CONCEPTOS FUNDAMENTALES DE

CROMATOGRAFA
1
INTRODUCCIN
En 1910, el botnico ruso M. Tswett describi por vez primera esta tcnica, que fue aplicada
a la separacin de pigmentos de plantas, dndole el nombre de cromatografa en referencia a las
bandas coloreadas de pigmentos que se separaban por su adsorcin selectiva sobre columnas de yeso.
Tras su descubrimiento, la cromatografa quedo prcticamente olvidada hasta 1930 ao en que fue
redescubierta por Kuhn y Lederer, quienes la aplicaron para la separacin de carotenoides; a partir
de este momento, el uso de esta tcnica se fue extendiendo cada vez ms, al tiempo que se
desarrollaban diferentes versiones de la misma: cromatografa de reparto (Martin y Synge, 1941),
de papel (Consden, Gordon y Martin, 1944), de capa fina (Stahl, 1958), etc. Un hito importante en
el desarrollo de la cromatografa lo constituy el desarrollo de la cromatografa gas-lquido (Martin
y James, 1952), tcnica que encontr rpidamente aplicaciones de gran importancia, lo que llevo a
su vez al desarrollo de la teora de la separacin cromatogrfica (Van Deemter, 1956; Giddings,
1965, etc.) as como al desarrollo de una instrumentacin que permita un mayor control de las
condiciones de trabajo.
Hoy en da casi no hay campo de la qumica, biologa, medicina, etc. en el que no se utilice
la cromatografa en alguna de sus formas, tanto en su vertiente preparativa como en la analtica; por
otra parte el desarrollo sobre el uso conjunto de la cromatografa con otras tcnicas analticas, as
como el desarrollo de otros tipos de cromatografa, como es por ejemplo la de fluidos supercrticos,
hace previsible una extensin an mayor de su uso.
2
CONCEPTOS BSICOS
La cromatografa es esencialmente un mtodo fsico de separacin en el que los componentes
a separar se distribuyen entre dos fases, una inmvil (lecho estacionario), y otra mvil (fase mvil)
la cual percola a travs de la primera. El proceso cromatogrfico se da como resultado de repetidos
procesos de sorcin-desorcin durante el movimiento de los componentes de la mezcla arrastrados
por la fase mvil a lo largo del lecho estacionario (elucin), producindose la separacin debido a
las diferencias en las constantes de distribucin de los componentes de la mezcla entre la fase
estacionaria y la mvil. A la distribucin final de los componentes en funcin de su posicin sobre
el lecho estacionario, o del tiempo en que eluyen se le denomina cromatograma.
Prcticamente no existen restricciones sobre la naturaleza de las fases a utilizar, siempre que
la fase estacionaria sea slida o lquida y la fase mvil lquida o gaseosa, por lo que es posible, en
principio, realizar por medio de estas tcnicas la separacin de los componentes de cualquier mezcla.
Por otra parte, la utilizacin de las tcnicas cromatogrficas no esta exenta de dificultades, debido
fundamentalmente a la gran cantidad de parmetros que pueden influir en el proceso de separacin,
lo cual dificulta la eleccin de las condiciones ptimas de separacin y en muchas ocasiones implica
la irreproducibilidad de los resultados. Por ello la cromatografa no es una tcnica de rutina que
pueda aplicarse sin ms a cualquier mezcla, sin invertir en muchos casos gran cantidad de esfuerzo
y tiempo.
Tipos de cromatografa
Las tcnicas cromatogrficas pueden clasificarse en funcin del mecanismo de separacin
de los componentes entre las fases, o bien por la forma de operar del sistema.
a) Mecanismos de separacin
En funcin del mecanismo de separacin, las tcnicas de cromatografa pueden clasificarse
3
en:
- Cromatografa de adsorcin. La separacin depende de los equilibrios de adsorcin-
desorcin de los componentes de la mezcla, entre la fase estacionaria slida y la fase mvil
lquida o gaseosa. La fuerza con que es adsorbido un componente depende de la polaridad
de este, de la actividad del adsorbente y de la polaridad de la fase mvil. En general cuanto
ms polar es un compuesto ms fcilmente ser adsorbido. El orden general de elucin de
algunos compuestos orgnicos, de la actividad de algunos adsorbentes y de la fuerza de
elucin de algunos disolventes comunes, se recogen en la Tabla I. La cromatografa de
adsorcin, es una tcnica que est particularmente bien adaptada para la separacin de
compuestos de polaridad baja y media. La separacin de compuestos muy polares mediante
cromatografa de adsorcin requiere, debido a la gran retencin que ofrecen, la utilizacin
de adsorbentes muy poco activos, o bien, tratamientos qumicos previos para la preparacin
de la muestra (preparacin de trimetilsilil derivados, etc.) a fin de reducir su polaridad.
- Cromatografa de reparto. Est basada en la separacin de una mezcla de substancias
mediante el reparto existente entre la fase mvil (lquido o gas) y la fase estacionaria
(lquida) soportada o ligada sobre un slido adecuado. La mayor o menor migracin de un
compuesto en este tipo de cromatografa, ser funcin del coeficiente de reparto de ste entre
la fase estacionaria y la fase mvil:
La cromatografa de reparto es utilizable para la separacin de mezclas de compuestos de
polaridad media y alta. Ejemplos de este tipo de cromatografa, son las cromatografas sobre
papel, slice hidratada y la cromatografa lqida de alta eficacia en fase reversa.
- Cromatografa por tamao molecular, tambin llamada de permeacin de gel o de tamiz
molecular. Consiste en la separacin de las molculas basndose en su tamao en lugar de
4
en su solubilidad o polaridad. Las fases estacionarias empleadas para este tipo de
cromatografa son inorgnicas (zeolitas), o geles orgnicos compatibles con disolventes
acuosos (agarosa, poliacrilamida) u orgnicos (copolmeros estireno/divinilbenceno). Estas
fases estacionarias poseen cavidades en las cuales las molculas de los compuestos a separar
pueden penetrar y ser retenidas, siendo las molculas mayores las eluidas de la columna en
primer lugar; el rango de trabajo de estas fases estacionarias, se define como el intervalo de
pesos moleculares que pueden ser separados; otro parmetro que caracteriza a este tipo de
fases, es su lmite de exclusin, que se define como el peso molecular a partir del cual los
compuestos pasarn a travs del lecho estacionario sin experimentar retencin.
- Cromatografa de cambio inico. Las separaciones por intercambio inico, se llevan a cabo
con materiales insolubles y de textura porosa, los cuales presentan grupos reactivos asociados
a iones lbiles capaces de intercambiarse con los del medio que les rodea, por lo que
inevitablemente este tipo de cromatografa ha de realizarse en medio lquido. La
cromatografa de intercambio inico, es utilizable para la separacin de substancias inicas,
tanto inorgnicas como orgnicas. Las separaciones por cambio inico, estn basadas en los
diferentes equilibrios de reparto de los iones de la mezcla entre el material cambiador y la
disolucin:
En general, se utilizan tres tipos de materiales para cromatografa de cambio inico: resinas,
geles y celulosas. La diferencia fundamental entre ellos reside en su microestructura ya que,
generalmente, las resinas presentan un tamao de poro mucho menor, siendo apropiadas para
la separacin de substancias de pequeo volumen molar. Otras diferencias existentes entre
los diversos materiales de cambio inico son debidas a la naturaleza de los grupos
cambiadores (fuerza del grupo cambiador) y al nmero de estos por unidad de peso de
material (capacidad de cambio).
Debe tenerse en cuenta que los mecanismos de separacin descritos, son aproximaciones a
5
las situaciones reales y que, aunque en una tcnica concreta predomine alguno de ellos, la separacin
suele estar basada en la conjuncin de diversos mecanismos.
TABLA I.- Adsorbentes y disolventes ms comunes en cromatografa.
Orden de elucin, actividad de adsorbentes y fuerza de elucin de los disolventes
Secuencia Orden de elucin de
compuestos
Actividad de
adsorbentes
Fuerza de elucin de
disolventes
-
+
Hidrocarburos saturados Celulosa Eter de petrleo
Hidrocarburos aromticos Ciclohexano
Derivados halogenados
Eteres
Benceno
Tetracloruro de carbono
Sulfato clcico (yeso) Diclorometano
Cetonas Slice Cloroformo
Aldehdos Florisil Eter dietlico
Esteres Oxido de magnesio Acetato de etilo
Alcoholes
Aminas
Almina
Acidos Carbn activo Acetona
n-propanol
Etanol
Metanol
Agua
Acido actico
6
b) Formas de separacin.
Otra posible clasificacin de las tcnicas cromatogrficas, est basada en la forma de operar
del sistema cromatogrfico. Bsicamente existen cuatro formas de operacin:
- Anlisis por desarrollo. Es el mtodo utilizado en los experimentos iniciales de
cromatografa. El cromatograma se desarrolla hasta que el frente de disolvente
alcanza el final del lecho estacionario, de forma que los constituyentes de la mezcla
una vez separados permanecen sobre el lecho al finalizar la separacin. La tcnica de
anlisis por desarrollo presenta la ventaja de que es analizable la totalidad de la
muestra, incluyendo los compuestos de muy baja o muy alta retencin. Se utiliza
fundamentalmente en cromatografa de papel y capa fina.
- Anlisis por elucin. Es la tcnica utilizada en casi todas las separaciones
cromatogrficas analticas y en muchas preparativas. En ella, el paso de la fase mvil
se contina indefinidamente hasta que los componentes separados de la mezcla
emergen al final del lecho cromatogrfico. Esta tcnica presenta la desventaja de que
los compuestos con retenciones muy altas pueden no ser observados.
- Anlisis frontal. Este mtodo est basado en la diferencia de afinidad del adsorbente
por cada una de las sustancias a separar. Se utiliza una pequea columna, que es
saturada sucesivamente por cada una de las substancias a separar, emergiendo de ella
el primer componente puro hasta que la columna se satura del segundo componente,
momento en el que empezar a emerger ste mezclado con el primero. El anlisis
frontal tiene su principal aplicacin como tcnica preparativa para la purificacin de
substancias.
- Anlisis por desplazamiento. En este caso, la substancia desplazante va incorporada
dentro de la fase mvil. Este metodo se utiliza tanto para separaciones analticas
como preparativas, siendo muy utilizada en cromatografa de cambio inico.
7
PARMETROS BSICOS DE CROMATOGRAFA
El tratamiento terico del proceso cromatogrfico, fue desarrollado fundamentalmente en
base a las tcnicas instrumentales de cromatografa que utilizan el mtodo de anlisis por elucin y,
en consecuencia, como parmetros para definir la banda cromatogrfica, se utilizan el tiempo o el
volumen de eluyente a que aparece dicha banda al final de lecho estacionario (tiempo o volumen de
retencin); no obstante, es necesario precisar que los parmetros que definen una separacin
cromatogrfica, son extrapolables a las separaciones que utilizan tcnicas de desarrollo.
Retencin y factor de capacidad
Cuando se introduce un compuesto en la corriente de fase mvil de un sistema
cromatogrfico, de no existir interaccin de ste con la fase estacionaria, la banda que forma se
desplazara a la misma velocidad que la fase mvil y emergera del lecho estacionario cuando el
volumen total de fase mvil utilizado fuese igual al volumen vaco o intersticial de la columna
(volumen muerto); sin embargo, como las molculas de la muestra interaccionan de hecho con la fase
estacionaria, aquellas necesitan para su elucin el paso de un volumen mayor de fase mvil, que se
denomina volumen de retencin de la muestra. Dado que en un sistema cromatogrfico que opere
a caudal constante, el volumen eludo y el tiempo son proporcionales, los conceptos de volumen
muerto y volumen de retencin, son directamente intercambiables por los de tiempo muerto (t
M
) y
tiempo de retencin (t
R
).
En la figura 1, se muestran los parmetros de retencin para el caso de una nica banda
cromatogrfica. Se observa que el tiempo de retencin de la banda, puede dividirse en dos partes:
el tiempo muerto (t
M
) y el tiempo transcurrido a partir de este momento hasta la aparicin del
mximo de la banda. A partir de la definicin de tiempo muerto, se induce que el segundo, es el
tiempo real que la fase estacionaria ha retrasado el avance del compuesto, y se conoce con el nombre
de tiempo de retencin corregido (t'
R
).
8
Figura 1.- Cromatograma de un componente y sus parmetros caractersticos
En base a los parmetros de retencin descritos, se define el factor de capacidad (k') como:
Este factor adimensional expresa la retencin de un compuesto por la fase estacionaria,
independientemente del caudal de la fase mvil. En la prctica, los compuestos de inters deben
presentar, en el sistema cromatogrfico elegido, valores de k' comprendidos entre 1 y 15, con el fin
de no alargar excesivamente los tiempos de separacin.
Dispersin de bandas
Cuando se introduce, en forma de banda muy estrecha, una mezcla de los componentes a
9
Figura 2.- Parmetros caractersticos de un pico gaussiano
separar en una columna cromatogrfica (cabeza de columna), al eluir la mezcla desde un extremo
a otro de la columna, se observa que las bandas de soluto se van ensanchando al mismo tiempo que
se separan; este proceso es debido fundamentalmente a la difusin termodinmica de las molculas
de la banda, que tienden a distribuirse uniformemente en todo el volumen disponible. El proceso de
difusin es dependiente del tiempo, de forma que la dispersin de la banda aumentar en funcin del
tiempo de elucin. Dado que los procesos de difusin de las molculas tienen su fundamento en
movimientos de las mismas al
azar, la concentracin final de las
molculas dentro de una banda
cromatogrfica adoptar, en un
caso ideal, un perfil de
distribucin normal, y el registro
de las concentraciones de la
banda en funcin del volumen
eludo o del tiempo, dar lugar a
una forma gaussiana de anchura
definida por la desviacin
standard de la dispersin. Los
parmetros caractersticos de un
pico gaussiano se ilustran en la
figura 2.
Eficacia
Para realizar una separacin cromatogrfica ptima, debe evitarse en lo posible, el
ensanchamiento de las bandas debido a la dispersin; en efecto, cuanto mas anchas sean las bandas,
menor nmero de ellas podrn ser resueltas en un espacio de tiempo dado; en otras palabras, cuanto
mas agudos sean los picos que emergen de una columna mejor estar actuando dicha columna. Las
anchuras de las bandas cromatogrficas dependen de las caractersticas de la columna (tamao de
10
las partculas del lecho estacionario, homogeneidad de este, etc.), as como de otros factores como
por ejemplo, la velocidad de la fase mvil. Para expresar la calidad de un pico, se utiliza un
parmetro relativo que tenga en cuenta tanto la retencin como la anchura de la banda; este
parmetro es el cociente entre el tiempo de retencin y la desviacin standard de la banda
cromatogrfica:
En la prctica, se define la eficacia de una columna como el cuadrado del cociente anterior
y se expresa como nmero de platos tericos:
As el nmero de platos tericos de una columna puede calcularse utilizando la anchura de
uno de sus picos, normalmente el ltimo que pueda medirse directamente sobre el cromatograma
(figura 3), utilizando las expresiones:
El nmero de platos de una columna cromatogrfica, depende lgicamente de su longitud,
por lo que para comparar la eficacia de columnas con diferente longitud, se introduce otro trmino,
denominado altura equivalente de un plato terico, que relaciona la eficacia de una columna con su
longitud y que se define como el cociente entre la longitud de la columna y su nmero de platos
tericos:
11
Figura 3.- Cromatograma de dos bandas y parmetros para calcular eficacia y resolucin
Es de destacar que al considerar la eficacia, solamente se han tenido en cuenta los efectos
propios de la columna, aunque existen otros parmetros del sistema (anchura de banda inicial,
velocidad de la fase mvil, etc.) que contribuyen al ensanchamiento de las bandas cromatogrficas.
De esta manera, no siempre la baja eficacia de un sistema cromatogrfico es atribuible a la columna,
sino que tambin contribuyen otros factores que ser preciso optimizar.
Separacin y resolucin
Hasta el momento, nicamente se ha considerado el caso de que en el cromatograma exista
una sola banda; sin embargo, el objeto de la cromatografa es separar mezclas de varios componentes
y es de suma importancia considerar la separacin entre ellos. Debe recordarse siempre que,
independientemente del nmero de componentes que pueda tener una mezcla, el problema de
separacin de todos ellos, queda siempre reducido al de las dos bandas adyacentes ms difciles de
12
separar. La separacin entre dos bandas cromatogrficas (figura 3), puede estudiarse en funcin de
dos parmetros, la retencin relativa, definida como el cociente entre los tiempos de retencin
corregidos de las dos bandas:
Y la resolucin, que se define como el cociente de la distancia entre los centros de las dos bandas
y el valor medio de la anchura de las mismas:
En consecuencia, una separacin total de dos bandas requerir valores de " y de R
s
lo mas
elevados posible. Es de tener en cuenta que mientras que un valor elevado de R
s
puede conseguirse
aumentando la eficacia de la columna (mayor longitud de columna, menores dispersiones de banda,
etc.), el valor de " es constante para cada sistema cromatogrfico y solamente podr variarse
alterando la fase estacionaria o la mvil, en otras palabras, cambiando de sistema cromatogrfico.
La solucin de un problema real de separacin entre dos bandas deber darse en funcin de los
valores de " y R
s
que presente; as, para valores altos de " y bajos de R
s
, la separacin podr
conseguirse mediante un aumento de eficacia, mientras que para valores bajos de " no es practico
intentar la separacin en base a un aumento de eficacia y debe procederse a un cambio del sistema.
13
LA CURVA DE AEPT
Como ya se ha visto, la eficacia de una columna cromatogrfica es de gran importancia a la
hora de conseguir una buena separacin; en consecuencia, es de gran inters el conocer los
parmetros de los que depende la eficacia.
La curva de AEPT, es la representacin de la altura equivalente a un plato terico, frente a
la velocidad lineal de la fase mvil. Como ya se ha visto, la altura de un plato terico viene dada por
la expresin:
O bin, por la expresin equivalente:
Es decir, el cociente entre la varianza de la banda cromatogrfica y la longitud de la columna.
El valor de la varianza total del pico cromatogrfico, vendr dado por la suma de las varianzas
individuales de todos los fenmenos que contribuyan al ensanchamiento de la banda:
Los factores que contribuyen al ensanchamiento de una banda cromatogrfica que se mueve
a lo largo de una columna son los siguientes:
1.- Difusin molecular.
14
2.- Irregularidades en el relleno (difusin de Eddy).
3.- Resistencia a la transferencia de materia en la fase mvil.
4.- Resistencia a la transferencia de materia en la fase estacionaria.
La difusin molecular es debida a la dispersin termodinmica de las molculas de la banda
cromatogrfica a lo largo de la columna, teniendo lugar esta dispersin tanto si la banda se mueve
como si est en reposo. La varianza originada por difusin molecular viene dada por la expresin:
Siendo D
m
el coeficiente de difusin molecular, L la longitud de la columna, u la velocidad
lineal del eluyente y ( es el denominado coeficiente de tortuosidad, que tiene en cuenta la
perturbacin de la difusin molecular debida a irregularidades de la fase estacionaria.
El ensanchamiento de la banda cromatogrfica debido a la irregularidad de la fase
estacionaria, viene dado por la expresin:
Donde a es un coeficiente que ser funcin del tamao medio de la partcula y del coeficiente
de dispersin en la fase mvil.
El ensanchamiento de la banda debido a la resistencia a la transferencia de materia, en la fase
mvil y en la fase estacionaria, vendr dado por las expresiones:
15
Donde d es el dimetro medio de la partcula del lecho estacionario y C
m
y C
e
, dos
coeficientes que dependen respectivamente de la fase mvil y de la fase estacionaria.
A partir de las ecuaciones anteriores, se puede deducir que la varianza total de la banda
cromatogrfica vendr dada por la expresin:
Y en consecuencia, la altura equivalente de plato terico, vendr dada por la expresin:
Esta ecuacin, es la expresin matemtica de la curva de AEPT o ecuacin de Van Deemter,
que frecuentemente se encuentra abreviada bajo la forma:
La ecuacin de Van Deemter resulta de difcil manejo desde el punto de vista prctico, ya que
16
Figura 4.- Representacin grfica de la curva de AEPT
muchos de los coeficientes que forman parte de ella son difciles de conocer. No obstante, pueden
extraerse de ella algunas informaciones interesantes; as, por ejemplo, puede verse que la altura de
plato es funcin del dimetro de las partculas de la fase estacionaria, mejorndose la eficacia del
sistema cromatogrfico a medida que disminuye el tamao de partcula. Por otra parte, puede verse
que la eficacia de una columna cromatogrfica, ser tambin funcin de la velocidad lineal de la fase
mvil, como se puede ver claramente en la representacin grfica de la ecuacin:
17
Figura 5.- Parmetros correspondientes a diferentes formas de pico
DISTORSIONES DE BANDA
Asimetra de pico
Como primera aproximacin, se ha venido considerando que el sistema cromatogrfico se
comporta como un operador gaussiano, ensanchando la banda cromatogrfica hacia una distribucin
normal segn va pasando a travs de la columna cromatogrfica.
En la prctica, los picos cromatogrficos raramente son gaussianos, y la realizacin de
clculos sobre el cromatograma en base a esta suposicin, puede llevar a errores significativos si se
trabaja con picos muy distorsionados. El modelo de la curva de Gauss slo es apropiado cuando se
trabaja con picos cuya asimetra es ligera. En la figura 5, se muestran las caractersticas de simetra
de picos gaussianos (a), picos con cola (b) y picos con distorsin frontal (c).
18
El factor de asimetra de un pico cromatogrfico, puede calcularse por medio de la ecuacin:
Donde:
Para los picos gaussianos, el factor de asimetra es igual a 1; si los picos presentan cola, se
asigna a As valor positivo, y cuando los picos presentan distorsin frontal, se le asigna valor
negativo.
Aunque prcticamente todos los picos cromatogrficos son ligeramente asimtricos, los
factores de asimetra exagerados deben ser evitados, tanto por la posibilidad de que se originen
errores en la cuantificacin, como por la prdida de resolucin que se origina (un pico con As = 1,1
ocasiona una prdida de eficacia de un 10 %).
La asimetra de los picos puede ser debida a un buen nmero de factores, tanto instrumentales
como cromatogrficos, entre ellos resolucin incompleta de dos bandas, presencia de puntos de gran
actividad en las fases estacionarias, reacciones qumicas del compuesto en la columna, volmenes
muertos en el sistema cromatogrfico, tcnicas de inyeccin incorrectas, etc.
Distorsin instrumental de banda
Hasta el momento, se han considerado algunos de los factores que originan el que las bandas
cromatogrficas experimenten una variacin de forma a lo largo del proceso cromatogrfico
(generalmente ensanchamientos). Si bien en la mayora de los casos no existe posibilidad de
19
intervenir sobre estos factores, en otros, si existen posibilidades de optimizacin, no ya con el fin de
aumentar la eficacia de una columna, lo que es imposible, sino con la finalidad de no perder la
eficacia que puede proporcionar.
Inyeccin
La muestra inyectada, puede originar una deformacin de la banda cromatogrfica por dos
motivos: la inyeccin de una masa excesiva de muestra, puede llevar a una sobrecarga de la columna,
con la consiguiente prdida de capacidad de separacin; este motivo de distorsin no tiene otra
solucin que inyectar masas menores de muestra. Un segundo motivo de deformacin de las bandas
que, por otra parte, suele ser el caso ms frecuente es el de que aunque la masa inyectada no sea
suficiente para sobrecargar la columna, la inyeccin de un volumen excesivo, provoque una prdida
de la eficacia del sistema.
Cuando se inyecta un determinado volumen de muestra, sta ocupar en la cabeza de la
columna una cierta longitud. En el caso de una columna ideal, que no ensanchase los picos, la banda
cromatogrfica a la salida de la columna tendra la misma anchura que la banda inyectada; este ancho
de banda inicial ocasionado por la inyeccin, nunca se reducir a su paso por la columna, sino que
por el contrario se har mayor. Es evidente, en consecuencia, la necesidad de inyectar volmenes
adecuados, as como de utilizar mtodos capaces de proporcionar inyecciones de alta calidad.
La calidad instrumental de un sistema de inyeccin, se expresa en funcin de un parmetro
K, en la expresin:
Donde V
0
es el volumen inyectado y F
i
la desviacin tpica de la banda ocasionada por la
inyeccin. De la ecuacin anterior, se deduce que la inyeccin ser tanto mejor cuanto mayor sea el
20
parmetro instrumental K y cuanto menor sea el volumen inyectado. La anchura total del pico
cromatogrfico a la salida de la columna, vendr dada por la expresin:
Siendo F
t
2
la varianza total del pico a la salida de la columna y F
c
2
la varianza del pico debida
a la columna. A partir de esta ecuacin, es posible obtener el valor de K de un inyector,
representando F
t
2
en funcin de V
0
2
. Se puede demostrar tericamente que para un inyector ideal, K
= 3,5, aunque en la prctica, para sistemas de inyeccin aceptables K = 2.
Respecto al volumen de muestra inyectado, su valor mximo para que se origine una prdida
de eficacia de )N platos en una columna, viene dado por la ecuacin:
Como se puede ver, el volumen mximo que se puede inyectar depender, adems de la
calidad del inyector, de las caractersticas de la columna (dimetro de la columna, porosidad,
longitud y altura de plato) y de la retencin del pico que se trate de analizar (k'). Es fcil deducir, que
si se quieren evitar prdidas elevadas de eficacia, los volmenes inyectados deben ser pequeos, en
particular si se trabaja con columnas muy eficaces (bajo valor de H), de pequeo dimetro, y muy
en particular, cuando los compuestos a analizar presentan pequeas retenciones. Como estimacin
prctica, para limitar a un cierto valor la prdida de eficacia de una columna, en la que el pico de
inters presente un volumen V
p
, los volmenes mximos a inyectar (V
i
), son los recogidos en la
Tabla II.
21
Tabla II.- Prdidas de eficacia del sistema en funcin del
volumen inyectado
V
i
Prdida de resolucin (%)
0,25 Vp 5
0,33 Vp 8
0,40 Vp 10
0,57 Vp 20
Conexiones
Los tubos capilares y los diferentes sistemas de unin utilizados para conectar los diferentes
componentes del cromatgrafo, deben ser considerados a todos los efectos como volmenes muertos
capaces de originar prdidas de eficacia del sistema.
El radio interno y la longitud del tubo de conexin que pueden provocar una prdida de )N
platos, vienen dados por la ecuacin:
Como puede verse, el factor fundamental en la prdida de eficacia, es en este caso el radio
del tubo de conexin, ya que la prdida de eficacia aumenta en funcin de su cuarta potencia; este
hecho, obliga a que todos los tubos de conexin en sistemas de alta eficacia sean extremadamente
finos (del orden de 0,1 mm de dimetro).
Respecto a las conexiones entre tubos, debe estarse extremadamente seguro de que a la hora
22
Figura 6.- Volmenes muertos provocados por conexiones mal realizadas
de realizar la conexin no se introducen volmenes muertos de ningn tipo (figura 6), no slo debido
al ensanchamiento de banda que provocara, sino al hecho, de mayor importancia todava, de que un
volumen muerto en este tipo de conexiones deja frecuentemente zonas que no son barridas por el
flujo de fase mvil, lo que conduce no slo a ensanchamientos de banda, sino tambin a distorsiones
de la forma de la banda que en ocasiones pueden llegar a ser de gran importancia.
23
Figura 7.- Cromatograma tpico de una mezcla
INTERPRETACIN DEL CROMATOGRAMA
Como ya se ha mencionado, la cromatografa es bsicamente un mtodo de separacin, tal
vez el ms potente de que se puede
disponer en un laboratorio, aunque
debe tenerse siempre en cuenta que
la cromatografa, a efectos
analticos, es una tcnica ciega. Los
mtodos cromatogrficos, por si
mismos, pueden informar, en el
mejor de los casos, del nmero de
compuestos qumicos que estn
presentes en una mezcla (figura 7),
pero nunca de proporcionar
informacin sobre su naturaleza.
Anlisis cualitativo
A pesar de la limitacin mencionada, ya desde los primeros trabajos publicados sobre
tcnicas cromatogrficas instrumentales, se indicaba que los parmetros de retencin (tiempo o
volumen) de un compuesto, eran constantes para un sistema cromatogrfico dado, por lo que podan
ser utilizados de forma cualitativa para identificar compuestos.
Evidentemente, los parmetros de retencin de un compuesto dependen de un gran nmero
de variables, por lo que la identidad entre analitos y patrones solamente puede ser establecida para
un sistema dado y en un momento dado, lo que hace muy trabajosa la identificacin de una
substancia por este mtodo. Aunque existen en la bibliografa colecciones de datos de retencin para
diversos compuestos, estos datos tienen un valor puramente orientativo, ya que resulta muy difcil
reproducir los datos de retencin (de unos laboratorios a otros e incluso dentro del mismo
24
laboratorio) debido a la irreproducibilidad de los sistemas cromatogrficos. De forma anloga, las
ecuaciones empricas desarrolladas para correlacionar datos de retencin con la estructura qumica
de diversos compuestos es utilizable nicamente para la identificacin de compuestos pertenecientes
a series homlogas muy bien definidas.
Teniendo en cuenta estas limitaciones, el mejor mtodo para realizar un anlisis cualitativo,
es, todava, la comparacin directa de los parmetros de retencin de los picos de la muestra con los
de substancias patrn, trabajando en ambos casos con el mismo sistema cromatogrfico. A la hora
de realizar las comparaciones, es conveniente utilizar determinados parmetros, que si bien no
eliminan totas las posibilidades de variabilidad de los resultados, si permiten al menos corregir la
variabilidad inducida por determinadas condiciones; como parmetros de retencin utilizados
frecuentemente para anlisis cualitativo, los ms utilizados son:
1.- Tiempos o volmenes de retencin corregidos.
2.- Factores de capacidad.
3.- Tiempos de retencin relativos.
De entre estos parmetros, los dos primeros permiten corregir las diferencias de retencin
debidas a los volmenes muertos de cada sistema.
Los tiempos de retencin relativos se definen mediante la ecuacin:
Donde t es el tiempo de retencin del compuesto que se trata de identificar y t
p
el tiempo de
retencin de un compuesto que se toma como patrn. La utilizacin de los tiempos de retencin
relativos, permite eliminar todos los factores de variabilidad, salvo los que pueden afectar a los
25
valores de k' (naturaleza de la fase estacionaria, naturaleza de la fase mvil y temperatura), por lo
que este parmetro es el ms adecuado para la identificacin cualitativa de compuestos en base a los
datos bibliogrficos.
Una ltima consideracin sobre la utilizacin de las tcnicas cromatogrficas para el anlisis
cualitativo, es que estas tcnicas permiten realizar una identificacin negativa, es decir, permiten
asegurar con absoluta certeza que un compuesto determinado no se encuentra presente en una mezcla
pero, por el contrario, no permiten nunca asegurar la presencia de un compuesto, ya que no se puede
excluir la posibilidad de que dos compuestos diferentes presenten los mismos parmetros de
retencin sobre un sistema dado. Este problema puede soslayarse en parte realizando la identificacin
sobre diversas columnas, con diferentes fases estacionarias. Por supuesto, es obvio que los resultados
cualitativos son ms fiables cuanto mayor nmero de columnas se utilicen, pero el mtodo es largo
y tedioso; como norma general se puede decir que la identificacin de un compuesto sobre tres
columnas, aunque no proporciona una certeza absoluta, ofrece una fiabilidad suficiente a todos los
efectos.
Anlisis cuantitativo
Si bien, como se ha mencionado en el apartado anterior, las tcnicas de anlisis
cromatogrfico ofrecen escasas posibilidades para la realizacin de anlisis cualitativos, sus
posibilidades como tcnica cuantitativa son enormes. La cromatografa permite separar mezclas muy
complejas de productos, aun cuando stos sean de naturalezas muy semejantes, lo que permite un
anlisis directo de muestras que de otra manera seran muy difciles de cuantificar. Por otra parte,
los detectores que se utilizan en cromatografa ofrecen una respuesta muy fcil de relacionar con la
cantidad de analito contenida en la disolucin inyectada, y con una sensibilidad que, en ocasiones,
es casi imposible de alcanzar por medio de cualquier otra tcnica.
La medida del rea o de la altura del pico cromatogrfico, es el factor ms importante a la
hora de realizar un anlisis cuantitativo. La utilizacin de la altura de pico para la cuantificacin es
26
de gran comodidad, pero nicamente proporciona una exactitud aceptable en cromatogramas que
presenten picos agudos, estrechos, claramente definidos y muy simtricos; este procedimiento de
cuantificacin es interesante para anlisis de rutina, en los que se puede sacrificar la exactitud en
favor de la sencillez y la rapidez de las cuantificaciones. La utilizacin para el anlisis cuantitativo
de las reas de los picos, es el procedimiento de uso ms general cuando se requiere exactitud en las
cuantificaciones.
Existen multitud de mtodos que permiten medir las reas bajo los picos cromatogrficos,
aunque la medida por medio de integracin electrnica es con mucho la ms utilizada; de entre los
restantes mtodos, slo se mencionar el de la "altura por la mitad de la anchura", un mtodo muy
sencillo y que ofrece muy buenos resultados. Este mtodo consiste en medir la anchura del pico
cromatogrfico a la mitad de su altura (W
1/2
), el producto de este valor por su altura:
A = W
1/2
h
Ofrece un valor A, que es proporcional al rea del pico. Este mtodo proporciona muy buenos
resultados para picos de forma aproximadamente gaussiana, pero los resultados son menos
satisfactorios para picos no simtricos o para picos pequeos y anchos.
Al margen de cualquier otro mtodo de medida de reas, el sistema ms utilizado actualmente
es el integrador electrnico; un dispositivo de esta naturaleza digitaliza la seal analgica
proporcionada por el detector, detecta el comienzo y el final de cada pico cromatogrfico, integra
digitalmente el rea bajo la curva y corrige automticamente la linea de base. El nico problema que
presentan los integradores digitales se plantea a la hora de integrar picos parcialmente resueltos
(figura 7), ya que muchos integradores tienen limitadas sus posibilidades de medida en estos casos
a muy pocos mtodos, llegando a realizar en algunos casos extremos integraciones totalmente
disparatadas. Este problema, no obstante, se resuelve bastante bien mediante la utilizacin de
integradores basados en ordenadores personales, que permiten al usuario tanto la visualizacin de
la forma en que se han integrado los picos, como la posibilidad de modificar la forma de integracin
en caso de ser necesario.
27
Figura 8.- Posibles mtodos de integracin de picos no resueltos
Mtodos de calibrado
Una vez conocida el rea o la altura del pico que se pretende cuantificar, es posible conocer
su masa o su concentracin en la muestra inyectada si se conoce la curva de calibracin que relaciona
la respuesta del detector con la cantidad de compuesto inyectada.
Las concentraciones de un analito que pueden ser medidas en cada caso dependen del rango
dinmico del detector, una caracterstica de cada combinacin detector/analito, que se define como
el rango de concentraciones de soluto entre las cuales el detector produce una respuesta dependiente
de la concentracin de soluto que llega a l; el valor mnimo de este rango se corresponde con la
sensibilidad del detector, y el mximo con la concentracin de soluto a partir de la cual la respuesta
del detector es constante (saturacin). Dado que casi todos los detectores presentan curvas de
respuesta de tipo sigmoide, debe tenerse en cuenta que lo ms conveniente es trabajar, siempre que
sea posible, dentro del rango dinmico lineal del detector, que se define como la zona del rango
dinmico en la que la respuesta del detector es lineal frente a la concentracin de soluto (figura 9);
las cuantificaciones realizadas fuera del rango dinmico lineal (figura 10) deberan ser evitadas en
28
Figura 9.- Calibracin con respuesta lineal
Figura 10.- Calibracin con respuesta exponencial
lo posible, realizndose nicamente en caso de trabajar con concentraciones muy prximas al lmite
de sensibilidad del detector.

De los diferentes mtodos que existen para realizar el calibrado, los ms utilizados con
mucho son el mtodo del estndar externo y el mtodo del estndar interno.
El mtodo del estndar externo, consiste en inyectar en el equipo volmenes constantes de
29
disoluciones de concentraciones conocidas y crecientes del compuesto que se pretende cuantificar;
tras este proceso, se representa la cantidad de compuesto frente al tamao del pico (rea o altura),
debindose obtener una linea recta. A partir de esta recta de calibrado, es posible realizar la
cuantificacin en una muestra desconocida, por interpolacin grfica o matemtica del pico obtenido
en la recta de calibrado. El principal problema que plantea la calibracin por medio de este mtodo
es la reproducibilidad de la inyeccin, o bien el control estricto de las cantidades inyectadas, aunque
tomando las debidas precauciones, la exactitud alcanzada puede ser notablemente alta. Por otra parte,
la calibracin debe repetirse peridicamente para verificar la fiabilidad de la cuantificacin, lo que
en algunos casos puede hacer que este mtodo sea un poco tedioso.
La calibracin por el mtodo del estndar interno, se utiliza con frecuencia en el anlisis
cuantitativo para compensar posibles errores derivados de la manipulacin de la muestra. Este
mtodo consiste en esencia en aadir una cantidad conocida de un compuesto patrn a la muestra
a analizar antes de realizar con ella cualquier manipulacin; en el cromatograma, aparecern los
picos correspondientes al analito y al patrn aadido, y de la relacin entre el tamao de ambos,
podr calcularse, previo calibrado, la cantidad de analito existente en la muestra. Para efectuar el
calibrado en este mtodo, se preparan disoluciones de concentracin creciente del compuesto a
analizar a las que se aade una cantidad idntica en todos los casos del compuesto patrn; tras
obtener los correspondientes cromatogramas, se representa la concentracin del compuesto a
cuantificar en funcin de la relacin de los picos problema/patrn, con lo que se obtendr una recta
en la que es posible interpolar la relacin entre los dos picos que se obtenga al realizar el
cromatograma de una muestra desconocida. Los requisitos que debe cumplir un producto para ser
utilizado como patrn interno, sern:
a) El producto patrn debe dar un pico totalmente resuelto de los de la mezcla a analizar.
b) El pico del compuesto patrn debe estar situado en el cromatograma en las proximidades
de los picos de inters.
c) A lo largo de todo el proceso de anlisis, debe tener un comportamiento similar al de los
30
compuestos a cuantificar.
d) En ningn caso debe estar presente en la muestra a analizar.
e) Debe ser qumicamente estable, tanto frente a los componentes de la muestra como frente
a los compuestos que se puedan utilizar durante el proceso de anlisis.
Debe destacarse que, para los dos mtodos de calibracin mencionados, muchos sistemas de
integracin permiten realizar el clculo nicamente en base a un factor de respuesta obtenido a partir
de una sola concentracin de patrn; este mtodo de clculo asume implcitamente que la respuesta
del detector es lineal frente a la concentracin con pendiente 1, lo que muy raramente se cumple en
la prctica. En estos casos la calibracin debe realizarse nicamente con patrones cuya
concentracin de analito sea muy similar a la de las muestras ya que, en caso contrario, las
cuantificaciones realizadas mediante este tipo de clculo pueden alejarse notablemente de la realidad,
tanto ms cuanto mayor sea la diferencia de concentraciones entre patrn y muestra.