundarios son sitios donde ocurre el contacto entre las clulas linfoides y los antgenos. El contacto entre estos elementos induce a la proliferacin celular y la sntesis de los mediadores solubles de la respuesta inmune (anticuerpos y citocinas). El Bazo se divide en pulpa blanca rica en folculos linfoides y centros germinales y pulpa roja abundante en macrfagos, eritrocitos, escasos linfocitos y clulas plasmticas.
Los anticuerpos de la clase IgM son terceros en cuanto su concentracin en sangre. Su estructura polimrica les confiere gran capacidad neutralizante de las toxinas y aglutinante de los microorganismos. Slo esta clase de anticuerpos de las IgG son capaces de activar el sistema del complemento por la llamada va clsica; ste tipo de anticuerpo es el predominante en las etapas tempranas de las respuestas inmunes primarias.
La tcnica de Jerne est basada es una hemlisis localizada, como se puede apreciar en la siguiente figura:
evaluar bacterinas por tiempo.
Modificaciones de la tcnica de Jerne
Se han realizado diversas modificaciones a la tcnica original de Jerne, entre las que se encuentran las siguientes:
Golub, Mishell y Dutton: Esta modificacin emplea toxoide de difteria, con la finalidad de obtener una mayor cantidad de anticuerpos.
Schwartz Braun: Es una prueba con bacterina, emplea E.coli muertas por calor. Se lleva a cabo con clulas del bazo + E. col viva + agar+MEM. Se le adiciona complemento y permite Nossal, Warner y Lewis: Inmuniza a conejo con Salmonella typhi; emplea Clulas de Ganglios linfticos, Sangra al conejo a los 5 das y un segundo conejo a los 21 das Observa una primera respuesta que es IgM (respuesta primaria) y IgG (respuesta secundaria. Cunningham y Szemberg: Emplea portaobjetos en lugar de placas, no utiliza azarosa. Emplea Clulas+GRG+MEM +C, es una tcnica sensible, observa anticuerpos aglutinantes.
Poduval: Emplea Toxoide de difteria, linfocitos +GR sensibilizados +MEM+ C, Se obtiene hemoglobina liberada que se cuantifica con medidor de ELISA; la evaluacin de anticuerpos se hace en base a la hemoglobina liberada
Las aplicaciones que tiene la tcnica de Jerne son mltiples, entre las cuales se encuentra la deteccin de enfermedades infecciosas, alergias, enfermedades autoinmunes, compatibilidad en trasplantes, estudios de endocrinologa, y el estudio de vacunas tanto para bacterias como para virus.