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Este documento presenta el procedimiento para realizar el ensayo de esterilidad en medicamentos. Describe los medios de cultivo utilizados como Tioglicolato y Digerido de Caseína y Soja, y los pasos para probar su esterilidad y capacidad de promover el crecimiento. Explica los métodos de filtración sobre membrana e inoculación directa, y los pasos para determinar si un producto tiene propiedades antimicrobianas. El objetivo del ensayo es comprobar la ausencia de microorganismos viables en medicamentos que
Este documento presenta el procedimiento para realizar el ensayo de esterilidad en medicamentos. Describe los medios de cultivo utilizados como Tioglicolato y Digerido de Caseína y Soja, y los pasos para probar su esterilidad y capacidad de promover el crecimiento. Explica los métodos de filtración sobre membrana e inoculación directa, y los pasos para determinar si un producto tiene propiedades antimicrobianas. El objetivo del ensayo es comprobar la ausencia de microorganismos viables en medicamentos que
Este documento presenta el procedimiento para realizar el ensayo de esterilidad en medicamentos. Describe los medios de cultivo utilizados como Tioglicolato y Digerido de Caseína y Soja, y los pasos para probar su esterilidad y capacidad de promover el crecimiento. Explica los métodos de filtración sobre membrana e inoculación directa, y los pasos para determinar si un producto tiene propiedades antimicrobianas. El objetivo del ensayo es comprobar la ausencia de microorganismos viables en medicamentos que
Introduccin Esta norma establece el mtodo para el ensayo de esterilidad, el cual se realiza con el objetivo de comprobar la ausencia de microorganismos viables en medicamentos (inyectables, colirios, oticos, sueros) material de reposicin peridica como suturas, gasas, jeringas y cualquier otro producto que requiere la condicin de estril para su utilizacin. Este ensayo tiene que ser realizado por personal calificado con experiencia en tcnicas de anlisis microbiolgico, ya que errores de manipulacin e interpretacin durante la prueba pueden llevar a interpretaciones falsas de los resultados obtenidos.
El procedimiento debe ser realizado bajo condiciones aspticas ambientales, en cabina de flujo laminar clase A y entorno clase B. Las precauciones utilizadas para evitar la contaminacin no deben afectar a ningn microorganismos que pudiera estar presente en la muestra. Las condiciones deben ser monitoreadas regularmente. Es necesario que al analista se le binde toda la informacin necesaria con relacin a los cambios en los procesos de esterilizacin y envase siempre que estos pudieran influir en el resultado del ensayo. En productos biolgicos constituidos por microorganismos vivos atenuados (vacunas) se entender como resultado satisfactorio, la ausencia en la muestra ensayada de cualquier microorganismo que no sea el que constituye el producto.
Medios de cultivo utilizados Los medios se preparan de acuerdo como lo describan las formulas deshidratadas. Los medios de cultivo son esterilizados usando procesos validados. Estos medios de cultivo deben promover el crecimiento de bacterias aerobias, anaerobias y hongos.
Medio fluido Tioglicolato: Es utilizado principalmente para el cultivo de bacterias anaerobias, pueden crecer tambin bacterias aerobias.
Medio Digerido de Caseina Soja: Es utilizado para evidenciar el crecimiento de Hongos y bacterias aerobias.
Medios para penicilinas o Cefalosporinas Cuando se realiza el ensayo de esterilidad por el mtodo directo y la muestra a ensayar contiene penicilina o cefalosporina, la preparacin de los medios se modifica. A los tubos o contenedores de cada medio de cultivo se le agrega aspticamente una cantidad de lactamasa requerida para inactivar el antibitico. La cantidad de lactamasa requerida debe ser ensayada previamente( en un rea separada de la usada para el ensayo de sterilidad), esta cantidad apropiada a incorporar en el medio de cultivo se determina siguiendo el mtodoensayo de validacin, utilizando menos de 100UFC de Staphylococcus aureus.Cuando un crecimiento tpico del inculo puede ser observado, se confirma que la concentracin de -lactamasa es apropiado.
Requisitos que deben cumplir los medio de cultivo 1) Esterilidad 2) Promocin de crecimiento
Prueba de Esterilidad del medio de cultivo (control negativo)
De los medios preparados separar dos tubos de cada uno ellos. Rotular como control negativo. Se incuban los tubos con Medio lquido de Tioglicolato a 35C por no menos de tres das. Incubar los tubos con Medio de Digerido de Casena y Soja A 22 por no menos de 5 das.
Interpretacin de resultado: Los medios se consideran estriles sin no hay evidencia de crecimiento microbiano. Son adecuados para el ensayo.
Prueba de promocin de crecimiento de organismos aerobios anaerobios y hongos(control positivo). Medios + microorganismos de prueba
Se evala cada lote de medio listo para usar y cada partida de medio preparado a partir de medios deshidratados. Inocular 3 porciones de Medio Liquido de Tioglicolato contenidos en tubos de ensayo con un nmero no mayor de 100 UFC/ml de las siguientes bacterias: Clostridium sporogenes, Pseudomona aeroginosa, Staphylococcus aureus. Se deben inocular 3 porciones de Medio de Digerido de Casena y Soja con un nmero no mayor de 100 UFC/ml microoganismos mencionados a continuacin: Aspergillus niger, Candida albicans, Bacilo subtiles
Se incuban los tubos que contienen cada uno de los medios con los microorganismos correspondientes durante no ms de 3 das para bacterias y durante no ms de 5 das para hongos.
Interpretacin: Los medios son adecuados si se produce un crecimiento claramente visible de los microorganismos.
. Propiedades antimicrobianas del producto o muestra: Medio de cultivo +Producto + Microorganismo Se debe verificar si el producto tiene propiedades antimicrobianas o inhibitorias en caso que la muestra no sea antibitico. Si el producto a ser analizado tiene propiedades antimicrobianas, se debe neutralizar esta propiedad antes de realizar la prueba de esterilidad a la muestra.
Esta se realiza transfiriendo a tres tubos con medio de cultivo Tioglicolato la cantidad de muestra apropiada considerando la tabla 2 (anexo) Se agrega al medio un inculo pequeo de microorganismos viables no mayor de 100 UFC/ ml. Los microorganismos de prueba son:
Igual que en la prueba anterior, se agrega a tres tubos que contenga Medio de Digerido de Caseina y Soja, un nmero no mayor de 100 UFC/ml de microorganismos mencionados a continuacin: Tubo uno: Aspergillus niger Tubo dos: Candida albicans Tubo tres: Bacilo subtiles Incubar todos los medios durante un tiempo no mayor de 5 das.
Interpretacin: Si despus de la incubacin se obtiene un crecimiento claramente visible de microorganismos, comparable visualmente con el del tubo de control sin producto (control positivo) el producto no posee actividad antimicrobiana en las condiciones de la prueba o tal actividad se ha eliminado satisfactoriamente. La prueba de Esterilidad de la muestra, puede llevarse a cabo sin modificacin.
Si no se obtiene un crecimiento claramente visible en presencia del producto a evaluar, el producto posee actividad antimicrobiana, que no se ha eliminado satisfactoriamente en las condiciones de la prueba. Modificar las condiciones con el fin de eliminar la actividad antimicrobiana, esto se efecta agregando un neutralizante adecuado o realizando diluciones de la muestra.
Mtodos utilizados para el ensayo Filtracin sobre membrana Inoculacin directa
Filtracin sobre membrana Se utilizan filtros de membranas que la medida de los poros no sea mayor de 0.45m, que pueda retener microorganismos. La tcnica descrita asume que la membrana tienealrededor de 50 mm de dimetro. S i los filtros son de diferentes dimetros el volumen de las diluciones y el enjuague puede ser ajustado. Soluciones acuosas. Transferir una pequea cntidad de diluyente estril sobre la membrana (contenida en el aparato de filtrar) El diluyente es agua de peptona, en caso de muestra de antibiticos el diluyente puede contener neutralizante o inactivante. Transferir y filtrar la cantidad de muestra sobre la membrana. La cantidad a agregar se describe en la farmacopea(tabla 2 y 3 para este ensayo) y esta de acuerdo al volumen que contiene la muestra. Lavado de la membrana (para eliminar restos de muestra y que solo queden retenidos los microorganismos en caso que hubiera). Si el producto no tiene propiedades antimicrobianasr la membrana se lava 3 veces. Si el producto tiene propiedades antimicrobianas, lavar la membrana no menos de 3 veces con el diluyente indicado, no exceder de 5 lavados con 200 ml de diluyente. Transferir la membrana completa a los medios de cultivo o cortar aspticamente en dos partes iguales y transferir cada parte a loa medios correspondientes. Incubar los medios por no menos de 14 das. Slidos solubles Usar para cada medio no menos de la cantidad indicada en la tabla 2 y 3 de la farmacopea y proceder como se describe para soluciones acuosas. Aceites y soluciones de aceite. Usar de cada medio no menos de la cantidad de producto descrito en la farmacopea. Aceites y soluciones aceitosas de baja viscosidad pueden ser filtradas, sin diluirse sobre la membrana seca. Aceites viscosos pueden se diluidos con una cantidad de diluyentes estril tal como Miristato de isopropilo. Lavar la membrana al menos 3 veces con 100ml de solucin estril cada vez. Los diluyentes y enjuages contienen agentes emulsificantes, ejemplo: Polisorbato 80 10g/lt.
Ungentos y cremas. Usar para cada medio no menos de la cantidad descrita en la USP(tabla 2 y 3). Los ungentos y emulsiones de agua en aceite pueden ser diluidos a 1% en miristato de isopropilo. Calentar si es necesario a una temperatura no mayor a 40C. En casos excepcionales puede ser necesario calentar a temperaturas no mayor de 44C. Filtrar rpidamente como sea posible.
Qu nmero de artculos o muestras se va a evaluar?
Previamente al ensayo se debe determinar la cantidad de envases y muestras a utilizar de acuerdo a la tabla 3 (anexos) Si el contenido de cada producto est en cantidad suficiente (tabla 2) se puede dividir para agregar a cada uno de los medios especificados en porcin igual y apropiada.
Prueba de esterilidad del producto o muestra por Inoculacin directa. Transferir la cantidad de la preparacin a ser examinada de acuerdo al contenido de la muestra (tabla 2 y 3) directamente a dos frascos con Medio tioglicolato y dos frascos con Medio Digerido de casena Soja, esto se debe realizar de forma asptica. La cantidad de producto examinado no debe ser sea mayor de 10% con respecto al volumen del medio. Si el producto posee propiedad antimicrobiana realizar la prueba despus de neutralizar esta actividad con una sustancia neutralizante adecuada o mediante su dilucin en una cantidad suficiente de medio de cultivo.. Incubar los medios, un frasco o tubo con Medio Tioglicolato y otro con Digerido de Caseina y Soja a 22C. Proceder de igual manera con los otros dos medios de cultivo pero a una temperatura de 35- 37C. La incubacin debe ser durante un tiempo no menor de 14 das. Los cultivos se deben observar varias veces durante el periodo de incubacin 3, 5, 7, 14 das.
Recomendaciones:
1. Agitar suavemente los cultivos que contengan productos oleosos todos los das. 2. Con el medio tioglicolato agitar mnimamente con el fin de mantener las condiciones anaerobias, evitando formacin de burbujas.
Preparacin de la muestra de acuerdo a sus caractersticas fsicas. Se debe considerar las caractersticas fsicas de la muestra antes de proceder a la inoculacin directa.
Lquidos oleosos Agregar al medio de cultivo un agente emulsificante apropiado como polisorbato 80 a una concentracin de 10 g/litro.
Ungentos y cremas Realizar una dilucin del producto de aproximadamente 1 en 10, emulsionando con el agente elegido (liquido A) en un diluyente estril adecuado. Transferir el producto diluido a los medios de cultivo que no contenga agente emulsificante. Incubar los medios con muestra.
Slidos Transferir una cantidad de producto en forma de slido seco o preparar una suspensin del producto agregando diluyente estril al envase primario correspondiente a no menos de la cantidad indicada en las tablas 2 y 3. Transferir el material obtenido a dos frascos con 200 ml de medio lquido de Tioglicolato cada uno y mezclar Transferir la misma cantidad a 200ml de medio de Digerido de Caseina y Soja.
Algodn purificado, Gasa, apsitos quirrgicos y artculos relacionados. De cada envase de algodn, vendas de gasa enrollada o apsitos quirrgicos grandes que se deba evaluar Se extrae aspticamente con una pinza estril dos o ms porciones aproximada de 100 a 500 mg cada una, de la parte ms interna del producto. Agregarlos a los medios de cultivo de acuerdo a la inoculacin directa del producto.
Materiales desechables envasados individualmente Extraer aspticamente todo el artculo. Sumergir el artculo en cada medio y se proceder segn lo indicado en Inoculacin directa del producto.
Dispositivos estriles, ejemplo jeringas Se sumergen los artculos ensamblados o desmontados, en un volumen de medio suficiente que cubra el dispositivo analizado. Se debe asegurar que los conductos del dispositivo estn en contacto con los medios.
Catteres en los que se requiere la esterilidad del lumen interno y de la parte externa. Catteres grandes Se corta el catter en piezas con un bistur nuevo. Sumergir las piezas en los medios de cultivo de modo que entre en contacto con todo el lumen interno. Catteres pequeos Llenar el lumen interno con medio de cultivo y sumergir la unidad intacta.
Observacin e interpretacin de resultado de la prueba de Esterilidad del producto o muestra a examinar. A intervalos durante el periodo de incubacin y al momento de su finalizacin, examinar los medios en busca de evidencia macroscpica de crecimiento microbiano. Si no se hallan evidencias de crecimiento microbiano el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si el material que se est evaluando enturbia el medio de modo que no puede determinarse fcilmente la presencia o ausencia de crecimiento microbianao mediante examen visual, transferir porciones de medio( no menores de 1 ml , cada una) 14 das despus de comenzada la incubacin, a recipientes nuevos con medio de cultivo indicados para esta prueba y a continuacin incubar el recipiente original y el de transferencia durante no menos de 4 das. Si no se hallan evidencias de crecimiento microbiano, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se hallan evidencias de crecimiento microbiano, el producto examinado no cumple con la prueba de esterilidad, a menos que pueda demostrarse claramente que la prueba result invalida por causa no relacionadas con el producto examinado.
La prueba puede considerarse invlida slo si se cumple una o ms de las siguientes condiciones: a. Los datos de monitoreo microbiolgico de las instalaciones para prueba de esterilidad demuestran una falla. b. Una revisin del procedimiento analtico usado durante la prueba en cuestin revela un error. c. Se halla crecimiento microbiano en los controles negativos. d. Despus de determinar la identidad de los microorganismos aislados de la prueba, el crecimiento de esta especie(o especies) puede atribuirse de manera inequvoca a errores con respecto al material o ala tcnica usados al realizar el procedimiento de la prueba de esterilidad.
Si la prueba se declara invlida, se repetir con el mismo nmero de unidades de la prueba original. Si no se hallan pruebas de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se hallan pruebas de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado no cumple con la prueba de esterilidad.
ANEXO No. 1 Tabla 2. Cantidad Mnima a Usar para cada Medio Cantidad por Envase Cantidad Mnima a Usar (a menos que se justifique y autorice algo diferente) Lquidos (distintos de antibiticos) Menos de 1 mL
1 40 mL
no mayor de 100 mL
Ms de 100 mL
Lquido antibiticos
Otras preparaciones solubles en agua o en miristato de isipropilo
El contenido total de cada envase
La mitad del contenido de cada envase, pero no menos de 1 mL.
20 mL.
10 % del contenido del envase, pero no menos de 20 mL 1 mL
El contenido total de cada envase para suministrar no menos de 200 mg. Preparaciones insolubles, cremas y ungentos que deben suspenderse o emulsionarse Usar el contenido de cada envase para suministrar no menos de 200 mg. Slidos
Menos de 50 mg
50 mg o ms, pero menos de 300 mg
300 mg-5 g Ms de 5 g
El contenido total de cada envase
La mitad del contenido de cada envase, pero no menos de 50 mg 150 mg 500 mg Dispositivos Catgut y otros materiales de sutura quirrgica para uso veterinario *Aposito quirrgico/algodn/gasa ( en envases)
Material de sutura y otro material desechable envasado Individualmente
Otros dispositivos mdicos
3 secciones de una hebra (cada uno de 30 cm de longitud) 100 mg por envase
El dispositivo completo
El dispositivo completo, cortado en piezas o desmontado
ANEXO No.2 Tabla 3. Nmero Mnimo de Artculo a Evaluar en Relacin con el nmero de Artculos del lote
Nmero de Artculos en la Partida Nmero Mnimo de Artculos a Evaluar para cada Medio (a menos que se justifique y autorice algo diferente) Preparaciones parenterales No ms de 100 envases Ms de 100 pero no ms de 500 envases Ms de 500 envases *Para parenterales de gran volumen
10% o 4 envases, lo que resulte mayor 10 envases 2% o 20 envases, lo que resulte menor 2% o 10 envases, lo que resulte menor Antibitico slidos Envasados farmacuticos a granel (5 g) Envasados farmacuticos a granel ( 5 g) Graneles y mezclas
20 envases 6 envases Ver productos slidos a granel Preparaciones oftlmicas y otras no inyectables No ms de 200 envases Ms de 200 envases
Si el producto se presenta en la forma de envases monodosis, Aplicar el esquema mostrado anteriormente para preparaciones para uso parenteral
5% o 2 envases, lo que resulte mayor. 10 envases Dispositivos Catgut y otros materiales de sutura quirrgica para uso veterinario 2 % o 5 envases, lo que resulte mayor, hasta un total mximo de 20 envases 10% o 4 artculos, lo que resulte mayor 10 artculos 2% o 20 artculos, lo que resulte menor.
* No ms de 100 artculos Ms de 100, pero no ms de 500 artculos Ms de 500 artculos Productos slidos a granel Hasta 4 envases Ms de 4 envases, pero no ms de 50 envases Ms de 50 envases Cada envase 20% o 4 envases, lo que resulte mayor 2% o 10 envases, lo que resulte mayor Si el contenido de un envase es suficiente para inocular dos medios, esta columna de el nmero de envases necesarios para los dos medios juntos
INFORME DE ANALISIS
Nombre genrico: Nombre comercial: Nmero de Lote: Fecha de vencimiento Fecha de elaboracin Presentacin: Forma farmacutica Fecha de recepcin: . Fecha de anlisis: Ensayo realizado:..