UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS

APLICAES DAS ENZIMAS EM DIAGNSTICO

MOLECULAR: DESENVOLVIMENTO DE UM REAGENTE
ENZIMTICO PARA DETERMINAO DE LACTATO EM
FLUIDOS BIOLGICOS.










ROSCELLI SETTE SILVA MAIOLINI


















LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
2009

ROSCELLI SETTE SILVA MAIOLINI





APLICAES DAS ENZIMAS EM DIAGNSTICO
MOLECULAR: DESENVOLVIMENTO DE UM REAGENTE
ENZIMTICO PARA DETERMINAO DE LACTATO EM
FLUIDOS BIOLGICOS.




Monografia apresentada ao Departamento
de Bioqumica da Universidade Federal de
Lavras, como parte das exigncias do
curso de Ps-Graduao Lato Sensu em
Qumica, para a obteno do ttulo de
Especializao.


Orientador
Prof. Dr. Walcle de Carvalho Melo
Co-orientador
Dr. Mrcio Henrique Lacerda Arndt











LAVRAS
MINAS GERAIS BRASIL
2009

ROSCELLI SETTE SILVA MAIOLINI





APLICAES DAS ENZIMAS EM DIAGNSTICO
MOLECULAR: DESENVOLVIMENTO DE UM REAGENTE
ENZIMTICO PARA DETERMINAO DE LACTATO EM
FLUIDOS BIOLGICOS.




Monografia apresentada ao Departamento
de Bioqumica da Universidade Federal de
Lavras, como parte das exigncias do
curso de Ps-Graduao Lato Sensu em
Qumica, para a obteno do ttulo de
Especializao.

Aprovada em de de


Prof.


Prof.


Prof. Dr. Walcle de Carvalho Melo
UFLA
(Coordenador do curso)





LAVRAS
MINAS GERAIS BRASIL
2009











RESUMO


Esta monografia pretende fazer uma abordagem geral das propriedades das enzimas
enfatizando a especificidade enzimtica, o que permitiu grande desenvolvimento da enzimologia com
aplicaes em diversas reas como na indstria farmacutica, indstria de alimentos, Indstria do
lcool, papel, celulose, etc. Na indstria de Diagnstico Molecular o avano foi significativo
propiciando o desenvolvimento de reagentes de fcil aplicao laboratorial e alta especificidade o que
gerou resultados cada vez mais exatos e importantes para as decises mdicas. O Lactato, importante
analito plasmtico encontrado em casos de exerccios severos, convulses, acidose respiratria, etc.
pode ser quantificado por meio de um reagente enzimtico-colorimtrico que aps testes de validao
e anlise de desempenho passou a ser fabricado pela BioTcnica Indstria de Diagnstico in vitro.


Palavras-chaves: enzimas; especificidade; diagnstico molecular; Lactato; reagente enzimtico;
validao.































SUMRIO
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................................ 5

LISTA DE TABELAS ....................................................................................................................... 6

1. INTRODUO ............................................................................................................................. 7

2. OBJETIVOS.................................................................................................................................. 10
2.1. Objetivo Geral.............................................................................................................................. 10
2.2. Objetivos especficos.................................................................................................................... 10

3. DESENVOLVIMENTO TERICO........................................................................................... 11
3.1. Enzimas........................................................................................................................................ 11
3.2. Propriedades das Enzimas............................................................................................................ 12
3.3. O centro ativo enzimtico............................................................................................................. 13
3.4. Desnaturao e Inibio Enzimticas........................................................................................... 14
3.5. Importncia do estudo das Enzimas e suas aplicaes gerais....................................................... 15
3.5.1. Importncia Clnica................................................................................................................... 16
3.5.2. Importncia Prtica.................................................................................................................... 16
3.6. Enzimas como reagentes analticos em Diagnstico Molecular................................................... 19
3.7. Exemplos de reaes enzimticas no Diagnstico Molecular..................................................... 20
3.8. Fabricao de Reagentes/Kits para Diagnstico Molecular.......................................................... 22
3.9. Desenvolvimento de um reagente enzimtico na Indstria de
Diagnstico in vitro.............................................................................................................................. 22
3.10. A importncia do Lactato no Diagnstico Clnico..................................................................... 23
3.11. O Reagente Lactato..................................................................................................................... 25
3.11.1. Composio do Reagente......................................................................................................... 26

4. Resultados obtidos no desenvolvimento do Reagente de Lactato
BioTcnica......................................................................................................................................... 27

5. Consideraes Finais.................................................................................................................... 33

REFERNCIA BIBLIOGRFICA................................................................................................ 34

ANEXOS........................................................................................................................................... 36












LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Comportamento cintico do reagente de Lactato aps adio de amostra biolgica (Reao
de Ponto Final)..................................................................................................................... 27
Figura 2 - Teste de preciso mostrando distribuio de 20 determinaes de uma amostra em torno da
mdia no eixo Y e com escalas de trs desvios padres abaixo e acima da
mdia.................................................................................................................................... 28
Figura 3 - Linearidade: correlao entre as absorvncias obtidas e as concentraes de Lactato
(Coeficiente de correlao) r = 0,9997................................................................................ 28
Figura 4 - Teste de Estabilidade do Calibrador de Lactato em condies de estresse (A absorvncia em
funo do Tempo em dias)................................................................................................... 29
Figura 5 Anlise Estatstica do Teste de Sensibilidade Metodolgica do Reagente de Lactato.
Grfico da mdia das dosagens de amostras de baixa concentrao de Lactato em funo
do Coeficiente de Variao de tais amostras....................................................................... 30
Figura 6 - Teste de Correlao do Reagente de Lactato Trinder e Reagente de Lactato LDH UV
(Lactato Desidrogenase Ultravioleta).................................................................................. 31
































LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Valores de referncia para o Lactato................................................................................... 25
Tabela 2 - Exatido: determinao da concentrao de lactato em relao aos soros controles e seus
respectivos desvios em relao ao valor esperado (Recuperao)..................................... 29
Tabela 3 - Dados referentes a Figura 5: Teste de Sensibilidade Metodolgica do Reagente de
Lactato............................................................................................................................... 30
Tabela 4 - Teste de Reprodutibilidade do Reagente de Lactato BioTcnica......................................... 31









































1. INTRODUO

As enzimas so essenciais para a vida j que apresentam uma eficincia cataltica
extraordinria, em geral muito maior que dos catalisadores sintticos ou inorgnicos. Elas tm um alto
grau de especificidade por seus substratos (molcula que se liga ao stio ativo e sofre ao da enzima),
aceleram as reaes qumicas de uma maneira formidvel e funcionam em solues aquosas sob
condies muito variveis de temperatura e pH.
Com exceo de um pequeno grupo de molculas de RNA que apresentam propriedade
cataltica, todas as enzimas so protenas tercirias e quaternrias com propriedades catalticas devido
sua capacidade de ativao especfica dos seus substratos. Tal definio indica as propriedades
caractersticas das enzimas, que, por sua vez governam os fundamentos dos mtodos de anlise
enzimtica.

Pelo fato de serem protenas com estrutura terciria ou quaternria,
as enzimas so dotadas de dobramentos tridimensionais em suas
cadeias polipeptdicas, o que lhes confere uma forma caracterstica
e exclusiva. Assim, diferentes enzimas tm diferentes formas e,
portanto, diferentes papis biolgicos. As protenas, como uma
classe de molculas, so altamente eficientes na catlise de diversas
reaes qumicas, por causa da sua capacidade de se ligar
especificamente a uma larga variedade de molculas. Pela
utilizao de um repertrio completo de foras intermoleculares, as
enzimas aproximam substratos a uma orientao tima, o preldio
do fazer e quebrar ligaes qumicas. Em essncia, elas catalisam
reaes pela estabilizao dos estados de transio, as espcies
qumicas de maior nvel de energia nos caminhos das reaes.
Fazendo isto seletivamente, uma enzima determina qual das reaes
qumicas potenciais realmente ocorre. As enzimas podem tambm
agir como interruptores moleculares, na regulao da atividade
cataltica e na transformao de energia, por causa da sua
capacidade de acoplar as aes em centros de ligao separados.
(STRYER, L.1996)

A determinao de um analito em qualquer amostra biolgica se baseia primariamente na
reao do analito que se deseja avaliar, qualitativa ou quantitativamente, com um ou mais reagentes
visando a formao de um produto, que podem ser identificado visualmente ou medido atravs de um
equipamento. O trabalho no Laboratrio Clnico baseia-se, quase na sua totalidade, no uso de
reagentes que produzem as reaes desejadas e especficas, formando os produtos indicadores da
reao.

Na grande maioria das vezes, os reagentes utilizados na anlise instrumental ou quantitativa
devem gerar produtos, cuja quantidade pode ser medida com a utilizao de equipamento como o
fotmetro e o espectrofotmetro. Os dados obtidos so comparados com padres para se obter ento a
concentrao do analito presente na amostra.
Durante muito tempo os reagentes empregados na pesquisa instrumental utilizaram somente
substncias qumicas, orgnicas ou inorgnicas, capazes de gerar um produto mensurvel. Para gerar
produtos estes reagentes devem, em muitos casos, produzir grandes quantidades de energia ou
necessitam da adio de energia externa fornecida por incubaes em temperaturas elevadas. Estes
reagentes qumicos, no entanto, apresentam os seguintes problemas:
1 - dificuldades de manuseio por serem em muitos casos, reagentes muito custicos ou muito cidos;
2 - o ensaio pode requerer o emprego de mais de um reagente, e estes reagentes no podem ser
combinados para formar reagente nico;
3 - o sistema de reagentes requer incubaes em temperaturas elevadas so dificilmente aplicveis nos
analisadores;
4 - em muitas situaes utilizam-se sistemas analticos complexos ou demorados, que por diversas
razes no podem ser aplicados em aparelhos.
O desenvolvimento de mtodos eficientes de fermentao e separao permitiu a obteno de
enzimas purificadas de custo acessvel, fazendo com que as enzimas pudessem ser utilizadas como
reagentes, substituindo os reagentes qumicos em muitos sistemas analticos. As enzimas passaram
ento a fazer parte da formulao de um nmero cada vez maior de sistemas analticos com as
seguintes vantagens:
- emprego de reagentes pouco agressivos e de fcil utilizao;
- facilidade para utilizao de reagentes nicos de alta especificidade;
- aplicao em analisadores automticos, por empregarem reagentes nicos pouco agressivos que no
requerem incubaes em temperaturas muito elevadas;
- custos operacionais totais muito similares aos dos reagentes qumicos, porque reduzem as operaes
manuais.
As enzimas so tambm produtos qumicos, mas devido a caractersticas prprias, os sistemas
analticos utilizando enzimas so denominados reagentes enzimticos. Os usurios dos reagentes
enzimticos sentiram necessidade de distinguir estes reagentes dos reagentes qumicos e criou-se ento
a denominao de reagentes colorimtricos para os reagentes qumicos e de reagentes enzimticos para
aqueles utilizando enzimas. Entretanto, muitos reagentes enzimticos formam produtos coloridos,
sendo colorimtricos tambm. Assim, para distinguir os dois tipos de reagentes, deve-se denominar
como enzimticos os reagentes que utilizam enzimas, e como reagentes qumicos aqueles que no
utilizam enzimas.
O cido lctico ou lactato um resduo do metabolismo glicdio, predominantemente
encontrado no msculo esqueltico, no crebro e nas hemcias. A concentrao de lactato no sangue
depende tambm da taxa da produo metablica no fgado e nos rins. O aumento da concentrao de

lactato no sangue , ento, um indicador do metabolismo anaerbico, sendo, portanto, um importante
marcador de insuficincia da circulao local por leses e isquemias especficas ou generalizadas por
estresse metablico ou exerccios fsicos.
A acidose lctica pode ocorrer em dois perfis clnicos caractersticos. No primeiro, ocorre a
diminuio de oxigenao tecidual (hipoxia), resultante de choques, hipovolemia e insuficincia
ventricular esquerda. No segundo perfil (metablico), ocorre associao a doenas como o diabetes
mellitus, neoplasias, doenas hepticas, ou ento est relacionado a drogas e/ou toxinas como o etanol,
o metanol e o salicilato. A acidose lctica tambm pode ocorrer na falncia renal, na leucemia e na
deficincia de tiamina. Portanto, as determinaes de lactato so importantes para a avaliao do status
cido-base sanguneo e tratamento da acidose lctica (acidez anormal do sangue).
O Lactato dosado no plasma e no Lquido Cfalo-raquidiano atravs da reao com um
reagente enzimtico-colormtrico. A concentrao de L-Lactato na amostra determinada atravs da
reao:

L-Lactato + O
2
Lactato Oxidase
Piruvato + H
2
O
2


H
2
O
2
+ 4-aminoantipirina + TOOS*
Peroxidase
Cromgeno + 2 H
2
O

* TOOS (N-etil-N-(2 hidroxi-3-sulfopropil)-3-metilanilina)

A intensidade da cor formada na reao proporcional a concentrao de Lactato na amostra,
que quando lido em fotmetro a 546 nm e comparado a um calibrador protico fornece o valor de
Lactato na amostra. (SHIMOJO; et al. 1991)
O desenvolvimento e anlise do reagente enzimtico-colorimtrico para dosagem de Lactato
ocorreu mediante pesquisa bibliogrfica, pesquisa de mercado, estudo e otimizao de lotes Pilotos e
por fim realizao da Validao da formulao por meio de testes como: o Teste da Linearidade, Teste
de Exatido, Teste de Ponto Final, etc., que comprovaram o desempenho adequada do reagente diante
de amostras biolgicas.











2. OBJETIVO

2.1. Objetivo Geral:

Destacar a importncia das enzimas para o desenvolvimento de reagentes para a Indstria
de Diagnstico in vitro, exemplificado pelo reagente de Lactato.

2.2. Objetivos especficos:

- Descrever as principais propriedades das enzimas enfatizando a especificidade, o centro
ativo e sua inibio;
- Destacar o avano alcanado com as diversas aplicaes enzimticas;
- Descrever o funcionamento de um reagente enzimtico e exemplificar;
- Descrever o Fluxograma na Indstria de Diagnstico;
- Descrever as etapas de desenvolvimento de um reagente enzimtico-colorimtrico na
Indstria de Diagnstico;
- Discutir sobre testes realizados durante o processo de Validao do reagente de Lactato
BioTcnica para uso laboratorial.





























3. DESENVOLVIMENTO TERICO

3.1. Enzimas

Existem duas condies fundamentais para a vida. Uma delas que o organismo vivo deve
ser capaz de se auto-replicar e a segunda que o organismo deve se auto-sustentar, o que se d atravs
da catlise de reaes qumicas eficientes e seletivas. Sem a catlise, as reaes qumicas necessrias
para sustentar a vida no ocorrem em uma escala de tempo til. As enzimas so responsveis pela
catlise de reaes e apresentam alta especificidade.
Em sistemas vivos, a maioria das reaes bioqumicas d-se em vias metablicas, que so
seqncias de reaes em que o produto de uma reao utilizado como reagente na reao seguinte.
Diferentes enzimas catalisam diferentes passos de vias metablicas, agindo de forma concertada de
modo a no interromper o fluxo nessas vias. Cada enzima pode sofrer regulao da sua atividade,
aumentando-a, diminuindo-a ou mesmo interrompendo-a, de modo a modular o fluxo da via
metablica em que se insere.

As enzimas, como outras protenas, tm pesos moleculares que
variam de cerca de 12.000 at mais de um milho. Algumas
enzimas no requerem nenhum outro grupo qumico alm de seus
resduos de aminocidos. Outras requerem um componente qumico
adicional chamado co-fator um ou mais ons inorgnicos, uma
molcula orgnica complexa ou uma molcula metalorgnica
chamada de coenzima. A coenzima, ou on metlico, que est
firmemente ou at mesmo covalentemente ligada parte protica da
enzima, chamado de grupo prosttico. Uma enzima completa e
cataliticamente ativa, juntamente com sua coenzima e/ou ons
metlicos ligados, chamada de holoenzima. A parte protica dessa
enzima chamada de apoenzima ou apoprotena. (LEHNINGER.
1995)

A funo das enzimas e de outros catalisadores diminuir a energia de ativao da reao
e, desta forma, aumentar a velocidade da reao de um fator de 10
5
a 10
17
. Cada enzima classificada
de acordo com a reao especfica que ela catalisa. As reaes catalisadas pelas enzimas so
caracterizadas pela formao de um complexo entre o substrato e a enzima (complexo ES).




K
1
K
3

[E] + [S] [ES] [E] + [P]
K
2

[E]: Concentrao de Enzima
[S]: Concentrao de Substrato
[ES]: Concentrao do complexo enzima-substrato
[P]: Concentrao de Produto
K
1
, K
2
, K
3
: Constantes de velocidade
A ligao ocorre em uma fenda na molcula da enzima chamada de stio ativo. Como
catalisadores, as enzimas no so consumidas na reao e no alteram seu equilbrio qumico.
A energia empregada para aumentar a velocidade da reao enzimtica derivada das
ligaes fracas (ligaes de Hidrognio, interaes hidrofbicas e inicas) entre o substrato e a
enzima. O stio ativo enzimtico est estruturado de tal maneira que algumas dessas interaes fracas
ocorrem preferencialmente no estado de transio da reao, estabilizando assim o estado de transio.
A energia disponibilizada pela formao das numerosas ligaes fracas entre a enzima e o substrato (a
energia de ligao) substancial e em geral pode explicar as aceleraes nas velocidades das reaes.

3.2. Propriedades das Enzimas

A cintica uma metodologia importante para o estudo dos mecanismos enzimticos. A
maioria das enzimas tem algumas propriedades cinticas em comum. medida que a concentrao do
substrato aumenta, a atividade cataltica de uma concentrao fixa de uma enzima aumenta de forma
hiperblica, aproximando-se de uma velocidade mxima, V
mx
caracterstica, na qual praticamente
toda enzima est na forma do complexo ES. A concentrao de substrato que produz metade da
velocidade mxima a constante de Michaelis , K
M
, que caracterstica para cada enzima agindo
sobre um determinado substrato. A equao de Michaelis-Menten

V
0
= V
mx
[S]
K
M
+ [S]

relaciona a velocidade inicial de uma reao enzimtica (V
0
) com a concentrao de substrato [S] e a
velocidade mxima (V
mx
) pela constante K
M
. Tanto o K
M
como a V
mx
podem ser medidos. Eles tm
significados diferentes para enzimas diferentes. Em condies de saturao, a velocidade limite de
uma reao catalisada enzimaticamente descrita pela constante K
cat
, tambm chamada nmero de
renovao. A relao K
cat
/K
M
fornece ento uma boa medida de eficincia cataltica. Cada enzima tem
um pH timo (ou intervalo de pH) no qual apresenta atividade mxima.
As enzimas, como outros catalisadores, no interferem na constante de equilbrio das reaes,
mas aumentam a velocidade das reaes qumicas, diminuindo a energia de ativao dos reagentes,
necessria para transform-los em produto. Para que haja essa transformao, os reagentes precisam
atingir um estado de transio e as enzimas aceleram a velocidade da reao reduzindo a energia do
estado de transio.

As enzimas no somente aceleram as reaes, mas tambm acoplam reaes de maneira
produtiva: Considerando a energia livre (G) necessria para transformar glicose em glicose-6-
fosfato:

Glicose Glicose-6-Pi G = 4,0 kcal/mol
e a energia de hidrlise do ATP:
ATP ADP + Pi G = -7,3 kcal/mol
A enzima hexoquinase catalisa o acoplamento destas duas reaes, gerando glicose-6-
fosfato, com G de hidrlise -3,3 kcal/mol:
Glicose + ATP Glicose-6-Pi + ADP + Pi

3.3. O Centro Ativo Enzimtico

O centro ativo de uma enzima a regio que se liga aos substratos (e ao grupamento
prosttico, se houver algum), e contm os radicais de aminocidos que participam diretamente na
gerao e quebra de ligaes. Estes radicais so chamados de grupamentos catalticos. Embora as
enzimas difiram amplamente em estrutura, especificidade e modo de catlise, podem ser feitas
algumas generalizaes referentes aos seus centros ativos:
1. O centro ativo ocupa uma parte relativamente pequena do volume total de uma enzima.
A maioria dos radicais de aminocidos em uma enzima no est em contato com o substrato. Isto
levanta uma questo intrigante de por que as enzimas so to grandes. Praticamente todas as enzimas
so feitas de mais de 100 aminocidos, o que lhes d uma massa maior do que 10 KDa e um dimetro
de mais de 25.
2. O centro ativo uma entidade tridimensional formada por grupamentos que vm de
diferentes partes da seqncia linear podem interagir mais fortemente do que os adjacentes na
seqncia.
3. Os substratos so ligados a enzimas por atraes fracas mltiplas. Os complexos ES tm
geralmente constantes de equilbrio que variam de 10
-2
a 10
-8
M, correspondendo a energias livres de
interao que variam de cerca de -3 a -12 kcal/mol. As interaes no covalentes de complexos ES so
muito mais fracas do que ligaes covalentes, as quais tm energias entre -50 e -110 kcal/mol. A
enzima e o substrato devem ter formas complementares de ligao, j que as interaes reversveis de
biomolculas so feitas por ligaes eletrostticas, pontes de hidrognio, foras de Van der Waals e
interaes hidrofbicas. O carter direcional das pontes de hidrognio entre enzima e substrato
freqentemente obriga um alto grau de especificidade.
4. Centros ativos so fendas ou frestas. Em todas as enzimas de estrutura conhecida, as
molculas de substrato esto ligadas a uma fenda ou a uma fresta. A gua geralmente excluda, a no
ser que ela seja um reagente. O carter apolar da maior parte da fenda melhora a ligao do substrato.
Contudo, a fenda pode tambm conter aminocidos polares. Ela cria um microambiente no qual certos

radicais adquirem propriedades especiais, essenciais para a catlise. As posies internas destes
aminocidos polares so excees biologicamente cruciais regra geral de que aminocidos polares
esto expostos gua.
5. A especificidade de ligao depende do arranjo precisamente definido de tomos no
centro ativo. Para caber dentro do centro, um substrato deve ter um formato correspondente. A
metfora de Emil Fisher, da chave e fechadura expressa em 1890, provou ser altamente estimulante e
profcua. Contudo, est evidente agora que os formatos dos centros atvos de muitas enzimas so
acentuadamente modificados pela ligao do substrato, como foi postulado por Daniel E. Koshland,
Jr., em 1958. Os centros ativos destas enzimas assumem formatos que s so complementares ao do
substrato depois que o substrato estiver ligado. Este processo de reconhecimento dinmico chamado
de encaixe induzido.

3.4. Desnaturao e Inibio Enzimticas

A atividade biolgica de uma molcula de protena sua atividade
cataltica no caso da molcula de enzima depende geralmente da
integridade de sua estrutura. Portanto, qualquer alterao de sua
estrutura acompanhada de uma perda de atividade, processo
conhecido como desnaturao. Se o processo de desnaturao no for
demasiado, poder ser revertido, e a atividade recuperada, quando o
agente desnaturante for removido. Isso acontece graas tendncia da
molcula da enzima de reassumir sua conformao habitual. Contudo,
condies desnaturantes prolongadas ou intensas resultam numa perda
irreversvel da atividade. As condies desnaturantes incluem
temperaturas elevadas, que quebram as ligaes de estabilizao por
aumentar a vibrao dos tomos constituintes. As temperaturas baixas
so, portanto, necessrias para preservar a atividade da enzima,
especialmente em solues aquosas com soro. Os extremos de pH
tambm causam o desenovelamento das estruturas moleculares das
enzimas. (BURTIS e ASHWOOD. 1998)

Algumas enzimas, por apresentarem alta estabilizao por efeito hidrofbico, podem
tambm sofrer desnaturao a frio. (KYTE. 1995)

As enzimas podem tambm ser inativadas por modificaes irreversveis de um grupo
funcional essencial para atividade cataltica. Podem ser inibidas ainda por molculas que se ligam
reversivelmente. Os inibidores competitivos competem reversivelmente com o substrato pelo centro
ativo, mas no so transformados pela enzima. Os inibidores no-competitivos ligam-se somente ao
complexo ES, em um stio distinto do stio ativo. Na inibio mista, o inibidor liga-se tanto a E como a
ES. Neste ltimo caso, em um stio distinto daquele em que o substrato se liga.
Se uma enzima quebrada em seus aminocidos constituintes, a sua atividade cataltica
sempre destruda. Assim, as estruturas proticas primria, secundria, terciria e quaternria das
enzimas so essncias para a atividade cataltica.

A maioria das enzimas pode ser inibida por certos reagentes qumicos. Essa inibio por
pequenas molculas e ons especficos importante nos mecanismos de controle em sistemas
biolgicos. O estudo de inibidores de enzimas, tambm se constitui em uma fonte valiosa de
informaes sobre os mecanismos da ao enzimtica.
Os inibidores podem ser agrupados em:
Inibidores irreversveis aqueles que se ligam ou destroem um grupo funcional,
imprescindvel para a atividade enzimtica. A ligao pode ser covalente ou no e sua dissociao
muito lenta. O composto diisopropilfluorofosfato (DIFP), por exemplo, reage com uma serina, no stio
cataltico da acetilcolinesterase. A inibio da enzima compromete a transmisso dos impulsos
nervosos.
Inibidores reversveis caracterizados por uma rpida dissociao do complexo enzima-
inibidor. Podem ser de dois tipos:
Competitivos em que a enzima pode ligar-se ao substrato ou ao inibidor, mas no aos dois
simultaneamente. Uma vez ligado, o inibidor competitivo no sofre transformao. Esse tipo de
inibio revertido pelo simples aumento da concentrao do substrato.(competio)
No-competitivos nesse caso o inibidor liga-se enzima em um local diferente do stio
ativo, alterando a sua conformao. Nesse caso a enzima pode ligar-se simultaneamente ao inibidor e
ao substrato. O aumento na concentrao de substrato, no entanto, no atenua a inibio.

A inibio da atividade enzimtica, por pequenas molculas e iontes
especficos, importante porque ela serve como dos principais
mecanismos de controle em sistemas biolgicos . Alm disso, muitos
medicamentos e agentes txicos agem inibindo enzimas. Mais ainda, a
inibio pode ser uma fonte de esclarecimento dos mecanismo de
ao enzimtica: aminocidos crticos para a catlise podem, muitas
vezes, ser identificados pelo uso de inibidores especficos. O valor de
anlogos de estado de transio. (STRYER. 1996)

3.5. Importncia do estudo das Enzimas e suas aplicaes gerais

As enzimas, importantes componentes do metabolismo de todos os seres vivos, tm a
capacidade de promover e acelerar reaes qumicas. Microrganismos ou substncias com essa
propriedade j eram usados por populaes humanas muito antigas para modificar alimentos
fermentar uvas e fabricar o vinho, ou alterar o leite e produzir queijo, por exemplo. Depois que os
cientistas desvendaram a atuao das enzimas, estas passaram a ser cada vez mais empregadas, com
variadas finalidades. Hoje, essas protenas especiais so teis inclusive na indstria, no apenas na
rea de alimentos, mas em muitos outros setores.
O estudo das enzimas tem uma grande importncia prtica e clnica. Em algumas doenas,
especialmente nas desordens genticas herdadas, pode ocorrer uma deficincia ou mesmo a ausncia
total de uma ou mais enzimas. Outras condies anormais tambm podem ser causadas pela excessiva
atividade de uma enzima. Medidas da atividade de enzimas no plasma sanguneo, eritrcitos ou

amostras de tecido so importantes no diagnstico de vrias doenas. Muitas drogas exercem seu
efeito biolgico por meio de interaes com as enzimas. As enzimas tornaram-se importantes
ferramentas prticas no apenas na medicina, mas tambm na indstria qumica, no processamento de
alimentos e na agricultura.

3.5.1. Importncia Clnica:

Todas as enzimas presentes no corpo humano so sintetizadas intracelularmente. Trs casos
se destacam:
- Enzimas plasma-especficas: Enzimas ativas no plasma utilizadas no mecanismo de
coagulao sangnea e fibrinlise. Exemplo: pr-coagulantes: trombina, fator XII, fator X e outros.
- Enzimas secretadas: So secretadas geralmente na forma inativa e aps a sua ativao
atuam extracelularmente. Os exemplos mais bvios so as proteases ou hidrolases produzidas no
sistema digestivo. Exemplos: lipases, alfa-amilase, tripsinogneo, fosfatase cida prosttica e antgeno
prosttico especfico. Muitas so encontradas no sangue.
- Enzimas celulares: Normalmente apresentam baixos teores sricos que aumentam quando
so liberadas a partir de tecidos lesados por alguma doena. Isso permite inferir a localizao e a
natureza das variaes patolgicas em alguns rgos, tais como o fgado, o pncreas e o miocrdio. A
elevao da atividade srica depende do contedo de enzima do tecido envolvido, da extenso e do
tipo de necrose. So exemplos de enzimas celulares as transaminases, lactato desidrogenases,
creatinoquinases, etc.
Enzimas digestivas tais como a amilase, protease e lipase, reduzem os alimentos em
componentes menores que so mais facilmente absorvidos no trato digestivo.

3.5.2. Importncia Prtica:

Segundo MUSSATO (2007), vantajoso usar enzimas na indstria, porque elas so natu-
rais, no txicas e especficas para determinadas aes. Alm disso, so capazes de alterar as
caractersticas de variados tipos de resduos, contribuindo para reduzir a poluio ambiental,
substituindo processos qumicos rigorosos.
Os microrganismos so a principal fonte de enzimas de aplicao industrial, mas diversas
podem ser obtidas de animais (pancreatina, tripsina, quimotripsina, pepsina, renina e outras) ou
vegetais (papana, bromelina, ficina e outras). Hoje, porm, como possvel modificar geneticamente
os microrganismos para que forneam qualquer enzima, a tendncia substituir as produzidas por
vegetais e animais pelas de origem microbiana.
O uso de enzimas em processos industriais de grande interesse, em especial devido
facilidade de obteno (por biotecnologia) e s vantagens em relao aos catalisadores (aceleradores
de reaes) qumicos, como maior especificidade, menor consumo energtico e maior velocidade de

reao. Alm disso, a catlise enzimtica tem outros benefcios, como o aumento da qualidade dos
produtos, em relao catlise qumica; a reduo dos custos de laboratrio e de maquinrio, graas
melhoria do processo; ou a fabricao controlada de pequenas quantidades.
Medicamentos: Vrias enzimas tm propriedades que permitem seu uso como
medicamentos. So exemplos as que tm ao antibitica ou antiinflamatria (lisozima, bromelina,
hialuronidase e outras), as que auxiliam a terapia da leucemia (L-asparaginase) ou facilitam a digesto
(papana, bromelina, tripsina e outras). Em geral, enzimas utilizadas com essa finalidade devem ter
pureza e especificidade altas, antigenicidade baixa (para evitar reaes imunolgicas) e estabilidade
em condies fisiolgicas.
Alm das aplicaes teraputicas, diversas enzimas so empregadas na sntese de frmacos
(penicilina, por exemplo). As lipases, que degradam gorduras, so teis em reaes qumicas
necessrias produo de remdios.
Atuao na produo de alimentos: As enzimas tm destacado papel no setor alimentcio,
pois podem influir na composio, no processamento e na deteriorao dos alimentos. Elas s vezes
so indesejveis: provocam, por exemplo, o escurecimento de frutas e vegetais ( o caso das
polifenoloxidases), o rano de farinhas (lipases e lipoxigenases) e o amo-lecimento de tecidos vegetais
(enzimas pcticas).
Na panificao, a enzima alfa-amilase promove a decomposio do amido, que leva
produo de maltose, aumentando a maciez e a textura da massa e do miolo e mantendo o po fresco
por mais tempo. J a amilase maltognica e a xilanase do estabilidade massa, enquanto a protease
altera a elasticidade e a textura do glten e melhora a cor e o sabor do po. No processamento de
amidos, enzimas como glicose isomerase, alfa-amilase, beta-amilase, pululanase e isoamilase
convertem o amido em dextrose ou xaropes ricos em acares simples.
Na indstria de laticnios, a quimosina promove a coagulao do leite (para a produo de
queijos), a lactase decompe a lactose em acares mais simples, a protease quebra protenas de soro.
Neste e em outros setores, as lipases decompem gorduras.
Enzimas como papana, bromelina e ficina ajudam a amaciar carnes, e outras so
empregadas nos processos de produo de bebidas alcolicas. No caso das bebidas destiladas, a alfa-
amilase e a glicoamilase decompem o amido. No caso dos vinhos, a pectinase facilita a prensagem, a
filtrao e a clarificao e reduz o tempo de processamento. Nos dois tipos de bebidas, as proteases
quebram protenas. As cervejarias usam diferentes enzimas para liquefazer e fermentar a matria-
prima (alfa-amilase), aumentar o teor de certos acares (glicoamilase), aumentar a velocidade de
filtrao (glucanase), remover compostos indesejveis (pentosanases) e evitar a turbidez do produto
final (papana, bromelina ou ficina).
Enzimas, celulose e papel: Muitas enzimas interessam indstria de papel e celulose. Para
produzir papel, composto basicamente de fibras de celulose, preciso picar a madeira, transform-la
em polpa, por processos qumicos, e retirar dessa polpa a hemicelulose, a lignina, certas resinas e

outros componentes. Enzimas capazes de realizar algumas dessas tarefas permitem, nessa indstria,
substituir produtos qumicos responsveis por srios problemas ambientais.
Tecidos com maior requinte: Na indstria txtil, a presena das enzimas tem crescido nas
ltimas dcadas. Elas podem atuar nas fases de fiao, tingimento e acabamento dos tecidos. Nesse
ltimo caso, ajudam a limpar a superfcie do material, a reduzir as pilosidades e a melhorar a
aparncia, o brilho, o caimento, a resistncia e a estabilidade. Em outra aplicao relevante, certas
enzimas (proteases) conferem resistncia ao encolhimento s fibras da l. Em muitos processos txteis,
substncias qumicas sintticas podem ser substitudas por enzimas, que tm ao mais especfica e
geram benefcios ambientais, pois so biodegradveis e dependem de menor consumo de energia.
Aumento do poder de limpeza: cada vez maior o nmero de produtos de limpeza que
contm enzimas, em especial amilases, proteases, lipases e celulases. Cada uma delas ataca um tipo
de substncia, tornando-a solvel em gua e facilitando sua remoo: as amilases atuam sobre o amido
(presente em manchas de molhos, frutas, chocolate e outras), as proteases quebram protenas, as
lipases degradam gorduras e as celulases ajudam a remover fibrilas de celulose que aparecem com o
tempo nos tecidos (essa remoo melhora o brilho e a maciez das roupas).
Cosmticos: Outra rea em que as enzimas vm ganhando espao a de cosmticos. J h
enzimas incorporadas formulao de vrios produtos presentes no mercado, como tinturas,
depilatrios, alisantes de cabelo, sais de banho, dentifrcios, desodorantes, produtos anti-caspa,
curativos e outros, ou aplicadas em limpezas de pele (descamao) e produtos aromticos. Enzimas
que quebram protenas tm recebido ateno especial da cosmetologia, com destaque para a papana,
capaz de promover a penetrao de compostos na pele e atuar como agente de raspagem e depilao
em produtos de uso local. importante, no desenvolvimento do cosmtico, conhecer as caractersticas
da enzima usada, dos demais componentes da frmula e do recipiente onde acondicionado, alm das
condies de armazenamento, para evitar reaes entre essas substncias, que prejudicariam a eficcia
e a segurana do produto.
Uso no tratamento de efluentes: O desenvolvimento das chamadas tecnologias limpas, ou
seja, que reduzem o impacto ambiental de uma atividade industrial, tambm conta com a participao
de enzimas. Um exemplo o uso na produo de polpa de celulose e no branqueamento desta.
Combinadas com tcnicas de processamento, as enzimas permitem reduzir ou at eliminar o uso de
cloro nessas atividades industriais, evitando a emisso de substncias organocloradas altamente txi-
cas e mesmo cancergenas para o ambiente.
Enzimas so aplicadas ainda no tratamento de efluentes e resduos industriais. As guas
residuais das indstrias alimentcias, por exemplo, contm gorduras slidas ou lquidas (graxas e
leos), que causam srios problemas de poluio, ao formar filmes na superfcie dos corpos receptores
(impedindo o fluxo do oxignio necessrio vida aqutica) e ao causar entupimentos. A adio de
lipases a esses efluentes gera substncias mais simples, facilmente degradadas, evitando tais
problemas.

O mercado mundial de enzimas industriais estimado hoje em US$ 2,3 bilhes anuais e
tem trs segmentos: enzimas tcnicas (destinadas a indstrias de tecidos e de produtos de limpeza),
enzimas para alimentos e bebidas e enzimas para rao animal. As principais enzimas de aplicao
industrial so proteases, amilases, lipases, celulases, xilanases e fitases, e as maiores empresas
produtoras so europias: Gist-Brocades (Holanda), Genencor International (Finlndia) e Novo
Nordisk (Dinamarca). A ltima detm, sozinha, cerca de metade do mercado mundial de enzimas
industriais.
No Brasil, em 2005, as importaes de enzimas chegaram a US$ 31 milhes e as
exportaes a US$ 3 milhes. As mais importadas foram amilases (US$ 4 milhes), seguidas de
proteases (US$ 2,5 milhes). O mercado brasileiro de enzimas, embora ainda pouco representativo
(cerca de 2% do total mundial), revela grande potencial, devido enorme gerao de resduos
agroindustriais e ao dinamismo das indstrias de alimentos, medicamentos, tecidos e celulose/papel. A
reduo do custo de produo de enzimas favorecida, no pas, pela possibilidade de bioconverso de
subprodutos agrcolas como farelo de trigo, farelo de algodo, casca de soja e outros. Acredita-se, por
isso, em um aumento rpido do uso de enzimas, de forma geral, e em particular em processos
industriais, no pas.

3.6. Enzimas como reagentes analticos em Diagnstico Molecular

Em todos os mtodos analticos, a quantidade da substncia a ser determinada deve ser a
nica varivel que cause uma diferena observvel nos resultados. (BURTIS e ASHWOOD. 1998)
De acordo com GURTMANN (1974), a quantidade de substrato transformada em produtos
durante uma reao enzimtica pode ser determinada com qualquer mtodo analtico apropriado.
Contudo, o mtodo mais comumente utilizado a anlise fotomtrica. A reao pode ser acompanhada
de uma mudana caracterstica de absorbncia de algum componente do sistema de ensaio, no espectro
do visvel ou do ultravioleta e esta mudana pode ser observada enquanto progride.
As necessidades fotomtricas das anlises enzimticas no so diferentes daquelas das
anlises quantitativas fotomtricas em geral. Contudo, o fotmetro utilizado deve ser provido de meios
para manter os contedos da cubeta numa temperatura constante durante a reao.
A utilizao de enzimas como reagentes analticos oferece a vantagem de maior
especificidade para a substncia a ser dosada. Esta alta especificidade reduz a necessidade de etapas
preliminares de separao e purificao, de modo que a anlise pode ser executada diretamente em
misturas complexas como o soro, a urina, o lquor, etc. As enzimas com especificidade absoluta para a
substncia a ser avaliada so claramente preferveis para o uso analtico. Contudo, este ideal no pode
ser sempre alcanado na prtica, e o conhecimento das especificidades para o substrato das enzimas
reagentes , portanto, essencial para permitir que uma possvel interferncia com o ensaio seja prevista
e evitada. As reaes acopladas so, com freqncia, utilizadas para construir um sistema analtico

enzimtico para dosagem de um composto em particular, e a especificidade das reaes acopladas
pode modificar a especificidade de todo o processo.
O fundamento mais amplamente utilizado para determinar a quantidade de uma substncia
de modo enzimtico permitir que a reao chegue ao fim, de maneira que todo o substrato seja
convertido a um produto mensurvel. Tais mtodos so chamados de ponto final ou, mais
corretamente, de mtodo de equilbrio, pois a reao cessa, quando o equilbrio alcanado. As
reaes nas quais o ponto de equilbrio corresponde realmente converso completa do substrato so
preferidas para esse tipo de anlise. Todavia, o equilbrio desfavorvel pode, com freqncia, ser
deslocado no sentido desejado por reaes enzimticas ou no-enzimticas adicionais, que
transformam ou aprisionam um produto da primeira reao.
importante destacar que o tempo necessrio para transformar uma quantidade fixa do
substrato em produtos inversamente proporcional quantidade da enzima presente. Os mtodos de
equilbrio podem, portanto, requerer o uso de quantidades apreciveis de enzimas para cada amostra, a
fim de impedir perodos de incubao inconvenientemente longos. Quando a concentrao do
substrato cai a nveis baixos pouco antes do fim da reao, a K
M
da enzima torna-se importante na
determinao da velocidade da reao. As enzimas com altas afinidades pelos substratos (valores
baixos de K
M
) so, portanto, mais apropriadas para as anlises de equilbrio. Os mtodos de equilbrio
so muito insensveis a pequenas variaes nas condies da reao. No necessrio ter exatamente a
mesma quantidade de enzima em cada mistura de reao, ou manter o pH ou a temperatura
absolutamente constante, contanto que as variaes no sejam grandes, a ponto da reao no se
completar dentro de um tempo fixo permitido.
A quantidade de enzima reagente necessria para cada anlise pode ser reduzida e o tempo
encurtado pelo uso de mtodos nos quais a quantidade de mudana produzida num intervalo de tempo
fixo seja medida. uma propriedade das reaes de primeiro grau que a variao na concentrao de
substrato por um intervalo de tempo fixo seja diretamente proporcional sua concentrao inicial.
A seleo cuidadosa das condies de reao, como concentraes dos substratos e co-
fatores pode, com freqncia, melhorar as curvas e os mecanismos de marcha da reao, eliminando as
fases de demora e prolongando o perodo de linearidade, de modo que os mtodos de anlise com
tempo fixo tornam-se factveis. Aperfeioamentos na fotometria, levando a medidas mais sensveis da
formao do produto, tambm permitiram que a durao da incubao fosse encurtada em comparao
com os testes mais antigos.

3.7. Exemplos de reaes enzimticas no Diagnstico Molecular

1 Na determinao enzimtica da glicose no soro, plasma ou no LCR (Lquido cfalo
raquidiano) a enzima glicose oxidase catalisa a oxidao da glicose existente na amostra, em presena
de oxignio e gua, produzindo perxido de hidrognio. A enzima peroxidase catalisa a oxidao do
fenol pelo perxido de hidrognio formado em presena de 4-aminoantipirina produzindo um

composto rseo-avermelhado (quinonimina), que apresenta um mximo de absoro em 505 nm. A
intensidade de cor proporcional concentrao de glicose na amostra, que quando comparado a um
padro de concentrao conhecida permitir o clculo da concentrao absoluta no soro ou plasma.

glicose oxidase
Glicose + O
2
+ H
2
O cido Glucnico + H
2
O
2


peroxidase
2H
2
O
2
+ 4-Aminoantipirina + Fenol Quinonimina + 4 H
2
O


2 Outro exemplo a determinao enzimtica do cido rico no soro, na urina, no lquido
amnitico e sinovial. O cido rico da amostra sofre a ao da uricase, na presena de oxignio,
produzindo alantona e perxido de hidrognio; este, em presena do reagente fenlico (DHBS)* e de
4-aminoantipirina, sofre a ao da peroxidade produzindo um composto violceo (quinonimina) com
mximo de absoro em 500 nm.

uricase
cido rico + O
2
+ 2 H
2
O

Alantona + CO
2
+ H
2
O
2


peroxidase
2 H
2
O
2
+ 4-aminoantipirina + DHBS*


Quinonimina + 3 H
2
O

* DHBS (cido Di-hidrxi benzeno sulfnico)

3 - A uria da amostra biolgica hidrolisada pela enzima urease com produo de gs
carbnico e ons amnio. Estes ons so captados por uma segunda enzima, a glutamato
desidrogenase, que em presena dos substratos NADH e -cetoglutarato produz NAD+ e glutamato. A
taxa de diminuio da concentrao de NADH no meio pode ser medida no espectrofotmetro em 340
nm, sendo proporcional concentrao de uria na amostra.

Urease
Uria + H
2
O 2 NH
4+
+ CO
2


glutamato desidrogenase
NH
4+
+ -cetoglutarato + NADH + H
+
Glutamato + NAD
+


4 - A Aspartato aminotransferase (AST ou TGO) catalisa a transferncia do grupo amino do
aspartato a -cetoglutarato, formando oxalacetato e glutamato. A concentrao cataltica se determina,
empregando a reao acoplada de malato desidrogenase (MDH), a partir da velocidade de
desaparecimento no NADH, medido em 340 nm.

AST
L-Aspartato + -cetoglutarato Oxaloacetato + L-Glutamato.

Oxalacetato + NADH + H
+
Malato + NAD
+
MDH


5 - A Alanina Aminotransferase (ALT ou TGP) catalisa a transferncia do grupo amino da
alanina a -cetoglutarato, formando piruvato e glutamato. A concentrao cataltica se determina,
empregando a reao acoplada de lactato desidrogenase (LDH), a partir da velocidade de
desaparecimento do NADH, medido a 340 nm.

ALT
L - alanina + -cetoglutarato Piruvato + L-Glutamato

LDH
Piruvato + NADH + H
+
D - Lactato + NAD
+



3.8. Fabricao de Reagentes/Kits para Diagnstico Molecular

A fabricao de reagentes nas indstrias de diagnstico in vitro acontece de acordo com as
Boas Prticas de Fabricao e Controle (BPFC), da Portaria 686 BRASIL - ANVISA. (1998) e da
RDC 167 ANVISA BRASIL (2004), o que garante a confiabilidade no produto e a rastreabilidade
do processo produtivo.
Aps validao do reagente pelo setor de Pesquisa e Desenvolvimento o reagente est
disponvel para fabricao. As matrias-primas so adquiridas conforme especificaes e o Controle
de Qualidade (CQ) realiza testes com os produtos qumicos como verificao do pH, ponto de fuso,
densidade, teste de especificidade para enzimas, etc. Aps aprovao dos produtos qumicos,
manipulado um lote Piloto que passa por nova anlise no CQ. Se aprovado, manipulado o lote
comercial com as mesmas caractersticas do lote piloto. Aps uma srie de testes no CQ como: Teste
de exatido, repetibilidade, linearidade, teste de branco, de estresse e do limite de deteco. Estes
testes tm como objetivo avaliar a performance e estabilidade do produto fabricado. Se o reagente
obtiver um desempenho adequado ser aprovado para envase e montagem do kit. O kit passa por uma
ltima inspeo do CQ e aprovado ento para venda. A cada lote envasado e embalado, aps
aprovao do CQ, so retirados kits para o estoque de rastreabilidade e o lote monitorado
periodicamente no CQ conforme prazo de validade. (Anexo A Fluxograma de Produo)

3.9. Desenvolvimento de um reagente enzimtico na Indstria de Diagnstico
in vitro

Aps pesquisa bibliogrfica, pesquisa de mercado e desenvolvimento da formulao, o
reagente submetido a uma srie de testes para sua validao como:
1. Estudo de efeito matriz, que a influncia de um componente na amostra, diferente do
analito a ser medido, na dosagem quantitativa e/ou qualitativa daquele analito.
2. Interferncia de anticoagulante, lipemia, bilirrubina e hemlise.

3. Teste de Sensibilidade (limite de deteco): variao da resposta de um mtodo de
medio dividida pela correspondente variao do mensurando ou a menor quantidade, diferente de
zero, que o mtodo consegue medir.
4. Teste de Linearidade: quantidade mxima de um analito que um reagente (ou sistema
analtico) consegue medir.
5. Teste Cintico: Teste que avalia o comportamento da reao em funo do tempo. Feito
em espectrofotmetro com leitura em intervalos determinados, imediatamente aps a adio da
amostra.
6. Teste de Exatido: Teste que avalia o quanto a dosagem realizada com o reagente em
anlise se aproxima do valor real da amostra. A calibrao do ensaio dever ser feita com Calibrador
ou Padro de Referncia. Dever ser dosado pelo menos um Soro Controle.
7. Teste de Branco de Reagente: Determina a cor do reagente em anlise em
espectrofotmetro e em relao gua no comprimento de onda pr-determinado, avaliando a sua
determinao.
8. Teste de correlao com reagente referncia utilizando pelo menos 50 amostras humanas.
9. Teste de Inspeo das caractersticas visuais do produto: os reagentes em anlise devem
ser colocados em frascos e/ou tubos transparentes e seu aspecto visual observado e registrado,
conforme especificaes.
10. Teste de Repetibilidade: Avalia a disperso dos resultados do teste realizado em um dia,
por um operador, por um reagente usando um equipamento. Um soro humano ensaiado 20 (vinte)
vezes seguidas pelo lote em teste, calibrado com Calibrador ou Padro de Referncia. Devero ser
calculados a Mdia, Desvio Padro (DP) e Coeficiente de Variao (CV) para cada ensaio.
11. Teste de Reprodutibilidade: Teste em que um dos parmetros modificado para avaliar
o comportamento analtico do reagente como, por exemplo, teste realizado em dia diferente, por
operador diferente, lotes diferentes de reagentes, etc.
12. Teste de Campo: teste de rotina que simula a utilizao do produto no Laboratrio
Clnico, de forma a avaliar o seu desempenho a partir de parmetros pr-estabelecidos.
Se o reagente aprovado nos testes citados, possui desempenho adequado para o uso em
Laboratrio Clnico.

3.10. A importncia do Lactato no Diagnstico Clnico

O cido lctico ou on lactato, um intermedirio no metabolismo dos
carboidratos, proveniente do msculo esqueltico, crebro e
eritrcitos. A concentrao de lactato sangneo dependente da sua
produo e degradao no fgado, rins e msculos esquelticos. Ao
redor de 30% do lactato formado utilizado no fgado,
predominantemente na glicognese para a produo da glicose.
Aumentos moderados na formao de lactato resultam no incremento
da depurao do lactato heptico. No entanto, a captao fica saturada
quando as concentraes excedem dois mmol/L, por exemplo, durante

o exerccio intenso, as concentraes de lactato podem aumentar
significativamente de uma mdia de 0,9 mmol/L para mais de vinte
mmol/L em apenas dez segundos. No existe uniformidade quanto aos
teores de Lactato que caracterizam a acidose lctica. Nveis de lactato,
excedendo cinco mmol /L e pH sangneo <7,25, indicam acidose
lctica. (MOTTA. 2003)

A acidose lctica se apresenta em duas condies clnicas diversas:
Tipo A (hipxica): Esse o tipo mais comum. Associada com a reduo de oxigenao
tecidual (hipxia) encontrada em exerccios severos, convulses, pobre perfuso tecidual (hipotenso,
insuficincia cardaca, parada cardaca), contedo de oxignio arterial reduzido (asfixia, hipoxemia,
toxicidade pelo monxido de carbono e anemia por deficincia de ferro severa).
Tipo B (metablica): Associada com doena subjacente: diabetes melitus, malignidade
(leucemias, linfomas e cncer de pulmo), hepatopatia, acidose respiratria, cetoacidose respiratria,
infeces (malria, e clera) insuficincia renal, feocromocitoma, deficincia de tiamina, intolerncia a
protenas do leite, pancreatite e sepse. Frmacos/toxinas/infuses: antiretrovirais, cido valprico,
agentes beta-adrenrgicos, cocana, etanol, metanol, salicilatos, nitroprussianos, fenformin,
catecolaminas, frutose e sorbitol. Acidose lctica congnita: defeitos na gliconeognese (deficincia de
glicose 6-fosfatase ou piruvato carboxilase), no metabolismo do piruvato (deficincia da piruvato
desidrogenase ou piruvato carboxilase), deficincia da fosforilao oxidativa mitocondrial e acidria
metilmalnica. O tipo B pode ser dividido em trs subtipos:
Tipo B1: ocorre em associao doena subjacente.
Tipo B2: promovida por frmacos.
Tipo B3: devida a erros inatos do metabolismo.
O mecanismo da acidose lctica tipo B no conhecido, mas
acredita-se que o defeito primrio seja o impedimento mitocondrial na
utilizao do oxignio que produz os estoques de ATP e NAD
+
, com
acmulo de NADH e H
+
. Em presena de perfuso heptica reduzida
ou enfermidade heptica, a remoo do lactato diminuda
provocando o agravamento da acidose lctica. (MOTTA. 2003)

O teor de lactato no LCR (lquido cfalo-raquidiano)
normalmente varia de forma paralela aos encontrados no sangue. Em
alteraes bioqumicas no LCR, entretanto, o lactato altera de forma
independente dos valores sanguneos. Nveis aumentados no LCR so
encontrados em acidentes cerebrovasculares, hemorragia
intracraniana, meningite bacteriana, epilepsia e outras desordens do
SNC. Na meningite assptica (viral), os nveis de lactato no LCR no
elevam. (Motta) O aumento da concentrao de lactato no sangue
um indicador do metabolismo anaerbico, isto , diminui o fluxo
sanguneo aos tecidos e a diminuio do oxignio insuficiente.
Graves insuficincias de oxignio podem originar Acidose Lctica.
O L-lactato pode, portanto ser utilizado como um indicador da
gravidade da insuficincia circulatria. (SHIMOJO. et al..1991)

Na coleta sangunea, como o lactato produzido pela gliclise nas hemcias, o sangue deve
ser colhido na presena de fluoreto obtendo-se assim o plasma fluoretado, e centrifugado rapidamente.

Apenas aps estes cuidados o lactato ficar estvel 14 dias se armazenado de 2 a 8
o
C. Ainda, como h
presena de lactato na saliva humana, deve-se utilizar mscara e evitar conversar prximo ao local de
ensaio e proceder com rigorosa higienizao dos materiais de laboratrio.

Tabela 1: Valores de Referncia para o Lactato.
Amostra mg/dL mmol/L Especificao
4,5-19,8 0,5-2,2 Venoso Plasma
4,5-14,4 0,5-1,6 Arterial

10-60 1,1-6,7 Neonato
10-40 1,1-4,4 De 3 a 10 dias
10-25 1,1-2,8 > 10 dias
LCR

10-22 1,1-2,4 Adulto

Converso para Unidade do Sistema Internacional (SI):
Lactato (mg/dL) x 0,111 = Lactato (mmol/L)

3.11. O Reagente Lactato

O Kit de Lactato destinado determinao no plasma e lquido cefalorraquidiano (LCR).
O reagente de Lactato enzimtico segue a metodologia TRINDER (1969 e 1972) (Lactato
Oxidase / Peroxidase), apresenta-se na forma MONOREAGENTE pronto para uso e contm um
calibrador protico lquido e estvel com valor definido, sendo adequado para a utilizao em todos os
sistemas manuais e automatizados de bioqumica clnica.
O lactato da amostra sofre a ao da enzima lactato oxidase na presena de oxignio,
produzindo piruvato e perxido de hidrognio. Este ltimo, em presena de um reagente fenlico
(TOOS) e de 4-aminoantipirina, sofre a ao da peroxidade produzindo um cromgeno violceo
(quinonimina) com mximo de absoro em 546 nm:

Lactato oxidase
L-Lactato + O
2
Piruvato + H
2
O
2


Peroxidase
H
2
O
2
+ 4-aminoantipirina + TOOS Cromgeno + 2 H
2
O


Em outra metodologia, o lactato oxidado a piruvato pela lactato desidrogenase (LDH) na
presena de NAD
+
. O NADH formado nesta reao determinado por espectrofotometria em 340 nm
e serve como uma medida da concentrao de lactato. (DURLIAT. 1976; MARTI. 1997)





3.11.1. Composio do Reagente

1 - Reagente: Tampo Pipes 200 mmol/L pH 6,8; Lactato Oxidase > 6.000 U/L; Peroxidase
> 2.500 U/L, 4-aminoantipirina 0,5 mmol/L; TOOS (N-etil-N-(2 hidroxi-3-sulfopropil)-3-metilanilina)
4 mmol/L; Triton X100 0,1% v/v.
2 - Calibrador: Contm; Albumina bovina 7% p/v; azida sdica 0,05% p/v e Lactato.






































4. Resultados obtidos na Validao do Reagente de Lactato BioTcnica

De acordo com NOLL (1974), para assegurar a qualidade nos Laboratrios Clnicos
necessrio implementar um sistema de qualidade que inclua um conjunto de processos e o uso de
reagentes de qualidade. As determinaes quantitativas na rotina laboratorial so realizadas por
instrumentos automatizados. Assim sendo, torna-se pr-requisito a elaborao de mtodos de
padronizao na indstria de diagnstico tais como: comportamento cintico da reao, exatido,
preciso e linearidade os quais foram avaliados durante o desenvolvimento da reagente enzimtico-
colorimtrico de Lactato, que ento permitiram avaliar o desempenho do produto segundo Manual de
Validao dos Produtos, BIOTCNICA (2006).
O comportamento cintico do reagente de lactato de ponto final, ou seja, o produto formado
atinge ponto mximo de concentrao e permanece inalterado por um determinado tempo em funo
da estabilidade do produto (equilbrio). A concentrao do produto formado medida atravs de
leituras fotomtricas.

Na figura 1 encontram-se resultado do reagente de lactato durante o processo de validao:

0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tempo (minut os)
A
b
s
o
r
v

n
c
i
a

(
5
4
6

n
m
)

Figura 1 Comportamento cintico do reagente de Lactato aps adio de amostra biolgica (Reao de Ponto Final)

O reagente apresentou ponto final da reao em trs minutos e permaneceu estvel at sete
minutos com absorvncia de aproximadamente 0,500A. preconizado que a reao atinja ponto final
no mximo em cinco minutos, sendo assim, o reagente em desenvolvimento atendeu a especificao.

Teste de repetibilidade onde forma obtidos os seguintes resultados: Mdia de 46,2 mg/dL,
Desvio Padro de 2,14 mg/dL e Coeficiente de Variao de 4,64%. Os resultados podem ser
visualizados na Figura 2:

39,74
41,88
44,02
46,16
48,3
50,44
52,58
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Anlises
V
a
l
o
r
e
s

Figura 2 Teste de preciso mostrando a distribuio das vinte dosagens de uma amostra em torno da mdia no eixo Y e
com escalas de trs desvios padres abaixo e acima da mdia

No teste de preciso foi obtido coeficiente de variao de 4,64% atendendo ao determinado
pelo setor de Pesquisa e Desenvolvimento da BioTcnica e pelo Manual do Controle de Qualidade
BIOTCNICA (2008), que de no mximo 5% e a disperso das determinaes em torno da mdia
no mostram tendncias de elevao ou diminuio em determinaes em seqncia. Alm disto,
nenhuma delas ultrapassa os limites de trs desvios padres conforme especificaes internas da
BioTcnica e Regras de WESTGARD (1981). A obteno de baixo coeficiente de variao indica
baixo erro aleatrio.

Os resultados obtidos no teste de linearidade esto demonstrados no Grfico 3:
R
2
= 0,9994
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 25 50 75 100 125
Concentr ao (mg/dL)
A
b
s
o
r
v

n
c
i
a

(
5
4
6

n
m
)

Figura 3 Linearidade: correlao entre as absorvncias obtidas e as concentraes de Lactato (Coeficiente de correlao
r = 0,9997)


No teste de linearidade os resultados obtidos mostram leituras de absorvncias lineares no
intervalo de concentrao de zero a 120 mg/dL e r= 0,9997 demonstrando comportamento linear neste
intervalo. Para este mtodo o coeficiente de variao r foi maior que 0,99 conforme determinado no
Manual de Validao do setor de Pesquisa e Desenvolvimento da BioTcnica.

Os resultados obtidos no teste de exatido encontram-se na Tabela 2.

Tabela 2 - Exatido: determinao da concentrao de Lactato em relao aos soros controles e seus respectivos desvios em
relao ao valor esperado (Recuperao)
Amostra Valor obtido Valor esperado Desvio Recuperao
Soro Controle um 11,8 mg/dL 11,4 mg/dL 3,50% 103,5%
Soro Controle dois 38,2 mg/dL 37,9 mg/dL 0,79% 99,21%
Soro Controle trs 13,8 mg/dL 13,7 mg/dL 0,73% 99,27%

O teste apresentou desvios de 3,5%, 0,79% e 0,73% para os soros controles um, dois e trs
respectivamente, demonstrando baixo erro sistemtico em relao ao valor esperado e de acordo com o
preconizado no Manual de Validao de produtos da BioTcnica que de 10% para este analito.

Os resultados obtidos no Teste de Estabilidade do Calibrador de Lactato esto demonstrados
na Figura 4:

Estabilidade CALIBRADOR - Lactato
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
50,00
55,00
60,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tempo ( dias)
C
o
n
c
e
n
t
r
a

o

(
m
g
/
d
L
)
2 a 8 oC Plstico
37oC Plstico
37oC Vidro

Figura 4 Teste de Estabilidade de Calibrador de Lactato em condies de estresse
(Absorvncia em funo do Tempo em dias)

No teste de Estabilidade do Calibrador de Lactato a concentrao inicial foi de 38,0 mg/dL.
Aps sete dias, as amostras de Calibrador que foram colocadas em estufa a 37C obtiveram queda na
concentrao para 37,1 mg/dL (em frasco de plstico) e para 37,4 mg/dL (em frasco de vidro) no
sendo esta queda significativa devido s variaes intra-ensaio, que so da ordem de aproximadamente

3% (~1,11 mg/dL) e variaes de calibrao do equipamento da ordem de 5% (~1,85%). Na amostra
refrigerada a concentrao obtida aps sete dias foi de 41,8 mg/dL. Aps 20 dias as amostras
obtiveram mesma concentrao. Aps 27, 34 e 41 dias a amostra de Calibrador de Lactato em
condio de estresse e em frasco de vidro obteve uma queda significativa na concentrao. Portanto o
Calibrador de Lactato tem maior estabilidade quando envasado em frasco plstico, mesmo em
condies de estresse.

Os resultados obtidos no Teste de Sensibilidade Metodolgica do Reagente de Lactato esto
demonstrados na Tabela 3 e na Figura 5:

Tabela 3 - Dados referentes Figura 5: Teste de Sensibilidade Metodolgica do Reagente de Lactato
Mdia de cinco replicatas(mg/dL) CV (%)
1,66 3,30
3,4 0
6,46 1,38
12,7 0,56
24,82 1,96




Figura 5 Anlise Estatstica do Teste de Sensibilidade Metodolgica do Reagente de Lactato. Grfico da mdia das
dosagens de amostras de baixa concentrao de Lactato em funo do Coeficiente de Variao (CV) de tais amostras

Os resultados obtidos no Teste de Sensibilidade (ou limite de deteco) Metodolgica do
Reagente de Lactato, de acordo com a Tabela 3 e a Figura 5, mostram uma replicata de maior
Coeficiente de Variao foi a mdia de 1,66 mg/dL, sendo este valor aproximado a sensibilidade o
Reagente de Lactato, j que a sensibilidade se refere a variao da resposta de um mtodo de medio
que possvel se medir.


Os resultados obtidos no Teste de Correlao do Reagente de Lactato BioTcnica
(Metodologia Trinder) em relao a um reagente de Lactato (Metodologia LDH UV Lactato
Desidrogenase Ultra violeta), esto demonstrados na Figura 6:

Teste de Correlao - Lactato
Y = 0,945X + 2,1316
R
2
= 0,9946
R = 0,9973
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120
Biotcnica LOD POD (mg/dL)

L
D
H

U
V

(
m
g
/
d
L
)


Figura 6 - Teste de Correlao do Reagente de Lactato Trinder BioTcnica e Reagente de Lactato LDH UV (Lactato
Desidrogenase Ultra violeta)

No Teste de Correlao do Reagente de Lactato Trinder BioTcnica que apresenta como
princpio do mtodo a reao do Lactato com a Lactato oxidase e a Peroxidase e leitura em
espectrofotmetro em 546 nm com um reagente de Lactato que tem como princpio do mtodo a
oxidao do Lactato pela Lactato Desidrogenase e leitura em 340 nm, o r obtido foi de 0,9973
demonstrando comportamento linear e atendendo aos requisitos do Manual de Validao de Reagente
da BioTcnica que de r no mnimo de 0,99. O reagente Lactato BioTcnica apresentou valores
correspondentes aos obtidos pelo reagente de Lactato LDH UV.

Os resultados obtidos no Teste de Reprodutibilidade encontram-se na Tabela 3:

Tabela 4 - Teste de Reprodutibilidade do Reagente de Lactato BioTcnica
Teste de Reprodutibilidade
Tempo (dias) Resultados (mg/dL)
Um 27,35
Dois 29,20
Trs 30,26
Quatro 28,60
Cinco 29,41
Mdia (mg/dL) 28,96
Desvio Padro (mg/dL) 1,08
Coeficiente de Variao (%) 3,73




No Teste de Reprodutibilidade um dos parmetros modificado para avaliar o comportamento
analtico do reagente. No caso dos resultados apresentados na Tabela 4 o teste foi realizado usando um
mesmo sistema analtico (Equipamento, operador, calibrador, etc) variando-se somente o dia. Foi
obtido coeficiente de variao de 3,73% atendendo as especificaes do Manual de validao do setor
de Pesquisa e Desenvolvimento da BioTcnica que de no mximo 5%. Este resultado demonstra que
o sistema analtico, que inclui o reagente em anlise estvel mesmo aps um determinado intervalo
de tempo.
















































5. Consideraes Finais

Neste trabalho foram revisadas as caractersticas gerais das enzimas e exploradas as suas
diversas aplicaes na cincia e na indstria. Ateno especial foi dada aplicao destas em
diagnstico molecular conforme explicaes mais detalhadas que seguem.
Aps a pesquisa e o desenvolvimento de metodologia Trinder para a dosagem do Lactato (um
analito plasmtico encontrado em diversas patologias ou situaes de estresse fsico), a formulao
proposta para o produto apresentou desempenho adequado, demonstrado nos testes de: exatido,
sensibilidade, especificidade, estabilidade, linearidade, reprodutibilidade, etc.
O desenvolvimento do reagente para dosagem de Lactato foi possvel devido alta
especificidade enzimtica que utiliza enzimas como a Peroxidase e a Lactato oxidase, demonstrando a
importante aplicao das enzimas no Diagnstico Molecular dentre as diversas reas. A otimizao e
estabilizao das enzimas em meio lquido foi possvel atravs da formulao desenvolvida na
BioTcnica de acesso restrito. Verificou-se que a metodologia enzimtica-colorimtrica para dosagem
de lactato atendeu de modo satisfatrio a determinao para o Diagnstico Clnico, o que possibilitou
sua utilizao na rotina laboratorial. Os procedimentos de validao, Controle de Qualidade e controle
estatstico foram perfeitamente aplicveis a essa metodologia e forneceram dados que garantem a
qualidade do processo analtico. Os laboratrios puderam, ento, adquirir reagentes confiveis para a
determinao de lactato dos seus pacientes.
A preveno de erros no desenvolvimento do reagente enzimtico implica na criao de
Processos Analticos capazes de atingir os requisitos da qualidade para a Produo de reagentes e
consequentemente resultados de utilidade mdica. uma atitude que determina a qualidade inerente
dos processos de medidas.
























REFERNCIA BIBLIOGRFICA


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