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A Dios por ser nuestro gua, quien ha
permitido que sigamos de pie, Por
darnos la fuerza necesaria para
seguir adelante.
A nuestros padres, por darnos la
vida, por brindarnos su apoyo
Incondicional siempre, por estar con
nosotros en las buenas y en las malas.
A nuestros hermanos por ser parte
de nuestra vida
A nuestros familiares por estar con
nosotros y darnos nimos para seguir
adelante.
A nuestros amigos por compartir con
nosotros su amistad, su sinceridad
por ser parte importante de nuestra
vida estudiantil.







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A la Universidad Nacional de
Ingeniera en especial al
laboratorio de microbiologa de
la facultad de ingeniera
ambiental por habernos
permitido cumplir con nuestro
laboratorio, y formarnos da a
da como futuros profesionales.
Al Dr. Alejandro Mendoza por su
asesoramiento y valiosa
colaboracin en el presente
laboratorio.
A nuestros compaeros que con
su apoyo hicieron posible la
culminacin de este proyecto
de laboratorio.













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RESUMEN




































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INDICE










































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1. INTRODUCCIN
Debido a que los microorganismos son ubicuos, -se encuentran presentes en
todas partes como el aire, el agua, el suelo, los alimentos, sobre las superficies
de los objetos y sobre el exterior e incluso en el interior de todos los
organismos- influencian o actan en diversos campos de nuestra vida como n
la salud, industria etc y tambin son objetos de estudio por las diferentes
ramas de la microbiologa como lo son en:
La microbiologa mdica para la prevencin, diagnstico y control de
las enfermedades causadas por microorganismos patgenos como por
ejemplo los estafilococos, Salmonella, Shinguella, etc. Adems estudia
la epidemiologa, antibiosis e inmunizacin.
La microbiologa agrcola en donde los microorganismos nos ayudan a
fertilizar las plantas y en los animales permiten la degradacin interna
de sus alimentos como en los vacunos al descomponer sus alimentos y
formar el rumen. Tambin el aspecto mdico en plantas y animales.
La microbiologa ambiental donde se da importancia a los
microorganismos ya que estos regulan y mantienen los procesos
geofisiolgicos como lo son la temperatura, qumica atmosfrica y la
circulacin de nutrientes.
La microbiologa industrial en el cual los microrganismos intervienen en
la produccin de sustancias como medicinas, alcoholes, cidos grasos
que son producto del metabolismo bacteriano.
Tambin influencian en campos como lo son la microbiologa de
alimentos, microbiologa blica, biotecnologa microbiolgica, y tambin
por los dems campos de la ciencia.
Debido a que la presencia y los campos de accin de los microorganismos
son muy amplios y variados-generan problemas (como las enfermedades)
pero tambin beneficios(biorremedacin)-es de vital importancia
identificarlos y estudiarlo, es por ello que se realiz el presente informe de
investigacin para determinar la presencia de bacterias en diversas
muestras de la Universidad Nacional de Ingeniera para conocer los
mtodos de cultivo y de siembra, y tambin la lectura e identificacin de
las muestras a nivel de gnero, mas no de especie (para este tipo de
identificacin se deben hacer pruebas bioqumicas de los
microorganismos analizados, pero se puede suponer cierto tipo de
especies sin estas pruebas) para lo cual se cultiv bacterias de diversas
muestras en diferentes medios los cuales fueron: SS Agar, TSA, agar
saburado (medios de cultivo slido), BHI, caldo lactosado(medios de
cultivo lquido) que luego se dieron las lecturas: dentro del mbito
macroscpico se caracteriz las colonias de las bacterias encontradas
(tamao, forma, elevacin, superficie, borde, consistencia, cromognesis,
grado de transparencia), mientras que en el mbito microscpico se
describi la morfologa bacteriana.









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2. MARCO TEORICO
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseado diversos
mtodos que permiten cultivarlos bajo condiciones artificiales, en los que es
posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de
microorganismo. Una de las tcnicas ms usadas en el laboratorio de
microbiologa consiste en transferir una muestra microbiolgica de un
ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos
microbianos. Al efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en
el rea de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es
necesario tomar precauciones para impedir que stos penetren y contaminen
los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no slo el aspecto
nutricional, sino tambin las condiciones ambientales de su hbitat natural,
por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentracin de
sales y durante la incubacin condiciones tales como la temperatura,
aireacin la luminosidad .La aplicacin de estos procedimientos ha permitido
propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, as como su aislamiento y
la obtencin de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio,
caracterizacin, aplicacin y control de los mismos. La forma de sembrarlos y
cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propsito especfico del
estudio.
CULTIVO DE MICROORGANISMOS
El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones
fsicas, qumicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de
forma controlada.
MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es un sustrato o una solucin de nutrientes que permite el
desarrollo de microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar
un cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en
las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias.
Los microorganismos son los seres ms abundantes de la tierra, pueden vivir
en condiciones extremas de pH, temperatura y tensin de oxgeno,
colonizando una amplia diversidad de nichos ecolgicos. Entre los
requerimientos ms importantes para su desarrollo estn el carbono, el
oxgeno, nitrgeno, dixido de carbono e hidrgeno. Muchas bacterias sin
embargo necesitan del aporte extra de factores de crecimiento especficos
en forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros.
Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son:
- Agua. Se debe usar agua destilada.
- Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacrido que se
obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de
degradarlo.
- Azcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los
ms empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa.












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- Peptonas. Son protenas hidrolizadas, se obtienen por digestin qumica
o enzimtica de protenas animales o vegetales.
- Indicadores de pH. Son indicadores cido-base que se aaden para
detectar cambios de pH en el medio.

Clasificacin de los medios de cultivo
Segn su origen:
a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen
animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya
composicin qumica no se conoce exactamente.
b) SINTTICOS: son los medios que contienen una composicin qumica
definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados
reproducibles.
c) SEMISINTTICOS son los sintticos a los que se les aaden factores de
crecimiento bajo una forma de un extracto orgnico complejo, como por
ejemplo extracto de levadura.
Segn su consistencia
a) LQUIDOS: se denominan caldos y contienen los nutrientes en solucin
acuosa.
b) SLIDOS: se preparan aadiendo un agar a un medio lquido (caldo) a
razn de 15 g/litro. El agar es una sustancia inerte polisacrida (hidrato de
carbono) que se extrae de las algas. Como esta sustancia no es digerida por
las bacterias no constituye ningn elemento nutritivo. Este conjunto
convenientemente esterilizado puede ser vertido en placas de Petri o en tubos
de ensayo y presentan la posibilidad de aislar y diferenciar bacterias,
"procesos que antes no eran posibles en medio lquido".
c) SEMISLIDOS: contienen 7,5 g de agar /litro de caldo. Se utilizan para
determinar la motilidad de las especies en estudio.
Actualmente se encuentran disponibles comercialmente con el agregado de
agar.
Segn su composicin:
A causa de los requerimientos qumicos del mundo microbiano, a veces es
necesario agregar o eliminar componentes qumicos del medio.

a) MEDIOS COMUNES O UNIVERSALES: Tienen los componentes esenciales
y destinados para cultivar la mayora de las bacterias. Es el medio ms
frecuentemente utilizado para mantener colonias microbianas. Por
ejemplo: Agua peptonada, Agua comn, Agar comn o Caldo
comn.
b) MEDIOS ESPECIALES: Son aquellos que se forman a partir de un medio
basal o comn. Al que se le aade diversas sustancias de acuerdo a la
finalidad deseada y pueden ser:







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1. ENRIQUECIDOS: estn compuestos de un medio base como apoyo del
crecimiento al cual se le puede agregar un gran exceso de nutrientes
como suplementos nutritivos, por ejemplo: sangre, suero, lquido
asctico, etc. Se utiliza para microorganismos que tienen grandes
exigencias nutricionales.
Ejemplos:
- Agar Sangre: Cuando a un medio basal o comn se le aade entre
5 a 10% de sangre (mayora de bacterias patgenas)
- Agar Ogawa o Lowenstein-Jensen (bacilo de Koch)
- Agar Chocolate: Cuando el agar sangre se calienta entre 60- 80 C
hasta que tome un color chocolate ( gonococos y mengicocos)
- Caldo Cerebro- Corazn (Brain Heart Infusion), microorganismos
exigentes.
2. SELECTIVOS:
Son medios en los que la selectividad se consigue alterando las
condiciones fsicas del medio o aadiendo o suprimiendo
componentes qumicos especficos con el fin de inhibir el crecimiento
de especies qumicas cuyo crecimiento no interesa. Este tipo de medio
slo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos e
inhibiendo el de otros. Se utiliza para seleccionar y aislar
microorganismos a partir de poblaciones mixtas. Por ejemplo:
- Agar salado-manitol o Chapman (permite el crecimiento de ciertos
estafilococos).
- Agar Mc Conkey (E. coli y otras enterobacterias).
- Agar EC (E. coli).
- Agar Centrimide (Pseudomonas).
- Agar Mitis Salivarius (Estreptococos orales).
- Agar TCBS (Vibrio cholerae).
- Agar Sabouraud (Hongos).
- Agar SS (Salmonella y Shigella).
Entre los factores selectivos que alteran las condiciones del medio
tenemos:
Cambio de pH: por ejemplo agregando cido actico para
favorecer el crecimiento de Lactobacillus (pH final: 5,4 que es hostil
para la mayora de las especies que crecen entre 6,5 y 7,2). Los
hongos crecen entre pH 4 y 6 y S. Faecalis a pH 9,6.
Cambio de temperatura: la mayora de las bacterias crece
ptimamente entre 20 C y 40 C. Los cultivos tpicos de S. Faecalis
requieren 60 C de temperatura y los de Listeria son capaces de
desarrollarse y crecer a 4 C.
Alteraciones osmticas: se acrecientan las propiedades osmticas
un medio con el agregado de cloruro de sodio. Estos medios
intensifican la seleccin de bacterias halfilas como
Staphylococcus spp. (7,5%).
Ajuste en la tensin de oxgeno: es importante en la seleccin de
aerobios y anaerobios.
Ajuste en la tensin de anhdrido carbnico: muchos patgenos
importantes pueden ser cultivados a menos que se eleve la tensin
ms all de la atmosfrica.












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Entre los factores que inhiben el crecimiento de bacterias
indeseables tenemos: Antispticos: sustancias antibacterianas
inespecficas que pueden actuar como inhibidores. Por ejemplo: el
medio de cultivo comercial S - S (Salmonella - Shigella) que
contiene verde brillante (inhibe las bacterias Gram-positivas) y sales
biliares (que inhiben un gran nmero de Gram-negativas menos
enterobacterias). Otro ejemplo es el medio de Mc Conkey que
contiene cristal violeta (inhibe las Gram-positivas pero no las
enterobacterias)
Antibiticos: sustancias antibacterianas especficas que impiden el
crecimiento de aquellos microorganismos que no nos interesa que
crezcan en ese medio. Un ejemplo es el medio de Thayer - Martin
con VCN (vancomicina, colistina y nistatina) que se utiliza para el
aislamiento de gonococos. La penicilina en una concentracin de
5,50 unidades/ ml inhibe la mayora de las Gram-positivas. Otro
ejemplo es el medio de Sabouraud - cloranfenicol para el
aislamiento de Cndida albicans.

3. DIFERENCIALES:
Son medios de cultivos que nos permiten distinguir entre varios gneros
y especies de microorganismos. Por ejemplo si al medio se le ha
aadido un carbohidrato y un indicador y la bacteria que se cultiva es
capaz de fermentar dicho carbohidrato, se produce una acidificacin
del medio con el consiguiente viraje de color del indicador por el
cambio de pH. El citrato de Simmons es un medio cuya nica fuente
de carbono es el citrato sdico, entonces en l solo crecern las
bacterias capaces de desarrollarse utilizando como nica fuente de
carbono ese componente. A menudo la separacin se basa en la
diferencia de color de las colonias aisladas, como en el agar con azul
de metileno - eosina que permite diferenciar E. coli (colonias oscuras y
de brillo metlico) de Enterobacter aerogenes (colonias rosadas de
centro azul sin brillo). Estos dos microorganismos en agar nutritivo
producen colonias de color gris blancuzco.
Suelen ser a la vez selectivos, por lo tanto solo crecern determinadas
bacterias (pueden ser dos o ms tipos) que al actuar sobre alguno de
los componentes especficos del medio, demuestran algunas de sus
propiedades o caractersticas y nos permite diferenciar entre ambos
tipos.
Ejemplos:
- Medio Ox- Ferm (Oxidacin- Fermentacin).
- Citrato de Simons (Determinacin del uso de citrato como fuente
de Carbono)
- TSI (Triple azcar hierro). Determinar el uso de lactosa, glucosa y
adems la produccin de H2S.
- LIA (Lisina agar). Determinar el metabolismo de lisina.
- Agar manitol salado (Determinar el uso de manitol).
- Agar urea.
- Agar SIM.






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4. DE TRANSPORTE:
Son utilizados para asegurar la viabilidad de la bacteria sin
multiplicacin significativa de los microorganismos desde el momento
de su extraccin hasta su posterior estudio. Se utilizan generalmente
cuando las muestras deben ser enviadas de un laboratorio a otro. Se
recomienda un lmite de dos horas desde la recoleccin de las
muestras y su estudio en el laboratorio, pero este lmite de tiempo es
superado (frecuentemente cuando se trata de muestras tomadas en
un consultorio). Esta demora hace necesario el uso de medios de
transporte adecuados. Los medios de transporte ms frecuentemente
utilizados son los de Stuart, Amies y Carey - Blair. Existe una unidad
descartable de cultivo de transporte llamada Culterette que consiste
en un tapn estril de poliestireno y una ampolla en la parte inferior
que se rompe cuando se ejerce presin liberando el medio de
transporte de Stuart alrededor del extremo del tapn impregnado en la
muestra.

Hasta hace algunos aos los componentes orgnicos mencionados deban
ser obtenidos por el microbilogo y el medio de cultivo se preparaba en el
laboratorio. Actualmente se dispone comercialmente de la mayor parte de
los medios e incluso de sus componentes adicionales.

Un gran nmero de medios de cultivo usados en el laboratorio de
microbiologa son mixtos, es decir que tienen como finalidad la de varios
grupos de los mencionados, por ejemplo, el agar S- S es selectivo (pues tiene
un inhibidor: el verde brillante) y es a la vez un medio diferencial (lleva lactosa
y un indicador) que permite diferenciar las bacterias fermentadoras o no de
dicho polisacrido. El medio de Thayer y Martin para
Neisseria es un medio enriquecido (contiene plasma) y es selectivo (tiene 3
antibiticos inhibidores de la flora bacteriana y fngica: colistina, vancomicina
y nistatina).

MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS
BHI (Brain Heart Infusion)
La infusin cerebro-corazn es una frmula muy rica que puede
emplearse, ya sea como caldo o medio, slido para el crecimiento de
una gran variedad de microorganismos. Los componentes clave incluyen
infusin de distintos tejidos animales con el agregado de peptona,
tampn fosfato y una pequea concentracin de glucosa que
proporciona una fuente de energa fcilmente accesible a los
microorganismos.












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Los caldos infusin cerebro-corazn se emplean con frecuencia como
medio para hemocultivo y como medio base para muchas pruebas
metablicas, en especial para la identificacin de estreptococos.

Caldo Lactosado
Es un medio rico en nutrientes y no contiene inhibidores del crecimiento
bacteriano. Permite recuperar clulas injuriadas, diluye sustancias toxicas
o inhibitorias s y favorece el desarrollo de Salmonella con respecto a otras
bacterias. El extracto de carne y la peptona son la fuente de carbono y
nitrgeno mientras que la lactosa es el hidrato de carbono fermentable.
Por la fermentacin de la lactosa se produce cido y gas (el cual se
evidencia al utilizar las campanas de Durham).
Medio recomendado como prueba presuntiva de la presencia de
bacterias del grupo coliforme en aguas y alimentos. Tambin est
indicado para el preenriquecimiento no selectivo en los protocolos de
investigacin de Salmonella spp. a partir de alimentos.


Agar SS (Salmonella- Shigella)
Es un medio selectivo y diferencial, diseando para el aislamiento de
Salmonella y Shigella. La inhibicin de las bacterias del grupo coliforme
(Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella) as como de Gram
positivas, se logra con la mezcla de sales biliares, citrato de sodio y






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tiosulfato de sodio (agentes quelantes) y verde brillante. Adems, el medio
tiene incorporado lactosa como nico carbohidrato y rojo neutro como
indicador de pH. Salmonella y Shigella no fermentan lactosa y forman
colonias traslucidas o incoloras, los pocos microorganismos fermentadores
de lactosa capaces de desarrollarse, acidifican el medio haciendo virar al
rojo el indicador de pH, obtenindose colonias rosadas o rojas sobre un
fondo rojizo. Este medio tambin contiene sales de Hierro como indicador
para detectar la produccin de sulfuro de hidrogeno (H2S), las bacterias
que lo produzcan forman colonias con un centro negro debido a la
precipitacin de sulfuro frrico (Fe2S3).
Debido a que algunos componentes del medio pueden precipitar con el
calentamiento, este medio se prepara calentndolo hasta la ebullicin por
2 o 3 min. Hasta su disolucin completa y no autoclava.

TSA (Tripteina Soya Agar)
El TSA Agar es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto de
microorganismos exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias
aerobias y anaerobias. Permite visualizar reacciones hemolticas que
producen muchas especies bacterianas.
Tiene por base una fuente proteica (digeridos trpticos, digeridos proteicos de
soja) con una pequea cantidad de hidratos de carbono naturales, cloruro
sdico (mantiene el balance osmtico) y 5% de sangre.
Es un medio recomendado para la deteccin y recuento de una amplia
gama de microorganismos. La presencia de Lectina y Tween permite
neutralizar la actividad antibacteriana, facilitando la investigacin de los
grmenes en productos o superficies que contengan: Aldehdos, derivados
fenlicos, o amonio cuaternario.
La aportacin de casena y peptonas de soja al Agar de Tripticasa-soja hace
el medio muy nutritivo por el suministro de nitrgeno orgnico, particularmente
aminocidos y pptidos de cadena ms larga. La presencia de estas
peptonas en el medio permite el cultivo de una gran variedad de grmenes












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aerobios y anaerobios que crecen rpidamente, as como los del gnero
Candida. Tambin permite el crecimiento de algunos grmenes exigentes
como estreptococos, pneumococos, Brucella, corinebacterias, Erysipelothrix y
Pasteurella.
Resultados:

Agar Sabouraud
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial para el aislamiento de hongos,
particularmente los asociados con infecciones cutneas (piel, pelo).
En el medio de cultivo, la peptona, la triptena y la glucosa son los nutrientes
para el desarrollo de microorganismos. El alto contenido de glucosa, la
presencia de cloranfenicol y el pH cido, inhiben el desarrollo bacteriano y
favorecen el crecimiento de hongos y levaduras. El agar es el agente
solidificante.
Puede ser suplementado con otros agentes selectivos de crecimiento.


SIEMBRA
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra
(inculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano,
para su desarrollo y multiplicacin. Una vez sembrado, el medio de cultivo se
incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.
Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:

. Que se efecten aspticamente
. Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estn esterilizados
. Que se realicen solo los manipuleos indispensables
. Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un
mechero o bien Flujo laminar.






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Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los
requerimientos del microorganismo a estudiar.
Medios lquidos:

- Siembra por inoculacin: Con el asa de siembra previamente
esterilizada tomar una cantidad suficiente de inoculo y ponerla en
contacto con el medio lquido.

Medios slidos:
- Siembra por inmersin: se coloca el inculo en una placa o caja de
Petri y sobre el mismo se vierte el medio de cultivo previamente
fundido. Este mtodo se utiliza para microorganismos aerobios.

- Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por
inmersin. Una vez solidificado el medio se vierte una cantidad
extra de medio necesaria para cubrir la capa anterior
(generalmente 10 ml. aprox.). Este mtodo se utiliza para
microorganismos anaerobios facultativos y microaeroflicos.

- Siembra por puntura o picadura: Consiste en tomar una pequea
cantidad de la muestra, con la aguja de Kolle y sembrar
introduciendo la aguja hasta cerca del fondo: del tubo que
contiene el medio slido (es til para ver el comportamiento
bioqumico de las bacterias).

- Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio
de cultivo fundido, se deja solidificar y se coloca sobre la superficie
el inculo. Con ayuda de una esptula de Drigalsky se extiende el
inculo hasta su absorcin total por el medio de cultivo. Este tipo de
siembra se recomienda para microorganismos aerobios estrictos.

- Siembra por agotamiento o dispersin: Consiste en repartir el
inculo sobre la superficie del medio slido en zigzag en 3 o 4
campos de la placa o por estriado simple en toda la placa. Es til
para obtener colonias aisladas.

- Siembra en estra: Existen distintas tcnicas para la siembra en
estras, el objeto es obtener colonias aisladas


Tcnica A

Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estras paralelas en la
cuarta parte de la superficie de la placa, se quema el ansa, se enfra,
se gira la placa a 90 y se vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el rea
sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de la placa. Por ltimo,
sin quemar el ansa, se estra el resto de la superficie sin sembrar.













15

Tcnica B

Con el ansa cargada se hacen 3 o 4 estras; se quema el ansa, Se hacen
3 o 4 estras perpendiculares a las anteriores, se quema el ansa y se
repite el procedimiento hasta agotar la superficie de la placa.



OBSERVACIN DE LAS BACTERIAS:
a) Observacin macroscpica:
El tamao de las bacterias impide verlas a simple vista. Sin embargo, las
colonias que forman sobre medios slidos s son visibles, y en ellas se puede
estudiar una serie de caractersticas que nos ayudan a su identificacin. A
nivel morfolgico, podemos estudiar la forma de las colonias, su tamao,
aspecto del borde (liso, rugoso, ondulado, ramificado, etc.), presencia de
brillo, color, etc. Incluso sobre medio lquido las bacterias producen
modificaciones de inters para su clasificacin y que tienen que ver
esencialmente con las caractersticas de su metabolismo. As se observa si la
turbidez es uniforme, si crecen en el fondo, si lo hacen en la zona superficial, si
producen pigmentos, etc...

b) Observacin microscpica:
Puesto que la inmensa mayora de las bacterias son incoloras, la nica forma
de observarlas bien en el microscopio ptico consiste en incrementar su
contraste con respecto al medio. Esto se consigue mediante su teido con






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colorantes o mediante la disposicin de una ptica especial de contraste,
generalmente de fases, en el microscopio. Para observar las bacterias teidas,
hay que proceder previamente a su fijacin. Inicialmente se prepara un frotis
a partir de medio lquido o dispersando en una gota de agua una porcin de
clulas crecidas en slido. Posteriormente se deshidrata el frotis por
calentamiento suave utilizando el reverso de la mano como control de
temperatura tras pasar repetidamente el portaobjetos sobre la llama del
mechero. Tras la fijacin por calor se procede a la tincin.

TINCIN GRAM
El mtodo de tincin diferencial ms importante usado en bacteriologa es la
tincin de Gram, llamada as en honor al Dr. Hans Christian Gram. Este mtodo
divide las bacterias en dos grandes grupos, las Gram-negativas y las Gram-
positivas. Esto es esencial para la clasificacin y diferenciacin de
microorganismos. La reaccin a la tincin de Gram est basada en la
diferencia en la composicin qumica de la pared celular bacteriana. Las
bacterias Gram-positivas s tienen una gruesa capa de peptidoglicano o
murena, mientras que esta capa es ms fina en las Gram-negativas y est
rodeada por una bicapa lipdica externa. El Peptidoglicano es un polisacrido
formado por dos subunidades qumicas, N-acetilglucosamina y cido N-
acetilmurmico.
Esta tincin adems, correlaciona con otras propiedades como endotoxinas,
susceptibilidad a antibiticos, sensibilidad o resistencia a sales biliares, punto
isoelctrico y tensin superficial.












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1. Tincin inicial: Las clulas se tien con cristal violeta, el cual es el
colorante primario. En este paso todas las clulas se tien de morado.
2. Mordente: Se adiciona yoduro (lugol) que reacciona con el cristal
violeta y forma un complejo violeta- yoduro. En este punto todas las
clulas continan de color morado.
3. Decoloracin: Se adiciona un solvente no polar, el cual acta lavando
el complejo cristal violeta- yoduro de las clulas Gram (-). De esta
manera las bacterias Gram (+) continan moradas y las Gram (-)
quedan incoloras. Este es el paso crtico de esta tincin, pues si se
exagera, decolora las Gram (+) y si se hace muy dbil no decolora las
Gram (-).
4. Contratincin: Se vuelve a teir con safranina o fucsina, de manera
que las bacterias Gram (-), que haban sido decoloradas, se tien de
rosado a fucsia segn el colorante empleado; en tanto, las bacterias
Gram (+) no se afectan con la contratincin y permanecen moradas
debido a lo intenso de esta coloracin.









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8. PARTE EXPERIMENTAL:
8.1. LUGAR DE INVESTIGACIN

La presente investigacin se llev a cabo en la Universidad Nacional de
Ingeniera.
Laboratorio de Microbiologa y Biologa de la Facultad de Ingeniera
Ambiental.

8.2. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

MUESTRA VEGETAL:
Para la investigacin se utiliz csped del parque de la facultad de ingeniera
de petrleo.
MUESTRA BIOLGICA:
Se emple carne cruda.
MUESTRA LIQUIDA:
Se emple agua de maracuy de la facultad de ingeniera mecnica.
MUESTRA AMBIENTAL:
Se emple aire ambiental del laboratorio de microbiologa de la facultad de
ingeniera ambiental.
MUESTRAS DE ALIMENTOS:
Se emple aj preparado del restaurante chaparral y mostaza procesada.
MATERIALES DE LABORATORIO










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EQUIPOS:












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8.3 METODOLOGIA:
TABLA 1: TOMA DE MUESTRAS PARA CADA MEDIO
BHI CALDO
LACTOSADO
SALMONELLA
S AGAR
TRITISOYA
AGAR
AGAR
SABORAUD
Aj del
chaparral
X X X X X












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PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO:
Obtener el medio de cultivo, en nuestro caso Agar SS, buscar en el rtulo del
envase la proporcin (gr/ml) para la correcta preparacin, luego en un
Erlenmeyer previamente esterilizado se mezclan 100 ml de agua destilada y
6gr del medio de cultivo Agar SS, y se tapar con un pedazo de algodn, se
proceder a calentar la mezcla-agitando frecuentemente-con un horno o
mechero hasta que entre en ebullicin, luego se calentar por 1 minuto ms
aprox. enfriar el Erlenmeyer y esperar que el medio se solidifique, finalmente
rotular debidamente y colocar en la refrigeradora.
OBS: Por qu no se esteriliza el medio de cultivo?
-Es simple, el Agar SS como se puede apreciar en su rtulo, tiene productos
que enriquecen el medio y evitan el crecimiento de otros microorganismos, si
se coloca en el autoclave estos compuestos comenzarn a desnaturalizarse
(degradarse) por la accin del calor y se malograr el medio.
PREPARACION DE LAS PLACAS PETRI PARA EL SEMBRADO:
Sacar el medio de cultivo de la refrigeradora y calentar hasta ebullicin, luego
se verter el contenido en 5 placas Petri de la siguiente manera:
-En un rea de trabajo limpio y estril se proceder a quitar el algodn con los
dedos meique y anular de la mano que usted prefiera, luego con la otra
mano se acercar la boca del Erlenmeyer al mechero y pasarlo por la flama
suavemente, con la misma mano del algodn abrir la placa Petri, no del todo,
solo la parte por donde se va a verter el medio y rpidamente se tapar la
placa, y nuevamente se pasar la boca del recipiente por la flama, el
procedimiento se repite para las dems placas, todo este procedimiento se
realizar cerca del mechero con la cautela debida.
ETAPA DE LA SIEMBRA DE LAS MUESTRAS:
-Esperar a que
las el medio en
las placas se
solidifique y
luego invertirlas,
proceder a
sembrar las
diferentes
muestras en las
Csped FIP X X X X X
Agua
maracuy
FIM
X X X X X
Carne X X X X X
Aire
Ambiental
- - - X X
Mostaza X X X - -






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placas, por dispersin o agotamiento, de la siguiente manera:
-En un rea de trabajo limpio y estril, destapar parcialmente una de las
placas, con un asa de siembra, previamente esterilizada, tomar una muestra
del cultivo a sembrar (inculo) y extender sobre un rea pequea de la
superficie de la placa con el medio (Agar SS), en forma de estras muy juntas,
pero sin hacer presin para no daar el agar, girar la placa un poco y volver a
sembrar en formas de estras, as sucesivamente y al final sembrar-en forma de
estra-en el centro de la placa, despus se colocar de cabeza la placa y se
rotular para su identificacin en la lectura de colonias, realizar estos pasos
para las diferentes muestras (Aj del chaparral, Csped FIP, agua de
maracuy FIM, carne, mostaza de tienda).
Para el sembrado de la muestra de Csped FIP y carne, se procedi a meter
en una bolsa la muestra y verterle agua destilada, para luego obtener una
solucin de la cual se obtendr el inculo.

Mediante esta tcnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra
que contenga un elevado nmero de grmenes para el anlisis de las
bacterias en procesos posteriores.
Luego de tener todas las placas sembradas, llevar las placas-siempre de
cabeza-a la incubadora durante 24-48 horas (en el desarrollo del laboratorio
fue por un lapso de 48h) con una temperatura de 37C +/-1.







Luego de las 48horas transcurridas se procede a sacar las muestras de la
incubadora, y colocarlas en la refrigeradora las placas invertidas hasta el da
que se continuar con la respectiva coloracin e identificacin.
Por qu se colocan las placas de forma invertida en la incubadora y en la
refrigeradora?
-El motivo es que las placas al calentarse y enfriarse en los distintos pasos y
recipientes su forma vapor de agua al calentarse en las placas, que luego al
enfriarse se convierten en gotas de agua que pueden precipitar en el medio
malogrando el experimento.

ETAPA DE COLORACION DE BACTERIAS TRAS LA FORMACION DE COLONIAS:
Se sacarn las muestras de la refrigeradora para luego proceder con la
coloracin con los siguientes pasos:












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Colocar con el asa de siembra una pequea gota de agua en el centro de
un portaobjetos limpio. Flamear el asa y dejar enfriar. Tomar, cerca del
mechero, una pequea cantidad del cultivo bacteriano en medio slido y
diluirlo en la gota de agua. Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar
su evaporacin acercando el portaobjetos a la llama del mechero. Con
cautela para evitar que las clulas se deformen o rompan. Fijar la muestra al
portaobjetos pasndolo 2 o 3 veces por la llama del mechero.
Luego de la fijacin se proceder a rotular el portaobjeto con un marcador o
un corrector y a colorear con la tincin Gram:
Primero: Colocar la placa en
un soporte y cubrir con
colorante cristal violeta por
un minuto aprox.
Lavar con agua de cao.
Segundo: Cubrir la placa con
lugol de Gram por 1 a 2
minutos.
Lavar con agua de cao.
Tercero: Cubrir la placa con
alcohol-acetona por 5
segundos aproximadamente
(movimiento de vaivn).
Lavar con agua de cao.
Cuarto: Cubrir la placa con fucsina bsica (safranina) por 30 segundos.
Lavar con agua de cao y secar.
OBS: En una placa se puede proceder a colocar 2 muestras para facilitar o
acelerar el proceso de coloracin.

ETAPA DE OBSERVACIN MICROSCOPICA:
Se coloca la placa previamente colorada en el microscopio ptico, se
preparar la correcta iluminacin y se enfocar con el objetivo de menor
resolucin, luego colocar un poco de aceite de inmersin a la muestra y se
observar con el objetivo de 100X (el objetivo debe estar inmerso en el
aceite).











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ETAPA DE LECTURA E INTERPRETACION DE LAS COLONIAS:
Se proceder a apuntar todo lo observado en la placa como tamao, forma,
elevacin, superficie, borde, consistencia, etc para las observaciones y
discusiones.

9. RESULTADOS
TABLA 1: VISTA MACROSCOPICAS BHI












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NOTA:
Orden de
turbidez de
mayor a menor: 2
1 3 4 5
Pelcula: 1 2
Sedimentacin: 2 1 4 3
OBS: No se obtuvieron observaciones microscpicas debido a que este grupo
trabaj con un microscopio sin mantenimiento, y por tanto no pudieron
visualizar nada.

















TABLA 2: MEDIO CALDO LACTOSADO
PELICULA SEDIMENTACION TURBIDEZ FLOCULOS
Aj del
chaparral
X X X -
Csped
FIP
X X X -
Agua
maracuy
FIM

-
X X -
Carne - X X -
Mostaza - - X -






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n
t
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Muestras Vista Macroscpica Vista Microscpica
Aj de
Chaparral
Se observ presencia de gas en la campana
de Durham.
Sedimentacin
Pelcula
Turbidez que fue la ms turbia en
comparacin con las otras muestras
No pudimos observar nada
con el objetivo de 100
Csped Se observ presencia de gas en la campana
de Durham
Pelcula
Turbidez que fue la segunda ms turbia en
comparacin a las otras muestras
No pudimos observar nada
con el objetivo de 100
Maracuy Se observ una pequesima cantidad de
gas en la campana de Durham
Turbidez
Sedimentacin
Pelcula( mnima )
Observamos en el
microscopio cocos que en
nuestro caso fueron la
especie de estafilococos
Carne Se observ presencia de gas en la campana
de Durham
Pelcula
Sedimentacin
No pudimos observar nada
con el objetivo de 100
Mostaza Tan solo se observ una muy pero muy
pequea sedimentacin
No pudimos observar nada
con el objetivo de 100
MUESTRA OBSERVACIN MACROSCPICA OBSERVACIN
MICROSCPICA
AJI DEL
RESTAURANTE
CHAPARRAL
Tamao: aproximadamente 1mm de dimetro.
Borde: entero.
Elevacin: convexa.
Superficie: granular.
Forma: redonda.
Pigmentacin: anaranjado-amarillo.
Grado de transparencia: opaco.
Se observaron:
estreptococos y bacilos.
CESPED DEL
JARDIN DE
PETROLEO
Tamao: aproximadamente 4mm de dimetro.
Borde: entero.
Elevacin: convexa.
Superficie: granular.
Forma: redonda.
Pigmentacin: anaranjado-amarillo.
Grado de transparencia: opaco.
Se observaron: bacilos,
Vibrio y bastones.
AGUA DE
MARACUYA DE LA
FACULTAD DE
MECNICA
Tamao: irregular, borde: irregular, elevacin:
convexa,
Superficie: granular, Forma: redonda,
Pigmentacin: prpura. Existe una colonia circular y
otra plana alargada.
Se observaron gran
cantidad de cocos.
CARNE Existen tres tipos de colonias: la primera posee Se observaron: bacilo












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TABLA 3: MEDIO AGAR SS


















forma redonda, la segunda es irregular y la tercera
alargada.
Superficie: cremosa.
Elevacin: convexa.
Pigmentacin: morado.
cocos, cocos y bacilos.
AIRE AMBIENTAL
DEL
LABORATORIO
FIA
No se hizo la prueba ya que ni la Salmonella ni
Shiguella estn en el aire. Por tanto no se obtendr
crecimiento.

MOSTAZA No se encontr crecimiento de colonias.






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TABLA 4: MEDIO TSA

LECTURA MACROSCPICA LECTURA MICROSCPICA
1 Aj de El chaparral Numerosas colonias de distintos
tamaos
Forma: redondeada
Elevacin: convexa
Superficie: lisa y granular
Borde: entero
Consistencia: cremosa
Cromognesis: color crema y en
algunos casos amarillenta
No se logr observar
microorganismos (error
sistemtico).
2 Csped FIP Presencia de abundantes colonias
Forma: redondeada e irregular
Elevacin: convexa
Superficie: lisa
Borde: entero
Consistencia: cremosa
Cromognesis: coloracin crema,
amarillenta y anaranjada.
Se encontr presencia de
abundantes racimos de
cocos(estafilococos) y
bacilos
3 Agua de maracuy
FIM
Se encontr menor cantidad de
colonias
Forma: irregulares y en roco
Elevacin: convexa, plana y
umbilicada
Superficie: lisa y granular
Borde: irregular
Consistencia: cremosa
Cromognesis: coloracin crema,
amarillenta y partes anaranjadas.
Se observ presencia de
cocos












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TABLA 5: AGAR SABORAUD

4 Carne Formacin de pequeas colonias
alrededor de la placa Petri.
Forma: redondeada e irregular
Elevacin: convexa y umbilicada
Superficie: lisa
Borde: entero
Consistencia: cremosa
Cromognesis: coloracin crema,
blanquecino y anaranjado.
Se observ presencia de
estafilococos y pequeas
cadenas de
cocos(estreptococos)
5 Aire ambiental
(Lab. 20)
Se encontr 5 colonias
Forma: redondeada y esfrica
Elevacin: convexa y crateriforme
Superficie: lisa
Borde: entera
Consistencia: cremosa y algodonosa
Cromognesis: coloracin crema,
anaranjada, roja y opaco
Se observ presencia de
cocos y bacilos
MUESTRA OBSERVACIONES
MACROSCOPICAS
OBSERVACIONES
MICROSCOPICAS

AJI DEL
RESTAURANTE
CHAPARRAL

Forma: Ameboide
Elevacin: Convexa
Borde: Ondulado
Consistencia: Gomosa
Cromognesis: Pigmentos de color
blanco
Grados de transparencia: Opaco
Superficie: Rugosa Escamosa

Se observaron tipos de hongos
miceliales (hifas) y levaduras

CESPED DEL
JARDIN DE LA
FACULTAD DE
PETROLEO

Forma: Irregular
Elevacin: Convexa
Borde: Irregular
Consistencia: Algodonosa
Cromognesis: Pigmentos de color
verde
Grados de transparencia: Opaco
Superficie: Rugosa

Se observaron tipos de hongos
miceliales






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AGUA DE
MARACUYA
DE LA
FACULTAD DE
MECNICA

Forma: Irregular
Elevacin: Convexa
Borde: Ondulado
Consistencia: Gomosa
Cromognesis: Pigmentos de color
blanco
Grados de transparencia: Opaco
Superficie: Rugosa Escamosa


Se observaron dos tipos de
hongos miceliales (hifas) y
levaduras.

CARNE

Forma: Roco
Elevacin: Plana convexa
Borde: Entero
Consistencia: Cremosa
Cromognesis: Pigmentos de color
blanco
Grados de transparencia: Opaco
Superficie:

Se observaron tipos de hongos
miceliales

AIRE
AMBIENTAL
DEL
LABORATORIO
FIA

Forma: Filamentosa
Elevacin: Crateriforme
Borde: Espiculado
Consistencia: Algodonosa
Cromognesis: Pigmentos de color
mostaza
Grados de transparencia: Opaco
Superficie: Rugosa

Se observaron dos tipos de
hongos miceliales (hifas).