PREINFORME

EXTRACCIN Y VERIFICACIN DE LA ACTIVIDAD DE LA SUCCNICO DESHIDROGENASA CITOCROMO

OXIDASA Y EL EFECTO DE ALGUNOS INHIBIDORES
MARIA CAMILA OJEDA ROJAS
Marco Terico:
Qu tipo de inhibicin efecta el Malonato en la accin de la succnico deshidrogenasa?

Efecta una inhibicion competitiva, la Succinato deshidrogenasa usando malonato que es un
inhibidor de la respiracin celular, se une al sitio activo del succinato deshidrogenasa el cual va a
acumular succinato, alfa-cetoglutarato y citrato.

Segn Hans Adolph Krebs se encuentra que la inhibicin especifica de la enzima Succinato
deshidrogenasa con Malonato, anula el efecto cataltico de todos los cidos, con acumulacin de
Succinato en forma proporcional a la cantidad aadida de acido. (Migel Angel Ordorica Vargas &
Maria de la luz Velazquez Monroy)
Succinato deshidrogenasa:
Esta xido- reductasa cataliza la oxidacin del Succinato mediante la eliminacin estereoespecifica
de dos tomos de hidrogeno, en forma de hidruro H
-
y protn H
+
, para formar el enlace trans del
fumarato. La enzima es un complejo formado por cuatro subunidades, con FAD Y un Hemo tipo b
como grupos prostticos, adems de 3 ncleos con Hierro y azufre. (Migel Angel Ordorica Vargas
& Maria de la luz Velazquez Monroy)


La oxidacin de Succinato reduce el FAD a FADH
2
.

El FADH
2
se oxida transfiriendo los electrones, atraves de los complejos de hierro y azufre, hasta la
Coenzima Q componente de la cadena respiratoria.
La Succinato deshidrogenasa es inhibida por el Malonato, con estructura semejante al succinato,
pero que nicamente tiene un metenilo (-CH
2
-) y no se puede oxidar por deshidrogenacion.
Tambien la inhibe el Oxalacetato, que tampoco se puede deshidrogenar.
La Succinato Deshidrogenasa est incluida en la membrana interna de la mitocondria, formando
parte del complejo II de la cadena respiratoria. (Migel Angel Ordorica Vargas & Maria de la luz
Velazquez Monroy)

Mecanismo de accin del cianuro sobre la citocromo oxidasa:
Forma complejos estables con iones metlicos, teniendo una gran afinidad por el hierro
frrico.
El complejo que forma con el metal inactiva ciertas enzimas, siendo la mas importante la
citocromo-oxidasa.
La inhibicin de la citocromo-oxidasa produce anoxia citotxica y paso de la glucolisis
aerobia a anaerobia.
Se inhibe la transformacin del piruvato en el ciclo de Krebbs, resultando en
hiperproduccin de lactato y acidosis metablica severa. (AVV, 2008)
El empleo de espectrofotometra diferencial o la medida del consumo de oxgeno
mediante un electrodo de oxgeno combinados con el empleo de compuestos exgenos
que actuaban como inhibidores respiratorios o como donadores o aceptores artificiales de
electrones ha sido de gran utilidad en el establecimiento de la secuencia de actuacin en
la cadena respiratoria.
Algunos de estos inhibidores son:
Rotenona: producto vegetal de Sudamrica que se utiliza como insecticida que bloquea el
flujo de electrones desde el NADH a la coenzima Q en el CI..
Amital: frmaco barbitrico que bloquea el flujo de electrones desde el NADH a la
coenzima Q en el CI.
Piericidina A: antibitico. Bloquea el flujo desde el NADH al CoQ en el Complejo 1, al
inhibir el flujo de electrones desde los centros sulfofrricos al CoQ.
Antimicina A: antibitico de Streptomyces que bloquea el flujo electrnico desde el cit bH
a CoQ en el CIII. Se une a Qn, cerca del hemo bH por el lado de la matriz.
Mioxitiazol: previene el flujo de electrones desde CoQH
2
a la protena Rieske en el CIII. Se
une al sitio Qp, cerca del centro Rieske y del hemo bL al lado intermembranar de la
membrana.
Cianuro, Azida, Monoxido de carbono: Actan sobre la citocromo oxidasa, CIV. Cianuro y
azida reaccionan con la forma oxidada del citocromo objeto y CO con la forma reducida.

Donadores y aceptores de electrones artificiales son compuesto que pueden ceder o
captar electrones de la cadena respiratoria en reacciones espontneas no enzimticas:
dinitrofenol (dnp) y carbonilcianida-p-trifluorometoxifenilhidrazona (fccp): desacoplante
qumico que no afecta a la estructura mitocondrial. Son cidos dbiles con propiedades
hidrofbicas, lo que les permite difundir a travs de las membranas mitocondriales.
Despus de entrar en la matriz mitocondrial en forma protonada, pueden liberar el
protn, disipando de esta forma el gradiente de protones formado por la cadena
respiratoria.
Ionforos: Compuestos como la valomicina permiten a los iones inorgnicos atravesar la
membrana. Estos ionoforos desacoplan la cadena de transferencia de electrones de la
fosforilacin oxidativa disipando la contribucin elctrica al gradiente electroqumico a
travs de la membrana mitocondrial.
El empleo de estos compuestos fue utilizado como mtodo para determinar la secuencia de
transportadores de electrones en la cadena de transferencia de electrones mitocondrial.















Fichas tcnicas:

Nombre Formula Aspecto Peligrosida
d
Primeros auxilios y medidas de
higiene
Informacin
adicional
Buffer de
Fosfatos
-- Forma:
Lquida
Color:
Amarillo
Olor:
Inodoro
No txico,
anticorrosi
vo. No
presenta
ninguna
peligrosida
d para la
salud
significativ
a.
Inhalacin: coloque en un lugar con
ventilacin, respiracin artificial en
caso de ser necesario.
Piel: Lavar con abundante agua.
Ojos: Enjuagar con abundante agua
manteniendo los parpados bien
abiertos. Consultar medico.
Ingestin: Hacer que el afectado
beba mucha agua.
Para usos de
laboratorio,
anlisis,
investigacin y
qumica fina.
p
fenilendiamina
C
6
H
8
N
2
/C
6
H
4
(NH
2
)
2
Cristales
blancos a
ligeramente
rojos.
(N)

(C)


Inhalacin: Aire limpio y someter
atencin medica.
Piel: Quitar la ropa contaminada y
lavar con abundante agua.
Ingestin: Enjuagar la boca y
someter a atencin medica.
Se utiliza para
fabricar tintes
para el pelo y
otras tinturas,
poliuretano,
revelado de
fotografas
Succinato de
sodio
(CH
2
COONa)
2
.6H
2
O Solido
Blanco
inodoro.
-- Inhalacin: Trasladar a la persona al
aire libre.
Piel: Lavar abundantemente con
agua. Quitarse las ropas
contaminadas.
Ojos: Lavar con agua abundante
manteniendo los prpados abiertos.
Ingestin: Beber agua abundante.
Provocar el vmito. En caso de
malestar, pedir atencin mdica.
En caso de
prdida del
conocimiento
nunca dar a
beber ni
provocar el
vmito.
Cianuro de
potasio
KCN Terrones
amorfos o
masa
cristalina
de color
blanco. Sin
olor cuando
esta seco.
(Xn)

(N)

Inhalacin: Trasladar al aire fresco,
si no respira dar respiracin
artificial, si respira con dificultad
suministrar oxigeno.
Ingestin: Lavar la boca con agua,
no dar nada de beber ni inducir el
vomito.
Piel: Retirar ropa contaminada lavar
la zona afectada con abundante
agua.
Ojos: Lavar con abundante agua
Mnimo durante 15 min.

Estable si esta
seco. En
presencia de
aire o
humedad se
descompone
para formar
cianuro de
hidrogeno.
Azida de sodio NaN
3
Solido,
blanco,
inodoro.
(C)

(N)

(Xn)

Inhalacin: aire fresco.
Tras parada respiratoria:
Inmediatamente proceder a
respiracin instrumental.
En su caso, aplicar oxgeno.
Piel: aclarar con abundante agua.
Eliminar inmediatamente la ropa
contaminada.
Ojos: Aclarar con abundante agua,
manteniendo abiertos los prpados.
Ingestin: estando consciente,
beber abundante agua, provocar
vmito, administrar carbn activo
(20 - 40 g de suspensin al 10%).
Llamar inmediatamente al mdico.
Mantener
seco el lugar
de trabajo. La
sustancia no
debe entrar
en contacto
con agua.








Malonato de
sodio
C
3
H
2
Na
2
O
4
Polvo,
cristalino
blanco,
inodoro.
Sustancia
no
peligrosa.
Inhalacin: Ir al aire fresco. En caso
de asfixia proceder a la respiracin
artificial. En caso de que persista el
malestar, pedir atencin mdica.
Piel: Lavar abundantemente con
agua y jabn. Quitarse las ropas
contaminadas.
Ojos: Lavar con agua abundante
(mnimo durante 15 minutos),
manteniendo los prpados abiertos.
Pedir atencin mdica.
Ingestin: Enjuagarse
inmediatamente la boca. Por
ingestin de grandes cantidades: En
caso de malestar, pedir atencin
mdica.
Asegurar una
buena
ventilacin y
renovacin de
aire del local.
Oxalato de
sodio
C
2
Na
2
O
4
Solido,
blanco,
inodoro
(Xn)

(C)

Inhalacin: aire fresco.
Piel: aclarar con abundante agua.
Eliminar ropa contaminada. Llamar
al mdico.
Ojos: Aclarar con abundante agua,
manteniendo abiertos los
prpados.
Ingestin: hacer beber
inmediatamente agua abundante.
Llamar al mdico.
Evitar la
penetracin
del agua de
extincin en
acuferos
superficiales o
subterrneos.
(Hojas de datos de Seguridad, 2005)




Procedimiento:

Extraccin y preparacin de las enzimas y coenzimas
Pesar una muestra de 6g de tejido

Colocarla en un mortero

Enfriar en bao con hielo

Macerar
Adicionando buffer de fosfatos

Centrifugar por 5 minutos

Transferir el sobrenadante a un erlenmeyer pequeo

Mantenerlo en bao de hielo todo el tiempo



Seguimiento de la reaccin catalizada por la citocromo oxidasa.
Hiptesis:


4 Tubos de ensayo
Preparar una serie de tubos segn la tabla

con arena
lavada
Cuidadosamente
hasta formar
una pasta suave
Poco a poco, hasta
completar un volumen
de aproximadamente
18 mL.
a 1500
rpm Identificado
como extracto
enzimtico
Hasta el momento
de usarlo.

Debidamente marcados
e identificados.


Reactivos (mL) Blanco 1 2 3 4
Buffer fosfatos 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Malonato de sodio 0,0 0,0 0,0 1,0 0,0
Cianuro de potasio 0,0 0,0 1,0 0,0 0,0
Azida de sodio 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0
Agua destilada 2,0 1,0 0,0 0,0 0,0
Extracto enzimtico 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
p-fenililendiamina 0,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Mezclar bien el contenido
Incubar a 37
o
C

Observe y escriba los resultados obtenidos en cada tubo.



Seguimiento de la reaccin catalizada por la succnico deshidrogenasa y la actividad de
algunos inhibidores.
Hiptesis:


6 Tubos de ensayo

Pipetee los reactivos en el siguiente orden
Hasta cuando
aparezca el
complejo
coloreado



Reactivos
(mL)
Blanco 1 2 3 4 5
Solucin
tampn
1.5 1,5 1,0 0,5 0,5 1,0
Succinato de
sodio
- 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Azul de
metileno
0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,20
Malonato de
sodio
- - - - 1,0 -
Oxalato de
sodio
- 1,0 - - - -
Oxalactico - - 1,0 - - -

Dejar tubos a bao de mara

Y agregue sin retirarlos


Extracto
enzimtico
(mL)

1,0

0,5

1,0

1,5

1,0

1,0




Agite cada tubo invirtindolo


Adicione 0,5 mL de aceite mineral



Registre el tiempo necesario para que se presente la decoloracin







termostatado a
37
o
C durante
10 minutos
djelos en
reposo
Tomando como
el momento
cero aquel en el
que se adiciona
la enzima
Bibliografa:

AVV, A. (16 de Febrero de 2008). Intoxicacion por Cianuro. Recuperado el 10 de noviembre de
2013, de http://es.slideshare.net/ALVARO_AAV/intoxicacin-por-cianuro
Hojas de datos de Seguridad. (21 de Marzo de 2005). Recuperado el 10 de Noviembre de 2013, de
http://www.cisproquim.org.co/HOJAS_SEGURIDAD/Cianuro_de_potasio.pdf
Migel Angel Ordorica Vargas & Maria de la luz Velazquez Monroy. (s.f.). Ciclo del cido Ctrico.
Recuperado el 10 de Noviembre de 2013, de
http://www.bioquimica.dogsleep.net/Teoria/archivos/Unidad62.pdf