Espectrofotometria Mtodos Quantitativos Instrumentais So mais sensveis; Requerem quantidades menores de amostras; So mais seletivos que os mtodos clssicos (anlise volumtrica).
So caracterizados pela interao entre a matria e a energia eletromagntica.
Energia Radiante: dividida em vrias regies e relaciona-se com os mecanismos de transies atmicas ou moleculares pertinentes a cada regio.
Mtodos Espectromtricos Regio do espectro (comprimento de onda) Modificaes Interao energia / matria Raios gama 0,0001 0,01 nm Reaes nucleares Raios x 0,01 2 nm Transies de eltrons de camada K e L Ultravioleta afastado 2 200 nm Transies de eltrons de camada intermediria Ultravioleta 200 400 nm Transies de eltrons valncia (externos) Visvel 400 750 nm Infravermelho prximo 0,75 2,5 m Vibraes moleculares Infravermelho 2,5 25 m Rotaes moleculares e vibraes fracas Microondas 1 mm 30 cm Rotaes moleculares MTODOS ESPECTROMTRICOS ESPECTROSCOPIA DE ABSORO NO UV-VISVEL Conceito: tcnica analtica quali-quantitativa que tem como fundamento a interao da radiao eletromagntica com diferentes espcies qumicas: molculas, ons, tomos isolados.
- Absoro: processo especfico relacionado com a estrutura da espcie absorvente.
ESPECTROSCOPIA DE ABSORO NO UV-VIS Objetivo: avaliao da qualidade de medicamentos, alimentos, cosmticos, insumos, anlises clnicas e toxicolgicas: IDENTIFICAO E QUANTIFICAO.
Caractersticas: facilidade de manuseio e operao, boa sensibilidade, boa exatido, ampla aplicabilidade, porm pouca seletividade. LEI DE LAMBERT-BEER Correlaciona a intensidade de energia absorvida com a concentrao da soluo.
Io
It b c= concentrao da espcie qumica absorvente (soluo em anlise) b= espessura atravessada pelo feixe luminoso I o = intensidade de luz incidente It = intensidade de luz transmitida = cte caracterstica para cada soluo. I o > It A quantidade de luz que absorvida por uma soluo depende da concentrao da substncia absorvente e da espessura da soluo atravs da qual a luz passa. Log I0 = . c . It It A = . c . It Desvios da Lei de Lambert-Beer Presena de mais de uma substncia absorvente;
Mudana de natureza do solvente ou solues muito concentradas;
Incidncia de luz com mais de um comprimento de onda em virtude de uma larga faixa de luz. Ps. Espectrofotmetros de boa qualidade apresentam menor desvio porque fornecem faixas de luz estreitas e um mnimo de luz dispersa. Definies Deslocamento batocrmico: deslocamento da absoro para comprimento de onda maior devido efeitos de substituio do solvente (deslocamento para o vermelho). Deslocamento hipsocrmico: deslocamento da absoro para comprimento de onda menor devido efeitos de substituio do solvente (deslocamento para o azul).
Efeito hipercrmico: o aumento da intensidade de absoro.
Efeito hipocrmico: uma diminuio da intensidade de absoro.
Espectroscopia no UV-Vis -Para quantificar substncias que no absorvem a luz a nenhum comprimento de onda da regio do UV ou compostos coloridos, as leituras devem ser efetuadas na regio do visvel (Vis) - 380 780 nm.
- Ou realizar reao da substncia com reagente especfico, de modo a desenvolver cor cuja intensidade diretamente proporcional concentrao. Cor Comprimento de onda (nm) Violeta 390 455 Azul 455 492 Verde 492 577 Amarelo 577 597 Laranja 597 622 vermelho 622 - 780 Regio do visvel ESPECTROFOTMETROS
- Quando se mede a absoro para fins de quantificao, o comprimento de onda escolhido, aquele em que se observa absoro mxima.
- A curva de absoro espectral a representao grfica da absorbncia em relao ao comprimento de onda. Fonte luminosa:
-Regio do UV: lmpada de descarga de hidrognio ou de deutrio (190 370 nm). -Regio do Visvel: lmpada de filamento de tungstnio (350 750 nm)
Monocromador: seleciona comprimento de onda da fonte luminosa.
Detector: desenvolve corrente eltrica.
Amplificador: amplia o sinal.
Galvanmetro: mede a intensidade de luz.
Cubeta: local onde transferida a amostra ou soluo. Pode ser de vidro, quartzo ou slica transparente, com faces perfeitamente paralelas, espessura de 1cm (padro).
Variaes nos clculos de doseamento - Absortividade (): razo entre absorbncia (A) e o produto da concentrao (c) em g/L e caminho ptico (b) em cm.
= A/bc ou A = . b .c
- Absortividade Molar (E) = razo entre absorbncia (A) e o produto da concentrao (c) em mol/L e caminho ptico (b) em cm.
E = A/bc ou E = . PM
Aplicaes da fotometria (Exemplo prtico) Dosagem de Protena A principal finalidade de uma medida espectrofotomtrica, nas regies do ultravioleta e visvel, avaliar quantidades. Rigorosa calibrao visando obter resultados exatos. Para obter-se uma curva de calibrao alguns aspectos devem ser considerados como:
1. A escolha de uma soluo padro ( Ex:proteina-Albumina) 2. O estabelecimento de um branco adequado 3. A seleo da rea espectral.
Preparo de uma curva padro (ou calibrao) O preparo da curva de calibrao de grande importncia e deve ser bem entendido. Todo analista deve ser capaz de preparar suas prprias curvas de calibrao e interpretar os resultados obtidos.
Para se obter o valor da concentrao de substncias cuja concentrao se desconhece, necessrio estabelecer uma relao entre a absorbncia desta soluo em diferentes concentraes com as suas concentraes.
Isto se chama curva de calibrao (curva padro).
Espectro de absoro do permanganato de potssio A amostra (1) tem 66 mg/L de concentrao.
As demais (2),(3),(4) e (5) foram diludas para (0,8), (0,6), (0,4) e (0,2) da concentrao da primeira amostra, respectivamente. - Preparar a srie de padres de concentrao conhecida, cobrindo-se a faixa de leitura. Curva de Calibrao Procedimento 1. Preparar uma srie de padres exatos, cobrindo a faixa de trabalho usada ou indicada. Usar o padro recomendado para o mtodo a ser calibrado. 2. Dosar todos os padres de acordo com a tcnica recomendada. Efetuar as leituras colorimtricas, usando o branco apropriado para acertar o zero-A, alm do comprimento de onda recomendado pela literatura ou obtido pela curva de absoro espectral previamente realizada. 3. Obter os valores de Absorbncia. 4. Plotar os resultados em papel milimetrado, relacionando Absorbncia (ordenada) com as concentraes dos padres (abscissa). Examinar bem os pontos e decidir se eles sero cobertos por uma linha reta. Se os pontos aparentemente seguirem uma linha reta, traar uma curva de modo que mais se aproxime de todos os pontos obtidos. A curva no deve ser traada de ponto a ponto, mas interpolando atravs dos pontos. 5. Examinar a curva traada, avaliando se ela tem sensibilidade correta
Temos que preparar as diluies do padro 10 mg/ml tendo como volume final 1,0 ml. Recorremos a regra geral da diluio: C i V i = C f V f onde: C i = concentrao inicial (10 mg/ml) V i = volume a ser retirado do padro (?) C f = concentrao final (2mg/ml) V f = volume final (1,0 ml)
V i = 0,2 ml V i = 0,2 ml do padro + 0,8 ml de gua
1,0 ml (2 mg/ml)
Curva padro de Albumina Na prtica, como ser a performance de vocs? Tubo Conc. (mg/ml)
Albumina 10 mg/ml (ml)
gua (ml) Biureto (ml) A 1 2,0 4,0 2 4,0 4,0 3 6,0 4,0 4 8,0 4,0 5 10,0 4,0 BR ----- ----- 1,0 4,0 ----- Preenchendo a tabela para obter a curva... Tubo Conc. (mg/ml) Albumina 10 mg/ml (ml)
gua (ml) Biureto (ml) A 1 2,0 4,0 2 4,0 4,0 3 6,0 4,0 4 8,0 4,0 5 10,0 4,0 BR ----- ----- 1,0 4,0 ----- 0,2 0,8 0,4 0,6 0,6 0,4 0,8 0,2 1,0 --- Deixar os tubos em repouso por 15 minutos. Ler as absorbncias de todos os tubos contra o Branco no adequado. Traar o grfico e analisar.
A curva padro ideal deve ter ngulo aproximado de 45
2 4 6 8 10 mg/ml 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 A C Equao da reta: y = bx + a Uma boa curva padro 1,0 ml da amostra 4,0 ml do reagente de biureto Esperar 15 minutos Ler contra o Branco
Amostra Conc. ? Determinar a concentrao de protenas totais na amostra recorrendo curva padro
2 4 6 8 10 mg/ml 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 A C Dosagem de protenas totais de uma amostra Equao da reta:
y = bx + a
2 4 6 8 10 mg/ml 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 A C Curva de calibrao da albumina Y = 0,0579x + 0,001
0,438 = 0,0579x + 0,001
X = 7,56 mg/mL
Leitura da amostra [ ] ? 7,56 mg/mL Exemplo pela extrapolao grfica e pelo clculo da equao da reta: um artifcio usado rotineiramente e seu clculo feito como:
Finalmente, para calcular a concentrao da amostra:
concentrao padro FC = absorbncia padro O uso de Fator de Calibrao (FC) [amostra] = Absorbncia da amostra FC Obtendo o Fator de Calibrao pela prpria curva padro FC = cotag 0. 5
cateto oposto (sen ) cateto adjacente (cos ) Portanto: FC = 1 / tg Como: tg = sen / cos Ento: FC = cos / sen De onde se conclui que: cateto adjacente X2 - X1 FC = = cateto oposto Y2 - Y1 Finalmente, para calcular a concentrao da amostra: [amostra] = Absorbncia da amostra FC