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Este documento presenta 6 problemas relacionados con diferentes técnicas de cromatografía. El primer problema propone identificar la técnica más adecuada para separar varias muestras de compuestos basándose en sus propiedades. Los problemas 2 al 5 proponen identificar el tipo de cromatografía o fase móvil adecuada en diferentes situaciones. El problema 6 implica determinar la masa molecular de dos proteínas desconocidas mediante cromatografía de exclusión y patrones de masa conocida.
Este documento presenta 6 problemas relacionados con diferentes técnicas de cromatografía. El primer problema propone identificar la técnica más adecuada para separar varias muestras de compuestos basándose en sus propiedades. Los problemas 2 al 5 proponen identificar el tipo de cromatografía o fase móvil adecuada en diferentes situaciones. El problema 6 implica determinar la masa molecular de dos proteínas desconocidas mediante cromatografía de exclusión y patrones de masa conocida.
Este documento presenta 6 problemas relacionados con diferentes técnicas de cromatografía. El primer problema propone identificar la técnica más adecuada para separar varias muestras de compuestos basándose en sus propiedades. Los problemas 2 al 5 proponen identificar el tipo de cromatografía o fase móvil adecuada en diferentes situaciones. El problema 6 implica determinar la masa molecular de dos proteínas desconocidas mediante cromatografía de exclusión y patrones de masa conocida.
Cul de los siguientes tipos de cromatografa ser ms adecuado para
separar los compuestos A y B componentes de cada muestra? n Componentes de la muestra Cromatografa A B 1) histona H1 (19,8 kDa, pI=10,6) pepsina (35 kDa, pI=3,9) ... 2) fenilalanina (M r =165, pI=5,45) serina (M r =105, pI=5,7) ... 3) lactato deshidrogenasa (228 kDa, pI=7,3) malato deshidrogenasa (140 kDa, pI=4,8) ... 4) seroalbmina (69 kDa, pI=4,8) inmunoglobulina G (153 kDa, pI=6,5) ... 5) seroalbmina (M r =69000, pI=4,8) glutatin (M r =333, pI=2,25) ... 6) cierta protena integral de membrana (55 kDa, pI=9,5) hexoquinasa (53 kDa, pI=10,0) ... Cromatografa: a. En capa fina de celulosa con cloroformo/metanol/actico (1:1:0,1) como fase mvil b. En columna de Sephadex G-50 con tampn fosfato pH=7 como fase mvil c. En columna de DEAE-Sepharosa con un gradiente de NaCl como fase mvil d. En papel con tampn fosfato pH=4 como fase mvil e. En columna de protena A-Sepharosa con un gradiente de pH 7,5 a 1,5 como fase mvil f. En columna de octil-Sepharosa con tampn fosfato pH=7 como fase mvil g. En columna de piruvato ligado a BioGel-P20 con un gradiente de NaCl como fase mvil h. En columna de gel de slice con hexano/ter/actico (60:40:1) como fase mvil Respuesta al problema 1 Muestra Cromatografa 1 (histona y pepsina) (c) por su distinta carga 2 (Phe y Ser) (a) o (h) por su distinta hidrofobia 3 (LDH y MDH) (g) afinidad, pues el piruvato es el producto de la reaccin de la LDH y tendr afinidad por su centro activo 4 (seroalbmina e IgG) (e), la protena A une inmunoglobulinas G 5 (seroalbmina y glutatin) (b), por su diferente tamao 6 (protena integral de membrana y hexoquinasa) (f), por su distinta hidrofobia
Problema 2 Disponemos de microesferas de polietileno con grupos sulfnico unidos covalentemente. Para qu tipo de cromatografa podremos utilizarlas (como fase estacionaria)? (a) de exclusin; (b) de intercambio aninico; (c) de intercambio catinico; (d) de reparto Respuesta al problema 2 De intercambio catinico, porque la resina tiene carga negativa
Problema 3 La casa GE Lifesciences vende, para cromatografa de filtracin en gel, el producto Sephadex G-100 Superfine, con las siguientes caractersticas: Material: dextrano entrecruzado con epiclorohidrina Tamao de partcula: 10-40 m (seco) Volumen de lecho: 15-20 ml/g (en agua) Lmite de exclusin para protenas globulares: 100 kDa Intervalo de fraccionamiento para protenas globulares: 4-100 kDa Una muestra contiene las protenas indicadas a continuacin. Razonar cul(es) de los componentes se podr(n) separar en una columna rellena con Sephadex G-100. Lactoferrina: 77 kDa, pI=8,8 Protena ligante de retinol (RBP): 21 kDa, pI=4,6 Lisozima: 15 kDa, pI=10,5 Ceruloplasmina: 134 kDa, pI=4,4 Glutatin: 333 Da, pI=2,25 Respuesta al problema 3 G-100 excluye la ceruloplasmina (que saldr al principio, en el volumen de exclusin). Se resuelven (separan) la lactoferrina, la protena ligante de retinol y la lisozima, pues sus tamaos estn en el intervalo de fraccionamiento de G-100; saldrn en ese orden. El glutation queda retenido en la columna y saldr al final, pero sin resolucin respecto a otros componentes pequeos (como los iones del tampn).
Problema 4 Resuelve el problema anterior empleando como medio cromatogrfico Sephadex G-75. Los datos necesarios pueden encontrarse en el catlogo de GE Life Sciences o en http://www.gelifesciences.com/ Respuesta al problema 4 El Sephadex G-75 tiene un intervalo de fraccionamiento para protenas globulares de entre 3 y 70 kDa. En consecuencia: La ceruloplasmina y la lactoferrina saldrn en el volumen de exclusin. Se resuelven la protena ligante de retinol y la lisozima, pues sus tamaos estn en el intervalo de fraccionamiento de G-75; saldrn en ese orden. El glutation queda retenido en la columna y saldr al final, pero sin resolucin respecto a otros componentes pequeos (como los iones del tampn). Problema 5 A partir de un antisuero se pretende purificar un anticuerpo anti- insulina, empleando cromatografa de afinidad en una columna rellena con Biogel-A al que se ha unido insulina de forma covalente a travs de un grupo espaciador de 6 carbonos.Elegir de entre las fases mviles siguientes las ms adecuadas para la etapa de lavado tras la muestra y para la elucin de lo retenido en la columna. a. Mezcla cloroformo/metanol 2:1 b. Alcohol isoproplico c. NaCl 0.9% d. Tampn bicarbonato sdico pH=10 e. 0.5 mg/ml de [ 125 I]-insulina en tampn fosfato pH=7.4 f. 2 mg/ml de glucagn en NaCl 0.9% g. 2 mg/ml de IgG anti-insulina en tampn fosfato pH=7 Respuesta al problema 5 Para lavar (c) (sin ningn efecto en especial pero compatible con la unin en condiciones fisolgicas). Para eluir (e), pues la insulina aadida competir con la insulina inmovilizada en la columna y as desplazar el anticuerpo retenido; el marcaje con yodo es irrelevante
Problema 6 Una de las aplicaciones frecuentes de la cromatografa de exclusin molecular es la determinacin de la masa molecular de protenas globulares. Para ello, es preciso disponer de protenas patrn de masa conocida. Tras un proceso de purificacin que parti de un extracto celular, el cromatograma de exclusin obtenido con la muestra resultante indic la presencia de 2 protenas diferentes. Calcule cul es su masa molecular, a partir de los datos de volumen de elucin obtenidos con la mezcla de protenas patrn cromatografiada bajo las mismas condiciones. Cromatograma de la muestra:
Cromatograma y datos de la mezcla de protenas patrn:
protena masa molecular Ve aldolasa 39.2 kDa 24.0 mL seroalbmina 66.2 kDa 21.3 mL fosforilasa b 97.0 kDa 18.0 mL - galactosidasa 116.0 kDa 16.5 mL miosina 212.0 kDa 14.0 mL
Respuesta al problema 6 Leemos en el cromatograma de la muestra los V e de sus dos componentes: 15.5 y 20 mL. Construimos una tabla con los datos de los patrones y con ellos una curva de calibrado (dada la gran dispersin de valores de masa molecular, es habitual representar stos en una escala logartmica, para conseguir agruparlos y adems normalmente as se ajustan mejor a una recta). Puesto que la distribucin de puntos patrn es bastante lineal, ajustamos a una recta (lo ideal sera un ajuste por regresin no lineal a una curva logartmica). La ecuacin resultante es: log(M r /1000) = 3.25 0.069 V e
M r es masa molecular relativa, es decir, sin unidades; si ponemos Da o kDa ya hay unidades y es masa molecular, mejor que peso molecular. El ajuste se hizo con los valores numricos de kDa, por lo cual la variable Y es M r /1000 Ntese la escala logartmica en el eje de ordenadas. Interpolando el volumen al que han eluido las dos protenas componentes de la muestra (picos a 15.5 y 20 mL) obtenemos: 151 y 75 kDa.