ESPECTROFLUORIMETRIA

Mtodos Instrumentais de Anlise

Farmcia
Conceito Terico
Mtodos qualitativos e quantitativos que se
baseiam no fenmeno de excitao de uma
molcula para, em seguida, ocorrer a emisso
de uma radiao.
A tcnica envolve dois espectros de radiao:
Excitao (menor l)
Emisso (maior l)
Classificao
Fluorescncia: a excitao no provoca
alteraes no spin durante a transio
eletrnica.
Fosforescncia: a excitao provoca alteraes
no spin durante a transio eletrnica.
Quimiluminescncia: emisso de radiao por
uma espcie excitada durante uma reao
qumica.
Vantagens
Sensibilidade trs vezes maior que a alcanada em
mtodos espectrofotomtricos (absoro
molecular).
Linearidade entre a intensidade de fluorescncia e
a concentrao bem maior que a de mtodos
espectrofotomtricos.
Desvantagem: Maior interferncia (efeitos
desativadores da luminescncia). Correo atravs
de procedimentos adequados de separao e
purificao da amostra a ser analisada.
Estado Fundamental
Excitao est relacionada ao estado
eletrnico do spin nas molculas.
Spin: Um orbital comporta, no mximo, dois
eltrons de spin contrrios (emparelhados).
Em um orbital eletrnico no estado fundamental,
os eltrons se encontram EMPARELHADOS,
como na figura ao lado.
Estados de Excitao
Quando um par de eltrons de uma molcula
excitado a um nvel de energia mais alto podem
ser formados dois estados energticos
excitados:
Singleto: eltrons permanecem emparelhados.
Tripleto: eltrons desemparelhados.
Estado Excitado
Singleto
(Fluorescncia)
Estado Excitado
Tripleto
(Fosforescncia)
Diagrama de Jablonski
Estados Excitados Singletos
Estados Excitados Tripletos
Energia
Fluorescncia
(emisso de fton)
Fosforescncia
(emisso de fton)
Relaxao
Vibracional
(no radioativo)
Absoro
Espectros de Excitao e Emisso
Para efetuar uma anlise fluorimtrica deve-se
obter, inicialmente, os l de excitao e
emisso para que se ajuste no equipamento.
Ambos so obtidos por uma varredura
semelhante quela efetuada no
espectrofotmetro.
Atravs de uma curva de calibrao possvel
converter a intensidade (I) em concentrao.
Equipamento
Sequncia de Estabelecimento
de uma Curva de Calibrao
Balana Analtica
Nivelamento da Balana
Pesagem do Padro
Preparo da Soluo-Me
Preparo das Diluies do Padro
Equipamento
Programao da Anlise
Varredura
Espectro de Excitao - FAD
Espectro de Emisso - FAD
Curva de Calibrao
Espectrofluorimetria
y = 237,13x + 0,2233
R = 0,9967
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e

(
I
)
C (g/l)
Curva de calibrao FAD
Aplicaes
Quantificao de amostras ( alimentos, frmacos,
amostras clnicas e produtos naturais).
Mtodo de deteco acoplado cromatografia.
Avaliao da degradao e resistncia de molculas
(estabilidade frente a pH, temperatura e concentrao
de solutos). Obs: testes variando a fluorescncia em
um intervalo de tempo.
Observar os exemplos, a seguir, que relatam testes de
degradao frente a pH e temperatura. (ocorre
reduo gradual da fluorescncia provocada pela
inativao ou degradao da molcula).
Testes de Degradao ou Resistncia
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
0 2 4 6 8 10
tempo (min)
L
o
g

1
0

I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
gua acetato pH 5,0 fosfato pH 6,0
fosfato pH 7,0 tris-EDTA pH 8,0
Valor D (min)
80C
pH 5.0 4.08
pH 6.0 15.41
pH 7.0 40.32
pH 8.0 27.03
gua 13.85
Soluo
Testes de Degradao ou Resistncia
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
0 30 60 90 120 150 180
tempo (min)
L
o
g
1
0

I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e

d
e

F
l
u
o
r
e
s
c

n
c
i
a
gua acetato pH 5,0 fosfato pH 6,0
fosfato pH 7,0 tris-HCl pH 8,0
Valores D
pH 6,0 pH 7,0, 8,0 e
gua = > 2 dias
pH 5,0 = 5 horas
ESTABILIDADE EM DIFERENTES VALORES DE pH
T
R =
25C
tris-EDTA pH 8,0