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NDICE

1- Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
- Estructura del VIH. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
- Ciclo de infeccin vrica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6
- Estructura de la proteasa del VIH-1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
- Mecanismo de catlisis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9
- Mutaciones de resistencia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11
- Localizacin de las mutaciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11
- Mutaciones de resistencia encontradas en diferentes inhibidores. . . . . . . . . . . . . . .12
- Mutaciones de resistencia in vivo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
- Inhibidores del tipo ureas cclicas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16
- Potencia relativa de inhibicin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
- El problema de las mutaciones de resistencia en ureas cclicas. . . . . . . . . . . . . . . . 18

2- Objetivos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20

3- Mtodos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23
- Parte terica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24
- Ciclo 1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25
- Ciclo 2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26
- Obtencin de los valores de variacin de energa libre, a partir de las constantes
experimentales K
i.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
- Modelos de solvatacin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28
- Naturaleza de los clculos realizados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

4- Trabajo Realizado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33
- Obtencin y tratamiento de las estructuras cristalogrficas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
- Clculos basados en el Ciclo 1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
- Clculos basados en el Ciclo 2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2
- Clculos preliminares para la determinacin del estado de protonacin de la dada
cataltica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
- Estudio preliminar de las perturbaciones a gran escala. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

5- Resultados y Discusin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44
-
Clculo de las variaciones de energa libre observadas, a partir de las constantes
experimentales K
i.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
- Clculos basados en los ciclos termodinmicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
- Clculos preliminares para la determinacin del estado de protonacin de la dada
cataltica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52
- Estudio preliminar de las perturbaciones a gran escala . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .57

6- Conclusin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .66

7- Bibliografa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .70

1. Introduccin

4
Los primeros casos de SIDA fueron detectados en 1981. Desde esta fecha, se estima que
ms de 11.7 millones de personas han fallecido a causa de esta enfermedad. Los primeros
casos detectados a principios de los 80, se caracterizaban por un agrupamiento inusual de
enfermedades oportunistas, que no se desarrollan en individuos con sus defensas
inmunitarias en condiciones normales.

A pesar de que el sndrome fue detectado en 1981, el virus no fue identificado hasta 1983
y en 1985 se desarroll la primera prueba de deteccin del virus de inmunodeficiencia
humana (VIH) en sangre. El VIH ataca a los linfocitos T4 humanos, parte del sistema
inmunolgico, y como consecuencia a esto la respuesta del organismo frente a infecciones
externas disminuye. Infecciones clsicas debido a esta enfermedad son pneumocitosis,
toxoplasmosis, sarcoma de Kaposi o tuberculosis y criptocosis, ms frecuentes en frica.
(1)

Hay variantes que afectan a otras especies animales. Los ms conocidos son VIS (virus de
inmunodeficiencia simia), VIF (felina) o VIE (equina). Dentro del VIH hay dos variantes
fundamentales:

VIH-1, est distribuido por todo el mundo

VIH-2, est concentrado mayoritariamente en frica occidental

Estructura del VIH

El VIH, agente causante del SIDA, es un lentivirus con una alta tasa de mutacin.
Pertenece a la familia Retroviriadae, cuyo genoma es codificado por ARN. Es de forma
esfrica, con un dimetro de 110 nm, y est formado por:

Bicapa lipdica: contiene las protenas gp41 y gag p17, junto con las glicoprotenas de
superficie gp120.

5
Core: formado por protenas estructurales como las p24. El core contiene las dos hlices
de ARN asociadas a protenas de tipo p7. Asimismo en el core se encuentran tres
enzimas: VIH PR (proteasa), VIH RT (reverso transcriptasa) y VIH IN (integrasa). (2)

Fig.1.1 Diagrama estructural del VIH (3)

El genoma del VIH presenta los genes estructurales gag, pol, y env, tpicos de otros
retrovirus. Cada unos de estos genes codifican una serie de protenas. Los gag codifican las
protenas internas del core, los pol codifican las enzimas virales reverso-transcriptasa,
6
proteasa e integrasa y los env codifican las protenas de envoltura gp120 y transmenbranar
gp41. Adems presenta cinco genes no estructurales cuya funcin se desconoce. Estos
genes son los tat, nef, vif, vpr y vpn.(3)

Ciclo de infeccin vrica

El ciclo de infeccin vrica consta de varias etapas: (3)

1. El objetivo del virus son los linfocitos T4. El VIH reconoce unas proteinas de
superficie (CD4) presentes en las clulas humanas anfitrionas, los linfocitos T. Estas
proteinas CD4 se unen a la protena gp120 del virus, dando lugar al anclaje del virus
a la clula. Posteriormente, se produce la fusin entre membranas, la protena gp41
se inserta en la membrana celular y el contenido del core vrico se libera en el
citoplasma celular.
2. La enzima reverso-transcriptasa cataliza la trancripcin del ARN vrico a doble
hlice de ADN.
3. El ADN vrico entra en el ncleo de la clula, integrndose en el genoma de la clula
infectada. Este proceso esta catalizado por la VIH IN (integrasa).
4. Despus de un perodo latente, diversos factores tanto intrnsecos como extrnsecos
provocan la activacin del virus. Las polimerasas del ARN celular transcriben el
ADN proviral en ARN mensajero, obtenindose nuevas copias del genoma.
5. Este ARNm viral se traduce dando lugar a protenas virales. En este paso es cuando
interviene la proteasa del VIH, que cataliza la hidrlisis de la cadena polipeptdica en
diversos fragmentos que corresponden a las diferentes protenas necesarias para la
obtencin de nuevos virus.
6. Se produce el agrupamiento de todo el material vrico fabricado por la maquinaria
celular. Esta etapa se conoce como ensamblaje.
7. La nueva partcula vrica, se fusiona con la membrana envolvindose en ella,
logrando construirse con ella una envoltura. A la nueva partcula vrica formada se le
unen las protenas de membrana necesarias para un nuevo anclaje a otra clula e
iniciar as el ciclo nuevamente.
7

Fig. 1.2 Ciclo de infeccin vrica del VIH. (4)

8
Estructura de la proteasa del VIH-1

En la secuencia de la proteasa del VIH nos encontramos con la presencia de la trada en el
centro activo, Asp-Thr-Gly, que junto con otras homologas hizo pensar que pertenece a la
familia de las proteasas asprticas eucariotas (5). La VIH PR est formada por dos
monmeros idnticos de 99 aminocidos. Un rasgo inusual de esta proteasa es que el centro
activo se localiza en la interfase de los dos monmeros, formado a partir de aminocidos
correspondientes a las dos subunidades que forman el dmero.
Adems presenta otras caractersticas de las proteasas asprticas como la inhibicin por
pepstatina e inactivacin por mutacin en la dada cataltica del centro activo, compuesta
por los residuos acido asprtico con nmero 25 en la secuencia de cada monmero.(6)
La estructura de la VIH PR fue modelada usando las estructuras conocidas de proteasas
asprticas como base. En este modelo, la VIH-1 PR estaba constituida por un dmero
formado a partir de dos dominios idnticos. Una estructura ms acertada fue construida
usando la estructura tridimensional de la proteasa del virus del sarcoma de Rous (VSR PR)
como modelo. (7)
Los estudios estructurales sobre la VIH-1 PR se vieron impedidos en un principio por la
poca cantidad disponible de la enzima, por lo que fue necesaria su sntesis para tener una
cantidad suficiente como para llevar a cabo estudios cristalogrficos de su estructura. La
determinacin de la estructura cristalogrfica de la VIH-1 PR fue realizada por Navia y col.
(8)

PRO GLN VAL THR LEU TRP GLN ARG PRO LEU VAL THR ILE
LYS ILE GLY GLY GLN LEU LYS GLU ALA LEU LEU ASP THR
GLY ALA ASP ASP THR VAL LEU GLU GLU MET SER LEU PRO
GLY ARG TRP LYS PRO LYS MET ILE GLY GLY ILE GLY GLY
PHE ILE LYS VAL ARG GLN TYR ASP GLN ILE LEU ILE GLU
ILE CYS GLY HIS LYS ALA ILE GLY THR VAL LEU VAL GLY
PRO THR PRO VAL ASN ILE ILE GLY ARG ASN LEU LEU THR
GLN ILE GLY ALA THR LEU ASN PHE

Fig. 1.3, Secuencia de aminocidos para cada monmero de la VIH-1 PR. Esta secuencia no es constante en
todos las VIH-1 PR aisladas. Hay variaciones en la secuencia debido a mutaciones o lugar de procedencia.

9
El centro activo de la VIH-1 PR est cubierto por dos lminas que reciben el nombre de
flaps. Estos flaps estn formados por los residuos 43-58, son flexibles y llevan a cabo
cambios conformacionales durante el enlace y posterior liberacin de los substratos. (9)

Fig. 1.4 Representacin del complejo VIH-1 PR con el inhibidor SD146, creada a partir de su estructura
cristalogrfica.

Mecanismo de catlisis

Se han publicado numerosos trabajos describiendo el mecanismo por el que discurre la
reaccin de escisin de pptidos catalizada por VIH-1 PR. En trminos generales, el
mecanismo es de tipo cido base y una molcula de agua est involucrada. (10, 11)

10

Fig. 1.5 Mecanismo de accin de VIH-1 PR.

La proteasa del VIH-1 se convirti en un objetivo prioritario en la lucha contra el SIDA,
ya que su inhibicin hace que las clulas infectadas produzcan virus inmaduros y no
infecciosos, en el proceso de creacin de nuevas partculas vricas. Este descubrimiento
hizo que la VIH-1 PR se convirtiese en objeto de estudio intensivo mediante el diseo de
inhibidores asistido por ordenador, y han sido creados una gran cantidad de estos
inhibidores diseados en funcin de la estructura de la enzima. (12)

O
O
Asp
25
O
O
Asp
25
H
O
H
H
N
O
R
OH
R
O
O
Asp
25
H
O
O
Asp
25
N
O
R
OH
R
H
O
H
O
O
Asp
25
O
O
Asp
25
H
NH
R
O R
OH
O H
11
Mutaciones de resistencia

En presencia de inhibidores de la VIH-1 PR, emergen variedades mutantes que son
ms resistentes al inhibidor en cuestin. Por esta razn, entender las causas de la prdida
de afinidad tras la mutacin es muy importante para el diseo de inhibidores ms
efectivos. Una caracterstica importante es que generalmente, cada inhibidor genera
unas mutaciones determinadas. Es decir, para cada inhibidor se producen unos
determinados cambios de aminocidos que suelen ser producidos solo por dicho
inhibidor.

El origen de esta alta mutabilidad de la VIH-1 PR est determinado por dos factores:

1. La alta tasa de error de la HIV-1 RT (retrotranscriptasa), que es sobre 1 entre
10.000 bases, genera un alto nmero de cambios en la secuencia de VIH-PR
que por seleccin natural acaban prevaleciendo al ser los menos afectados
por los inhibidores. (13)
2. Las nuevas partculas de VIH-1 son producidas en las clulas infectadas a
razn de 10
8
10
9
viruses diarios. (13)

En un principio se escogi a VIH-1 PR como objetivo en el tratamiento contra el
SIDA, en parte porque se pensaba que los aminocidos del centro activo permanecan
inmutables. Posteriormente se ha observado la existencia de variantes naturales en el
centro activo de VIH-1 PR, en pacientes no tratados con inhibidores de VIH-1 PR. (no
se incluyen dentro de las mutaciones de resistencia). (12)

Localizacin de las mutaciones

La estructura de la VIH-1 PR debe evolucionar a una variante que conserve la
capacidad cataltica sobre su substrato pero que sea resistente a los inhibidores, para
lograr esto las mutaciones se localizan en diferentes partes de la molcula: (12)

1. En el centro activo, interfieren directamente con el enlace enzima-inhibidor, son
efectos localizados.
2. Fuera del centro activo, a travs de perturbaciones globales y a larga escala.
12
3. Compensatorias, favorecen el procesamiento de substratos y aumenta la actividad de
la enzima.

En el trabajo realizado en este proyecto fueron analizadas mutaciones del primer
tipo, aunque ms adelante veremos que esta clasificacin no es tan sencilla. En el
tercer tipo de mutaciones, se engloban las mutaciones que tienen efectos
compensatorios. Estas mutaciones no producen ningn cambio significativo en la
inhibicin por si solas, pero suelen aparecer con otras mutaciones que si son
perjudiciales. El papel de estas mutaciones compensatorias es mejorar las
capacidades catalticas de la enzima si es que una mutacin en el centro activo las
disminuye. Un ejemplo de mutacin con efectos compensatorios est en el siguiente
apartado para el inhibidor ABT-538.

El mecanismo de accin de las mutaciones no est completamente racionalizado, y en
este proyecto intentaremos demostrar que las mutaciones en el centro activo, tambin
producen perturbaciones a larga escala, por lo que la clasificacin anterior deja de ser
vlida.

Mutaciones de resistencia encontradas en diferentes inhibidores

BMS 186,318
El rasgo ms caracterstico de este inhibidor es el grupo aminodiol que posee. Las
mutaciones que emergen en presencia de este inhibidor son V82A y A71T, siendo
V82A la que le confiere la resistencia. (14)

O
N
O
O N
H
N
H
N
H
O
O
OH
Ph
OH
O
O
BMS 186,318
13
ABT-538
Durante el tratamiento in vitro de la VIH-1 PR con este inhibidor, las mutaciones
emergentes fueron I84V, M46I, V82F, L63P y A71V. De estas mutaciones, las que
confieren resistencia son V82F e I84V, con M46I, L63P y A71V produciendo efectos
compensatorios. La proteasa con la triple mutacin L63P/V82F/I84V tuvo un mayor
crecimiento in vitro que la doble mutante V82F/I84V, de lo que se deduce que la
mutacin en L63P tiene efectos compensatorios en la capacidad cataltica de la
enzima. (15)

P9941
Para este inhibidor se comprob una reduccin en la inhibicin de 6 a 8 veces
comparada con la inhibicin en la enzima nativa, debido a la emergencia de mutantes.
La mutacin encontrada fue V82A. (16)

A-77003
Las variantes emergentes en presencia de este inhibidor presentaron las mutaciones en
V82I, V32I y R8Q. La reduccin en la inhibicin es de 3 veces para V32I y
aparentemente ninguna para V82I, sin embargo la doble mutacin V32I/V82I resulta
en una reduccin de 20 veces. La mutacin R8Q fue la que produjo la mayor
disminucin en la inhibicin. (17)
N N
H
N
H
N
H
O
N
S
O
O
Ph
Ph
O
N
S
OH
ABT - 538
N
H
N
H
N
H
N
H
N
O
O
H
OH
OH
O
H
O N
P9941
14

RPI 312
La mutacin surgida en presencia de este inhibidor fue I84V. Un hecho importante es
que si bien la mutacin produjo un descenso en la afinidad por el inhibidor, se produjo
un descenso en la infecciosidad del virus al producirse la mutacin. (18)

U-89360E
Se han publicado estudios sobre mutaciones en G48H (19) y en el aminocido V82
(20a).

KNI-272
Las enzimas mutantes resultantes del anlisis in vitro de este inhibidor, contienen las
mutaciones V32I, I84V, K45I, F53L, A71V, L89M, siendo la doble mutante
N N
H
N
H
N
H
N
H
N N
O OH
OH
O
O
A-77003
N
O N
H
N
H
O
O
NH
2
O
OH
O
NH
O
RPI 312
N
H
N
H
N
H
NH
2
O
OH
O
O NH
2
O
O
N
H
NH
NH
2
U-89360E
15
V32I/I84V y la sxtuple mutante V32I/K45I/F53L/A71V/I84V/L89M las
combinaciones que prevalecieron sobre el resto. (21)

Mutaciones de resistencia in vivo

La mayora de las mutaciones de resistencia que se conocen y han sido estudiadas,
proceden de ensayos con inhibidores en cultivos celulares. Dado que el hombre no es un
cultivo celular, es necesario estudiar las mutaciones de resistencia que emergen en
individuos infectados con el virus del SIDA y tratados con inhibidores de VIH-1 PR. Se
han realizado estudios dedicados a las variantes mutantes emergentes en pacientes,
Condra y col. (22) estudiaron las mutaciones de resistencia tras el tratamiento a un
grupo de individuos, con el inhibidor MK-639 (comercializado con el nombre de
Indinavir), extrayendo y analizando molculas de VIH-1 PR procedentes de cada
individuo y en fases diferentes del tratamiento.

Despus del tratamiento, se obtuvieron cinco variantes mutantes que tenan resistencia
cruzada a seis inhibidores diferentes de la proteasa, por lo que se desecha la terapia
combinatoria para una posible solucin del problema de las mutaciones de resistencia.
De todas las variantes obtenidas en cuatro pacientes diferentes, se dedujo que las
mutaciones necesarias para desarrollar resistencia a los seis inhibidores son: M46I,
L63P, V82T y I84V. Las mutaciones necesarias para desarollar resistencia a MK-639
fueron M46I, L63P y V82T.
N N
H
N
H
N
O
O
S
O
OH
O
S
O
N
H
KNI-272
N
N
N
N
H
OH
O NH
O
N
H
OH
MK-639 (Indinavir)
16
Inhibidores del tipo ureas cclicas

En las estructuras cristalogrficas de los complejos de VIH-1 PR / inhibidor, existe un
rasgo estructural muy interesante que es la presencia de una molcula de agua que no forma
parte del disolvente, es decir, esta molcula tiene una funcin estructural en la enzima. La
molcula de agua acepta dos enlaces de hidrgeno de los tomos de hidrgeno del enlace
peptdico de Ile50 e Ile50 y dona a su vez dos enlaces de hidrgeno a tomos de oxgeno
carbonlicos del inhibidor (23). La molcula de agua est tetradricamente coordinada y
hace que las lminas de los flaps se ajusten sobre el inhibidor (24).

Las ideas en la que se bas el trabajo de Lam y col, (25, 26) para el desarrollo de nuevos
inhibidores fueron:
- El desplazamiento de la molcula de agua de la estructura est favorecido
energticamente.
- El paso de un inhibidor con una estructura flexible y lineal a otro con una estructura
cclica, rgida y con restricciones conformacionales puede tener un efecto entrpico
positivo.
- La presencia de la molcula de agua es caracterstica de la VIH-1 PR y por lo tanto
un inhibidor que estuviese destinado a desplazarla de la estructura, sera altamente
especfico en relacin a otras proteasas asprticas.

El desarrollo desde una estructura cclica inicial, basada en las distancias de los enlace de
hidrgeno en los que mediaba la molcula de agua, hasta la estructura de urea cclica que es
usada como base a diferentes inhibidores, est resumido en la Fig. 1.6. Los grupos P
1
y P
1

se colocaron para interaccionar con los bolsillos S
1
y S
1
en el centro activo de la enzima.
El grupo carbonilo se utiliz para desplazar a la molcula de agua antes mencionada, y el
grupo hidroxilo para interaccionar con los aspartatos del centro activo. A continuacin, se
ampli el ciclo de seis a siete miembros, para poder as incorporar un grupo diol que
generara una mayor interaccin con los aspartatos del centro activo. Posteriormente se
pas a la estructura de urea cclica por dos causas principales; en primer lugar las ureas
cclicas son excelentes dadores/aceptores de enlaces de hidrgeno y en segundo lugar, la
17
sntesis de ureas heptacclicas es accesible a travs de la ciclacin de un diaminodiol
derivado de la fenilalanina, usado en la sntesis de otros inhibidores de VIH-1 PR.
Finalmente se introdujeron los grupos P
2
y P
2
para interaccionar con los bolsillos S
2
y S
2

del centro activo y se determin la configuracin estereoqumica ptima de los
sustituyentes.
Fig. 1.6 Evolucin en la estructura de los inhibidores diseados por Lam y col. (25) que resultaron en ureas
cclicas.

Inicialmente se colocaron grupos fenilo en P
1
y P
1
porque generaban un buen contacto
con los bolsillos S
1
y S
1
y hay diferentes ureas cclicas con diferentes grupos en P
2
y P
2
.
Los diferentes ensayos con diferentes grupos en P
2
/P
2
condujeron a la estructura de urea
cclica conocida como DMP323, que tuvo unos buenos valores de interaccin con S
2
y S
2
a
la vez que una biodisponibilidad adecuada. (25)

Los inhibidores con estructura de ureas cclicas estudiados en este proyecto son DMP323,
SD146 y XV638.
N
H
N
H
N
O
N N
O
O H OH
N
H
N
H
N
O
N
H
S
N
O
N N
O
O H OH
N
H
S
N
O
SD146
XV638
P
1
' P
1
OH
O
P
1
P
1
'
O
OH O H
NH
N H
P
1
P
1
'
O
OH O H
N
N
O
OH O H
P
1
P
1
'
P
2
'
P
2
N N
O
O H OH
OH
OH
DMP323
18
Potencia relativa de inhibicin

La potencia relativa de inhibicin viene dada por las interacciones entre enzima e
inhibidor. Las interacciones entre las ureas cclicas y el centro activo de la enzima se
pueden clasificar en dos tipos:

Las que anclan el anillo de 7 miembros en el centro activo. No varan entre los
diferentes inhibidores.
Las que se crean entre los substituyentes del ciclo (P
2
, P
2
, P
1
, P
1
,) y los bolsillos del
centro activo.

Para el primer grupo de interacciones se generan dos enlaces de hidrgeno entre las
amidas e Ile50 e Ile50, y cuatro enlaces de hidrgeno entre el diol y los carboxilatos de los
aspartatos catalticos, Asp25 y Asp 25. Este ltimo punto no est del todo aclarado ya que
dichos aspartatos pueden tener diferentes estados de protonacin y esto puede cambiar el
patrn de enlaces de hidrgeno. En el segundo grupo de interacciones estas varan
dependiendo de la naturaleza de los grupos P
2
y P
2
. Estas interacciones son las que
diferencian a las ureas cclicas en potencia de inhibicin. SD146 y XV638, por este orden,
son los que generan un mayor nmero de contactos de Van der Waals y enlace de
hidrgeno con P
2
y P
2
. Por esta razn son inhibidores ms potentes que DMP323. (27)

El problema de las mutaciones de resistencia en ureas cclicas

Se conocen toda una serie de variantes de VIH-1, emergentes en presencia de este tipo de
inhibidores. Las estudiadas en este proyecto son V82F, I84V y la doble mutante V82F e
I84V. Aparte de estas, se conocen problemas de resistencia producidos por mutaciones en
los residuos G48V, I50V, V82A, V82T, R8Q, R8K, D30N (28) y L10F L90M (29).
Se ha tratado de justificar de diferentes formas la prdida de afinidad de la enzima por los
inhibidores tras las mutaciones, aunque ninguna de ellas justifica de una manera
cuantitativa el total de la prdida de afinidad. Trabajos anteriores establecen que la prdida
de afinidad puede atribuirse a la modulacin de interacciones electrostticas y de Van der
19
Waals, en el centro activo de la enzima; por otra parte, las mutaciones alejadas del centro
activo o los efectos en la estructura son ms difciles de racionalizar (30, 31).
Para el caso concreto del DMP323, XV638 y SD146 se han publicado trabajos que
intentan racionalizar la prdida de interaccin para las mutaciones estudiadas en este
proyecto (V82F, I84V y V82F/I84V) (30, 31).

En el trabajo de Ala y col. (30) para DMP323, se pone de manifiesto que las mutaciones
no alteran el patrn de enlaces de hidrgeno entre la proteasa y el inhibidor, sin embargo si
alteran los contactos de Van der Waals distribuidos en tres regiones de la enzima:

1. Residuos 23 a 28, en la base del centro activo.

2. Residuos 47 a 50 en los flaps.

3. Residuos 29-32 y 81-84 en los laterales del centro activo.

Estas interacciones corresponden al 14% del total de interacciones de Van der Waals entre
enzima e inhibidor y una disminucin de estas interacciones conlleva una prdida de
afinidad. Esta prdida de contactos modula la prdida de afinidad pero la causa de la
principal, parece ser un efecto de perturbaciones a gran escala de la estructura de la enzima,
idea de trabajo que ser expuesta en la seccin de Objetivos.
En un trabajo posterior de Ala y col. (31) se trat el problema de la resistencia para
XV638 y SD146. Se estableci que se pierden las mismas interacciones de Van der Waals,
tras la mutacin en los tres inhibidores (DMP323, XV638 y SD146). Lo que hace a XV638
y SD146 ms resistentes son las interacciones adicionales de Van der Waals y enlace de
hidrgeno de los grupos P
2
y P
2
con los bolsillo S
2
y S
2
. De esta manera, se demostr que
los inhibidores con grupos P
2
ms largos y capaces de desarrollar ms contactos en S
2
, no
tienen grandes constantes K
i
, pero son ms potentes frente a las variedades mutantes.

3

2. Objetivos

21
La proteasa del VIH-1, en presencia de los inhibidores DMP323, XV638 y SD146, del
tipo ureas cclicas, produce mutaciones que disminuyen sensiblemente su afinidad por
los inhibidores. Las mutaciones de resistencia que provocan estos cambios en la
afinidad, y que hemos estudiado son: las mutaciones simples I84V y V82F para
DMP323 y XV638, y la doble mutacin I84V/V82F para DMP323, XV638 y SD146.
Estas mutaciones provocan severas prdidas de afinidad con los inhibidores respecto a
la afinidad con la enzima nativa.

Se han realizado estudios para DMP323 (30), XV638 y SD146 (31) en los cuales se
pone de manifiesto que al producirse las mutaciones, aunque hay una disminucin en el
nmero de contactos de Van der Waals entre la proteasa y el inhibidor, esta prdida de
contactos no es de suficiente magnitud para dar cuenta del total de la prdida de
afinidad, manteniendo intactas sus propiedades catalticas. Eso se traduce en que la
variacin de energa libre para la componente de Van der Waals entre enzima nativa y
mutantes, calculada para la interaccin enzima-inhibidor, no corresponda con la
prdida de afinidad por el inhibidor. Este hecho advirti de la existencia de efectos ms
complejos que tendran que producir esa prdida de afinidad, formando parte de un
fenmeno ms extenso y que se extiende a toda la estructura de la enzima; fenmeno
que trataremos de explicar en este proyecto. En general los enlaces de hidrgeno entre
proteasa e inhibidor no se modifican con las mutaciones.

El objetivo central de nuestro trabajo consiste en investigar dos hiptesis
fundamentales:

La prdida de afinidad, tiene que estar relacionada con efectos
desestabilizantes producidos por las mutaciones, que son transmitidos por toda
la estructura de la enzima a travs de las conectividades por enlaces de
hidrgeno. El inhibidor puede estar implicado tambin en esta transmisin
actuando de puente transmisor entre los dos monmeros de la enzima. Este
ltimo punto es fundamental ya que la enzima conserva su actividad cataltica
tras la mutacin, es decir, no pierde afinidad (o su disminucin es muy
pequea) por los substratos y si la pierde por el inhibidor. En resumen, el
complejamiento de inhibidores a las enzimas mutantes, produce distorsiones
22
en el empaquetamiento del complejo con respecto a la protena en estado libre
no enlazado, reduciendo la afinidad de sta por el inhibidor.

El estado de protonacin de los aspartatos del centro activo (Asp25 y Asp25),
podra cambiar de un inhibidor a otro o podra modificarse con diferentes
mutantes, lo cual tendra un efecto marcado en la energa de asociacin de los
complejos.

Mediante clculos de Mecnica Molecular intentaremos demostrar la presencia de
distorsiones en la estructura del complejo enzima/inhibidor, intentando explicar as las
causas de la prdida de afinidad. Las implicaciones de esta hiptesis, suponen un
cambio importante en el enfoque de la interaccin enzima inhibidor, ya que
normalmente se suele estudiar desde un punto de vista localizado en las interacciones
directas entre inhibidor y centro activo.
El esclarecimiento del mecanismo de la prdida de afinidad, dara lugar a una base
desde la que sera factible el diseo, en un futuro, de inhibidores capaces de hacer frente
al problema de las mutaciones de resistencia.

20

3. Mtodos

24
Parte Terica

De una manera general, se define la afinidad de los inhibidores por la enzima nativa y
mutante como,

donde E es la enzima nativa (N) o mutante (M), I es el inhibidor y G
1
es la variacin de
energa libre de enlace del inhibidor a la enzima. G(E
X
I) se expresa como,

G(E
X
I) =G(E
U
X
) +G(I
U
) +G
inter
+G
dist
(E
X
) +G
dist
(I) (1)

donde G(E
U
X
) son las energas de la enzima nativa o mutante, G(I
U
) es la energa para el
inhibidor, G
inter
es la energa de interaccin entre la enzima y el inhibidor, G
dist
(E
X
) es la
energa producida por la distorsin en la estructura de la enzima al enlazarse al inhibidor y
G
dist
(I) es la energa producida por la distorsin en la estructura del inhibidor al enlazarse
a la enzima. Para el equilibrio de inhibicin de la enzima E
X
por el inhibidor I, la variacin
de energa libre G
1
se expresa como,

G
1
=G(E
X
I) - G(I
U
) - G(E
U
X
) (2)

y sustituyendo (1) en (2),

G
1
=G
inter
+G
dist
(E
X
) +G
dist
(I)

En la mayora de los casos las energas libres de enlace correlacionan con G
inter
dado que
las energas de distorsin suelen ser mucho ms pequeas que las energas de interaccin,
por lo cual se suele expresar G
1
como la energa de interaccin entre la enzima y el
inhibidor.
G
1
=G
inter
E
X
+ I [E
X
I]
G
1
X =N, M
25
En el caso particular de la inhibicin de VIH-1 PR con los inhibidores del tipo de ureas
cclicas, Ala y col. han demostrado (30, 31) que la energa de interaccin, medida como la
variacin de energa de Van der Waals para la interaccin entre enzima y inhibidor, no es
suficiente para demostrar la prdida de afinidad entre enzima e inhibidor, al producirse las
mutaciones V82F, I84V y V82F/I84V en la estructura primaria de la enzima para DMP323,
y V82F y V82F/I84V para XV638 y SD146 . Dado que esta variacin en la energa de Van
der Waals, no corresponda con la magnitud de la prdida de afinidad, el anlisis energtico
en este proyecto fue extendido a la energa total del sistema, mediante ciclos
termodinmicos que relacionan la diferencia de energa libre entre enzima nativa y mutante,
con la variacin de energa libre de enlace entre inhibidor y enzima. Ciclos termodinmicos
de este tipo aplicados al estudio de mutaciones de resistencia en VIH-1 PR, han sido
realizados con anterioridad por Sussman y col. (20).

Ciclo 1

El ciclo 1, consta de la reaccin de complejacin de la enzima nativa E
N
con el inhibidor I
para dar el complejo E
N
I, respecto a la complejacin de la enzima mutante E
M
con el
mismo inhibidor I, para dar E
M
I. E
N
se conoce como estado de referencia.

Fig. 3.1 Ciclo Termodinmico 1.

Debido a la propiedad de clausura del ciclo, se cumple que: G
4
G
3
= G
2
G
1
.
Conociendo los valores G
3
y G
4
, podemos calcular G
2
G
1
, lo que nos da un valor de
energa libre del cambio de afinidad de la enzima mutante E
M
por el inhibidor, respecto a la
26
afinidad de la enzima nativa E
N
. G
3
y G
4
son la diferencia de energa libre entre la
enzima nativa y la mutante, y el complejo enzima/inhibidor nativo y mutante
respectivamente.

Ciclo 2

El ciclo 2 consiste en la reaccin de intercambio del inhibidor I
i
por el inhibidor I
j
, para la
enzima nativa E
N
y la enzima mutante E
M
.

Fig. 3.2 Ciclo Termodinmico 2

Debido a la propiedad de clausura del ciclo, se cumple que: G
4
G
3
=G
2
G
1,
y el
enlace al inhibidor I
i
es el estado de referencia.

Conociendo los valores G
3
y G
4
, podemos calcular G
2
G
1
, lo que nos da un valor
energtico del cambio de afinidad de la enzima por un inhibidor I
j
respecto a otro I
i
, tras la
mutacin. G
3
y G
4
son la diferencia de energa libre entre el complejo enzima/inhibidor
mutante y nativo para cada inhibidor. Es importante destacar que en el Ciclo 2, se
comparan las afinidades de un inhibidor I
j
respecto a otro I
i
, por lo que la G
2
- G
1
no
refleja un valor absoluto del cambio de afinidad tras las mutaciones, sino que refleja un
valor relativo de dicho cambio de afinidad para I
j
respecto a I
i
.

27
Obtencin de los valores de variacin de energa libre, a partir de las constantes
experimentales K
i

En el Ciclo 1, se puede relacionar directamente las constantes de inhibicin K
i
con la
variacin de energa libre de cada una de las reacciones que componen el ciclo, mediante la
ecuacin de Arrhenius. De esta manera,

G
1
=- RT ln (K
i
N
) y G
2
=- RT ln (K
i
M
),

G
2
- G
1
= RT ln (K
i
N
/ K
i
M
) (3)

y aplicando (3) a los valores de la Tabla 5.1 (pag. 45), podemos obtener los valores de la
G
2
- G
1
observados.

En el caso del Ciclo 2, debido a la distinta naturaleza del ciclo termodinmico, el valor de
la variacin de energa libre (G
2
- G
1
)
obs
fue calculado de diferente forma y toma valores
diferentes. La primera reaccin del ciclo 2, se puede expresar como la resta entre las dos
reacciones de inhibicin de la enzima nativa E
N
con los inhibidores I
i
y I
j
.

Utilizando la ecuacin de Arrhenius, podemos calcular la variacin de energa libre para
esta reaccin.
G
1
=- RT ln (
j
K
i
N
/
i
K
i
N
) (4)

E
N
I
i
E
N
I
i +
E
N
I
j
E
N
I
j +
E
N
I
i
+
I
j
E
N
I
j +
I
i
i
K
i
N
j
K
i
N
i
K
i
N
j
K
i
N
28
De manera anloga, la variacin de energa libre para la segunda reaccin del Ciclo 2, se
puede expresar como,

G
2
=- RT ln (
j
K
i
M
/
i
K
i
M
) (5)

Substrayendo (5) con (4) obtenemos (G
2
- G
1
)
obs
para el ciclo 2,

G
2
- G
1
=- RT ln (
j
K
i
M
/
i
K
i
M
) + RT ln (
j
K
i
N
/
i
K
i
N
)

G
2
- G
1
=- RT ln (
j
K
i
N i
K
i
M
/
i
K
i
N

j
K
i
M
) (6)

y aplicando (6) a los valores de la tabla 5.1 (pag. 45) podemos obtener los valores de la G
2

- G
1
observados.

Modelos de Solvatacin

Los clculos realizados, se pueden clasificar en dos tipos, clculos realizados en ausencia
de disolvente, y clculos realizados en presencia de disolvente, siendo estos ltimos los que
conllevan una mayor exactitud. Dentro de los clculos realizados en presencia de
disolvente, hay dos tipos:

I. Solvatacin Implcita, consiste en adoptar un modelo o algoritmo que modifique las
interacciones entre los tomos del sistema, de manera que imiten las interacciones
que habra en presencia del disolvente. El modelo utilizado fue el de Born
Generalizado (32), en el cual la energa libre de solvatacin G
sol
se define como,

G
sol
= G
cav
+G
VdW
+G
pol

donde G
cav
es el trmino de cavidad de solvatacin , G
VdW
es el trmino de solvatacin
de Van der Waals y G
pol
es el trmino de polarizacin electrosttica de solvatacin.
G
cav
y G
VdW
son calculadas conjuntamente por el mtodo de Born Generalizado,
29

G
cav
+G
VdW
=
N
k=1

k
SA
k

donde SA
k
es la superficie de todos los tomos de tipo k accesible al disolvente y
k
es
un parmetro emprico de solvatacin atmica. El clculo de G
pol
est derivado de la
expresin original de solvatacin de Born (33).

q
i
q
j

G
pol
=- 166,0 (1 1/)
n
i=1

n
j=1

(r
ij
2
+
ij
2
e
Dij
)
0,5

donde es la constante dielctrica del medio, q
i
y q
j
son las cargas de los tomos i y j,
r
ij
es la distancia entre los tomos i y j,
ij
es el radio de Born y D
ij
=r
ij
2
/(2
ij
)
2
para
cada pareja de tomos i y j.

II. Solvatacin Explcita, el uso de disolvente explcito consiste en rodear al sistema,
en este caso el complejo VIH-1 PR/inhibidor, de varias capas de molculas de agua
de un determinado grosor. Las molculas de agua interaccionan con la enzima,
reproduciendo las condiciones del disolvente.

El modelo de Born Generalizado utilizado para la solvatacin implcita y la solvatacin
explcita tienen ventajas y desventajas uno respecto del otro. El uso de molculas de agua,
incrementa considerablemente el tiempo de computacin, ya que aadimos al sistema una
gran cantidad de tomos dependiendo del grosor de la capa. En el caso de VIH-1 PR, una
capa de 12 aade al sistema unas 3000 molculas de agua que suponen 9000 nuevos
tomos, triplicando el nmero original de tomos en el sistema (el complejo
enzima/inhibidor tiene alrededor de 3000 tomos). El mtodo de Born Generalizado, por el
contrario, supone un ahorro considerable de tiempo de computacin. La desventaja del
mtodo de Born Generalizado es que no reproduce efectos del disolvente, como la friccin
con la superficie de la enzima y los enlaces de hidrgeno que se crean entre las molculas
del disolvente y tomos superficiales de la enzima. En conclusin, el uso de un disolvente
30
explcito confiere a los resultados una mayor exactitud, a costa de un mayor tiempo de
computacin, mientras que el modelo de Born Generalizado es menos exacto pero ms
rpido.

Naturaleza de los clculos realizados

Los clculos realizados fueron del tipo de Mecnica Molecular, concretamente
minimizaciones de energa y dinmica molecular.

Minimizacin de energa

La minimizacin de energa consiste en buscar un mnimo para la funcin de
energa potencial de la protena. Dado el vector de la posicin espacial de los tomos
de la protena x=(x
1
, x
2
, x
3
, ..., x
n
) y la funcin potencial V=V(x), la tarea es buscar la
nueva posicin x* que satisfaga V(x*)=min(V(x)). Es importante mencionar que este
mtodo no encuentra el mnimo de energa absoluto, sino que uno de los mnimos o
pozos de energa potencial que se puedan encontrar ms cerca. La forma de actuar de
la minimizacin se puede resumir en el movimiento desarrollado en pasos (o
desplazamiento) a travs de la superficie potencial en una determinada direccin que
disminuye la energa. Esto se puede expresar como,

r
n+1
=r
n
+
n

donde r
n
es el vector posicin al paso n y
n
es el desplazamiento en el paso n. Los
diferentes mtodos lo que hacen es calcular el desplazamiento
n
. Los algoritmos de
minimizacin aplicados en nuestros clculos fueron: (34, 35)

Steepest Descents (SD), es un algoritmo en el cual el clculo de
n
est
basado en la primera derivada de la funcin de energa potencial.

31
ABNR, acrnimo de Adopted Basis Newton-Raphson, en este algoritmo el
clculo de
n
est basado en la segunda derivada de la funcin de energa
potencial.

Dinmica molecular

En este mtodo bsicamente se integra la ecuacin de Newton para el movimiento,
de todos los tomos del sistema a lo largo de una trayectoria descrita en un tiempo
prefijado. La ecuacin que rige este mtodo se expresa como,

d
2
r
i
m
i
=-
i
[ U(r
1
, r
2,
. . ., r
N
)] i =1, N
dt
2

donde m
i
y r
i
son la masa y posicin de la partcula i, U(r
1
, r
2,
. . ., r
N
) es la superficie
de energa potencial que depende de las posiciones de las N partculas del sistema y t
es el tiempo. La dinmica molecular consta de varias etapas diferentes. Dichas etapas
son minimizacin, calentamiento, equilibracin y dinmica. Las dinmicas
moleculares calculadas en este proyecto fueron llevadas a cabo con las condiciones
NVT (N constante, volumen constante y temperatura constante). (34, 35)

Campo de fuerzas

Para poder llevar a cabo clculos mediante los algoritmos antes mencionados, es
imprescindible disponer en primer lugar de las coordenadas cartesianas, y en segundo
lugar de los potenciales atmicos. Las coordenadas cartesianas representan las
posiciones en el espacio real de cada uno de los tomos del sistema, y son dadas en la
forma del vector (x, y, z). En este proyecto, dichas coordenadas fueron obtenidas a
partir de las estructuras cristalogrficas depositadas en el Protein Data Bank (PDB)
(36), disponibles para uso pblico a travs de Internet. En segundo lugar, son precisas
los llamados potenciales atmicos, las cuales consisten en un conjunto de descriptores
que establecen la estructura molecular en trminos de distancias de enlace, ngulos de
32
enlace, hibridacin, etc. de cada tomo, y son imprescindibles para la asignacin de
parmetros de la energa potencial y as poder calcular energas o aplicar cualquiera
de los algoritmos mencionados con anterioridad. Hay diferentes campos de fuerzas
que utilizan diferentes tipos de potenciales, y en todos los clculos realizados en este
proyecto fue utilizado el campo de fuerzas de CHARMm (37), en el cual hay tipos
atmicos para cada uno de los tomos de los complejos enzima/inhibidor analizados,
y que describen todos los parmetros necesarios para realizar los clculos requeridos.

34
Obtencin y tratamiento de las estructuras cristalogrficas

Las estructuras cristalogrficas fueron obtenidas del Protein Data Bank (36). Las
estructuras utilizadas fueron complejos de VIH-1 Pr/inhibidor con los inhibidores que se
indican a continuacin:

DMP323: 1QBS
1
, enzima nativa, 1MET mutante V82F, 1MES mutante I84V, 1MEU
doble mutante V82F/I84V.
XV638: 1QBR, enzima nativa, 1BV7 mutante V82F, 1BV9 mutante I84V, 1BWA
doble mutante V82F/I84V.
SD146: 1QBT enzima nativa, 1BWB doble mutante V82F/I84V.

La estructura cristalogrfica de la enzima nativa libre (sin estar enlazada a inhibidor
alguno), fue encontrada en el PDB en forma monomrica con el nombre 3HVP. Dado que
ambos monmeros son idnticos en el estado de enzima libre y que estn relacionados por
una operacin de simetra, pudo obtenerse la estructura de la enzima completa aplicando
dicha operacin.

El paquete grfico utilizado para el procesamiento de las estructuras cristalogrficas fue
Insight II (38).
1 - El formato pdb en el que se obtienen las estructuras consiste en la posicin espacial
para todos los tomos de la enzima excepto los tomos de hidrgeno, por lo que stos
tuvieron que ser aadidos con el mdulo Builder de InsightII.
2 - En cada estructura de complejos enzima/inhibidor, los tomos de hidrgeno situados
en los hidroxilos del diol en los inhibidores, fueron orientados hacia los aspartatos de la
dada cataltica (Asp A25 y Asp B25, vase Introduccin, pag. 8), que se consideraron
ionizados ambos.
3 - Las estructuras 1QBT y 1BWB incluan molculas de agua que fueron eliminadas.

1
Nombres que tienen las estructuras en el Protein Data Bank.
35
4 - Se utiliz para todos los clculos de Mecnica Molecular, el campo de fuerzas de
CHARMm (37), por lo que a cada estructura les fueron asignados los potenciales atmicos
de dicho campo de fuerzas.
5 Los potenciales inicialmente asignados por CHARMm, tuvieron que ser corregidos
en la parte de la estructura de naturaleza no peptdica, es decir, el inhibidor y ms
concretamente en los ciclos y heterociclos (XV638 y SD146) aromticos de los grupos
P
1
/P
1
, P
2
/P
2
(vase . Introduccin, pag. 17).
6 Una vez realizadas las correcciones en los potenciales, fueron calculadas las cargas
parciales excepto para las estructuras de los complejos con el inhibidor SD146, en las
cuales tuvieron que ser asignadas manualmente ya que el grupo benzoimidazol en su forma
catinica tiene un pK
a
=6. En el caso del XV638 el catin tioazolio tiene un pK
a
=2,5 por
lo que no debe estar protonado (20b). La carga total fue igual a 4 en los complejos de
DMP323 y XV638, y 6 para los complejos de SD146.

Clculos basados en el Ciclo 1

Para los clculos basados en el Ciclo 1, se necesita la estructura de las enzimas libres
conteniendo las mutaciones V82F e I84V. Estas estructuras no han sido determinadas
experimentalmente, por lo que tuvimos que modelarlas a partir de la estructura de la enzima
nativa obtenida a partir del monmero 3HVP. El paso de Isoleucina a Alanina (I84V) se
hizo eliminando un tomo de carbono de la cadena lateral, utilizando el mdulo Builder en
InsightII. El resto de tomos conservan la conformacin inicial de la estructura.

Fig 4.1 Cambio producido en la cadena lateral del residuo 84 al producirse la mutacin.

El paso de Valina a Fenilalanina (V82F) fue mucho ms problemtico, ya que las cadenas
laterales de ambos aminocidos son completamente diferentes y supone introducir un grupo
36
fenilo en la estructura, introduciendo un nuevo ngulo de torsin. Tampoco conocemos cual
sera su empaquetamiento idneo en el seno de la estructura de la enzima. El paso de
Valina a Fenilanalina se llevo a cabo con el mdulo Biopolymer de InsightII y fue
necesario determinar la conformacin de la cadena lateral del residuo F82.

Hay diferentes mtodos y algoritmos para determinar la conformacin adecuada (39), e
incluso se ha publicado una base de datos de rotmeros para la prediccin de las
conformaciones de las cadenas laterales en protenas (40). En nuestro caso, la
determinacin de la conformacin de la cadena lateral introducida manualmente fue
realizada de forma diferente.

Fig 4.2 Cambio producido en la estructura de la cadena lateral del residuo 82 al producirse la mutacin.

La determinacin de la conformacin de la cadena lateral del residuo 82 se llev a cabo
minimizando la estructura con diferentes ngulos. Los ngulos
1
y
2
(Fig. 4.2) (35)
fueron girados de 10 en 10 obteniendo 396 estructuras por cada estructura de enzima
mutante V82F y doble mutante V82F/I84V. El mtodo elegido consisti, en primer lugar,
en una minimizacin de 50 pasos Steepest Descents (SD) para cada una de las 396
estructuras del estado de referencia con la mutacin V82F, siendo elegidas las 10 ms
estables. En segundo lugar, las diez estructuras fueron minimizadas 1000 pasos (con
diferentes protocolos de minimizacin vase Tabla 4.1), eligindose la de menor energa.

Para el Ciclo 1, las dos estructuras elegidas en la determinacin de la conformacin para
V82F y V82F/I84V, el estado de referencia nativo e I84V, y todas las estructuras de
complejos VIH-1 PR/DMP323 fueron minimizados 1000 pasos por diferentes protocolos
37
(vase tabla 4.1). No se hicieron clculos para XV638 y SD146. La Tabla 4.1 describe los
protocolos de minimizacin aplicados en los clculos del Ciclo 1.

Tabla 4.1 Protocolos de minimizacin utilizados en la obtencin de energas para el
Ciclo 1.
Algoritmo N de pasos Cte. Dielctrica
Steepest Descents 1000 1
ABNR 1000 1
Ciclo 1
ABNR 1000 4

Clculos basados en el Ciclo 2

El Ciclo 2 present una ventaja fundamental respecto al Ciclo 1 y es que disponemos de
las estructuras cristalogrficas necesarias y no fue necesario modelizar ninguna, lo que se
traduce en una mayor exactitud en nuestros clculos. Para el ciclo 2, fueron realizados
clculos en ausencia de disolvente, con el modelo de Born Generalizado y con disolvente
explcito. DMP323 fue escogido como estado de referencia en todos los casos (E
N
I
i
). La
Tabla 4.2 describe los diferentes protocolos de minimizacin aplicados en los clculos del
Ciclo 2, en ausencia de disolvente y con el modelo de disolvente implcito de Born
Generalizado.

Tabla 4.2 Protocolos de minimizacin utilizados en la obtencin de energas para el
Ciclo 2 a excepcin del uso de disolvente explcito.
Algoritmo N de pasos Cutoff
ABNR 100 15 Ausencia de disolvente
ABNR
a
100 15
ABNR 100 15
ABNR
a
100 15
ABNR 1000 15
ABNR 100 999,9
Born Generalizado
ABNR 1000 999,9
a
Fue realizada con anterioridad una minimizacin de 1000 pasos Steepest Descents, solo a los tomos de
hidrgeno de la estructura.
38
En el caso de los clculos realizados con disolvente implcito, el modelo elegido fue el
modelo de Born Generalizado. Algunos de los clculos se llevaron a cabo variando una
opcin en CHARMm, llamada cutoff. Cutoff limita la distancia a la que puede haber
interacciones electrostticas entre tomos que no estn enlazados entre s. Dado que las
interacciones electrostticas son de muy largo alcance, este comando lmite tiene como fin
ahorrar tiempo de computacin en clculos no tan importantes como las interacciones entre
tomos muy lejanos (34). Por defecto est puesto a 15, y en algunos clculos lo variamos a
999,9 para que las distancias a la que dos tomos no enlazados pudiesen interaccionar
fuese mayor.

Clculos en presencia de una multicapa de disolvente.

A las estructuras nativas de los complejos VIH-1 PR, con DMP323, XV638 y SD146 le
fueron aadidas 3173 molculas de agua rodeando la estructura con un bao de agua 12.5
amstrongs de espesor. Se realizaron dinmicas moleculares de 60.000 pasos aplicando un
constreimiento a los tomos del complejo enzima/inhibidor, para conseguir as que las
molculas de agua se distribuyan sobre la superficie de la enzima. Al aplicar un
constreimiento al complejo enzima/inhibidor, lo que se consigue es que ste se fije y solo
se realice la dinmica molecular a las molculas de disolvente. La dinmica molecular fue
evaluada a 20.000, 40.000 y 60.000 pasos. Este bao de agua equilibrado por la dinmica
molecular en la superficie de la enzima nativa, fue aadida a las estructuras de los
complejos enzima/inhibidor mutantes.
Las multicapas de disolvente fueron minimizadas 5000 pasos ABNR manteniendo el
constreimiento al complejo enzima/inhibidor, para todas las estructuras. Posteriormente se
minimiz todo el sistema (complejo enzima/inhibidor ms la multicapa de agua) 500 pasos
ABNR. La energa utilizada para el ciclo se compuso de la energa de el complejo
enzima/inhibidor, sumada a la energa de interaccin de el complejo enzima/inhibidor con
las molculas de agua. Posteriormente a las molculas obtenidas de la dinmica a 40.000
pasos les fue medida la energa de interaccin residuo por residuo con el disolvente y
calculada la variacin energtica de las estructuras mutantes respecto a la nativa.
39

Fig. 4.3 Vista del complejo VIH-1 PR /DMP323 en presencia del disolvente explcito compuesto por una
multicapa de molculas de agua.

Clculos preliminares para la determinacin del estado de protonacin de la dada
cataltica

El estado de protonacin de la dada cataltica tiene una importancia fundamental en la
energtica del enlace VIH-1/inhibidor. Es por esto que decidimos determinarlo para obtener
unos mejores resultados. En lneas generales, hay tres estados de protonacin posibles para
la dada cataltica (Asp A25 y Asp B25, vase Introduccin pag. 8). Todos los clculos
anteriores fueron realizados en el estado desprotonado. Los estudios mediante RMN de
1
H
y
13
C, y cristalografa de Rayos X, predijeron que el estado de protonacin de VIH-1
cuando est enlazado a DMP323 es el doblemente protonado (41). Se han calculado estados
de protonacin de diferentes formas con anterioridad; Harte y Beveridge establecieron que
el estado de protonacin para HIV-1 PR enlazada a U85548 y MVT-101 son diprotonado y
desprotonado respectivamente. Esto se llev a cabo realizando dinmicas moleculares de
40
complejos con diferente estados de protonacin, adoptando la que difera menos de la
estructura cristalogrfica original al ser superpuestas (42). Por otra parte Piana y col.
llevaron a cabo dinmica molecular ab initio
2
y estudios de RMN de
13
C para establecer
que el complejo VIH-1/Pepstatina A esta diprotonado (43). Esto implica que diferentes
inhibidores provocan diferentes estados de protonacin, por lo que es importante que
determinemos cual es el estado de protonacin para los complejos con los inhibidores
DMP323, XV638 y SD146
Para cada estructura fue creado un estado monoprotonado para el cual fueron creados
cuatro protmeros diferentes. Con protn en A25 y dos posibles orientaciones los estados
A1 y B1. Con protn en B25 y dos posible orientaciones C1 y D1 (vase Fig. 4.4). Para el
estado doblemente protonado fueron creados dos protmeros diferentes A2 y B2, con dos
posibles orientaciones (vase figura 4.5). Las estructuras fueron modeladas con el mdulo
Biopolymer en InsightII.
Los clculos realizados consistieron en primer lugar, en la determinacin del estado de
protonacin mediante el clculo de la energa de interaccin entre los residuos asprticos
A25 y B25 con el resto de los residuos de la enzima y la capa de agua, para cada uno de los
protmeros que definen un estado de protonacin. Todos estos diferentes estados de
protonacin y protmeros fueron modelados para todas las estructuras de complejos
enzima/inhibidor con capa de agua a partir de las estructuras resultantes en los clculos del
anterior apartado (presencia de disolvente explcito). Se escogieron estas estructuras a
40.000 pasos de dinmica molecular para el agua porque obtuvo los mejores valores de
estabilizacin.
Dado que el estado doblemente protonado para DMP323 est avalado por estudios de
RMN en las publicaciones de Yamazaki y col. (41) y clculos computacionales de Trylska
y col. (44), realizamos los clculos de minimizacin para su aplicacin al ciclo 2 con el
estado doblemente protonado. Para ello, a las estructuras de los complejos enzima/inhibidor
con los diferentes protmeros del estado doblemente protonado, se les aplic un mtodo
anlogo a los clculos en presencia de disolvente explcito del apartado anterior.

2
Dinmica Molecular Ab Initio, tipo de dinmica en la que las fuerzas interatmicas no estan derivadas de
potenciales de un campo de fuerzas, sino que son evaluadas mediante clculos mecano-cunticos, a medida
que se lleva a cabo la dinmica molecular. Esto produce un nivel mayor de exactitud, aunque se aumenta el
tiempo de computacin (45).
41

Fig 4.4 Protmeros utilizados para el estado monoprotonado.

Fig 4.5 Protmeros utilizados para el estado doblemente protonado.

Estudio preliminar de las perturbaciones a gran escala

Los trabajos anteriores sobre mutaciones de resistencia en VIH-1 con DMP323, XV638 y
SD146, no consiguieron encontrar la razn de la prdida de afinidad de las mutaciones. La
prdida de contactos de Van der Waals no es suficiente y se puso de relieve la existencia de
42
efectos a una mayor escala. Est probada, mediante dinmica molecular, la existencia de
dominios en la estructura de la enzima, que tienen un movimiento correlacionado, y esto
puede jugar un papel importante en la transmisin de efectos desestabilizadores desde las
mutaciones, a toda la estructura de la enzima. Estas correlaciones entre diferentes dominios
fueron descritas entre la regin de los flaps incluyendo el centro activo, y zonas ms
remotas de la enzima (45, 46, 48). La relacin entre estos dominios y las mutaciones de
resistencia fue analizada mediante dinmica molecular por Reiling y col. para inhibidores
peptidomimticos (47). La idea de trabajo es que los inhibidores al complejarse a la enzima
mutante, producen distorsiones en el empaquetamiento del complejo que se transmiten a
toda la estructura. En esta transmisin los enlaces de hidrgeno deben tener un papel
fundamental. Incluso el inhibidor, al desarrollar enlaces de hidrgeno con la enzima, puede
actuar como transmisor entre los dos monmeros de la enzima. Para ello los mapas
dinmicos de inter-correlacin (DCCM)
3
de Harte y col. (46) nos sirvieron para conocer si
entre los residuos desestabilizados energticamente en los complejos enzima/inhibidor
mutantes, haba alguna correlacin en el movimiento que posibilitan la transmisin de
dicha desestabilizacin.

Las estructuras utilizadas para este fin fueron todos los complejos enzima/inhibidor de
DMP323 y XV638. El estudio se dividi en varias partes, en un primer lugar, se calcul la
diferencia de la energa de interaccin residuo por residuo e inhibidor con el resto del
complejo, para las mutantes, con la enzima nativa. Las estructuras utilizadas de complejos
enzima/inhibidor fueron minimizadas 100 pasos ABNR y se realiz el clculo de la energa
de interaccin de cada residuo, con el resto del complejo enzima/inhibidor. A continuacin,
les fue calculado el trmino de solvatacin por residuo con el modelo de Born
Generalizado. Posteriormente se llev a cabo la determinacin de los enlaces de hidrgeno
en los residuos y el inhibidor del complejo enzima/inhibidor, utilizando para ello el
interface grfico de InsightII. La informacin obtenida fue utilizada en diagramas de la
estructura secundaria de los complejos enzima/inhibidor representando los enlaces de

3
Dynamical Cross-Correlation Maps (DCCM), representacin de la correlacin en el movimiento entre
residuos a lo largo de una dinmica molecular. Se representa el coeficiente de inter-correlacin
C
ij
=<r
i
r
j
>/(<r
i
>
2
<r
j
>
2
)
1/2
para dos residuos, donde r
i
es el desplazamiento del centroide del residuo i
desde su posicin media. (46, 34)
43
hidrgeno entre residuos; dichos mapas son conocidos como mapas topolgicos (49).
Finalmente, fueron analizados los residuos desestabilizados en el clculo de interacciones,
con los mapas dinmicos de inter-correlacin publicados en los trabajo de Harte y col. (46,
48), y los mapas topolgicos previamente mencionados.

45
Clculo de las variaciones de energa libre observadas, a partir de las constantes
experimentales K
i

Las constantes experimentales de inhibicin Ki, para DMP323, XV638 y SD146
obtenidas por Ala y col. (31), fueron utilizadas para calcular los valores de (G
2
G
1
)
obs

en los dos ciclos termodinmicos con la finalidad de ser comparados con los valores
obtenidos en nuestros clculos. El procedimiento utilizado para el clculo de las variaciones
de energa libre observadas en los dos ciclos, est expuesto en la seccin de Mtodos.

Tabla 5.1 Constantes experimentales de inhibicin para los complejos VIH-1 PR con
las ureas cclicas DMP323, XV638 y SD146.
K
i
(nM)
a

DMP323 XV638 SD146
Nativa 0,8 0,1 0,1
K
i
mutante/K
i
nativa
V82F 0,5 0,5 0,5
I84V 20 1.1 2.6
V82F / I84V 1000 25 38

a
Determinadas por Ala y col. (31).

Ciclo 1
Aplicando los valores de la tabla 5.1 a la ecuacin (3) de la seccin de Mtodos,
obtuvimos los valores de variacin de energa libre observados para el ciclo 1.

Tabla 5.2 Valores de G
2
- G
1
observados en el Ciclo 1, calculados a partir de las
constantes experimentales presentes en la Tabla 5.1.
(G
2
- G
1
)
obs
a
DMP323 XV638 SD146
V82F -0,41 -0,41 -0,41
I84V 1,79 0,057 0,57
V82F/I84V 4,14 0,55 0,80

a
Kcal/mol

Como se puede ver en la Tabla 5.2, las enzimas mutantes V82F tienen una afinidad
ligeramente mayor que las nativas, por el inhibidor, dado el carcter favorable del ciclo
46
((G
2
- G
1
)
obs
=-0,41). En la mutacin I84V, todos los valores son positivos, reflejando la
prdida de afinidad de la enzima por el inhibidor en esta mutacin, siendo el ms
desfavorecido DMP323 seguido de SD146 y XV638. En el caso de la doble mutacin
V82F/I84V, los valores son ms positivos que en la mutacin simple I84V, lo que
demuestra la mayor disminucin en la afinidad, respecto a I84V. En el caso de la doble
mutacin, DMP323 es el ms desfavorecido, seguido de SD146 y XV638. El efecto de las
mutaciones V82F y I84V no es aditivo para la doble mutacin V82F/I84V.

Ciclo 2
Aplicando los valores de la tabla 5.1 a la ecuacin (6) de la seccin de Mtodos,
obtuvimos los valores de variacin de energa libre observados para el ciclo 2.

Tabla 5.3 Valores de G
2
- G
1
observados en el Ciclo 2, calculados a partir de las
constantes experimentales presentes en la Tabla 5.1.
(G
2
- G
1
)
obs
a
XV638
b
SD146
V82F 0 0
I84V -1,74 -1,22
V82F/I84V -2,21 -1,96
a
Kcal/mol.
b
El complejo VIH-1 PR/DMP323 es el estado de referencia E
N
I
i
que intercambia el inhibidor por
Ij que es XV638 y SD146.

Como se puede ver en la Tabla 5.3, en la mutacin V82F, el cambio en la afinidad es
equivalente en todos los inhibidores, por lo que (G
2
- G
1
)
obs
es cero para cada uno de
ellos. En el caso de la mutacin I84V, el intercambio es favorable con los dos inhibidores,
siendo XV638 el ms favorable. En la doble mutacin V82F/I84V, el intercambio de
inhibidores es ms favorable que en la mutacin simple I84V, siendo XV638 el ms
favorable seguido de SD146. La doble mutacin V82F/I84V afecta mucho menos a XV638
y SD146 que a DMP323.

47
Clculos basados en los ciclos termodinmicos

En todos los clculos energticos efectuados, es muy difcil reproducir las variaciones de
energa libre observadas (G
2
G
1
)
obs
, calculadas a partir de las constantes de inhibicin
experimentales K
i
(Tablas 5.2 y 5.3), ya que dichas variaciones son del orden de 1 a 4
Kcal/mol en los dos ciclos termodinmicos utilizados. Bsicamente, fue buscada una
relacin semicuantitativa en dichas variaciones de energa libre, es decir, un ndice del
efecto de las mutaciones sobre los inhibidores

Ciclo 1

En los resultados obtenidos, para DMP323 no hubo correlacin alguna para la energa
total, ya que se obtuvieron valores muy diferentes a los (G
2
G
1
)
obs
(Tabla 5.2). En las
mutaciones I84V y V82F/I84V todos los resultados para la energa total fueron de signo
negativo, y para V82F, de los cuatro protocolos de minimizacin utilizados, en tres de ellos
fueron obtenidos valores positivos. Segn los valores energticos calculados a partir de las
constantes experimentales K
i
, para V82F deberamos haber obtenido valores ligeramente
negativos dado que esta mutacin estabiliza ligeramente al complejo. Por el contrario I84V
e V82F/I84V son desestabilizantes, por lo que los valores deberan ser todos positivos,
teniendo la doble mutacin el valor ms positivo. El aumento de constante dielctrica de 1 a
4 produjo una ligera mejora en los resultados para la energa total, sin embargo empeor
los resultados en la componente de Van der Waals de la energa. Dicha componente de Van
der Waals fue la que obtuvo un mayor nivel de correlacin en el Ciclo 1.

Tabla 5.4 Resultados para los clculos del Ciclo 1 aplicado a DMP323 siguiendo
diferentes protocolos de minimizacin.
G
2
G
1

a
Energa total Componente de Van der Waals
Algoritmo SD =1 SD =4 ABNR =1 ABNR =4 SD =1 SD =4 ABNR =1 ABNR =4
V82F
-28.94 27.66 8.81 8.95 13.35 4.98 3.42 11.60
I84V
-156.32 -41.05 -98.38 -58.60 0.77 -11.91 7.79 -22.65
V82F/I84V
-167.81 -23.19 -25.84 -4.84 4.86 -1.96 33.24 -8.10
a
Kcal/mol.

48
Como se puede ver en la tabla 5.4, los valores de la componente de Van der Waals para
I84V y V82F/I84V, de ser positivos a =1, pasan a ser negativos a =4. En cualquier
caso, con =1, a pesar de obtener valores positivos para las mutaciones que contienen
I84V, el valor para V82F es positivo, lo cual no se corresponde con los (G
2
G
1
)
obs
. Los
resultados que presentaron una mejor correlacin con la (G
2
G
1
)
obs
se obtuvieron en la
componente de Van der Waals de la energa libre, siguiendo el protocolo ABNR a =1.

Dado que las estructuras utilizadas para las enzimas mutantes libres tuvieron que ser
modelizadas, y tuvo que efectuarse la determinacin de la conformacin de las cadenas
laterales (vase Trabajo Realizado, pag. 35), no fueron realizados clculos para el resto de
inhibidores decidiendo desechar el Ciclo 1 en favor del Ciclo 2, ya que dicha bsqueda de
ngulos podra ser una fuente de error importante en los clculos realizados. En el Ciclo 1,
existe la incgnita de si el complejo mutante modelado, se acerca a la realidad y es una
prediccin correcta, mientras que en el caso del Ciclo 2, todas las estructuras utilizadas
fueron estructuras cristalogrficas originales sin necesidad de modelizar ninguna, lo cual
implica una mayor exactitud .

Ciclo 2

En el ciclo 2, los resultados

mejoraron respecto al ciclo anterior, a pesar de esto, no se
consigui una correlacin estable de la energa total. Segn los valores de (G
2
G
1
)
obs

calculados a partir de las constantes experimentales de inhibicin (K
i
) (Tabla 5.3), en la
mutacin V82F, (G
2
G
1
)
obs
debe ser igual a cero, ya que las afinidades relativas son las
mismas en todos los inhibidores para esta mutacin. En la mutacin simple I84V y doble
V82F/I84V, los valores deben ser negativos para XV638 y SD146 cuando DMP323 es el
estado de referencia, siendo los valores ms negativos con XV638 que con SD146 y con la
doble mutacin V82F/I84V que con la mutacin simple I84V.

49
Tabla 5.5 Resultados para los clculos del Ciclo 2 para DMP323 y XV638 en ausencia
de disolvente, siendo DMP323 estado de referencia.
G
2
G
1
a
Protocolo SD 100 pasos ABNR 100 pasos ABNR
b
SD 100 pasos ABNR 100 pasos ABNR
b

V82F -47.87 -112.02 86.13 -155.42 -6.38 -3.36
I84V 1443.13 42.55 90.12 1353.24 -17.52 -38.75
V82F/I84V 169.72 1.97 -9.84 105.74 4.71 -13.30
a
Kcal/mol
b
mininimizacin previa de 1000 pasos SD a los tomos de hidrgeno. La constante dielctrica se
mantuvo a 1 en todos los clculos

Como se puede ver en la Tabla 5.5, en los clculos realizados en ausencia de disolvente,
para DMP323 (I
i
) y XV638 (I
j
) no se obtuvo correlacin con la energa total, obtuvimos
valores positivos en I84V, en V82F/I84V en dos de los tres protocolos de minimizacin y
en ningn caso un valor prximo a cero para V82F. Los mejores resultados se obtuvieron
en la componente de Van der Waals utilizando el protocolo consistente en 1000 pasos
Steepest Descents solo para tomos de hidrgeno seguido de 100 pasos ABNR toda la
molcula, ya que 3.36 en V82F es un valor prximo a cero, y para I84V y V82F/I84V se
obtuvieron valores negativos. La nica desviacin es que el valor ms estable fue para
I84V, lo que no est de acuerdo con los valores (G
2
G
1
)
obs
.

Debido a la falta de correlacin en los clculos realizados en ausencia de disolvente,
realizamos los siguientes clculos incluyendo un modelo de disolvente, eligiendo el modelo
implcito de Born Generalizado ya que conlleva un tiempo de computacin mucho menor
que el uso de un modelo de disolvente explcito.

Tabla 5.6 Resultados para los clculos del Ciclo 2 para DMP323 y XV638 incluyendo
el modelo de Born Generalizado, algoritmo de minimizacin ABNR y DMP323 como
estado de referencia.
G
2
G
1
a
N de Pasos 100 100
b
100
c
1000 1000
c, d
100 100
b
100
c
1000 1000
c, d

V82F 87.93 59.49 17.22 19.38

-10.15 13.50 -11.97 33.04
I84V 108.70 60.95 51.25 90.90 -13.23 -9.17 -26.18 43.13
V82F/I84V 50.68 71.05 60.60 13.17 27.61 -2.77 3.31 0.33 24.79 25.70
a
Kcal/mol
b
mininimizacin previa de 1000 pasos SD a los tomos de hidrgeno
c
lmite para interacciones
electrostticas (cutoff) 999,0 d no se incluyeron V82F ni I84V en estos clculos.
50
Tabla 5.7 Resultados para los clculos del Ciclo 2 para DMP323 y SD146 incluyendo
el modelo de Born Generalizado, clculos con el algoritmo de minimizacin ABNR
100 pasos y DMP323 estado de referencia.
G
2
G
1
a
V82F/I84V 59.82 28.50
a
Kcal/mol

Los resultados utilizando el modelo de Born Generalizado, no mejoraron cualitativamente
respecto a los anteriores. En todos los casos (XV638 Tabla 5.6, SD146 Tabla 5.7) se
obtuvieron valores positivos para G
2
G
1
en la energa total y para todas las mutaciones,
lo cual no tiene relacin con los (G
2
G
1
)
obs
calculados a partir de las constantes
experimentales K
i
(Tabla 5.3). En la componente de la energa de Van der Waals, se
obtuvieron mejores resultados siendo la mejor correlacin a los 100 pasos ABNR.

El aumento de la distancia lmite para interacciones entre tomos no enlazados (cutoff,
vase pag. 38) no produjo una mejora importante en los resultados, por lo que se descart
que tuviese algn efecto provechoso en nuestros resultados. Los problemas sugeran ser de
una ndole diferente, por lo que decidimos utilizar un mtodo de disolvente explcito que,
pese a conllevar un tiempo de computacin ms elevado, reproduce de una manera ms fiel
los efectos del disolvente.

El uso de disolvente explcito, conllev una mejora importante en nuestros resultados,
aunque no suficiente para conseguir la correlacin buscada en la energa total.

Tabla 5.8 Resultados para los clculos del Ciclo 2 para DMP323 y XV638 en presencia
de disolvente explcito, siendo DMP323 estado de referencia.
G
2
G
1
a
Pasos de DM
b
20.000 40.000 60.000 20.000 40.000 60.000
V82F 154.93 -35.50 -56.75 13.33 -6.06 -32.54
I84V 45.19 191.42 112.47 -9.94 -16.27 -8.79
V82F/I84V 91.32 -110.69 124.89 -42.51 -20.43 -18.17
a
Kcal/mol y constante dielctrica del medio 1 en todos los casos.
b
Dinmica Molecula

51
Tabla 5.9 Resultados para los clculos del Ciclo 2 para DMP323 y SD146 en presencia
de disolvente explcito, siendo DMP323 estado de referencia.
G
2
G
1
a
Pasos de DM
b
20.000 40.000 20.000 40.000
V82F/I84V -63.67 -77.46 -7.74 -12.51
a
b
Dinmica Molecular.

La dinmica molecular realizada a las molculas de agua se llev hasta 60.000 pasos,
siendo evaluada a 20.000, 40.000 y 60.000. Con XV638 y a 20.000 pasos, en el apartado
de energa total, no se obtuvo correlacin alguna (Tabla 5.8); los valores para I84V son
muy positivos, siendo los peores resultados a 20.000 pasos ya que se obtienen valores
positivos en todas las mutaciones. En el caso de SD146, solo se realizaron dinmicas
moleculares hasta 40.000 pasos y se obtuvieron valores negativos en el nico caso
estudiado (V82F/I84V).
Sin embargo, en la componente de Van der Waals, los resultados mejoraron en
comparacin con los clculos realizados anteriormente. Concretamente en las dinmicas
moleculares de 40.000 pasos es donde se obtienen los mejores resultados
La caracterstica ms importante de estos resultados para la componente de Van der
Waals es que, por primera vez fue obtenido un valor ms estable en la doble mutacin que
en I84V, mutacin que tuvo tendencia a estabilizarse demasiado en los otros clculos. An
as el valor para V82F no es correcto, ya que debera ser cercano a cero.
Con XV638 y 40.000 pasos de dinmica molecular, los resultados para la componente de
Van der Waals, mejoran ya que la mutacin V82F se aproxima ms a cero y se sigue
manteniendo un orden de magnitud correcto para I84V y V82F.
Con XV638 y 60.000 pasos, los valores para la componente de Van der Waals empeoran
al alejarse mucho de cero el valor para la mutacin V82F.
Aunque en el caso de SD146 (Tabla 5.9), tanto a 20.000 como a 40.000 pasos el valor de
G
2
G
1
tanto en la energa total como en la componente de Van der Waals, se
obtuvieron valores negativos. El problema es que al no haber una correlacin satisfactoria
para XV638 y solo estudiar un caso para SD146, los resultados no pudieron ser
comparados.

52
Respecto a la energa total, destac la gran variacin entre los valores energticos, a lo
largo de la dinmica. (Tabla 5.8) Salta a la vista, aparte de la falta de correlacin, el hecho
de que las energas varan a lo largo de la dinmica un tanto arbitrariamente, sin seguir
ninguna tendencia de estabilizacin o desestabilizacin durante la dinmica molecular. Este
hecho, puso de relieve que una posible causa del fallo en conseguir una correlacin en los
clculos realizados, es la posibilidad de que los residuos cargados y que estn en la
superficie de la enzima, sean responsables de este comportamiento ya que estn expuestos
al disolvente y tienen alto grado de libertad. A raz de este grado de libertad, estos residuos
podran colocarse en posiciones favorables o desfavorables energticamente a lo largo de
la dinmica molecular, dando lugar a variaciones arbitrarias en la energa.
Esta hiptesis, se vio reforzada al hacer el anlisis de interacciones de los residuos con el
agua, ya que los residuos que presentaron una mayor desestabilizacin respecto a la energa
en el complejo enzima/inhibidor nativo, fueron los residuos cargados. En la suma de las
componentes de energa libre de Van der Waals, para los complejos enzima/ complejo
mutantes, expresada como diferencia respecto de la nativa, aquellos residuos que se
desestabilizaron por encima de las 30 Kcal/mol, fueron siempre de tipo inico, como D60,
K70, R57 y muchos otros.
Dado que en la enzima, las cargas de los grupos superficiales ionizados estaran
neutralizadas, o bien por formacin pares inicos o bien por la presencia de contraiones en
el disolvente, la neutralizacin de las cargas superficiales, posiblemente sea muy
importante para la obtencin de unos resultados adecuados. Otra posible causa de esta
variacin en la energa son los estados de protonacin de la dada cataltica.

Clculos preliminares para la determinacin del estado de protonacin de la dada
cataltica

La determinacin del estado de protonacin tiene un nivel de importancia similar a la
neutralizacin de las cargas superficiales. El estado de protonacin doblemente protonado
para DMP323 fue avalado por Yamazaki y col. mediante estudios de RMN(41) y Trylska y
col. (44) mediante clculos computacionales. En la aplicacin del ciclo 2 a los complejos
enzima/inhibidor doblemente protonados (Vase Fig 4.5 pag. 41), los resultados no
alcanzaron el nivel de correlacin esperados.
53
Para el ciclo entre DMP323 y XV638, los valores de variacin de energa libre G
2
G
1

(Tabla 5.10)

no se correspondieron fiablemente con las diferencias de afinidad. La
mutacin V82F en el protmero A2, obtuvo un valor cercano a cero, lo cual es muy
prximo a la G
2
G
1
observada para esta mutacin. No ocurri lo mismo con I84V, que
presento una desestabilizacin un tanto alarmante en el protmero A2 y bastante
considerable en B2. V82F/I84V se mantuvo por debajo de cero, lo cual est de acuerdo con
las afinidades relativas, pero que no podemos comparar con I84V dado que la variacin de
energa libre para I84V no est en absoluto de acuerdo con dichas afinidades.
Los resultados para SD146 (Tabla 5.11) tampoco fueron esclarecedores en ningn caso.
En el protmero A2, si bien el valor es negativo, la magnitud de este es tan grande que nos
hace sospechar de su vala. En segundo lugar, el valor para el protmero B2 es positivo, lo
cual no est de acuerdo con las K
i
experimentales.

Tabla 5.10 Resultados para los clculos del Ciclo 2 para DMP323 y XV638 en
presencia de disolvente explcito, siendo DMP323 estado de referencia.
G
2
G
1
a
Estados de protonacin A2 B2 A2 B2
V82F -0.78 -56.38 -12.08 10.69
I84V 3532.53 177.45 2614.84 -19.67
V82F/I84V -118.45 -95.42 -23.42 2.20
a

Tabla 5.11 Resultados para los clculos del Ciclo 2 para SD146 en presencia de
disolvente explcito, siendo DMP323 estado de referencia.
G
2
G
1
a
Estados de protonacin A2 B2 A2 B2
V82F/I84V -1724.94 7.25 61.89 -1.59
a

Aparte de un posible efecto sobre estos resultados de la existencia de cargas superficiales,
problema antes expuesto, de los valores energticos se extrae que si bien el estado
doblemente protonado puede ser el ms favorable para DMP323, parece o puede no serlo
para XV638 y SD146, incluso podra haber un cambio en el estado de protonacin debido a
54
las mutaciones. En algunos casos, como la mutacin V82F en el ciclo entre DMP323 y
XV638, produce buenos resultados, sin embargo, para I84V o en el ciclo entre DMP323 y
SD146 esto no es as, lo cual es un indicio de que es posible que la doble protonacin de la
dada cataltica para XV638 y SD146 no sea lo ms favorable. Por esta razn, parece
indispensable la determinacin del estado de protonacin para cada complejo/inhibidor en
cada una de las mutaciones. Para ello realizamos el anlisis de interaccin de los residuos
asprticos de la dada cataltica con el resto del sistema enzima/inhibidor/multicapa de
molculas de agua, en los diferentes estados de protonacin y sus protmeros.

Tabla 5.12 Resultados para el clculo de energa de interaccin de los residuos A25 y
B25 en el estado monoprotonado.
A25 B25
Energa de interaccin
a
A1 B1 C1 D1 A1 B1 C1 D1
Nativa -106,98 -108,60 -256,73 -243,87 -220,88 -218,65 -119,38 -125,83
V82F -126,93 -136,61 -260,48 -247,11 -247,49 -232,85 -126,26 -144,07
I84V -120,47 -120,43 -240,70 -223,85 -251,32 -236,57 -134,96 -131,33
DMP323
V82F/I84V -130,33 -125,06 -252,09 -237,17 -218,83 -204,02 -128,89 -137,55
Nativa -116,73 -124,24 -237,67 -223,30 -230,53 -217,26 -123,74 -125,37
V82F -115,53 -119,78 -223,90 -210,34 -231,67 -216,21 -119,38 -127,19
I84V -118,65 -119,28 -241,57 -225,29 -237,12 -221,70 -122,54 -98,94
XV638
V82F/I84V -115,12 -119,32 -248,97 -234,11 -248,07 -233,46 -125,31 -131,96
Nativa -120,47 -117,71 -286,51 -271,58 -238,61 -223,86 -131,53 -133,58
SD146
V82F/I84V -121,75 -119,51 -221,59 -211,29 -244,52 -229,96 -135,03 -136,51
a

B25 en el estado diprotonado.
A25 B25
Energa de interaccin
a
A2 B2 A2 B2
Nativa -103,44 -127,82 -130,85 -114,01
V82F -122,09 -146,59 -152,92 -121,74
I84V -115,92 -131,41 -140,20 -130,34
DMP323
V82F/I84V -126,26 -136,72 -147,78 -124,67

55
A25 B25
A2 B2 A2 B2
Nativa -111,60 -132,07 -136,18 -119,20
V82F -111,22 -112,05 -137,02 -114,18
I84V -113,87 -130,46 -132,71 -118,38
XV638
V82F/I84V -110,78 -129,58 -142,24 -120,79
Nativa -116,54 -128,54 -142,62 -126,32
SD146
V82F/I84V -117,35 -124,15 -143,82 -131,69
a

B25 en el estado desprotonado.
Energa de Interaccin
a
A25 B25
Nativa -182,74 -148,12
V82F -156,86 -168,01
I84V -181,35 -167,09
DMP323
V82F/I84V -172,36 -140,98
Nativa -160,22 -148,93
V82F -140,95 -149,22
I84V -158,75 -155,36
XV638
V82F/I84V -168,73 -167,36
Nativa -202,98 -160,93
SD146
V82F/I84V -177,67 -164,95
a

En todos los casos, el estado doblemente protonado tiene la menor energa de interaccin,
siendo ms favorables los estados monoprotonado y desprotonado por este orden. Este
resultado no est de acuerdo con lo que determinaron Yamazaki y col. (41) y Trylska y col.
(44), por lo que una revisin del mtodo utilizado parece lo ms razonable. Los protmeros
adoptados para el estado doblemente protonado (Vase Fig 4.5 pag. 41) son solo dos
posibles orientaciones de las cadenas laterales de los cidos asprticos y es posible la
existencia de protmeros que no hayan sido considerados en nuestro estudio.

56
Tabla 5.15 Estados de protonacin asignados para cada una de las estructuras de
complejos VIH-1 PR/inhibidor analizadas.
Complejos enzima/inhibidor DMP323 XV638 SD146
Nativa C1 C1 C1
V82F D1 A1
I84V C1 C1
V82F/I84V C1 C1 A1

Una revisin de los protmeros utilizados, incluyendo ms conformaciones, quiz sea
necesaria para encontrar un estado doblemente protonado que produzca resultados acorde
con los estudios de RMN antes mencionados.

Fig 5.1. Protmeros establecidos para el estado monoprotonado.

En los estados de protonacin obtenidos por nuestro anlisis resalta el hecho de que,
excepto para DMP323 y V82F, el resto tienen estados C1 y A1, en la que el protn se
encuentra directamente estabilizado por enlace de hidrgeno con el tomo de oxgeno del
carboxilato del aspartato adyacente. En cualquier caso, los resultados obtenidos no son
definitivos y no pueden ser tenidos en cuenta para la asignacin del estado de protonacin
de la enzima.
57

Estudio preliminar de las perturbaciones a gran escala

En el anlisis de las interacciones, fueron seleccionados los residuos con una
desestabilizacin mayor a 2 Kcal/mol para la mutacin V82F/I84V de DMP323 y XV638.

Fig 5.2 Variacin de energa de Van der Waals para el complejo VIH-1 PR/XV638 (V82F/I84V) en el
Monmero A, expresada como diferencia respecto a la energa de Van der Waals de el complejo VIH-1
PR/XV638 nativo.

1
2
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363738
39
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68
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76
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78
79
8081
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84
85
86
87
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89
90
91
9293
94
95
96
97
98
99
-7.00
-6.00
-5.00
-4.00
-3.00
-2.00
-1.00
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
58

Fig. 5.3 Variacin de energa de Van der Waals para el complejo VIH-1 PR/XV638 (V82F/I84V) en el
Monmero B, expresada como diferencia respecto a la energa de Van der Waals de el complejo VIH-1
PR/XV638 nativo.

De los residuos seleccionados con una desestabilizacin mayor a 2 Kcal/mol, mediante
los diagramas de movimiento inter-correlacionado (DCCM vase seccin Trabajo
Realizado pag. 42) de Harte y col. (46), se escogieron aquellos que presentaban correlacin
en el movimiento. Las estructuras analizadas fueron la doble mutacin en DMP323 y
XV638. El diagrama expresa en abscisas y ordenadas los residuos de la enzima para uno de
los monmeros. En la interseccin entre dos residuos podremos ver si existe correlacin en
su movimiento. La diagonal central no es de importancia ya que es la correlacin entre un
residuo consigo mismo o con los que estn adyacentes.
1
2
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-6.00
-5.00
-4.00
-3.00
-2.00
-1.00
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
59

Fig 5.4 Mapa Dinmico de Inter Correlacin (DCCM) calculado por Harte y Beveridge (46), para la
estructura nativa sin enlazar de VIH-1 PR.

60
Tabla 5.16 Correlacin entre residuos desestabilizados para VIH-1 PR (V82F/I84V) /
DMP323 en el Monmero A.
Residuo Desestabilizado Movimiento correlacionado con
25 87, 68 ,85
43 73, 77
82 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 31, 32, 33, 34

DMP323 en el Monmero B.
14 34, 35, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70
15 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70
22 30, 31, 32, 33, 34, 20, 21. 23
29 85, 86, 87, 88
57 72, 73, 74, 75, 76
58 72, 73, 74, 75, 76
82 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 31, 32, 33, 34
91 54, 70, 71, 72
92 67, 69, 70

XV638 en el Monmero A.
21 31, 32, 33, 64, 67, 79, 80, 81, 82, 83, 84
25 85, 86, 57
28 85, 86, 87, 88
35 75, 76, 77, 78, 79
43 73, 77
57 72, 73, 74, 75, 76
59 50
65 20
78 30, 31, 32, 33, 34, 35

61
XV638 en el Monmero B.
7 19, 20, 21, 22, 23, 66, 67
22 7, 20, 21, 22, 23, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85
50 56, 57, 58, 59, 60, 61, 73, 74, 75
63 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20
64 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ,21, 22, 34

Consultando las Tablas 5.16 y el mapas topolgicos (Fig 5.5) para el complejo
enzima/DMP323, no hay movimiento correlacionado y enlace de hidrgeno en el
monmero A. En el monmero B (Tabla 5.17 y Fig 5.6), hay movimiento correlacionado y
enlace de hidrgeno entre 14 y 65 y entre 29 y 88 siendo un total de dos enlaces de
hidrgeno los que se ven afectados por el movimiento correlacionado entre residuos.

Para el complejo enzima/XV638, hay movimiento correlacionado y enlace de Hidrgeno
entre 28 y 87 en el monmero A (Tabla 5.18 y Fig 5.7). En el monmero B (Tabla 5.19 y
Fig. 5.8) no hay movimiento correlacionado y enlace de Hidrgeno en ningn residuo.

De este anlisis se extrae que para el complejo VIH-1 PR (V82F/I84V) / DMP323, la
desestabilizacin afecta a tres enlaces de hidrgeno, mientras que para el complejo VIH-1
PR (V82F/I84V) / XV638 la desestabilizacin afecta solo a 1.

Esta diferencia en el nmero de enlaces de hidrgeno que se ven afectados por la
desestabilizacin, inclina la balanza a favor del XV638, indicando que la razn para las
diferencias entre las afinidades de DMP323 y XV638, aparte de en las interacciones
enzima-inhibidor en el centro activo, est en mayor medida en las diferencias en el
empaquetamiento del inhibidor con la estructura enzima, originando desestabilizaciones
que afectan al patrn de enlaces de hidrgeno de diferente forma con diferentes inhibidores.
En los mapas topolgicos las lneas gruesas indican enlaces de hidrgeno entre
aminocidos de la enzima, y las delgadas indican enlaces de hidrgeno entre aminocidos e
inhibidor.

44

6. Conclusin

67
Los objetivos marcados en este proyecto fueron la investigacin de dos hiptesis
fundamentales en la bsqueda de la causa de la prdida de afinidad de la VIH-1 PR mutante
por los inhibidores de tipo ureas cclicas DMP323, XV638 y SD146.

La relacion entre la prdida de afinidad y efectos desestabilizantes producidos por
las mutaciones, que podran ser transmitidos por toda la estructura de la enzima a
travs de las conectividades por enlaces de hidrgeno. Por otra parte, el
complejamiento de inhibidores a las enzimas mutantes, podra producir
distorsiones en el empaquetamiento del complejo con respecto a la protena en
estado libre no enlazado, reduciendo la afinidad de sta por el inhibidor.

El estado de protonacin de los aspartatos del centro activo (Asp25 y Asp25),
podra cambiar de un inhibidor a otro o podra modificarse con diferentes
mutantes, lo cual tendra un efecto marcado en la energa de asociacin de los
complejos.

Estas hiptesis se hicieron necesarias para justificar la prdida de afinidad ya que los
trabajos anteriores en este campo realizados por Ala y col. (30, 31), no pudieron encontrar
la respuesta bajo el punto de vista localizado en la interaccin centro activo - inhibidor. En
estos trabajos se investigo la componente de Van der Waals para la interaccin entre
enzima e inhibidor y en este proyecto nosotros extendimos los clculos a la energa total.

En el transcurso del trabajo realizado, la dificultad principal y obstculo de las secciones
posteriores fue la imposibilidad de llegar a establecer la correlacin entre los valores de
energa libre calculados y las constantes de inhibicin observadas. En un primer lugar, y
debido a la falta de correlacin en los resultados de los clculos realizados en ausencia de
disolvente, se incluy un modelo de disolvente, siendo el modelo explcito el que produjo
los resultados ms acertados. En la mayora de los clculos con los diferentes modelos de
disolvente utilizados, se alcanz una buena correlacin para la componente de Van der
Waals, siendo el uso de disolvente explcito y dinmica molecular a 40.000 pasos los que
produjeron los mejores resultados (vanse Tablas 5.8 y 5.9 pag. 50, 51). A pesar de esto, no
68
se consigui una buena correlacin para la energa total, presentando los resultados
desviaciones respecto a los resultados esperados, especialmente persistentes en la estructura
con la mutacin I84V, mutacin en la que se observaron la mayora de las desviaciones.

La explicaciones de las desviaciones en la energa total fueron, en primer lugar, que como
consecuencia del uso de un disolvente explcito, se produjeron interacciones entre los
residuos superficiales cargados y las molculas de disolvente, dando lugar a variaciones en
la energa de los complejos enzima/inhibidor que dieron lugar a resultados no esperados. Es
por esto que la neutralizacin de las cargas superficiales del complejo enzima/inhibidor,
por formacin de pares inicos o por contraiones, dara lugar a resultados ms slidos.
En segundo lugar, el otro punto importante es la determinacin del estado de protonacin
de la dada cataltica. Las implicaciones de la determinacin del estado de protonacin son
muy importantes, debido a que si tuvisemos diferencias en el estado de protonacin entre
complejos enzima/inhibidor con inhibidores diferentes, o entre complejos enzima/inhibidor
mutantes, las consecuencias energticas de aadir un H
+
al ciclo podran dar cuenta de las
diferencias energticas que estamos buscando. En este proyecto se llev a cabo una
determinacin preliminar de dichos estados de protonacin, pero al estar los resultados
obtenidos para los estados de protonacin del DMP323 en oposicin a los resultados
obtenidos por Yamazaki y col. mediante estudios de RMN (41) y Trylska y col. mediante
estudios computacionales (44), es razonable un replanteamiento de los posibles protmeros
a utilizar y un refinamiento del mtodo de determinacin.

Es por esto que es necesario retomar el trabajo con las modificaciones antes descritas, es
decir, los clculos energticos para su aplicacin a los ciclos termodinmicos, debern ser
llevados a cabo en presencia de disolvente explcito, con los residuos superficiales
neutralizados y con su respectivo estado de protonacin en la dada cataltica del centro
activo.

Una vez lograda la correlacin entre valores de energa libre y constantes experimentales,
ser posible un anlisis fiable de las interacciones y de las perturbaciones a gran escala; no
de manera preliminar, como se hizo aqu, dado que no fue conseguido un establecimiento
69
del ciclo termodinmico que relaciona la energa libre calculada de las estructuras con las
constantes experimentales. An a pesar de que cuando fue realizado el anlisis de
interacciones, la energtica del complejo enzima/inhibidor no haba sido establecida, el
anlisis preliminar de las perturbaciones a gran escala para los complejos VIH-1
PR/inhibidor (DMP323 y XV638) para la doble mutacin, favoreci al XV638 en
comparacin con DMP323, lo cual est de acuerdo con las afinidades experimentales. Por
otro lado, los mapas dinmicos de inter-correlacin (DCCM) utilizados en este proyecto
fueron los obtenidos por Harte y col. (46), para la enzima nativa libre. Nosotros hemos
analizado complejos enzima/inhibidor nativos y mutantes, por lo que es importante la
obtencin en un futuro de mapas propios para cada estructura de complejo
enzima/inhibidor. Pensamos que as se podr demostrar la hiptesis, de una manera
definitiva y slida, de que el inhibidor al enlazarse a la enzima mutante, produce
distorsiones en el empaquetamiento del inhibidor respecto al enlace a la enzima nativa, que
son transmitidos a toda la estructura de la protena. Podramos dar cuenta as de las
diferencias en afinidades para diferentes inhibidores con enzimas mutantes, que no haban
podido ser racionalizadas en la base de la interaccin localizada del inhibidor con el centro
activo.

A pesar de no haber comprobado las dos hiptesis planteadas de una manera definitiva, se
han establecido las pautas que debern ser tenidas en cuenta para el trabajo en este campo
en un futuro, as como se ha establecido y comprobado, de manera preliminar, un mtodo
para poder dar un enfoque global a la interaccin enzima/inhibidor, en contraposicin al
enfoque tradicional localizado en la interaccin del inhibidor con el centro activo.

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