PRACTICA # 2.

REVISIN DE TECNICAS MS USADAS EN MICROBIOLOGA

OBJETIVO.
El alumno debe recordar y aprender las tcnicas que sern utilizadas
frecuentemente durante el curso.
INTRODUCCIN.
Las tcnicas microbiolgicas se utilizan para detectar si hay microorganismos
sobre una muestra y para identificarlos y cuantificarlos. Por tanto, el primer paso
en el estudio microbiolgico ser aislar las diferentes especies de
microorganismos que haya en la muestra.
Tcnicas de aislamiento.
La tcnica para el aislamiento comienza preparando un inculo de siembra, que es
la deposicin de una pequea porcin de la muestra en el medio o en los medios
de cultivo adecuado, en funcin de las especies microbianas que se espera
encontrar.
Por eso existen distintos mtodos o tipos de siembra, en funcin de la muestra de
partida, del medio en el que se siembra y de la finalidad del estudio. Describiremos
la siembra para inoculacin y la siembra para aislamiento.
Siembra para inoculacin: La inoculacin consiste en tomar una pequea
porcin de la muestra y diluirla para dispersarla y que crezca con ms
facilidad en el medio de cultivo. Se puede inocular en medio lquido o en
medio slido.
Siembra para aislamiento: La finalidad de este tipo de siembras es la de
obtener cultivos puros. Se siembra en placa de Petri que contienen medios
de cultivo slidos. Existen varios tipos de siembras para aislamiento:
Siembra en estra o zig-zag, siembra por estra mltiple, siembra de los
cuatro cuadrantes, siembra de los tres giros.
Siembra en estria o zig-zag.


Siembra de los cuatro cuadrantes.
En la base de la placa se dibujan dos lneas perpendiculares que debern
cruzarse en el centro de la placa de tal forma que esta quede dividida en 4
cuadrantes iguales.Se tomara con el asa de siembra estril una cantidad de
inoculo y se adicionara al extremo superior de uno de los cuadrantes
extendindose por todo ese cuadrante en forma de zig-zag.
Realizamos la misma operacin sin flamear en todos los dems cuadrantes
siguiendo un orden de tal forma que iremos arrastrando el MIO problema,
observndose en el ltimo cuadrante las colonias mas aisladas.

Siembra de los 3 giros.
Se rotula la placa de forma anloga al caso anterior. Se toma inoculo con el
asa de platino y se siembra por estra la mitad superior de la placa. Sin
flamear el asa de platino giraremos la placa unos 90 y volvemos a sembrar
una segunda vez .As sucesivamente hasta completar toda la siembra. Esta
tcnica no es muy utilizada porque no permite buenos aislamientos.

Tcnica de Siembra por dilucin.
Se dispondr de una batera de tubo con medio de cultivo especifico o agua
esteril segn los casos.
Se adicionara una cantidad de muestra slida o liquida en los tubos
sabiendo la cantidad de muestra o inoculo que se aade en el tubo inicial.
Se agitara hasta la homogenizacin.
Con pipeta estril se tomara una cantidad especfica o exacta y se
adicionara al segundo tubo, que se homogeniza. Repetimos la operacin
anterior con el tercer tubo y as sucesivamente hasta obtener la dilucin
deseada.
Posteriormente se inocula en placas de cultivo con una cantidad de inoculo
exacto y extender mediante la Tcnica de Barry.


Siembra por estria en tubos con medio solido inclinado.
Se toma con asa de siembra previamente esterilizada por flameado una
cantidad de muestra adecuada.Se aade al tubo desde el fondo de la
superficie de este, realizando movimientos ascendentes en zigzag hasta
completar toda la superficie del medio.Este mtodo es utilizado para
conservar cepas durante largos periodos.

Siembra por picadura.
Se suele tomar un hilo de siembra aunque en algunas ocasiones tambin
puede hacerse con asa de siembra. Consiste en introducir el asa en el
medio de cultiv que se encuntra en el tubo hasta el fondo de este y en
posicin central. Esta tcnica se utiliza para siembra en medios
semislidos.


Siembra por picadura y estria.
Consiste en la utlizacion de las dos tcnicas descritas anteriormente. Este
mtodo se lleva a cabo cuando el medio es solido y esta inclinado. Primero
se realiza la siembra por picadura y posteriormente la siembra por estria.

MATERIAL
1 Matraz Erlenmeyer de 250 ml.
2 Cajas Petri
2 Tubos de ensayo
1 Pipeta graduada de 10 ml
1 Pipeta graduada de 1 ml
1 Porta-asa con asa
1 Agitador de vidrio
1 Microscopio
1 Porta objetos
1 Probeta de 100 ml
1 Frasco de dilucin
1 Licuadora
1 Balanza granataria
Reactivos
Agar Nutritivo
Reactivos de Gram
Aceite de Inmersin
Algodn, papel manila, agua destilada
Solucin de hipoclorito de sodio al 2ppm
Solucin salina al 0.9% (3 a 5 tubos con 9 ml y un frasco con 90 ml)

PROCEDIMIENTO.
Preparacin de la muestra.

Tcnica de Dilucin.

Nota 1: Los tubos de solucin salina deben estar previamente esterilizados.
Nota 2: Toda la tcnica se realiza con 2 mecheros encendidos para poder esterilizar el rea.
10 gr de
Jicama
Pesar
Adicionar los 10 gr de
jicama mas los 90 ml de
solucion salina al 0.9%
Realizar en una
licuadora esterilizada.
Licuar

Introducir la mezcla que
se licuo en un matraz
previamente
esterilizado.
Vaciar
1
Tomar 1 ml de la muestra y agregarla al primer tubo de ensayo que contiene 9 ml de solucion salina al 0.9%( identificado como
10-2).
Agitar 27 veces con cada mano.
Adicionar 1ml del tubo 10-2 en una caja petri .Posteriormente se le agrega el agar nutritivo.
Realizar la tecnica de Barry
2
Tomar 1 ml del tubo 10-2 y agregarlo a un nuevo tubo con 9 ml de solucion salina al 0.9%(identificado como 10-3).
Agitar 27 veces con cada mano
Adicionar 1 ml del tubo 10-3 en una caja petri.Posteriormente se le agrega el agar nutritivo.
Realizar la tecnica de Barry
3
Tomar 1 ml del tubo 10-3 y agregarlo a un nuevo tubo con 9 ml de solucion salina al 0.9%(identificado como 10-4).
Agitar 27 veces con cada mano
Adicionar 1 ml del tubo 10-4 en una caja petri.Posteriormente se le agrega el agar nutritivo.
Realizar la tecnica de Barry
4
Repetir la tecnica hasta lograr la disolucion 10-6.
Siembra en tubos
1. Sembrar en los tubos de agar (inclinados), con el asa previamente esterilizada,
picar-sacar y realizar una pequea estra desde abajo hasta el pico.
2. Los tubos con caldo se siembran introduciendo la estra y realizando una
pequea agitacin con los dedos
3. Incubar los tubos a 35C durante 24 hrs.
Siembra en caja Petri
1. Realizar la tcnica de estra mltiple.
2. Realizar la tcnica de los 4 cuadrantes
3. Realizar la tcnica de zig-zag.
4. Incubar los tubos a 35C durante 24 hrs.
RESULTADOS.

En todos los agar y caldos se sembr E. Coli
Citrato de Simmons: Verde (-)
El medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y
no hay cambio de color.
Caldo urea: Rosa (+)
La enzima ureasa hidroliza la urea en amoniaco y anhdrido carbnico, ante la
variacin del pH por la alcalinizacin el indicador Rojo Fenol, vira de amarillo claro
a ligeramente rosado o rosa mexicano.

Caldo Verde Brillante Bilis: No vire (-)
Ausencia de gas.
Agar de Hierro: Amarillo A/A gas (-)
Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta
glucosa, y lactosa. Sin produccin de gas.
Agar LIA: morado/caf K/A
Descarboxilacin K / K = lisina o sin fermentacin.
Agar MIO: Mobilidad (+) Indol (-) Ornitina (+)
Movilidad positiva: Presencia de turbidez o crecimiento mas all de la lnea de
siembra.
Indol negativo: El color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.
Ornitina positiva: Color prpura.