Qumica Biolgica 2110-2104. Microbiologa y Tcnico de Laboratorio. Ao 2013
Trabajo Prctico N 2: Cuantificacin de carbohidratos totales de Pseudomonas fluorescens C en diferentes condiciones nutricionales.
Objetivos: - Familiarizarse con tcnicas de determinacin de glcidos. - Comprender el uso de la espectrofotometra en tcnicas bioqumicas. - Determinar el contenido de carbohidratos totales de P. fluorescens C por el mtodo de antrona.
Introduccin: Los glcidos estn ampliamente distribuidos en el mundo de los seres vivos y desempean funciones estructurales y metablicas. Las bacterias poseen un gran nmero de carbohidratos diferentes: azcares libres, derivados de azcares, polisacridos simples (polmeros de azcares) y polisacridos complejos (polmeros de azcares diferentes, aminoazcares, cidos urnicos, etc). Algunas macromolculas contienen adems componentes no glucdicos (lipopolisacridos, peptidoglucanos, cidos teicoicos, cidos nucleicos, glucoprotenas, etc). Los mtodos colorimtricos son tiles para estimar la cantidad de azcares simples y sus polmeros. Los ensayos ms convenientes para carbohidratos totales involucran calentamiento de las muestras con H 2 SO 4 para hidrolizar los polisacridos y deshidratar los monosacridos para obtener las formas furfural e hidroximetilfurfural de las pentosas y hexosas respectivamente. Estas soluciones son luego tratadas con un reactivo aromtico (antrona o fenol) para producir un compuesto coloreado que se puede medir espectrofotomtricamente. Las pentosas, hexosas, heptosas y sus derivados, excepto aminoazcares, reaccionan generando un producto coloreado, mientras que las triosas y tetrosas no. Los mtodos de antrona y fenol son los ms utilizados por su simplicidad, rapidez y baja interferencia con otros componentes celulares, lo cual los convierte en los mtodos de eleccin para la determinacin de un ndice confiable de carbohidratos totales. Dos desventajas notables de estos mtodos son: 1- Los azcares individuales no pueden ser identificados 2- Trabajar con soluciones concentradas de cidos o fenol es peligroso.
En el presente trabajo prctico se analizar si variaciones en las condiciones nutricionales pueden afectar el contenido glucdico de un microorganismo. Para ello se realizar una curva de calibrado del mtodo de antrona utilizando glucosa como solucin patrn y se determinar el contenido de carbohidratos totales de Pseudomonas fluorescens C crecida en diferentes medios de cultivo.
PRECAUCIONES PARA TRABAJAR CON EL REACTIVO DE ANTRONA:
Este reactivo est preparado con H 2 SO 4 y ste es un cido muy fuerte. Se debe evitar el contacto con los ojos y la piel, y si hubiera exposicin a este cido, se debe lavar con abundante cantidad de agua fra. La dilucin del cido con agua es muy exotrmica y la solucin resultante se vuelve muy caliente incluso hasta quemar la piel o romper el contenedor. Esto se previene realizando las soluciones en baos de agua-hielo. Nunca se debe agregar agua al cido ya que puede producir salpicaduras, por eso NUNCA HAY 2 QUE DARLE DE BEBER AL ACIDO!! sino que SIEMPRE se debe agregar el cido al agua.
Materiales y mtodos:
A) Reactivos: Soluciones estndares de glucosa: Se utilizarn soluciones madres de 20 g/ml, 40 g/ml, 60 g/ml y 80 g/ml con las cuales se realizar la curva de calibrado del mtodo. Solucin de H 2 SO 4 : Preparar solucin madre al 75% v/v. TENER EN CUENTA LAS PRECAUCIONES PARA MANIPULAR ESTE CIDO. Reactivo de antrona: Preparar la solucin agregando 100 mg de antrona a 2,5 ml de etanol absoluto y llevar a un volumen final de 50 ml con H 2 SO 4 al 75%. Agitar hasta disolucin. La solucin debe ser preparada en el momento y conservar a 4 C a resguardo de la luz en frasco color caramelo.
B) Tcnica:
Cada comisin tendr 5 ml de cultivo de P. fluorescens C crecida en un medio rico (por ejemplo medio Luria-Bertani) y 5 ml de cultivo del microorganismo crecido en un medio salino mnimo suplementado con colina como nica fuente de C y N. A partir de los cuales se realizar la determinacin de carbohidratos totales.
1- Cosechar las clulas por centrifugacin a 5000 rpm durante 5 min y descartar el sobrenadante obtenido. 2- Resuspender el precipitado en 5 ml de solucin fisiolgica (NaCl 0.9 %) para lavar las clulas y eliminar restos del medio de cultivo que pueden interferir en la determinacin. Centrifugar nuevamente a 5000 rpm durante 5 min y descartar el sobrenadante. 3- Resuspender el precipitado en 5 ml de H 2 O destilada. Esta muestra se utilizar para la determinacin de carbohidratos. 4- Rotular 7 tubos de vidrio como: B, T20, T40, T60, T80, LB, MM 5- Colocar en cada tubo 1 ml de la solucin madre o muestra correspondiente y 1 ml de H 2 O en el tubo del blanco de reaccin. 6- Enfriar los tubos y el reactivo de antrona en hielo. 7- Agregar 5 ml del reactivo de antrona fro a cada tubo y mezclar durante 5 minutos en fro. 8- Transferir los tubos a un bao de agua a 100 C e incubar EXACTAMENTE durante 10 minutos. 9- Retirar los tubos y colocar nuevamente en hielo. 10- Medir la absorbancia de cada tubo a 625 nm. 11- Preparar la curva de calibrado graficando la DO corregida de cada patrn en funcin de la concentracin de los mismos. 12- Determinar la concentracin de carbohidratos totales en cada unas de las muestras problema utilizando la curva elaborada anteriormente.